專利名稱：：改進的神經(jīng)營養(yǎng)因子分子的制作方法改進的神經(jīng)營養(yǎng)因子分子相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年10月30日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/256352的權(quán)益，所述專利的完整內(nèi)容通過引用的方式并入。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及開發(fā)和使用增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其擁有降低的肝素和硫酸乙酰肝素結(jié)合親和力，但是仍保持神經(jīng)營養(yǎng)活性；編碼所述神經(jīng)營養(yǎng)因子變體和載體的核酸以及表達增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的宿主細胞。另外，本發(fā)明也包括所述增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽、核酸和宿主細胞在治療疾病中的用途。神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)家族配體(GFLs)是TGF-P超家族的遠親成員，它們是體外強有力的神經(jīng)營養(yǎng)因子并且對于體內(nèi)不同神經(jīng)元群體的發(fā)育是重要的(Airaksinen,M.S.等人，(1999)“GDNFfamilyneurotrophicfactorsignalingfourmasters,oneservant(神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)家族神經(jīng)營養(yǎng)因子信號傳導四個主導，一個從屬？)"Mol.Cell.Neurosci.13,313-325)。該家族存在具有高度序列相似性的四個已知成員GDNF、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)。這些因子均通過轉(zhuǎn)染期間重排(RET)的跨膜受體酪氨酸激酶的活化發(fā)揮功能，所述活化激活多條信號傳導途徑。(Knowles,PP.(2006)“StructureandchemicalinhibitionoftheRETtyrosinekinasedomain(RET酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和化學抑制)”，J.Biol.Chem.28133577-33587)。受體復合物中包括高親和力糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的細胞表面蛋白，名為GFRa(⑶NF家族受體a)，雖然每種GFL存在一種GFRa，但是交叉信號傳導在受體復合物之間出現(xiàn)(Airaksinen等人，ibid)。多種GFLs還共有針對肝素的親和力，PSPN例外，它似乎具有低親和力或無親和力(MaximM.Bespalov博士論文，18.12.2009，赫爾辛基大學)。肝素是一種主要限于肥大細胞的硫酸化多糖。然而，高度相關(guān)的硫酸乙酰肝素(HS)更為普遍存在，其位于在細胞表面和胞外基質(zhì)上。已經(jīng)表明，⑶NF和肝素/HS之間的相互作用顯示對2-0-硫酸鹽存在的高依賴性(Rickard等人，(2003)“Thebindingofhumanglialcellline-derivedneurotrophicfactor(GDNF)toheparinandheparansulfateimportanceof2-0-sulfategroupsandeffectsonitsinteractionwithitsreceptorGFRaI(人神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)與肝素和硫酸乙酰肝素的結(jié)合2-0-硫酸鹽基團的重要性及對與其受體GFRaI相互作用的影響).”Glycobiology13,419-426)。由于它們的神經(jīng)營養(yǎng)性質(zhì)，GFLs是用于治療中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的新出現(xiàn)候選物。GFLs如神經(jīng)營養(yǎng)因子的治療性用途的核心在于這些分子能夠刺激廣泛類型的神經(jīng)元的存活和生長，包括例如多巴胺能神經(jīng)元、交感神經(jīng)元、副交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和脊髓運動神經(jīng)元。(Bespalov,MM和Saarma,M.(2007)“⑶NFfamilyreceptorcomplexesareemergingdrugtargets(GDNF家族受體復合物是新出現(xiàn)的藥物靶).”TrendsinPharm.Sci.28(2)68-74)。例如GDNF蛋白和基因治療載體中的NRTN均已經(jīng)在治療帕金森病的臨床試驗中施用至患者，并且已經(jīng)顯示刺激動物模型中的多巴胺反轉(zhuǎn)。(Hadaczek等人,(2010)“Pharmacokineticsandbioactivityofglialcellline-derivedfactor(GDNF)andneurturin(NTN)infusedintoratbrain(輸注至大鼠腦中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTN)的藥物代謝動力學和生物活性).”Neuropharm.581114-1121)。另外，疾病如阿爾茨海默、ALS、癲癇、成癮性、慢性疼痛和中風也可以得益于基于神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠促進神經(jīng)元存活和生長的神經(jīng)營養(yǎng)因子療法。