本發(fā)明涉及一種植物瞬時(shí)表達(dá)植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶(Recognizing DNA Mismatch Specific endonucleases in plants)是一種單鏈、雙鏈都特異識別的特異性核酸酶(Pimkin et al,2007)，mung bean nuclease、SP1、S1、P1、ZEN1、ZEN2、CEL I、CEL II、M1、BENI、T7Endonuclease I、Endo V或T4Endonuclease VII等具有同源性(圖7和圖8)的核酸內(nèi)切酶都屬于植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶(Till et al,2004；Pimkin et al,2007)。傳統(tǒng)理論認(rèn)為該酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺(Till et al,2004)，它可以識別八種錯(cuò)配形式的堿基(mismatches)分別為AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowski et al,1999；Oleykowski et al,1998)，因此被廣泛應(yīng)用于突變檢測領(lǐng)域，如植物TILLING技術(shù)平臺中(Colbert et al,2001；Till et al,2006)。它可以特異性切割錯(cuò)配堿基(Yang et al,1999)。通過酶切擴(kuò)增的目標(biāo)檢測片段，并經(jīng)瓊脂糖或毛細(xì)管電泳分離檢測(Jiang et al,2013)，一般可方便獲得突變位置和大小。因此，它是一種比較方便和經(jīng)濟(jì)的檢測未知和已知突變位點(diǎn)的手段(Yeung et al,2005)。

目前CELI酶主要提取途徑是從芹菜中提取，主要提取方法是硫酸銨沉淀法，得到的粗提酶液一般可直接用于檢測(Till et al,2006)。如果需要得到純度更高的酶，需要經(jīng)過刀豆體蛋白A-瓊脂糖柱吸附(Pimkin et al,2007)，用alpha-甘露糖苷洗脫，但是得率較低(Yang et al,1999)。因此，大部分TILLING突變體檢測實(shí)驗(yàn)是用粗提酶來檢測的，該粗提酶的主要成分即為CELI酶。

由于CELI酶為糖基化修飾酶，故不能在原核細(xì)胞中表達(dá)(Yang et al,1999)。因此，Maxim Pimkin等人用昆蟲細(xì)胞系Sf9細(xì)胞系得到重組的CEL I酶(Pimkin et al,2007)，但是該方法成本較高、周期較長，實(shí)驗(yàn)條件苛刻。此外，目前商業(yè)化的CEL I和CEL II都需要依賴進(jìn)口，由于冷鏈運(yùn)輸價(jià)格昂貴，導(dǎo)致其未廣泛在國內(nèi)使用。

早在上世紀(jì)八十年代人們就開始在植物中表達(dá)重組蛋白，并且廣泛地應(yīng)用在醫(yī)學(xué)制藥領(lǐng)域(Buyel et al,2014)。植物細(xì)胞不僅僅能夠表達(dá)一般外源蛋白，當(dāng)然還包括醫(yī)用抗體等產(chǎn)品(Rodr guez et al,2004)。因此轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)外源蛋白是一種不可或缺的方法，相比其他動物，如昆蟲細(xì)胞，它既經(jīng)濟(jì)而且可以大規(guī)模種植來用于生產(chǎn)。傳統(tǒng)的重組外源蛋白方法主要依賴于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株，它不僅耗時(shí)并且受資源、空間的限制。相比而言，植物瞬時(shí)表達(dá)法是一種在幾天內(nèi)非?？焖佼a(chǎn)生大量外源活性蛋白 的方法，并且能夠迅速滿足商業(yè)化產(chǎn)品的生產(chǎn)要求(Sainsbury et al,2014)。一般來說這種系統(tǒng)表達(dá)的蛋白量的高低，主要受mRNA密碼子選擇及GC含量、表達(dá)載體的框架結(jié)構(gòu)、寄主細(xì)胞、培養(yǎng)條件等影響(Ullrich et al,2015)。植物瞬時(shí)表達(dá)能夠在農(nóng)桿菌浸染后2-4天內(nèi)迅速表達(dá)至最高水平(Lacroix et al,2013)。而穩(wěn)定的表達(dá)體系需要T-DNA整合至目標(biāo)的基因組，在浸染農(nóng)桿菌10-14天后，才有選擇性地提高表達(dá)水平(Janssen et al,1990)。間接的證據(jù)表明瞬時(shí)表達(dá)中的外源T-DNA拷貝在表達(dá)外源蛋白時(shí)占主要的作用，而非整合至植物基因組中再發(fā)揮作用(Lacroix et al,2013；et al,2015)。

