專利名稱：半連續(xù)和連續(xù)酶促水解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及受保護(hù)的醇基團(tuán)，例如酯或氨基酸酯或磷酸酯基團(tuán)的區(qū)域選擇性酶促
水解的改進(jìn)方法。 W005/121162描述了通過在受保護(hù)的醇基團(tuán)的核糖部分的5'-基團(tuán)進(jìn)行選擇性水解而制備的某些D-呋喃核糖基化合物。然而，W005/121162描述的酶促水解方法本身對非均相反應(yīng)方法固有例如反應(yīng)時(shí)間長、水解的選擇性有限、每批需要大容器、數(shù)個(gè)過濾步驟和不易于回收酶等缺點(diǎn)。 本發(fā)明提供區(qū)域選擇性酶促水解的改進(jìn)方法，該方法克服了以前采用的區(qū)域選擇性酶促水解方法的許多缺點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明，出乎意料地發(fā)現(xiàn)通過對具有一個(gè)以上可水解基團(tuán)的底物進(jìn)行區(qū)域選擇性酶促水解的半連續(xù)或連續(xù)式方法，可實(shí)現(xiàn)較高的水解選擇性和較少的雜質(zhì)以及不良水解產(chǎn)物。此外，相對于以前采用的長時(shí)間、高成本、低處理量的間歇式方法，這種半連續(xù)或連續(xù)方法是長期而經(jīng)濟(jì)的解決之道。與例如W005/121162描述的方法相比，本發(fā)明方法可顯著縮短周期時(shí)間并盡可能降低對總?cè)萘啃阅艿偷挠绊憽＿@與處理量增加的大規(guī)模方法尤其相關(guān)。 因此，就其最寬的方面而言，本發(fā)明提供一種區(qū)域選擇性酶促水解包含一個(gè)以上可水解基團(tuán)的底物的方法，其中所述酶促水解以半連續(xù)或連續(xù)方式進(jìn)行。
在本發(fā)明的半連續(xù)或連續(xù)式方法中，通常使加成物的緩沖溶液流過固定化酶。本發(fā)明的術(shù)語"半連續(xù)"或"連續(xù)"指或多或少連續(xù)地(有間斷或沒有間斷)流過柱的過程。合適的停留時(shí)間后，加成物完全水解，該過程可原位監(jiān)測，例如通過對柱后收集并隨后提取的包含產(chǎn)物的溶液的pH監(jiān)測。半連續(xù)或連續(xù)式方法的關(guān)鍵參數(shù)需要依據(jù)例如底物、酶等獨(dú)立進(jìn)行調(diào)整，具體情況可憑經(jīng)驗(yàn)確定。這些參數(shù)包括，例如停留時(shí)間、柱的填料、最佳pH、溫度、加成物的濃度、有機(jī)溶劑的選擇。例如，可調(diào)整停留時(shí)間以使加成物達(dá)到最佳水解，即選擇性高并且轉(zhuǎn)化快，所述停留時(shí)間通常可以是O. l分鐘到300分鐘。例如，停留時(shí)間取決于酶活性、溫度、pH、溶劑體系，可調(diào)整停留時(shí)間從而能允許半連續(xù)或連續(xù)處理和最佳水解，如上所述。通常根據(jù)酶水解反應(yīng)所需的條件選擇pH和溫度。例如，pH可以介于，例如5-8，或者例如5. 5-7. 5之間。溫度可以在，例如15°C _70°C。 可利用適合于酶促反應(yīng)的任何緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液、銨緩沖液、碳酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液。 此外，為完全溶解加成物和產(chǎn)物，可利用合適的有機(jī)組分。典型的有機(jī)組分包括，例如丙酮、甲乙酮、甲基異丁基酮、甲醇、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、3-甲基-l-丁醇、2-甲氧基乙醇、2_乙氧基乙醇、叔丁基甲基醚、四氫呋喃、2_甲基四氫呋喃、二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、離子性液體、壓縮氣體，如二氧化碳、水等等，或它們的混合物。也設(shè)想了其它醇類、醚類、酮類。 此外，可利用添加齊U，例如來提高反應(yīng)速率。典型的添加劑包括，例如PEG(1% -10% ) 、 NaCl、 Na2S04、 FeCl3。可憑經(jīng)驗(yàn)確定這些添加劑的合適濃度，通?？梢允?. 05M-1M。為方便起見，可將添加劑加入加成物的溶液中。 將酶固定在物理支承物，例如固體支承物上。適合于本發(fā)明的固定化酶所用的物理支承物包括，例如柱、連續(xù)攪拌罐、填充床反應(yīng)器、膜式反應(yīng)器、膜。根據(jù)本發(fā)明可使用適 合于水解的任何酶，例如酯酶、水解酶、脂肪酶。 本發(fā)明方法的合適底物含有至少兩個(gè)可水解的基團(tuán)，S卩，例如兩個(gè)乙酸酯基、苯甲 酸酯基。這種基團(tuán)的典型例子是保護(hù)的醇基團(tuán)，例如酯基、氨基酸酯基、磷酸酯基。在一個(gè) 實(shí)施方式中，底物是吡喃糖苷或呋喃糖苷。 按照本發(fā)明的一方面，底物是通常由如以下式(1)_(21)所示的化合物(不具有立