另夕卜，對于下述概念存在增加的支持神經(jīng)營養(yǎng)因子療法可以用于治療糖尿病(Rossi等人，(2005)Diabetes54(5)1324-30；Mwangi等人，(2008)Gastroenterology134(3)727-37;Mwangi等人，(2010)AmJPhysiol.GastrointestLiverPhysiol.299(I)G283-92);勃起障礙(Laurikainen等人，(2000)Cell.Tissue.Res.302(3)321-9，Laurikainen等人，(2000)J.Neurobiol.43(2)198-205,May等人，(2008)Eur.Urol.54(5)1179-87;Kato等人，(2009)GeneTherapy16⑴26-33)；脫發(fā)(Botchkareva等人，(2000)Am.J.Pathol.156(3)1041-53,Adly等人,(2008)J.Am.Acad.Dermatol.58(2)238-50);聽力下降(Ylikoski等人，(1998)HearRes.124(1-2)17-26，Stover等人，(2001)HearRes.155(1-2)143-51,Stover等人，(2000)BrainResMolBrainRes.76(I)25-35;先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung，sdisease)(Taraviras等人，(1999)Development126(12)2785-97，Roberts等人，(2008)AmJPhysiol.Gastrointest.LiverPhysiol.294(4)G996-G1008);神經(jīng)病理性疼痛(Adler等人，(2009)Pain.Med.10(7)1229-36)和視網(wǎng)膜病變(Igarahi等人，(2000)Cell.Struct.Funct.25(4)237-41，Nishikiori等人，(2007)56(5)1333-40)。在一項最近的II期臨床試驗中，使用病毒載體(CERE-120)，將NRTN施用至帕金森病患者。通過立體定位注射法遞送CERE-120至腦的硬膜區(qū)，從而以高度定向的方式提供穩(wěn)定的、長時間持續(xù)的NRTN表達。然而，雙盲對照的試驗的結(jié)果表明，用CERE-120治療的患者與對照組中的那些患者之間不存在可覺察的差異。相對于在基線的大約39點的平均值，兩個組均在方案定義的主要端點方面顯示大約7點的改善(在12個月后進行統(tǒng)一帕金森病評定量表(UPDRS)運動評分(UnifiedParkinson’sDiseaseRatingScale-motoroffscore)0兩個組有相當數(shù)目的患者顯示出基于基線具有臨床意義的改善。CERE-120似乎是安全和良好耐受的。在CERE-120試驗法的18個月隨訪中，相對于安慰劑，觀察到適中的臨床益處。試驗失敗的原因尚不完全明了。一種假設是，盡管直接注射至腦的受影響區(qū)域，但是神經(jīng)營養(yǎng)因子對硫酸乙酰肝素的高親和力阻止該分子充分擴散至寬廣到足以產(chǎn)生效力的區(qū)域。在這種假設的支持下，對神經(jīng)營養(yǎng)因子在兩位治療過的患者的腦中分布的分析以及動物研究表明，在輸注至腦內(nèi)后，神經(jīng)營養(yǎng)因子未能均勻分布((Hadaczek等人，(2010)“Pharmacokineticsandbioactivityofglialcellline-derivedfactor(GDNF)andneurturin(NTN)infusedintoratbrain(輸注至大鼠腦中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTN)的藥物代謝動力學和生物活性)”Neuropharm.581114-1121;2009年5月27日CeregenePressRelease),從而再次表明更寬的生物分布可能是有利的。另外，新近的動物研究包括將肝素連同神經(jīng)營養(yǎng)因子共輸注至帕金森病的獼猴模型的腦中(Grodin等人，“IntraputamenalinfusionofexogenousneurturinproteinrestoresmotoranddopaminergicfunctionintheglobuspallidusofMPTP-Iesionedrhesusmonkeys(外源神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白質(zhì)的殼核內(nèi)輸注恢復了MPTP受損獼猴的蒼白球中的運動和多巴胺能功能)”CellTransplantation17:373_381，2008)。理論上，共輸注的肝素將阻止神經(jīng)營養(yǎng)因子與胞外基質(zhì)結(jié)合，同時仍允許與靶細胞上的RET/GFRa受體復合物結(jié)合。因此，共注射的神經(jīng)營養(yǎng)因子可能擴散至更廣泛的面積。另一種改善神經(jīng)營養(yǎng)因子的功效和生物分布的方法將是改變該分子的肝素結(jié)合親和力，而不影響影響其神經(jīng)營養(yǎng)性能。然而，在本申請人的發(fā)現(xiàn)之前，神經(jīng)營養(yǎng)因子中參與介導肝素結(jié)合作用的實際氨基酸的位置和身份是未知的。另外，不知道肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變是否會破壞該蛋白質(zhì)的折疊和/或三維結(jié)構(gòu)，并且導致突變分子喪失生物學功能喪失，并且更具體地喪失神經(jīng)營養(yǎng)活性。因此，對改進的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽仍存在需要，所述多肽顯示出改進的生物分布，同時保留高的生物學活性。盡管這種方法富有吸引力，但是已經(jīng)調(diào)研過神經(jīng)營養(yǎng)因子和⑶NF家族其他成員的肝素結(jié)合特征其功能性影響的先前研究，提供了雜亂和矛盾的結(jié)果。(Rider，CC，(2006)Biochem.Soc.Trans.34(3)458-460；RickardSM等人，(2003)Glycobiology13(6)419-26，DaviesJA等人，(2003)GrowthFactors21(3-4)109-19,RiderCC,(2003)Biochem.Soc.Trans.31(2)337-9,TanakaM等人，(2002)Neuroreport13(15)1913-1916,HamiltonJF等人(2001)Exp.Neurol.168(1)155-61，AiX等人，(2007)Developmentl34(18)3327-38)。例如，雖然先前研究已經(jīng)顯示，基序“BBXB”或“BBBXXB”，其中“B”是一個堿性氨基酸并且“X”是任何氨基酸，對于肝素結(jié)合是重要的，然而其他研究顯示，不含有這種基序的蛋白質(zhì)也可以結(jié)合肝素和HS(Delacoux等人“UnravelingtheaminoacidsequencecrucialforheparinbindingtocollagenV(揭不對于肝素與膠原蛋白V結(jié)合至關(guān)重要的氨基酸序列)."J-Biol.Chem.2000275(38):29377-82)。