煙草作為植物界的“小白鼠”，被作為反應(yīng)器的主要物種(Lacroix et al,2013)，主要是由于煙草的葉片量多，非常適合表達(dá)外源蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶(Recognizing DNA Mismatch Specific endonucleases in plants)的制備方法。

本發(fā)明提供的植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的制備方法包括如下步驟：在煙草葉片中表達(dá)植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶，再從表達(dá)植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的煙草葉片中提取植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶。

上述方法中，所述在煙草葉片中表達(dá)植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶，再從表達(dá)植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的煙草葉片中提取植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的方法包括如下步驟：將所述植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的編碼基因?qū)朕r(nóng)桿菌，得到重組菌；再用所述重組菌侵染煙草外植體，得到侵染后煙草外植體；再從所述侵染后煙草外植體中提取所述植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶，得到植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶。

上述方法中，所述植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述農(nóng)桿菌的。

上述方法中，所述侵染的方法為將所述重組菌注射到所述煙草葉片下表皮。

上述方法中，所述重組表達(dá)載體為將所述植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的編碼基因插入表達(dá)載體中得到的載體。

上述方法中，所述外植體為非子葉葉片；所述目的農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌EH105。

上述方法中，所述植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶為mung bean nuclease、SP1、S1、P1、ZEN1、ZEN2、CEL I、CEL II、M1、BENI、T7Endonuclease I、Endo V或T4Endonuclease VII；所述植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶具體為CELI。

上述方法中，所述CELI酶的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列3的第65-958位。

上述方法中，所述表達(dá)載體為pCambia 2300-GFP(N)或pCambia 2300-GFP(C)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由上述方法制備得到的植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶。

上述植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶在切割含有錯(cuò)配位點(diǎn)DNA中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明采用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，高效表達(dá)外源CEL I酶。通過實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)從注射農(nóng)桿菌到純化蛋白僅需3-5天時(shí)間，大大節(jié)約時(shí)間和成本，并且酶活并沒有降低。

附圖說明

圖1為重組載體pCambia2300-CELI-His的示意圖。

圖2為重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His的示意圖。

圖3為煙草注射農(nóng)桿菌后，重組載體pCambia2300-CELI-His的表達(dá)情況。左側(cè)為含有空載體的重組菌；右側(cè)為含有重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His的重組菌。

圖4為重組CELI-GFP的SDS-PAGE圖。

圖5為CELI-His注射農(nóng)桿菌后，不同天數(shù)表達(dá)情況。

圖6為重組CELI-GFP和CELI-His(外源CELI)與內(nèi)源CELI比較。泳道1為內(nèi)源CELI對野生型DNA的酶切結(jié)果；泳道2為重組CELI-GFP對突變體DNA的酶切結(jié)果；泳道3為CELI-His對突變體DNA的酶切結(jié)果；泳道4為內(nèi)源CELI對突變體DNA的酶切結(jié)果。

圖7為部分植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的同源性分析。圖7A為部分植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的同源性分析譜圖；圖7B為部分植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的同源性分析(Bradley J.Till,2004；Maxim Pimkin,2007)。

圖8為為部分植物DNA錯(cuò)配識別的核酸內(nèi)切酶的同源性分析(Bradley J.Till,2004；Maxim Pimkin,2007)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

pCambia 2300-GFP(N)和pCambia 2300-GFP(C)是北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為MCV036。

農(nóng)桿菌EH105是上海邁其生物科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為CH5002B。

實(shí)施例1、植物瞬時(shí)表達(dá)CELI酶的方法及效果

一、植物瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建

1、提取新鮮的芹菜葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄引物如下所示(下劃線為His-tag)：正向引物：5’-TAAAAAAACCTATAAATACGGATCTCGAGATGACGC-3’；反向引物：5’-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCTTCTGCCAAAGAATGATCTG-3’。

2、以步驟1獲得的cDNA為模板，采用正向引物F和反向引物R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下(下劃線的序列為酶切位點(diǎn))：正向引物：5’-GGATCCTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATA-3’；反向引物：5’-TCTAGATTCAGCAGAGTCGGTACAGATCTCCCGGGGGTACCGAATTCAGTGGTGG-3’。