體化學(xué)特性)
<formula>formula see original document page 8</formula>
式中R獨(dú)立地為H、烷基、羥基、羥基烷基、-NR' R〃、-SR〃 '、鹵代；R'禾口 R"獨(dú)立地為烷基、-SR〃 ' 、-S0R〃 ' 、-S02R〃 ' ；R"'獨(dú)立地為H、烷基、芳基；W獨(dú)立地為H、 -C(0)R^外消旋的、L-或D-氨基酸基團(tuán)-C(0)CH2NHR4、 -C(O)CH((V6烷基)NHW、磷酸酉旨基；R3是(V18烷基；R4是H、 -C (0) CH (C卜6烷基)NH2、或_C (0) CH (CH2-芳基)NH2 ;B是核堿基(皿cleobase) ;X、Y禾P Y'獨(dú)立地為_CH2_、—CHR' -、_CR' R〃 —或0、NR〃 ' 、S，其中R' 和R〃獨(dú)立地為烷基和R〃 '是H或烷基或CO (Z) ， Z是0-烷基或NH-烷基或N-烷基2 ;和 R2是H、 -C (0) CH ((V6烷基)NH2 、或-C (0) CH (CH2-芳基)NH2 。 本文所用的術(shù)語"烷基"包括具有直鏈、支鏈或環(huán)狀部分(包括稠合和橋連雙環(huán)和 螺環(huán)部分)或上述部分組合的飽和單價(jià)烴基團(tuán)。優(yōu)選的烷基的例子包括C卜w或(V12烷基。 芳基可以未取代或在任何位置取代。芳基通常有0、1、2或3個(gè)取代基。在另一優(yōu)選的實(shí)施 方式中，烷基是低級烷基，例如C卜e，更優(yōu)選(V4。特別優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁 基、仲丁基或叔丁基、正戊基或支化的戊基。烷基可以未取代或在任何位置取代。烷基通常 有0、1、2或3個(gè)取代基。 本文所用的術(shù)語"烯基"包括具有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的烷基部分，其中烷基如上 定義，包括所述烯基部分的E和Z異構(gòu)體。本文所用的術(shù)語"炔基"包括具有至少一個(gè)碳_碳 三鍵的烷基部分，其中烷基如上定義。 本文所用的術(shù)語"芳基"包括通過自芳烴除去一個(gè)氫而衍生的有機(jī)基團(tuán)，通常是 C6—w芳基。芳基可以未取代或在任何位置取代。所述芳基通常有0、1、2或3個(gè)取代基。典 型的例子包括苯基或萘基。 本文所用的術(shù)語"磷酸酯基"包括一個(gè)或多個(gè)磷酸酯基團(tuán)，例如-(HO(PO)OH) 邁-(HO(PO(OH))OH) ， m是0、1或2， n是0、 1、2、3、4、5。 本發(fā)明的烷基或芳基還可以進(jìn)一步取代，例如用一個(gè)或多個(gè)鹵素(F、Cl、Br、1)取 代基或一個(gè)或多個(gè)以下取代基取代氰基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、C「Ce烷基、C廠Ce烯 基、C2-C6炔基、羥基、CrC6烷氧基、_NH2、 -NH-烷基、-N(烷基)2、 -NH-芳基、-N(烷基)(芳 基)、-N(芳基)2、 -NHCHO、 -NHC (0)烷基、-NHC (0)芳基、-N(烷基)C (0) H、 -N(烷基)C (0) 烷基、-N(芳基)C(O)H、 -N(芳基)C(O)烷基、-朋0)2烷基、_^烷基)0)2烷基、-NHC(O) NH2 、 -N (烷基)C (0) NH2 、 -NHC (0) NH-烷基、-NHC (0) N (烷基)2 、 _N (烷基)C (0) NH-烷基、N (烷 基)C(0)N(烷基)2、 -NHS02-烷基、-N(烷基)S02-烷基、-C(O)烷基、-C(O)芳基、-OC(O) 烷基、-OC(O)芳基、-0)2-烷基、-0)2-芳基、-C02H、 -C(0)NH2、 -C(O)NH-烷基、-C(O)N(烷 基)2 、 -C (0) NH-芳基、-C (0) N (芳基)2 、 -C (0) N (烷基)(芳基)、-S (0)烷基、-S (0)芳基、_S02 烷基、_S02芳基、-S02NH2、 -S02NH-烷基和_S02N(烷基)2。