另外，缺少神經(jīng)營養(yǎng)因子的詳細三維結(jié)構(gòu)阻礙了以下詳細分析神經(jīng)營養(yǎng)因子中任何帶正電荷的相應殘基是否實際上在成熟蛋白中表面暴露和取向，從而它們的側(cè)鏈是正確對齊以與肝素相互作用。另外，采用其他GFL成員的研究已經(jīng)顯示，肝素結(jié)合作用可能主要源自這個蛋白質(zhì)家族的N末端區(qū)域之內(nèi)或跨越幾個區(qū)域分布。(Alfano等人(“Themajordeterminantoftheheparinbindingofglialcell-linederivedneurotrophicfactorisneartheN-terminusandisdispensableforreceptorbinding(神經(jīng)膠質(zhì)細胞系源神經(jīng)營養(yǎng)因子的肝素結(jié)合作用的主要決定因素位于N-端附近并且對于受體結(jié)合作用是可替代的)”Biochem.J.404:131-140,2007);Silvian等人，(“Artemincrystalstructurerevealsinsightsintoheparansulfatebinding(Artemin晶體結(jié)構(gòu)揭不硫酸乙酉先月干素結(jié)合的內(nèi)情)”Biochemistry45:6801-6812,2006))。Silvian等人探索了ARTN的肝素結(jié)合特征并且表明，前_a-螺旋區(qū)內(nèi)的一系列精氨酸殘基接觸晶體結(jié)構(gòu)中的硫酸鹽原子。他們發(fā)現(xiàn)在該晶體中無序的ARTN氨基端區(qū)域(第1-9位氨基酸)負責一些HS結(jié)合活性。此外，他們通過用谷氨酸殘基取代方式，將ARTN的前-a-螺旋區(qū)中的三個精氨酸(Arg48，Arg49和Arg51)進行了誘變。谷氨酸的摻入導致對肝素分子的親和力降低，這表明這個前螺旋區(qū)域可能在硫酸乙酰肝素相互作用中發(fā)揮作用。然而，ARTN的這個前螺旋區(qū)域在神經(jīng)營養(yǎng)因子中不是充分保守的，表明神經(jīng)營養(yǎng)因子中這個區(qū)域的功能可以得不到保留。在Alfano等人報道的研究中，缺失⑶NF的N端區(qū)域?qū)е赂嗡亟Y(jié)合作用的明顯降低。另外，Alfano等人對GDNF中含有多個堿性氨基酸的區(qū)域中的成對帶正電荷的氨基酸(K81A/K84A和R88A/R90A)，實施了丙氨酸掃描誘變，所述堿性氨基酸位于成熟GDNF蛋白的a螺旋區(qū)的一個面上。Alfano等人發(fā)現(xiàn)無論單個或組合地，雙氨基酸變化均未能顯著地降低GDNF對肝素的結(jié)合親和力。雖然⑶NF、ARTN和NRTN是同源的并且包含總體上相似的結(jié)構(gòu)，但是成熟蛋白的N端區(qū)域和理論性肝素結(jié)合序列周圍的區(qū)域均不是充分保守的。因此，就這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在NRTN中作用的精確預測，不能從源于GDNF或ARTN的研究中精確推斷。本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子中這樣的氨基酸，其包括第51至63位氨基酸(以成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子進行編號)，它們在介導神經(jīng)營養(yǎng)因子與肝素相互作用方面發(fā)揮重要作用。另外，本申請人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，這個區(qū)域內(nèi)氨基酸的突變導致增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其顯示出降低的肝素親和力并且仍保留有神經(jīng)營養(yǎng)活性，特別地，其保留有與GFRaI或GFRa2相互作用以誘導RET磷酸化和誘導細胞效應的能力。因而，本發(fā)明提供了具有改進生物學活性的新的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，編碼此類多肽的多核苷酸，和表達此類多肽的細胞以及它們用于治療和預防疾病的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)這樣的神經(jīng)營養(yǎng)因子分子，其具有降低的肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合能力，但仍保留一旦與受體復合物結(jié)合就誘導RET蛋白磷酸化的能力。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括純化的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其包括擁有誘導RET磷酸化并且擁有降低的肝素結(jié)合活性能力的神經(jīng)營養(yǎng)因子變體。在另一個實施方案中，純化的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽變體包含在第51、52、54、55、56、57、58、60、61、62或63位氨基酸處的一個或多個置換。在另一個實施方案中，含神經(jīng)營養(yǎng)因子變體的純化多肽包含SEQIDNO:1、2、3和4。在另一個實施方式中，本發(fā)明包括一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子(SEQIDN05)的差異是，在所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子第51至第63氨基酸的包含區(qū)域內(nèi)具有至少一個帶正電荷氨基酸的突變；并且其中與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有降低的肝素親和力。在一個方面，以100ng/ml的濃度在37°C添加至成纖維細胞持續(xù)10分鐘時，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有誘導RET磷酸化的能力，其中所述成纖維細胞表達RET和GFRaI或GFRa2。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽可以在小于IMNaCl的NaCl濃度在pH7.2下從肝素親和柱洗脫。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有在選自R52、R54、R56、R58、R61和R63的位置處的至少一個突變。