專利名稱：新的肽基α-羥基甘氨酸α-酰胺化裂合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有肽基a -羥基甘氨酸a -酰胺化裂合酶活性的分離多肽、用于制 備這樣的多肽的方法和這樣的多肽在用于產(chǎn)生C端a _酰胺化肽的方法中的用途。
背景技術(shù)：
在多細(xì)胞生物體中，某些肽(“前體”)，像神經(jīng)肽，是在一連串切割并進(jìn)一步修飾肽底 物來產(chǎn)生完整功能的生物反應(yīng)性肽的酶促步驟中翻譯后修飾的。該過程在反式_高爾基體 中開始并作為未成熟的分泌顆粒繼續(xù)。對(duì)于多數(shù)這類肽，非常重要的晚期翻譯后修飾是羧 基端的a酰胺化。C端殘基的a酰胺化對(duì)于參與人或動(dòng)物代謝的數(shù)種肽激素的活性是關(guān)鍵的。數(shù)種 肽激素現(xiàn)今被用作藥物治療人類(例如用于控制肥胖癥和/或糖尿病)或作為潛在藥物在 開發(fā)中。這種肽激素的一個(gè)實(shí)例是胰淀粉樣肽(例如Symlin ，醋酸普蘭林肽，其為人胰淀 粉樣肽的類似物)。人胰淀粉樣肽是37個(gè)氨基酸殘基的肽，其可用于治療或預(yù)防肥胖癥和 /或糖尿病。因此，為了獲得完整生物學(xué)活性，胰淀粉樣肽的C端需要被酰胺化。同樣地肽 YY (PYY)應(yīng)該被a酰胺化以獲得完整生物學(xué)活性。大腸桿菌(￡ co7i)和酵母被廣泛用于真核生物來源的肽的重組表達(dá)。然而，由 于C端a _酰胺基的性質(zhì)，使用基于大腸桿菌和酵母的現(xiàn)有技術(shù)微生物表達(dá)系統(tǒng)不能將肽 激素表達(dá)為活性形式，因?yàn)閍酰胺化酶在這些生物體中不能被天然表達(dá)。因此，C端a酰 胺必須被引入到重組表達(dá)肽中，這使用例如具有a酰胺化酶的離體修飾。在數(shù)種真核生物體中發(fā)現(xiàn)，憑借雙功能肽基a-酰胺化單加氧酶(PAM)將具有C 端Gly的肽前體酶修飾為a-酰胺。關(guān)于該酶，已描述了多種編碼不同同工型的可變剪接 轉(zhuǎn)錄物變體。關(guān)于多細(xì)胞生物體，已專門描述該酶(Metazoa)。將肽中C端Gly殘基轉(zhuǎn)化為 a-酰胺是兩步過程，其中PAM的N端結(jié)構(gòu)域(命名為PHM)催化甘氨酸轉(zhuǎn)化為a _羥基甘 氨酸，然后PAM的C端結(jié)構(gòu)域(命名為PAL)催化a -羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為a -酰胺。在真核 生物體中，兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域順序工作來催化神經(jīng)內(nèi)分泌肽為活性a-酰胺化產(chǎn)物。在來自 真核生物體的PAL結(jié)構(gòu)域中，兩條二硫橋是高度保守的。雖然通過化學(xué)方法合成包含C末端上酰胺基(a酰胺)的小肽是可能的，但是產(chǎn) 生較大的a-酰胺化肽是困難和昂貴的。因此，a酰胺化酶可用于轉(zhuǎn)化重組前體肽為成熟 肽。US4708934描述從甲狀腺髓樣癌細(xì)胞系和組織樣品中提取的肽基-甘氨酸a -酰 胺化單加氧酶。US5789234描述通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生a -酰胺化酶。W090/08194涉及一種用于通過使用真核生物C端a酰胺化酶從前體肽產(chǎn)生C端 a酰胺化肽的方法。還描述了一種用于真核表達(dá)這些C端a酰胺化酶的方法。W089/02460描述一種牛來源的PAM酶、其克隆、cDNA和通過重組DNA技術(shù)的表達(dá)。EP0448513描述一種用于重組表達(dá)來源于非洲爪蟾Cfeflo/ws Lae vis)的肽基甘 氨酸a-羥化單加氧酶的方法，其包括培養(yǎng)用重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞來產(chǎn)生該酶，其中編碼肽基甘氨酸a-羥化單加氧酶的DNA已摻入到重組桿狀病毒中。EP0465404描述一種來源于非洲爪蟾的酶(PHL ；PAL)、酶的克隆及其在昆蟲細(xì)胞 中的重組表達(dá)，該酶催化切割在C端a-羥化肽的a-羥基甘氨酸部分中的N-C鍵。US 20060292672描述一種用于表達(dá)PAM或其兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)的細(xì)胞系。EP2172550描述一種重組C端a -酰胺化酶衍生物，其不形成來源于非洲爪蟾的C 端a-酰胺化酶中通常存在的5個(gè)二硫鍵中的至少1個(gè)，和描述一種在大腸桿菌中重組產(chǎn) 生所述衍生物的方法，其中獲得的包含體是增溶的并經(jīng)歷重折疊步驟。