本文所用的術(shù)語"鹵素"或"鹵代"指F、 CI 、 Br或I 。 本發(fā)明中的術(shù)語"核堿基"指適合摻入核酸的任何堿基，例如W005/121162所示例 的。 在一個(gè)實(shí)施方式中，在有一個(gè)或多個(gè)受保護(hù)的可水解仲醇基團(tuán)，例如仲醇的酯存 在下，選擇性水解受保護(hù)的可水解伯醇基團(tuán)，例如伯醇的酯。 在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述呋喃糖苷是呋喃核糖基噻唑并[4，5_d]嘧啶。例如，合 適的化合物在W005/121162中描述，其涉及3-l3-D-呋喃核糖基噻唑并[4，5_d]嘧啶核苷。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物是W005/121162中的化合物89。
因此，在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述底物是式22所示的化合物
<formula>formula see original document page 10</formula> 式中 Rla、Rlb和Rlc獨(dú)立為H、-C (0) R3、外消旋的、L_或D_氨基酸基團(tuán)_C (0) CH2NHR4、_C (0) CH((V6烷基)NHW、或者Rlb和Rle共同為-C(O)-，它們與氧原子一起形成5-元碳環(huán)；
R2是H、 0R5、或N(R6)2 ;R3是C卜18烷基;R4是H、 _C (0) CH(Q—6烷基)NH2、或_C (0) CH(CH2-芳基)NH2 ;R5是獨(dú)立為H、 C卜6烷基、C3—7烯基、C3—7炔基、-(CR7R8) t (C6_C10芳 基)、-(CR7R8) t (C3-C1Q環(huán)烷基)、_ (CR7R8) t (C4-C1Q雜環(huán))、-(CR7R8) t >肌-(CR7R8) t > 。C02(V18烷基、和-(CR7R8) t > 。N (R9) C02(V18烷基、和S02 (芳基)，其中t是0-6的整數(shù)， 其中上述基團(tuán)的烷基、烯基、炔基、芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)部分任選被獨(dú)立選自下組的取代 基取代鹵素、氰基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、C「Ce烷基、C2_C6烯基、C2_C6炔基、羥 基、C「C6烷氧基、-NH2、 -NH-烷基、-N(烷基)2、 -NH-芳基、_N(烷基)(芳基)、-N(芳 基)2、 -NHCHO、 -NHC (0)烷基、-NHC (0)芳基、_N(烷基)C (0) H、 _N(烷基)C (0)烷基、_N(芳 基)C (0) H、 -N(芳基)C (0)烷基、-NHC02烷基、_N(烷基)C02烷基、-NHC (0) NH2、 _N(烷基) C (0) NH2 、 -NHC (0) NH-烷基、-NHC (0) N (烷基)2 、 _N (烷基)C (0) NH-烷基、N (烷基)C (0) N (烷 基)2、-NHS02-烷基、-N(烷基)S02-烷基、-C(0)烷基、-C(0)芳基、-OC(0)烷基、-OC(0)芳 基、-C02-烷基、-C02-芳基、-C02H、 -C (0) NH2、 _C (0) NH-烷基、_C (0) N (烷基)2、 _C (0) NH-芳 基、-C (0) N(芳基)2、 -C (0) N(烷基)(芳基)、-S (0)烷基、-S (0)芳基、-S02烷基、_S02芳 基、-502朋2、-502朋-烷基、和-S02N(烷基)2 ;R6獨(dú)立地為H、C卜6烷基、C3-Q。環(huán)烷基，或與氮 一起形成5-元或6-元雜環(huán)；R7和R8獨(dú)立為H、 C卜6烷基、C2—6烯基、或C2—6炔基；和R9是H、 (V6烷基、或_CH2-芳基；其中所述化合物包含至少兩個(gè)可水解基團(tuán)。 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式22所示的化合物，式中R2是H或者ORS，其中所 述化合物包含至少兩個(gè)可水解的基團(tuán)。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式22所示的化合物，式中Rla、 R"和Rk獨(dú)立地為 H、 -C(0)R3、外消旋的、L-或D-氨基酸基團(tuán)-C(O)CH((V6烷基)NH2 ;R2是OR5 ;R3是C卜18烷 基；R5獨(dú)立為C卜6烷基丄3—7烯基丄3—7炔基、-(CR7R8)t(C6-Q。芳基)、-(CR7R8)t(C4_C10雜環(huán))、 和-(CR7r8)。。