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有在選自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62的位置處的至少一個突變。在一個方面，該突變導入至少一個中性、兩性或帶負電荷的脂族氨基酸。在另一個方面，該突變導入至少一個獨立地選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R52A、R56A和R58A。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R54A、R61A和R63A。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G、和E62S。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含由ARLQGQGALVGS序列對第51至第62位氨基酸的替換。在這些神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽中任一者的另一個方面，所述多肽是增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽。在這些神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽中任一者的另一個方面，所述多肽是增強的人神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽。在這些神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽中任一者的另一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與(SEQIDNO5)在成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子的所述氨基酸序列范圍內(nèi)基本上同源或基本上相似，但成熟人神經(jīng)營養(yǎng)因子的第51至第63位殘基所包括的13個氨基酸除外。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含SEQIDN0:1。在權(quán)利要求7多肽的一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含SEQIDN0:2。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含SEQIDN0:3。在一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含SEQIDNO:4。在這些神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽中任一者的另一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽是與另一種蛋白質(zhì)融合的融合蛋白。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種治療細胞變性或減少的方法，包括施用治療有效量的前述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽中任一者至需要這種治療的患者。在一個方面，該患者患有選自周圍神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、缺血性卒中、急性腦損傷、急性脊髓損傷、神經(jīng)病理性疼痛、糖尿病、勃起障礙、脫發(fā)、先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung’sdisease)、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、聽力下降、視網(wǎng)膜病變和感染中的疾病或病癥。在一個方面，所述細胞變性或減少包括造血細胞變性或減少，其選自由嗜酸粒細胞減少、嗜堿粒細胞減少、淋巴細胞減少、單核細胞減少、嗜中性粒細胞減少、貧血、血小板減少和干細胞減少。在這些方法中任一者的一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過全身性施用法施用。在另一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過鞘內(nèi)施用法施用。在另一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過鼻內(nèi)施用法施用。在另一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過腦實質(zhì)內(nèi)施用法施用。在另一個方面，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過持續(xù)釋放組合物或裝置施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種藥物組合物，其包含前述神經(jīng)營養(yǎng)因子肽的任一者和藥學上可接受載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括分離的編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子(SEQIDNO:5)，區(qū)別在于所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子在包含第51至第63氨基酸的區(qū)域內(nèi)至少一個帶正電荷的氨基酸突變；并且其中與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有降低的肝素親和力。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中以100ng/ml的濃度在37°C添加至成纖維細胞持續(xù)10分鐘時，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有誘導RET磷酸化的能力，其中所述成纖維細胞表達RET和GFRaI或GFRa2。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽可以在小于IMNaCl的NaCl濃度在pH7.2下從肝素親和柱洗脫。