3、用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xba I對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收并純化大小為1025bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(即為CELI的編碼基因)；用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xba I對pCambia 2300-GFP(N)和pCambia 2300-GFP(C)進(jìn)行雙酶切，回收大小為11,227bp的骨架載體1和大小為11,236bp的骨架載體2；將大小為1,025bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與大小為11,227bp的骨架載體1和大小為11,236bp的骨架載體2連接，分別得到重組載體pCambia 2300-CELI-His(圖1)和重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His(圖2)。

對重組載體pCambia 2300-CELI-His進(jìn)行測序驗(yàn)證：重組表達(dá)載體pCambia 2300-CELI-His為將pCambia 2300-GFP(N)的BamH I和Xba I位點(diǎn)間的DNA替換為序列3中第65-958位核苷酸所示的CELI酶的編碼基因，保持pCambia 2300載體的其他序列不變得到的重組載體，表達(dá)GFP-CELI。

對重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His進(jìn)行測序驗(yàn)證：重組表達(dá)載體pCambia2300-GFP-CELI-His為將pCambia 2300-GFP(C)載體的BamH I和Xba I位點(diǎn)間的DNA替換為序列3中第65-958位核苷酸所示的CELI酶的編碼基因，保持pCambia 2300-GFP(C)載體的其他序列不變得到的重組載體，表達(dá)CELI-His。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切反應(yīng)(總體積20ul)：Cutesmart buffer(NEB)2.0ul；KpnI 0.5ul；XbaI 0.5ul；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(200ng/ul)5ul；H₂O 12ul。37℃反應(yīng)1-2h。

pCambia 2300-GFP(N)或pCambia 2300-GFP(C)的酶切反應(yīng)(總體積20ul)：Cutesmart buffer(NEB)2.0ul；KpnI 0.5ul；XbaI 0.5ul；pCambia 2300-GFP(N)或pCambia 2300-GFP(C)(200ng/ul)5ul；H₂O 12ul。37℃反應(yīng)1-2h。

連接反應(yīng)體系(總體積20ul)：10倍ligation buffer 2.0ul；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切(膠回收)2.0ul；載體雙酶切(膠回收)4.0ul；Ligase 1.0ul；H₂O 11ul。16℃過夜。

二、植物瞬時(shí)表達(dá)CEL I酶

1、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

將農(nóng)桿菌EH105接種到5ml的50mg/ml含利福平的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，得到菌液；將5ml的菌液全部加入250ml的含利福平的LB培養(yǎng)基中；28℃，200rpm培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8；冰浴10min，5000rpm，4℃，離心10min，棄上清，收集菌體；等體積10％甘油懸浮，收集菌體；1/2體積10％甘油懸浮，收集菌體；1/2體積10％甘油懸浮，收集菌體；50ml超純水配制的甘油懸浮，收集菌體；1ml超純水配制的10％甘油懸浮，得到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；100ml分裝，保存于-70℃待用。

2、重組菌的獲得

將40ml的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞分別和重組載體pCambia 2300-CELI-His、重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His和pCambia 2300-GFP(N)載體(對照)混合；冰浴30分鐘；轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電擊杯，電擊，分別得到含有重組載體pCambia 2300-CELI-His的重組菌、含有重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His的重組菌和含有pCambia 2300-GFP(N)載體的重組菌；將含有重組載體pCambia 2300-CELI-His的重組菌、含有重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His的重組菌和含有pCambia 2300-GFP(N)載體的重組菌分別加入1ml的LB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3h；濃縮至150ml涂布于含利福平50mg/ml，卡納50mg/ml的LB培養(yǎng)基。對含有重組載體pCambia 2300-CELI-His的重組菌、含有重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His的重組菌和含有pCambia 2300-GFP(N)載體的重組菌進(jìn)行菌液PCR鑒定。

PCR反應(yīng)體系(總體積20ul)：H₂O 16.5ul；10×PCR buffer(含20mmol/L MgCl₂)2.0ul；dNTPs mix(10mmol/L each)0.5ul；P1(10mmol/L)0.5ul；P2(10mmol/L)0.5ul；農(nóng)桿菌菌液0.5ul；Tag(2.5U/ml)0.5ul。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

3、煙草瞬時(shí)體系

(1)挑取含有重組載體pCambia 2300-CELI-His的重組菌、含有重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His的重組菌和含有pCambia 2300-GFP(N)載體的重組菌的單克隆于5ml含有100ug/ml潮霉素和50ug/ml卡納的LB液體培養(yǎng)中，28～30℃震蕩過夜培養(yǎng)。以含有pCambia 2300載體的重組菌為對照。