N(R9)C0^—18烷基，除非另有表明，其中t是0-4的整數(shù)，其中上述基團(tuán)的烷 基、烯基、芳基和雜環(huán)部分任選被1-3個(gè)選自下組的取代基取代卣素、氰基、硝基、三氟甲 基、三氟甲氧基、C「C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、羥基、Q-Ce烷氧基、-C02-烷基、-co2-芳 基、-OC(0)烷基、和-OC(0)芳基；I^和R8獨(dú)立地為H、(V6烷基、或(:2—6烯基；和W是H、-CH3、 或-CH2CH3。 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式22所示的化合物，式中Rla、 R"和Rk獨(dú)立為 H、-C(0)R3 ;R2是H，且其中R3是低級烷基。在另一實(shí)施方式中，Rh、R113和Rlc為H、-C(0)R3 ; ^是H，且其中R3是低級烷基。 適合由本發(fā)明的連續(xù)方法區(qū)域選擇性水解的其它底物的例子包括<formula>formula see original document page 11</formula><formula>formula see original document page 12</formula>
和其它非對映體， 基、-NR'

<formula>formula see original document page 12</formula>
式中R如上定義；其中W、R^RS、RA和RS獨(dú)立地為H、烷基、羥基、羥基烷 R" 、SR〃 '、鹵素；其中R' 、R〃和R〃 '如上定義，其中B是核堿基。 實(shí)施例1
用Novozyme435填充柱
pH持續(xù)調(diào)節(jié)至6.3-6.5 約25 °C 2小時(shí)
在叔丁醇、磷酸緩沖劑的溶液中
給直徑lcm的濾器Nutsche裝載約1克極地假絲酵母(CandidaAntarctica)脂肪 酶Novozym 435。使加成物的溶液(約1克溶解于9mL叔丁醇和16mL pH 7. 0的磷酸鹽緩 沖液中)流過該濾器，流速約1. 6毫升/分鐘(約0. 2巴壓力)直至結(jié)束。用Na2HP04溶液 將過濾后混合物的pH持續(xù)維持在6.3-6.5。約2小時(shí)后反應(yīng)完成。隨后，容易地分離諸相， 用約20mL 2-甲基四氫呋喃萃取水相1次。用水洗滌合并的有機(jī)相l(xiāng)次，減壓濃縮得到粗 產(chǎn)物，其產(chǎn)率> 90%，具有< 1%的過度水解(over-hydrolysis)的副產(chǎn)物。
本發(fā)明的半連續(xù)或連續(xù)方法相對于例如W005/121162描述的分批方法具有多種 優(yōu)點(diǎn)，例如產(chǎn)率提高、反應(yīng)更快、可能連續(xù)進(jìn)行后處理、沒有太多的過濾、易于回收酶、處理 量增加、廢物減少，而且，更重要的是，選擇性提高并且盡可能減少了不良的單乙酸酯和三 羥基(tris-hydroxy)化合物的水解。采用W005/121162所述方法獲得粗產(chǎn)物，產(chǎn)率約為 90%，過度水解為3-5%，而采用連續(xù)或半連續(xù)方式可以獲得高于90%的產(chǎn)率以及小于1% 的過度水解副產(chǎn)物。
權(quán)利要求
一種區(qū)域選擇性酶促水解底物上的可水解基團(tuán)的方法，所述底物包含一個(gè)以上的可水解基團(tuán)，其中所述酶促水解以半連續(xù)或連續(xù)式方法進(jìn)行。
2. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述底物包含可水解的受保護(hù)伯和仲醇 基團(tuán)，并區(qū)域選擇性水解伯或仲酯基。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，底物的緩沖溶液以0. 1毫升/分鐘-50 毫升/分鐘，或0. 5毫升/分鐘-10毫升/分鐘的流速流過固定化酶。
4. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述底物是吡喃糖苷或呋喃糖苷。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述底物是<formula>formula see original document page 2</formula><formula>formula see original document page 3</formula>式中R獨(dú)立地為H、烷基、羥基、羥基烷基、-NR' R〃 、-SR〃 '、鹵代；R'和R〃獨(dú)立地 為烷基、-SR〃 ' 、-S0R〃 ' 、-S02R〃 ' ；R"'獨(dú)立地為H、烷基、芳基；R1獨(dú)立地為H、_C(0) W、外消旋的、L-或D-氨基酸基團(tuán)-C(0)CH2NHR4、 -C(O)CH((V6烷基州服4、磷酸酯基；R3是 (V18烷基；W是H、 -C(O)CH(C卜6烷基)NH2、或-C(0)CH(CH廠芳基)NH2 ;B是核堿基；X、 Y和 Y'獨(dú)立地為_CH2-、-CHR' -、-CR' R" -或0、NR" ' 、S，其中R'和R〃獨(dú)立地為烷基和 R〃 '是H或烷基或C0(Z)，Z是0-烷基或NH-烷基或N-烷基2 ;和I^是H、-C(0)CH(C卜6烷 基)NH2 、或-C (0) CH (CH2-芳基)NH2 。