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有在選自R52、R54、R56、R58、R61和R63的位置處的至少一個突變。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有在選自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62的位置處的至少一個突變。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中突變導入至少一個中性、兩性或帶負電荷的脂族氨基酸。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中突變導入至少一個氨基酸，其獨立地選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述多肽包含突變R52A、R56A和R58A。在一個方面,該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽,其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R54A、R61A和R63A。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。在一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述多肽包含由ARLQGQGALVGS序列對第51至第62位氨基酸的替換。在要求保護的多核苷酸中任一者的另一個方面，該多核苷酸編碼一種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與(SEQIDN05)在成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子的所述氨基酸序列范圍內(nèi)基本上同源或基本上相似，但成熟人神經(jīng)營養(yǎng)因子的第51至第63位殘基所包括的13個氨基酸除外。在一個方面,所述多核苷酸包含SEQIDNO:6。在一個方面,所述多核苷酸包含SEQIDN0:7。在一個方面，所述多核苷酸包含SEQIDNO:8。在一個方面，所述多核苷酸包含SEQIDNO:9。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種重組載體，其包含前述多核苷酸。在一個方面，該重組載體還包含與所述多核苷酸有效連接的表達控制序列。在一個方面，該重組載體是病毒載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種治療細胞變性或減少的方法，包括施用治療有效量的前述重組載體中任一者至需要這種治療的患者。在這種方法的一個方面，該患者患有選自周圍神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、缺血性卒中、急性腦損傷、急性脊髓損傷、神經(jīng)病理性疼痛、糖尿病、勃起障礙、脫發(fā)、先天性巨結(jié)腸、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、聽力下降、視網(wǎng)膜病變和感染中的疾病或病癥。在這種方法的另一方面，所述細胞變性或減少包括造血細胞變性或減少，其選自嗜酸粒細胞減少、嗜堿粒細胞減少、淋巴細胞減少、單核細胞減少、嗜中性粒細胞減少、貧血、血小板減少和干細胞減少。在一個方面，該重組載體通過全身性施用法施用。在一個方面，該重組載體通過鞘內(nèi)施用法施用。在一個方面，該重組載體通過鼻內(nèi)施用法施用。在一個方面，該重組載體通過腦實質(zhì)內(nèi)施用法施用。在一個方面，該重組載體通過持續(xù)釋放組合物或裝置施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種藥物組合物，其包含任一的前述重組載體和藥學上可接受載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種宿主細胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求26至43中任一項所述的多核苷酸。在一個方面，該宿主已經(jīng)用前述重組載體的任一者轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。在一個方面，該宿主細胞分泌前述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的任一者。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種治療細胞變性或減少的方法，包括施用治療有效量的前述宿主細胞的任一者至需要這種治療的患者。在一個方面，該患者患有選自周圍神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、缺血性卒中、急性腦損傷、急性脊髓損傷、神經(jīng)病理性疼痛、糖尿病、勃起障礙、脫發(fā)、先天性巨結(jié)腸、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、聽力下降、視網(wǎng)膜病變和感染中的疾病或病癥。在一個方面,所述細胞變性或減少包括造血細胞變性或減少,其選自嗜酸粒細胞減少、嗜堿粒細胞減少、淋巴細胞減少、單核細胞減少、嗜中性粒細胞減少、貧血、血小板減少和干細胞減少。在一個方面,該宿主細胞通過全身性施用法施用。在一個方面，該宿主細胞通過鞘內(nèi)施用法施用。在一個方面，該宿主細胞通過鼻內(nèi)施用法施用。在一個方面，該宿主細胞通過腦實質(zhì)內(nèi)施用法施用。在一個方面，該宿主細胞通過持續(xù)釋放組合物或裝置施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種藥物組合物，其包含前述宿主細胞的任一者和藥學上可接受載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種藥物遞送系統(tǒng)，其包含鞘內(nèi)泵和前述任一多肽。圖I.純化的增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子變體的樣品以及市售批次的神經(jīng)營養(yǎng)因子利用15%SDS-PAGE在非還原條件下進行分析，并且經(jīng)考馬斯染色法顯現(xiàn)。圖2.將純化的神經(jīng)營養(yǎng)因子變體1、2、3、4制備物(NI至N4)、成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子商業(yè)制備物(2ug)施加至HiTrap肝素柱并用連續(xù)NaCl梯度洗脫(用IOmMHepes開始,逐步增加NaCl至2M)。