(2)分別將1ml培養(yǎng)后的含有重組載體pCambia 2300-CELI-His-GFP的重組菌、含有重組載體pCambia2300-GFP-CELI-His的重組菌和含有pCambia 2300-GFP(N)載體的重組菌轉(zhuǎn)接到25ml含有100ug/ml潮霉素、50ug/ml卡納和乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中，檢測過夜培養(yǎng)的菌液OD600的值。

(3)5000g，離心15分鐘，分別收集菌體，并用重懸液(10mM MgCl₂、10mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、100uM乙酰丁香酮)重懸菌體至OD600為0.4，分別得到侵染液1、侵染液2和侵染液3。

(4)將侵染液1、侵染液2和侵染液3室溫放置2～3h后分別裝入5ml注射器內(nèi)，用拇指按壓注射器反板將侵染液從葉片下表皮注射到煙草(本式煙草，Nicotiana benthamiana)葉片內(nèi)(勿使用子葉)。

(5)注射后將煙草培養(yǎng)2～5天，用熒光顯微鏡觀察熒光情況，發(fā)現(xiàn)CEL I酶在侵染液1注射得到的煙草的細(xì)胞間質(zhì)中表達(dá)(圖3)，并且在4天時(shí)表達(dá)量最高(圖5)。

三、CEL I酶的提取及純化

1、取侵染液1和侵染液2注射得到的煙草葉片各30-40片(含CELI酶)，分別用液氮磨碎成粉末加至100ml的50mM Tris-Hcl(pH 7.7)、0.2M KCl、100um PMSF的緩沖液中，混勻。

2、分別用紗布過濾殘?jiān)玫綖V液；將濾液9000g離心力離心45min，棄沉淀，分別收集上清；向上清中加入硫酸銨至飽和度25％(每100ml接入10.6g硫酸銨)，分十次加入，并緩慢攪拌，分別得到溶液1和溶液2。

3、分別將溶液1和溶液2在9000g離心力的條件下離心45min，棄沉淀，分別收集上清；向上清中加硫酸銨至飽和度80％(每100ml加入39g硫酸銨)，分十次加入，并緩慢攪拌，分別得到溶液3和溶液4。

5、分別將溶液3和溶液4在9000g離心力的條件下離心45min，棄上清，分別收集沉淀；用2ml 20mM Tris-Hcl(pH7.7)和0.2M KCl溶解沉淀，離心，棄去不溶物，分別得到粗酶液1和粗酶液2。

6、將粗酶液1和粗酶液2經(jīng)Ni柱吸附，用300mM咪唑洗脫，分別得到純化后的酶液1和酶液2。

7、將純化后的酶液1和酶液2分別經(jīng)SDS-PAGE膠分離，酶液1在75kDa有明顯條帶(GFP-CELI)，酶液2在43kDa有明顯條帶(CELI-His)(圖4)。

實(shí)施例2、CEL I酶的功能驗(yàn)證

用含有錯(cuò)配位點(diǎn)的待酶切DNA樣品測試上述實(shí)施例1獲得的外源CEL I酶(CEL I-His和GFP-CEL I)的活性，以內(nèi)源CEL I酶作對照。

一、內(nèi)源CEL I酶的制備

1、取10kg芹菜，放入榨汁機(jī)中，緩慢榨汁后，避免溫度過熱，在汁液中加入預(yù)冷勻漿緩沖液(含100mM Tris-HCl(pH均為7.7)和100uM PMSF)，得到混合液。

2、將所述混合液4℃下14000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液；向上清液中 緩慢加入硫酸銨(每100ml上清液加25g硫酸銨)，分10次加入(每100ml體積加入14.4g硫酸胺)，待完全溶解后，低速攪拌30min；14000rpm離心45min，棄沉淀，取上清液。

3、向上清液中緩慢加入硫酸銨至(每100ml上清液加80g硫酸銨)，分十次加入(每100ml體積加入39.0g固體硫酸銨)。低速攪拌30min后，14000rpm離心3min。棄上清，收集沉淀。

4、用1/10體積的緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)溶解步驟3中得到的沉淀，1000rpm離心20min，棄沉淀，取上清。

5、把透析袋剪成適當(dāng)長度的小段。用1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸5min。用超純水清洗透析袋。將透析袋放入10倍蛋白質(zhì)溶液以上體積的緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)中，透析過夜，透析4-5次至透析液無顏色為止。