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及新的酶，其能夠催化肽中a-羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為a-酰胺(肽基a-羥基 甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性)。新的肽來源于原核生物體并具有與對(duì)真核生物PAL酶所述的不同的物理化學(xué)和 結(jié)構(gòu)特性。因此，本發(fā)明提供具有肽基- a _羥基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征 在于它們來源于原核生物體。本發(fā)明還提供具有肽基-a _羥基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征在于 它們?cè)诖竽c桿菌中可被表達(dá)為可溶性酶促活性蛋白。本發(fā)明還提供具有肽基-a _羥基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其特征在于 它們具有不包含半胱氨酸殘基或者包含至多1或至多2個(gè)半胱氨酸殘基的氨基酸序列。本發(fā)明還提供一種具有肽基-a _羥基甘氨酸a -酰胺化裂合酶活性的酶，其特征 在于其可通過包括以下步驟的方法產(chǎn)生a)在適合于酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組大腸桿菌 菌株宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含含有編碼酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體；和(ii)在宿主細(xì)胞破 碎和離心后從上清液中回收酶。本發(fā)明還提供能夠催化肽中a-羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為a-酰胺的酶，其中所述酶具 有包含下述基序(命名為基序1)的氨基酸序列
Xaax Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gin Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Gly Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trp ;其中XaafXaa^獨(dú)立選自天然存在氨基酸,條件是Xaa: 和Xaa7不是Cys。本發(fā)明還提供能夠催化肽中a-羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為a-酰胺的酶，其中所述酶具 有包含下述基序(命名為基序2)的氨基酸序列
Asp Gly Tyr Xaa17 Asn Xaa18 Arg Xaa19 Xaa20 Xaa21 Phe Xaa22 Xaa23 Xaa24 Gly Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32 Xaa33 Gly Xaa34 Xaa35 Xaa36 Gly Xaa37 Phe ;其中 Xaa17-Xaa37獨(dú)立選自天然存在氨基酸,條件是Xaa17不是Cys。本發(fā)明還提供具有肽基_ a -羥基甘氨酸a _酰胺化裂合酶活性的酶，其包含與 選自以下序列的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列(a) SEQ ID NO: 1的氨基酸 2-306 ； (b) SEQ ID NO: 2 的氨基酸3-336 ; (c) SEQ ID NO: 3 的氨基酸3-305 ; (d) SEQ ID NO: 4 的氨基酸3-279 ; (e) SEQ ID NO: 19 ； (f) SEQ ID NO: 20 ； (g) SEQ ID NO: 21 ； (h) SEQ ID NO: 22 和(i) SEQ ID NO: 23。本發(fā)明另外提供本發(fā)明的酶在用于通過催化肽中C端a-羥基甘氨酸殘基轉(zhuǎn)化 為a-酰胺殘基來制備a-酰胺化肽的方法中的用途。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的酶產(chǎn)生α-酰胺化肽的方法。此外，本發(fā)明涉及一種用于通過提供編碼本發(fā)明酶的分離核酸、包含 核酸的載體和宿主細(xì)胞由重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明酶的方法。