通過214nm處的蛋白質(zhì)吸收(在左側(cè)軸上顯示)監(jiān)測蛋白質(zhì)的洗脫?；趯щ娦?由虛線和所述圖的右側(cè)軸指示)測定含有洗脫蛋白質(zhì)組分的確切鹽濃度。圖2A顯示商業(yè)神經(jīng)營養(yǎng)因子制備物的洗脫圖，圖2B顯示使用與神經(jīng)營養(yǎng)因子變體相同的方法所產(chǎn)生的野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子制備物的洗脫圖，圖2C顯示NI的洗脫圖，圖2D顯示N2的洗脫圖，圖2E顯示N3的洗脫圖，并且圖2F顯示N4的洗脫圖。圖3顯示RET-磷酸化測定的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。穩(wěn)定表達RET的細胞用GFRa2瞬時轉(zhuǎn)染，并且在用所示神經(jīng)營養(yǎng)因子變體刺激后，將細胞裂解并且通過通過免疫沉淀法分離RET。樣品通過用抗磷酸酪氨酸抗體(A)探測來分析。為證實相等的載量，所述樣品隨后用抗RET抗體⑶再探測。圖4顯示RET-磷酸化測定的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。穩(wěn)定表達RET的細胞用GFRaI瞬時轉(zhuǎn)染，并且在用所示神經(jīng)營養(yǎng)因子變體刺激后，將細胞裂解并且通過免疫沉淀法分離RET。樣品通過用抗磷酸酪氨酸抗體(A)探測來分析。為證實相等的載量，所述樣品隨后用抗RET抗體⑶再探測。具體實施例方式定義為了可以更容易地理解本公開，首先定義某些術(shù)語。額外的定義遍及發(fā)明詳述各處描述。如本文和所附權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式“一個(a)”、“一種(an)”和“該(the)”包括復數(shù)稱謂，除非上下文另外清楚地指出。因而，例如，對“一個分子”的指稱包括一個或多個此類分子，對“一種試劑”的指稱包括一種或多種此類不同的試劑，對“一種抗體”的指稱包括一種或多種此類不同的抗體，并且對“該方法”的指稱包括指稱本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的同等步驟和方法，所述同等步驟和方法可以被修改或替換本文所述的方法。在提供一個值范圍的情況下，應當理解，其也具體地披露了該范圍上限與下限之間的每一個中間值，直至該下限值的十分之一個單位，除非上下文有明確的其他說明。所述范圍內(nèi)任一所述值或中間值與這個范圍內(nèi)任一其他所述值或中間值之間的每一較小范圍，其包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地被包括在該范圍內(nèi)或排除在外，并且在所述較小范圍包括上下限值二者之一、上下限值二者均排除、或者上下限值二者均包括——這些情形下的每一范圍也包括在本發(fā)明中，其受所述范圍中任何具體排除的界限約束。在所述的范圍包括所述界限之一者或兩者的情況下，本發(fā)明中也包括排除所包括的這些界限的任一者或兩者的范圍。術(shù)語“約”或“大約”意指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所測定特定值的可接受的誤差范圍，這將部分地取決于怎樣度量或測定該值，即，測量系統(tǒng)的界限值。例如，“約”可以意指處于距均值的I或2個標準偏差范圍內(nèi)。或者，“約”可以意指加上或減去至多到20%、優(yōu)選地至多到10%、更優(yōu)選地至多到5%的范圍。如本文所用，術(shù)語“細胞”、“多個細胞”、“細胞系”、“宿主細胞”、和“多個宿主細胞”互換地使用，并且包括動物細胞，并且包括無脊椎動物細胞、非哺乳脊椎動物細胞和哺乳動物細胞。全部此類名稱均包括細胞群體和子代。因而，術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)染子”包括原代個體細胞和源自其中的細胞系，無論傳代次數(shù)是多少。示例性非哺乳脊椎動物細胞包括例如鳥類細胞、爬行類細胞和兩棲類細胞。示例性無脊椎動物細胞包括，但不限于昆蟲細胞，例如毛蟲(草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))細胞、蚊(埃及伊蚊(Aedesaegypti))細胞、果蜆(黑腹果蜆(Drosophilamelanogaster))細胞、Schneider細胞和家蠶(Bombyxmori)細胞。參見,例如，Luckow等人，Bio/Technology6:47-55(1988)。細胞可以是分化的、部分分化的或未分化的，例如，干細胞，包括胚胎干細胞和多能干細胞。另外，可以根據(jù)本發(fā)明使用源自器官或器官系統(tǒng)的組織樣品。示例性哺乳動物細胞包括，例如源自人、非人靈長類、貓、犬、羊、山羊、牛、馬、豬、兔、包括小鼠、倉鼠、大鼠和豚鼠的嚙齒類動物及其任何衍生物和子代的細胞。術(shù)語“細胞培養(yǎng)物”或“組織培養(yǎng)物”指在如轉(zhuǎn)瓶、組織培養(yǎng)瓶、皿、多孔平板等的容器中懸浮或貼附于多種表面或基材所培育的細胞。術(shù)語“細胞療法”指包括將細胞注射、移植或其他方式置入哺乳動物身體中用于治療的療法。在不同的方面，細胞可以是自體的，細胞可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)，細胞可以是再生性的，細胞可以是修飾的，細胞可以是基因修飾的，細胞可以是體細胞、前體細胞或干細胞。短語“保守性氨基酸置換”或“保守性突變”指一個氨基酸由具有共同特性的另一個氨基酸置換。限定各個氨基酸之間共同特性的功能性方式是分析同源生物的相應蛋白質(zhì)之間氨基酸變化的歸一化頻率(Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag)。根據(jù)此類分析,可以定義氨基酸的組,其中組內(nèi)的氨基酸優(yōu)先交換彼此，并且因此在它們影響總體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面彼此最相似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag)。以這種方式定義的氨基酸組的實例包括“由Glu、Asp、Asn、Gin、Lys、Arg和His組成的帶電荷/極性組；由Pro、Phe、Tyr和Trp組成的“芳香族或環(huán)狀組”;和由Gly、Ala、Val>Leu;Ile、Met、Ser、Thr和Cys組成的“脂族組”。