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述底物是<formula>formula see original document page 3</formula>式中Rla、Rlb和R^獨(dú)立地為H、-C(0)R^外消旋的、L-或D-氨基酸基團(tuán)-C1 (0) CH2NHR4、_C (0) CH((V6烷基)NHW、或者Rlb和Rle共同為-C(O)-，它們與氧原子一起形成5-元碳環(huán)；R2是H、 OR5、或N (R6) 2 ;R3是C卜18烷基;R4是H、 _C (0) CH (C卜6烷基)NH2、或_C (0) CH (CH2-芳 基)NH2 ;R5獨(dú)立地為H、(V6烷基丄3—7烯基丄3—7炔基、_ (CR7R8) t (C6-C1Q芳基)、-(CR7R8) t (C3_C10 環(huán)烷基)、_ (CR7R8) t (Q-Cw雜環(huán))、-(CR7R8) t > !OH、 - (CR7R8) t > oCO^—18烷基、和-(CR7R8)。。N(R9)C(^(V18烷基、和S0J芳基)，其中t是0-6的整數(shù)，其中上述基團(tuán)的烷基、烯基、 炔基、芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)部分任選被獨(dú)立地選自下組的取代基取代卣素、氰基、硝基、三 氟甲基、三氟甲氧基、C「Ce烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、羥基、C「Ce烷氧基、_NH2、 -NH-烷 基、-N (烷基)2 、 -NH-芳基、-N (烷基)(芳基)、-N (芳基)2 、 -NHCHO、 -NHC (0)烷基、-NHC (0) 芳基、-N(烷基)C(0)H、-N(烷基)C(0)烷基、-N(芳基)C(0)H、-N(芳基)C(0)烷基、-朋0)2 烷基、-N (烷基)C02烷基、-NHC (0) NH2 、 -N (烷基)C (0) NH2 、 -NHC (0) NH-烷基、-NHC (0) N (烷 基)2、 -N(烷基)C(O)NH-烷基、N(烷基)C(0)N(烷基)2、 _NHS02-烷基、-N(烷基)S02-烷 基、-C(0)烷基、-C(0)芳基、-OC(0)烷基、-OC(0)芳基、-0)2-烷基、-0)2-芳基、-0)211、-(:(0) NH2、 -C (0) NH-烷基、-C (0) N(烷基)2、 -C (0) NH-芳基、-C (0) N(芳基)2、 -C (0) N(烷基)(芳 基)、-S(0)烷基、-S(0)芳基、-S02烷基、-S02芳基、-S02NH2、-S02NH-烷基、和-S02N(烷基)2 ; R6獨(dú)立地為H、 C卜6烷基、C3-C1Q環(huán)烷基，或與氮一起形成5-元或6-元雜環(huán)；R7和R8獨(dú)立為 H、(V6烷基、(V6烯基、或C2—6炔基；和R9是H、C卜6烷基、或_CH2-芳基；其中所述化合物包含 至少兩個(gè)可水解的基團(tuán)。
7.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述底物是和對該酯在5'位進(jìn)行區(qū)域選擇性水解。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述底物是t7t^,0和其它非對映體<formula>formula see original document page 5</formula>
全文摘要
本發(fā)明涉及受保護(hù)的醇基團(tuán)，例如酯或氨基酸酯或磷酸酯基團(tuán)的區(qū)域選擇性酶促水解的半連續(xù)或連續(xù)式方法。本發(fā)明方法可用于，例如選擇性酶促水解具有一個(gè)以上的可水解基團(tuán)的吡喃糖苷或呋喃糖苷。
文檔編號C08B37/00GK101720333SQ200880021642
公開日2010年6月2日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月25日
發(fā)明者F·高魯, P·本尼 申請人:安那迪斯藥品股份有限公司