圖I :質(zhì)粒C的典型pETlla載體圖譜,其編碼來自赤細(xì)菌屬(Erythrobacter)的 細(xì)菌PAL樣結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: I)(不具有預(yù)測(cè)的信號(hào)肽)和N端融合伴侶(SEQ ID NO: 7)以及介于中間的接頭區(qū)(SEQ ID NO: 8)中的HRV14 3C蛋白酶切割位點(diǎn)(用特征蛋白3 標(biāo)記整個(gè)融合蛋白)。描繪了 Ndel、XhoI和BamHI限制酶位點(diǎn)。T7啟動(dòng)子區(qū)、氨芐青霉素 抗性基因、IacI阻抑區(qū)和復(fù)制起點(diǎn)位點(diǎn)也在載體圖譜中示出。圖2 :SDS-PAGE，顯示加上RL9_THEMA TAP標(biāo)簽的赤細(xì)菌屬PAL樣結(jié)構(gòu)域(A)和 大鼠PAL (B)的表達(dá)概況。Uind :未誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)照(陰性對(duì)照)，Ind :在30°C用 O. 5mM IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)后，Sup :可溶性級(jí)分，Pel :不溶性級(jí)分。箭頭指示凝膠上PAL條帶 的分子量位置。雖然表達(dá)水平是可比的，但是赤細(xì)菌屬PAL樣結(jié)構(gòu)域被表達(dá)為高度可溶性蛋白， 相比之下大鼠PAL被表達(dá)為不溶的并將需要重折疊來獲得功能性酶。圖3 :A =FPLC色譜圖，顯示加上RL9_THEMA標(biāo)簽的赤細(xì)菌屬PAL樣結(jié)構(gòu)域的SP Sepharose FF純化概況。用箭頭所示的約O. 25 M濃度的NaCl洗脫融合蛋白。虛線表示電 導(dǎo)率曲線，實(shí)線表示在280nm的UV吸收信號(hào)。在X軸上的數(shù)字表示級(jí)分和ml。B =SDS-PAGE凝膠，顯示來自圖3A色譜圖上主峰的級(jí)分。Apl :裝載到柱子上的裝 載物(application), Ft :流通級(jí)分。在一個(gè)陽離子交換色譜步驟后，TAP標(biāo)簽提供有效的 捕獲和高純度。圖4A :FPLC色譜圖，顯示用HRV14 3C蛋白酶加工融合蛋白后，釋放RL9_THEMA標(biāo) 簽的成熟微小桿菌屬(Exiguobacterium) PAL樣結(jié)構(gòu)域的Q Sepharose HP分離。以箭頭 所示的約0.4M NaCl洗脫主峰。虛線表示電導(dǎo)率曲線，實(shí)線表示在280nm的UV信號(hào)。在X 軸上的數(shù)字表示級(jí)分和ml。圖4B :來自圖4A所示的FPLC分離的洗脫級(jí)分的SDS-PAGE分析。圖4A. Apl :裝 載到柱子上的裝載物，F(xiàn)t:流通級(jí)分。在裝載物泳道中，兩條條帶代表成熟微小桿菌屬PAL 樣結(jié)構(gòu)域(約30 kDa)和釋放的純化標(biāo)簽(約18 kDa)。來自純化的主峰幾乎只包括成熟 PAL (實(shí)箭頭)，而釋放的TAP標(biāo)簽不結(jié)合陰離子交換柱并在流通級(jí)分中存在(虛箭頭)。圖5 :分別代表α -羥基甘氨酸(Gly (OH))和α -酰胺(-ΝΗ2)(在相關(guān)峰下標(biāo)記) 的合成的α-羥基苯甲酰甘氨酸和苯甲酰胺的UPLC分析。用在N端具有或不具有TAP標(biāo) 簽的細(xì)菌PAL樣酶加上相關(guān)輔因子在37°C孵育α-羥基苯甲酰甘氨酸3小時(shí)。加粗箭頭指 示最顯著的酶促轉(zhuǎn)化為苯甲酰胺。圖5. A :使用酸性(MES ρΗ5. 5)或堿性(Tris ρΗ7. 5)緩沖條件測(cè)試的具有(+TAP) (SEQ ID NO: 7)或不具有(-TAP)純化標(biāo)簽的赤細(xì)菌屬PAL樣結(jié)構(gòu)域的分析。陰性(neg.) 對(duì)照(ctrl)是不加入酶的樣品的色譜圖。α羥基苯甲酰甘氨酸轉(zhuǎn)化為苯甲酰胺可在如之 前文獻(xiàn)所述的高PH (圖5A 6/7)下自發(fā)發(fā)生。然而，從α-羥基苯甲酰甘氨酸和苯甲酰胺 底物峰面積的相對(duì)面積得出的結(jié)論是，加入酶可催化轉(zhuǎn)化，具有(圖5Α 2/7)和不具有TAP 標(biāo)簽(圖5Α 4/7)兩者都在ρΗ7. 5時(shí)最有效。
g 5. B(MES pH5. 5) iMfê (Tris pH7. 5)W W (+TAP)(SEQ ID NO: 7) W'ê'itêifflii {Chthoniobacter) PAL faille°
( S 5B 3/7)
pH5. 5( 53 5B1/7) o 6MS if, Mìi^XWL PHM MWüEmnn PAL PAL f fêo X $é -.MMVC, tM/l^i+o Y $é :MS AfMMm MS tfltWM i#1; 0íf#JttXíM ( c M Gly f m ) : 13934, 66 Da, a -C a -) =13951 Da, a - fM : 13876. 62Da
AB :ia! PHM mil (2 /W ), C(Planctomyces) PAL #