在每個組內(nèi)部，也可以鑒定出亞組，例如，帶電荷/極性氨基酸組可以進一步劃分成由Lys、Arg和His組成的“帶正電荷亞組”；由Glu和Asp組成的“帶負電荷亞組”和由Asn和Gln組成的“極性亞組”。芳香族或環(huán)狀組可以進一步劃成由以下亞組組成的亞組由Pro、His和Trp組成的“氮環(huán)亞組”和由Phe和Tyr組成的“苯基亞組”。脂族組可以進一步劃成由以下亞組組成的亞組由Val、Leu和Ile組成的“大脂族非極性亞組”、由Met、Ser,Thr和Cys組成的“脂族輕微極性亞組”和由Gly和Ala組成的“小殘基亞組”。保守性突變的實例包括置換以上亞組內(nèi)部的氨基酸，例如，Lys替換Arg并且反之亦然，從而可以維持正電荷；Glu替換Asp并且反之亦然，從而可以維持負電荷；Ser替換Thr，從而可以維持游離-OH；Gln替換Asn，從而可以維持游離-NH2。如本文所用，術(shù)語“減少”或相關(guān)的術(shù)語“減少的”、“降低”或“降低的”指統(tǒng)計顯著的減少。為避免懷疑，所述術(shù)語通常指所給出參數(shù)的至少10%減少，并且可以包括至少20%減少、30%減少、40%減少、50%減少、60%減少、70%減少、80%減少、90%減少、95%減少、97%減少、99%或甚至100%減少(即,測量的參數(shù)是處于零)。術(shù)語“表位標簽”指與目的蛋白編碼區(qū)融合以使檢測或純化目的蛋白成為可能的任何抗原決定簇或任何生物學結(jié)構(gòu)或序列。此類融合蛋白可以鑒定和純化，例如通過使用表位標簽特異性抗體。表位標簽的代表性實例包括而不限于His標簽(6-組氨酸)、HA標簽(血凝素)、V5-標簽、c-Myc標簽、GST標簽和FLAG標簽(DYKDDDDK)。術(shù)語“被囊的”在表述“被囊細胞”的語境下指已經(jīng)用人工膜包被各個細胞或細胞群外部的細胞。如本文所用的術(shù)語“表達”指核苷酸序列在宿主細胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。宿主細胞中所需產(chǎn)物的表達水平可以基于細胞中存在的相應mRNA的量或由選擇的序列編碼的所需多肽的量確定。例如，從選擇的序列中轉(zhuǎn)錄的mRNA可以通過RNA印跡雜交、核糖核酸酶RNA保護法、與細胞RNA原位雜交或通過PCR定量。由選擇的序列編碼的蛋白質(zhì)可以由多種方法定量，所述方法包括，但不限于例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測定、免疫沉淀測定、蛋白質(zhì)生物學活性分析、或者FACS分析后再蛋白免疫染色?！氨磉_控制序列”是引起編碼序列在宿主細胞中表達的DNA調(diào)節(jié)序列，如啟動子、增強子、多腺苷酸化信號、終止子、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)等。示例性表達控制序列在Goeddel,GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中描述。術(shù)語“異源DNA”指已經(jīng)導入細胞中的DNA，或源自另一來源或來自相同來源但處于不同(即非固有)環(huán)境下的核酸序列。術(shù)語“同源性”描述基于數(shù)學的序列相似比較結(jié)果，其用來鑒定具有相似功能或基序的基因或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以用作“查詢序列”以針對公共數(shù)據(jù)庫執(zhí)行進行檢索，以例如鑒定其他家族成員、相關(guān)序列或同源物。此類檢索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)進行。BLAST核苷酸搜索可以在采用NBLAST程序，評分=100、字長度=12的情況下執(zhí)行，以獲得與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肵BLAST程序、評分=50、字長度=3進行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得同源于本發(fā)明蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列。為了出于比較目的獲得空位比對結(jié)果，可以使用空位BLASTJnAltschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所述。當使用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用相應程序(例如，XBLAST和BLAST)的默認參數(shù)。術(shù)語“同源的”指擁有“共同進化起源”的兩個蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，所述蛋白質(zhì)包括相同動物物種中來自超家族的蛋白質(zhì)(例如，免疫球蛋白超家族)，以及來自不同動物物種的同源蛋白(例如，肌球蛋白輕鏈多肽等；見Reeck等人，Cell，50:667，1987)。無論根據(jù)同一性百分數(shù)還是根據(jù)存在特定的殘基或基序和保守位置，如其序列相似性所反映的，此類蛋白質(zhì)(和它們的編碼核酸)具有序列同源性。如本文所用，術(shù)語“增加”或相關(guān)的術(shù)語“增加的”、“增強”或“增強的”指統(tǒng)計顯著的增加。為避免懷疑，所述術(shù)語通常指所給出參數(shù)的至少10%增加，并且可以包括超過對照值的至少20%增力口、30%增力口、40%增力口、50%增力口、60%增力口、70%增力口、80%增力口、90%增力口、95%增力口、97%增力口、99%或甚至100%增加。術(shù)語“分離的”，當用來描述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽時，意指已經(jīng)鑒定過并且從其自然環(huán)境的組分中分離和/或回收的一種蛋白。其自然環(huán)境的雜質(zhì)組分是一般將干擾該蛋白質(zhì)的研究、診斷性或治療性用途的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)溶質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)將被純化到至少95%均勻性，這可通過在非還原性或還原性條件下使用考馬斯藍或優(yōu)選地銀染色法進行SDS-PAGE來評估。分離的蛋白質(zhì)包括在重組細胞內(nèi)部在原位的蛋白質(zhì)，因為目的蛋白的自然環(huán)境的至少一種組分將不再存在。