6、取40ml透析過的酶液經(jīng)ConA-Sapharose-4B柱，用緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)沖洗，經(jīng)alpha-甘露糖苷洗脫后，經(jīng)緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)透析過夜，得到純化后的CELI酶，經(jīng)過SDS-PAGE檢測，其大小為43kDa，即為內(nèi)源CELI酶。

二、待酶切DNA樣品的制備

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子，將其按2:1比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的DNA(濃度為1ng/ul)。

序列2為將序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳后得到的DNA分子。

2、PCR擴(kuò)增

以步驟1獲得的待PCR擴(kuò)增的DNA為模板，采用F和R引物對所述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增至45個(gè)熱循環(huán)，然后進(jìn)行99℃變性10min，降溫至70℃，每個(gè)循環(huán)降低0.3℃，69個(gè)循環(huán)結(jié)束，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即待酶切DNA樣品。待擴(kuò)增完畢后，用1％瓊脂糖凝膠檢測，檢測條帶是否特異，條帶亮度是否達(dá)到要求。若條帶較暗或不特異，需要重新擴(kuò)增。引物序列如下：

F：5’-ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG-3’；

R：5’-TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA-3’。

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子。

PCR擴(kuò)增體系(10ul)：10倍PCR緩沖液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H₂0 6.78ul；

PCR擴(kuò)增熱循環(huán)：95℃2min；94℃10s，60℃30s，72℃1-3min；72℃5min，12℃hold。

異源錯(cuò)配雙鏈形成：99℃10min；70℃20s，-0.3℃per cycle，70cycles；12℃10min。

3、PCR產(chǎn)物純化

將步驟2獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到待酶切DNA樣品，純化的具體步驟如下：

(1)用在1倍體積的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2倍體積的Binding Buffer，翻轉(zhuǎn)充分混勻(對小于200bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5倍體積的Binding Buffer)得到混合液。

(2)將所述混合液加入DNA純化柱內(nèi)(如果溶液體積>700μl，分次轉(zhuǎn)移溶液)；室溫放置1-2min或更長時(shí)間。

(3)13,000g離心1min，棄廢液(目的DNA長度≤500bp時(shí)，離心結(jié)束后將收集管中的溶液再次轉(zhuǎn)入DNA純化柱中，離心)。

(4)在DNA純化柱中加入650ul Wash Buffer，13,000g離心30秒，棄廢液，將DNA純化柱放回收集管。

(5)重復(fù)步驟(4)。

(6)13,000g離心3min，以去除柱中殘余乙醇。

(7)將純化柱放入新的離心管中，向柱中加入在60℃預(yù)熱的30-50μl Elution Buffer或ddH₂O，室溫放置1-2min或更長時(shí)間。

三、酶切反應(yīng)

1、酶切緩沖液的配制

酶切緩沖液組成：10倍digestion buffer(含有Mg²⁺)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl₂；

2、酶切反應(yīng)

取2ul的待酶切DNA樣品作為酶切反應(yīng)底物，用上述酶切緩沖液進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物。

外源CEL I的酶切反應(yīng)體系(6ul)：10倍酶切緩沖液0.6ul、外源CELI(0.3mg/ml)0.2ul、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0ul、純水3.2ul。

內(nèi)源CEL I的酶切反應(yīng)體系(6ul)：10倍酶切緩沖液0.6ul、內(nèi)源CELI(0.3mg/ml)0.2ul、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0ul、純水3.2ul。

上述酶切反應(yīng)條件均為45℃溫育30min。

若酶切產(chǎn)物含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，則待酶切DNA樣品含有錯(cuò) 配位點(diǎn)(AC)；若酶切產(chǎn)物僅含有791bp的酶切片段，則待酶切DNA樣品不含有錯(cuò)配位點(diǎn)(AC)。

3、毛細(xì)管電泳檢測酶切效果

酶切反應(yīng)結(jié)束后立即加入2ul的0.225M的EDTA終止反應(yīng)(15ul體系應(yīng)加入3ul EDTA)，再補(bǔ)入91ul超純水稀釋樣品，可直接上機(jī)(FS 96，美國AATI公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，毛細(xì)管電泳條件如表1所示。

表1、毛細(xì)管電泳條件

結(jié)果如圖6所示：本發(fā)明獲得的外源CEL I-His與內(nèi)源CEL I酶效果相當(dāng)，酶切產(chǎn)物均分離得到大小為791bp、544bp和247bp的酶切片段，與待酶切DNA樣品中的錯(cuò)配位點(diǎn)(AC)一致，說明本發(fā)明獲得的外源CEL I酶與內(nèi)源CEL I酶的活性無差異。