^ ssio (2/Jnw),d:^mmmpMn^niá, ú3 (2/m),e:# mpal10 (5/JnBí ),F:^MPAL#^}| )j|!c,Sá 3 (5 /jNftf ) 0M7 :^m^HìèMMPALW^fàià (SEQ ID NO: 1-4) W MitW C m a ^
sttMmM#w^#iíWíi ^íRMsif0 x$éy$é -Msmm
MS tfltWM ie^dj ; a -^ c M a - H
sttMn-.m 4023Da) mm -im (^39490a)
(w/w) A(SEQ ID NO: 1) i) PHM &bSéftXtM (etri), ii) 1:1250, iii)1:500, iv) 1:100
B :i￥ J^ M (SEQ ID N0: 4) i) PHM(etri), ii) 1:1250, iii) 1:500,
iv) 1:100
C:^±fêiffl (SEQ ID NO: 3) i) PHM&b I Mj (etri), ii) 1:100, iii) 1:50,iv) 1:25
D MA'IftMM (SEQ ID NO: 2) i) PHM&b I Mj (etri), ii) 1:100, iii) 1:50,iv) 1:25
aX
rnvfummmta-iMw^t^êBio
2-imBi>iís a -im bsa -m^p - -f-mvfum a-m
mm^m*“PHM”^“JftSttM
PHMW Wi&W2-a-llftl
MBIJiSttM a -a -a - mtmü
üBSa -EC 1. 14. 17. 3 SttMS^Pl ^ffffiatl“PALS|,V<PAL,,sK“Jte -aa
ita -!M o PALa
$1tMSmMit $BS>HGAD,PGL4. 3. 2. 5
mmviumn-c(phlk palsiw^ tm^ d) m mit cm
R-Gly (OH) - R-NH2R JéfljL g S0
本文所用的表述“本發(fā)明的酶”意指具有肽基_ a -羥基甘氨酸a -酰胺化裂合酶 活性的本發(fā)明多肽。非肽底物(例如a -羥基苯甲酰甘氨酸)也充當(dāng)PAL的底物。術(shù)語“PAL樣”意指與已知真核生物PAL酶具有相同活性的酶。“靶肽”意指在a -酰胺化過程中被修飾而獲得C端a _酰胺基的肽。靶肽應(yīng)該在 C端中包含Gly殘基。靶肽可被描述為具有式R’ -X-Gly，其中X代表任何氨基酸且X是將 被轉(zhuǎn)化為氨基酸酰胺的氨基酸，即對(duì)于該氨基酸，在酶促a-酰胺化過程反應(yīng)中-C00H被 轉(zhuǎn)化為C0-NH2，R’代表肽的剩余部分，和Gly代表C端甘氨酸殘基。靶肽的一個(gè)實(shí)例是胰淀粉樣肽前體，其除了胰淀粉樣肽序列外還在C端包含Gly 殘基。與本發(fā)明相關(guān)的Gly-延伸肽前體的其他非限制性實(shí)例包括神經(jīng)肽Y (NPY)、肽 YY (PYY)、PYY-3-36、胰多肽(PP)、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、胃泌素、降鈣素、降鈣素相關(guān) 肽(CGRP)、胃泌素釋放肽、加壓素、催產(chǎn)素、神經(jīng)激肽A、胰泌素、胰抑釋素、阿黑皮質(zhì)素原 (POMC)、a-促黑素細(xì)胞激素(a MSH)、Y _促黑素細(xì)胞激素(Y 1MSH)和酰胺化鉸鏈肽 (HP-N)，或者它們的功能類似物。本文所用的術(shù)語“分離的多肽”或“分離的多核苷酸”指的是從其天然來源分離的 多肽或多核苷酸。本文所用的術(shù)語“純化”或“回收”指的是從樣品中移除污染物。例如，本發(fā)明的 PAL酶是通過移除溶液或制品中的污染蛋白和其他化合物純化。在一些方面，使用細(xì)菌表達(dá) 本發(fā)明的PAL酶，并通過移除其他宿主細(xì)胞成分來純化這些重組PAL酶，從而增加樣品中重 組PAL的百分比。術(shù)語“實(shí)質(zhì)上純的多肽”在本文中指，多肽制品包含至多20%、至多10%或至多5% 重量的與其天然或重組締合的其他多肽材料。因此，以制品中存在的總多肽材料的重量計(jì)， 優(yōu)選實(shí)質(zhì)上純的多肽是至少80%純、至少90%純或優(yōu)選至少95%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選為 實(shí)質(zhì)上純的形式，即多肽制品基本上不含與其天然或重組締合的其他多肽材料。這可例如 通過公知的重組方法或通過經(jīng)典的純化方法制備多肽來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)方面，“％純度”定義為目標(biāo)蛋白的量/(目標(biāo)蛋白的量+宿主細(xì)胞污染物的 量)X 100。其可通過SDS-PAGE分析或確定量的HPLC分離來確定。在一個(gè)方面，本發(fā)明多肽為至少1%純，例如至少5%純、至少10%純、至少20%純、 至少40%純、至少60%純、至少80%純、至少90%純。本文使用的關(guān)于本發(fā)明多肽的術(shù)語“回收”意指，在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽/酶不 與顯著水平(例如，至多1%、至多2%、至多3%、至多5%、至多10%或至多25%)的產(chǎn)生多肽的 系統(tǒng)(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物)內(nèi)所包含的任何外來和不合需要的生物分子締合?；厥盏亩嚯?指的是，由于人類干預(yù)(不管是自動(dòng)、手動(dòng)還是兩者)而通過純凈階段的本發(fā)明的多肽。應(yīng) 當(dāng)理解，在組合物中存在的本發(fā)明的回收多肽和本發(fā)明的分離多肽也在本發(fā)明內(nèi)。換言之， 術(shù)語“回收”或“分離”并不意在排除有其他化合物或材料的人工或合成混合物。本文可交換使用術(shù)語“蛋白”、“肽”和“多肽”。其中肽是蛋白的一部分，本領(lǐng)域技 術(shù)人員理解該術(shù)語在上下文中的使用。本文可交換使用表述“本發(fā)明的酶”和“本發(fā)明的多 肽”。氨基酸序列的“修飾”意指，在序列中置換、缺失和/或添加(包括插入)一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在另外的方面中，它也包括一條或多條氨基酸側(cè)鏈的置換。術(shù)語“表達(dá)載體”本文定義為這樣的線性或環(huán)狀DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽 的多核苷酸，并與提供其表達(dá)的另外的核苷酸有效連接。術(shù)語“質(zhì)?！?、“表達(dá)載體”和“載體” 可交換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是目前最常用的載體形式。然而，本發(fā)明旨在包括這樣的起等價(jià)功能 的其他形式的表達(dá)載體。本文使用的“表達(dá)載體”或“載體”指的是這樣的DNA構(gòu)建體，其包 含與能夠影響DNA在合適宿主中表達(dá)的合適控制序列有效連接的DNA序列。這樣的控制序 列例如可包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、控制這種轉(zhuǎn)錄的任選的操縱基因序列、編碼合適mRNA核 糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體例如可為質(zhì)粒、噬菌體或僅潛在 的基因組插入片段。一旦轉(zhuǎn)化到合適宿主中，載體可例如復(fù)制并獨(dú)立于宿主基因組起作用， 或在一些實(shí)例中可將其自身整合到基因組中。兩條氨基酸序列之間的關(guān)聯(lián)性由參數(shù)“同一性”(“％同一性”)描述。在本發(fā)明氨 基酸序列的上下文中，同一性可通過任何合適的技術(shù)/程序確定，通常通過使用具有起始 空位罰分為-12和延伸罰分為-2的BL0SUM50評(píng)分矩陣的Needleman-Wunsch比對(duì)分析(參 見 Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453)確定。使用 Needle 標(biāo)記 的“最長同一性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的輸出，百分比同一性可如下計(jì)算(相同的 殘基X 100)/(比對(duì)的長度-比對(duì)中空位的總數(shù))。因?yàn)镹eedleman-Wunsch比對(duì)提供兩 條序列之間的總體或全局同一性測(cè)定，所以應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，靶序列(其可為較大肽序列的部 分或子序列)可以類似于完整序列的方式應(yīng)用，或備選地，可將局部比對(duì)值用于評(píng)估子序 列之間的關(guān)系，例如通過 Smith-Waterman 比對(duì)(J. Mol. Biol. (1981) 147:195-197)確 定，其可通過可得的程序獲得。適合于分析同一性的其他局部比對(duì)方法可包括應(yīng)用啟發(fā)式 局部比對(duì)算法的程序，例如FastA和BLAST程序。當(dāng)本文使用的術(shù)語“編碼序列”意指核苷酸序列時(shí)，其直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基 酸序列。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框確定，開放閱讀框通常以ATG起始密碼子或備 選起始密碼子(例如GTG和TTG)開始并以終止密碼子(例如TAA、TAG和TGA)結(jié)束。編碼 序列可為DNA、cDNA、合成或重組核苷酸序列。術(shù)語“cDNA”本文定義為可通過逆轉(zhuǎn)錄從獲自 真核細(xì)胞的成熟、剪接mRNA分子中制備的DNA分子。cDNA沒有通常存在于相應(yīng)基因組DNA 中的內(nèi)含子序列。最初的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其在成為成熟剪接mRNA之前通 過一系列的步驟加工。這些步驟包括通過稱為剪接的過程移除內(nèi)含子序列。cDNA來源于 mRNA,因此沒有任何內(nèi)含子序列。術(shù)語“編碼…的核酸分子”、“編碼…的核酸序列”、“編碼…的DNA序列”和“編碼… 的DNA”指的是，沿著一連串脫氧核糖核酸的脫氧核糖核苷酸的順序或序列。這些脫氧核糖 核苷酸的順序決定沿著蛋白鏈的氨基酸的順序。DNA序列因此編碼蛋白(例如酶)的氨基 酸序列。本文使用的術(shù)語“核酸構(gòu)建體”指的是單鏈或雙鏈的核酸分子，其從天然存在基因 中分離，或者其經(jīng)修飾而以非天然方式包含核酸區(qū)段，或者其為合成的。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含 表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的控制序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。術(shù)語“有效連接”在本文中指一種結(jié)構(gòu)，其中控制序列位于相對(duì)于多核苷酸序列的 編碼序列的合適位置，使得控制序列指導(dǎo)多肽的編碼序列的表達(dá)。術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多 肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括例如轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。本文與從給定來源(即生物體)中衍生的多肽或多核苷酸相關(guān)地使用的術(shù)語“來源于”意指，與來源生物體相比，多核苷酸(編碼多肽的多核苷酸)與該來源生物體中天然 存在的多核苷酸序列相同或?yàn)槠渥凅w，而不管該多核苷酸序列是否已被插入到另一生物體 中或者該多肽由另一生物體產(chǎn)生?！皝碓从凇痹诒景l(fā)明的上下文中還意指“從…中鑒定”?！皝?源于”在本發(fā)明的上下文中還意指用細(xì)菌核苷酸/蛋白序列從數(shù)據(jù)庫中鑒定本發(fā)明的酶，即 通過在蛋白數(shù)據(jù)庫(例如Uniprot、trEMBL或RefSeqP)中進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助檢索。本文在本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語野生型意指，其天然存在的形式(例如基因 或蛋白序列)。也包括由通過在包括細(xì)菌核苷酸/蛋白序列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫中檢索而推測(cè)的 核苷酸序列所編碼的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語野生型包括不具有信號(hào)肽和前導(dǎo)肽的 肽序列。本文使用的術(shù)語“成熟”(本發(fā)明的酶、多肽或氨基酸序列)意指，推定的多肽最小 功能序列，其中未添加天然或人工氨基酸延伸(例如信號(hào)肽或融合伴侶)。本文使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括，具有包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá) 載體的易受轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等影響的任何細(xì)胞類型。表述“純化標(biāo)簽”意指，在酶的N或C端與酶融合并用于純化該酶的肽序列。表述“TAP”標(biāo)簽指的是來源于嗜熱細(xì)菌的熱穩(wěn)定堿性蛋白標(biāo)簽，當(dāng)其與酶的肽序 列在N或C端融合時(shí)可用于純化該酶，如在以編號(hào)W0 2006/108826和W0 2008/043847公 布的國際專利申請(qǐng)中所揭露。表述“融合酶”、“融合蛋白”或“加上標(biāo)簽的酶”意指具有與酶的C端或N端連接 的“融合伴侶”的酶。融合伴侶的一個(gè)實(shí)例是蛋白標(biāo)簽，其可增加融合蛋白的表達(dá)水平、溶 解度或純化。表述“接頭”意指將融合伴侶(例如純化標(biāo)簽)和酶連接在一起的氨基酸序列。接 頭序列可例如包括促進(jìn)靶蛋白更好折疊的序列和/或用于切除純化標(biāo)簽的切割位點(diǎn)?！奥菪Y(jié)構(gòu)”的特征在于具有導(dǎo)致由鏈間氫鍵穩(wěn)定的卷曲結(jié)構(gòu)的氨基酸序列?！埃ト芙舛取倍x為，來自宿主細(xì)胞裂解物的可溶性蛋白的量/ (來自宿主細(xì)胞裂解 物的可溶性+不溶性蛋白的量)X 100。它可通過基于SDS-PAGE分析來比較細(xì)胞裂解物的 不溶性和可溶性級(jí)分而確定。在本上下文中，術(shù)語“功能性酶”意在表示與天然酶具有相似功能的蛋白。蛋白可 與天然酶結(jié)構(gòu)上相似并通過如下方式衍生自天然酶向天然酶的C端和N端之一或兩者中 添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在天然氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)上置換一個(gè)或多個(gè)氨 基酸，或在天然酶的一端或兩端或者在氨基酸序列中的一個(gè)或數(shù)個(gè)位點(diǎn)上缺失一個(gè)或多個(gè) 氨基酸，或在天然氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸?！把b載物”意指裝載在純化柱上的包含酶的樣品?！傲魍ā币庵覆慌c純化柱結(jié)合的 包含宿主細(xì)胞蛋白和污染物的部分裝載物?！爸鞣濉敝傅氖蔷哂凶顝?qiáng)UV強(qiáng)度并包含蛋白的 純化色譜圖中的峰?！癿AU”是毫吸光度單位?！癠V280強(qiáng)度”是以毫吸光度單位計(jì)量的在 280nm波長下的吸光度，在該波長下蛋白將吸收。“IPTG”是異丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖 苷。SDS-PAGE是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。FPLC (快速蛋白液相色譜)是類 似于高效液相色譜(HPLC)的一種液相色譜形式，其用于從復(fù)雜混合物中分離或純化蛋白。 LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜)是結(jié)合液相色譜(或HPLC)的物理分離能力和質(zhì)譜的質(zhì)量分析 能力的分析技術(shù)。
氨基酸在本上下文中，3字母或1字母表示的氨基酸用作如表1中所示的其常規(guī) 意思。除非明確指出，本文提及的氨基酸為L-氨基酸。另外，除非另外指定，肽的氨基酸序 列的左端和右端分別是N端和C端。表1 :氨基酸的縮寫
權(quán)利要求
1.一種能夠催化a-羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為a-酰胺的分離多肽，其中所述多肽包含含有下述基序I的氨基酸序列Xaa1 Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gln Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 GlyXaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trp ；中 、Xb&2、、XBBg'* 、XBBg、XBBg^、Xaa15和Xaa16獨(dú)立選自天然存在氨基酸,條件是Xaa1和Xaa7不是Cys。
2.一種能夠催化a-羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為a-酰胺的分離多肽，所述多肽選自 (a)包含與SEQID NO: I的氨基酸2-306有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽； (b)包含與SEQID NO: 2的氨基酸3-336有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽； (c)包含與SEQID NO: 3的氨基酸3-305有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽； (d)包含與SEQID NO: 4的氨基酸3-279有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽；和 (f)具有肽基-a-羥基甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性的多肽，其特征在于它具有不包含半胱氨酸殘基或者包含至多I個(gè)或至多2個(gè)半胱氨酸殘基的氨基酸序列。
3.一種具有肽基-a-羥基甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性的分離多肽，其特征在于它在大腸桿菌中可被表達(dá)為可溶性蛋白。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽,其包含0、1或2個(gè)半胱氨酸殘基。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽，所述多肽來源于原核生物體。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)能夠催化a-羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為a -酰胺的多肽，其中所述a -羥基甘氨酸是式R-Gly (OH)的C端a -羥基甘氨酸，其中R是肽，Gly (OH)是與所述肽的C端連接的a-羥基甘氨酸殘基，和 其中所述a -酰胺具有式R-NH2。
7.一種用于產(chǎn)生具有肽基-a-羥基甘氨酸a-酰胺化裂合酶(PAL)活性的酶的方法，其包括以下步驟 a)在適合于酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)非哺乳動(dòng)物來源的重組表達(dá)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含含有編碼酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體；和 (ii)從(a)細(xì)胞破碎和離心后的上清液和/或(b)生長培養(yǎng)基中回收酶 其中宿主細(xì)胞為非哺乳動(dòng)物來源，例如大腸桿菌菌株，且其中當(dāng)在步驟(ii)中回收時(shí)，所述酶是可溶的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中當(dāng)在步驟(ii)中回收時(shí)，酶是催化活性形式，意指酶不需要重折疊的步驟來獲得催化活性。
9.一種分離多肽，其為可通過權(quán)利要求7或8的方法獲得的具有肽基-a-羥基甘氨酸a -酰胺化裂合酶活性的酶，其中所述酶能夠催化反應(yīng)R-Gly(OH) — R-NH2, 其中R是肽，Gly(OH)是與所述肽的C端連接的a -羥基甘氨酸殘基。
10.權(quán)利要求9的多肽，其進(jìn)一步通過權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)表征。
11.一種用于產(chǎn)生具有肽基-a-羥基甘氨酸a-酰胺化裂合酶活性的酶的方法，其包括在適合于產(chǎn)生所述酶的條件下維持重組表達(dá)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含含有編碼權(quán)利要求1-6或權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列的重組核酸。
12.權(quán)利要求1-6或權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)的多肽用于催化肽中C端a-羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為a-酰胺的用途。
13.一種用于產(chǎn)生a-酰胺化肽的方法，其包括 a)在適合于酶促活性的條件下，使得具有c端甘氨酸殘基的靶肽能夠與肽基甘氨酸a -羥化單加氧酶(PHM)和權(quán)利要求1-6或權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)的多肽兩者反應(yīng),其中用所述PHM和所述多肽對(duì)所述靶肽進(jìn)行的反應(yīng)在兩個(gè)單獨(dú)的步驟中或同時(shí)進(jìn)行； (ii)回收C端a-酰胺化肽。
14.權(quán)利要求12的用途或權(quán)利要求13的方法，其中回收的a-酰胺化肽被用作藥物。
15.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述肽選自胰淀粉樣肽、神經(jīng)肽Y(NPY)、肽YY (PYY)、PYY-3-36、胰多肽(PP)、胰高血糖素樣肽(GLP-I)、胃泌素、降鈣素、降鈣素相關(guān)肽(CGRP)、胃泌素釋放肽、加壓素、催產(chǎn)素、神經(jīng)激肽A、胰泌素、胰抑釋素、阿黑皮質(zhì)素原(POMC)、a -促黑素細(xì)胞激素(a MSH)、y -促黑素細(xì)胞激素(Y 1MSH)和酰胺化鉸鏈肽(HP-N)，或者它們的功能類似物。
全文摘要
本發(fā)明申請(qǐng)涉及能夠催化α-羥基甘氨酸轉(zhuǎn)化為α-酰胺的酶以及這樣的酶用于產(chǎn)生C端α-酰胺化肽的用途。
文檔編號(hào)C07K14/195GK102666570SQ201080054717
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者A.C.肖 申請(qǐng)人:諾沃—諾迪斯克有限公司