然而，一般將通過至少一個純化步驟制備分離的蛋白質(zhì)。如本文所用，“同一性”意指當比對兩個或更多個序列以使序列匹配最大化、即計入空位和插入時，在所述序列中相應位置處的相同核苷酸或氨基酸殘基的百分數(shù)?？梢酝ㄟ^已知的方法容易計算同一丨I"生，所述方法包括但不限于在(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.編著，OxfordUniversityPress,NewYork,1988；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects,Smith,D.ff.編著，AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編著，HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.編著，MStocktonPress,NewYork,1991;以及Carillo,H.,和Lipman,D.，SIAMJ.AppliedMath.，48:1073(1988)中描述的那些方法。設計確定同一性的方法，以獲得所檢驗序列之間的最大匹配。另外，確定同一性的方法編纂于可公共獲得的計算機程序中。確定兩個序列之間同一性的計算機程序方法包括，但不限于GCG程序組(Devereux，J.等人，NucleicAcidsRes12(1):387(1984))、BLASTp、BLASTn和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215:403-410(1990)和Altschul等人Nuc.AcidsRes.,25:3389-3402(1997))oBLASTX程序是從NCBI和其他來源而可公共獲得(BLAST手冊·，Altschul,S.等人，NCBINLMNIHBethesda,Md.20894；Altschul,S.等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。公知的SmithWaterman算法也可以用來確定同一性。如本文中可互換使用的術(shù)語“有效連接”和“有效連接的”指將兩個或更多個核苷酸序列或序列元件，以允許它們按照意圖方式發(fā)揮作用的方式安置。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括與編碼重組蛋白的核苷酸序列有效連接的、能夠使染色質(zhì)開放和/或維持染色質(zhì)處于開放狀態(tài)的ー個或多個DNA元件。在其他實施方案中，核酸分子可以額外地包括一個或多個核苷酸序列，其選自(a)能夠增加翻譯的核苷酸序列；(b)能夠增加重組蛋白分泌于細胞外部的核苷酸序列；和(C)能夠增加mRNA穩(wěn)定性的核苷酸序列，其中此類核苷酸序列與編碼重組蛋白的核苷酸序列有效連接。通常但不必然地，有效連接的核苷酸序列是連續(xù)的，并且根據(jù)需要，是符合可讀框的。然而，雖然能夠使染色質(zhì)開放和/或維持染色質(zhì)處于開放狀態(tài)的有效連接的DNA元件，通常位于編碼重組蛋白的核苷酸序列的上游；但是它不必然與該核苷酸序列連續(xù)。通過本領(lǐng)域公知的重組方法，例如使用PCR方法，通過在適宜的限制性位點處連接或通過復性，完成多種核苷酸序列的有效連接。如果合適的限制性位點不存在，可以根據(jù)常規(guī)慣例使用合成性寡核苷酸接頭或銜接子。如本文所用，術(shù)語“患者”在本發(fā)明語境中優(yōu)選地是ー種哺乳動物。該哺乳動物可以是人、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬或牛，但不限于這些實例。除人之外的哺乳動物可以有利地用作代表特定疾病和病癥動物模型的患者?；颊呖梢允切坌曰虼菩??；颊呖梢允窍惹耙呀?jīng)被診斷或鑒定為存在細胞變性或減少的個體，和任選地已經(jīng)經(jīng)歷或正在經(jīng)歷干預性治療的個體。優(yōu)選地，該患者是人。術(shù)語“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”在本文中可互換地使用，指任何長度的核苷酸聚合物形式，無論是核糖核苷酸或是脫氧核糖核苷酸。這些術(shù)語包括單鏈、雙鏈或三鏈的DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體、或者包含嘌呤和嘧啶堿基，或其他天然的、化學的、生物化學修飾的、非天然或衍生的核苷酸堿基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸酯基團(如一般可以在RNA或DNA中找到)，或修飾或取代的糖或磷酸酯基團。此外，可以通過合成互補鏈并且在適宜的條件下復性雙鏈，或者通過使用DNA聚合酶以適宜的引物從頭合成互補鏈，而從化學合成的單鏈多核苷酸產(chǎn)物獲得雙鏈多核苷酸。核酸分子可以表現(xiàn)為許多不同的形式，例如基因或基因片段、一個或多個外顯子、一個或多個內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支化多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物，尿嘧啶(uracyl)，其他的糖類和連接基團，如氟代核糖(fluororibose)與硫代酯(thioate),以及分支性核苷酸(nucleotidebranches)。如本文所用，“DNA”或“核苷酸序列”不僅包括堿基A、T、C和G，還包括以下情況的任一者這些堿基的類似物或修飾形式、如甲基化核苷酸，核苷酸間的修飾體，如不帶電荷的連接和硫酯鍵連接、糖類似物的使用、以及使用修飾的和/或替代的骨架結(jié)構(gòu)如聚酰胺。如本文所用，術(shù)語“多肽”指包含彼此通過肽鍵或修飾肽鍵連接的兩個或多個氨基酸殘基的任何分子(即肽電子等排體)。“多肽”指短鏈，常稱作肽、寡肽或低聚物，同時也指較長鏈，通常稱作蛋白質(zhì)。多肽可以含有除20種基因編碼氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通過天然過程如翻譯后加工、或通過本領(lǐng)域公知的化學修飾技術(shù)，所修飾得到的氨基酸序列。此類修飾在基本教材中和更詳細的專著中以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的海量研究文獻中都有充分描述。修飾可以在多肽中的任何地方出現(xiàn)，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基端或羧基端。可以理解，相同類型的修飾可以在給定多肽中的幾個位點處以相同或不同的程度存在。另外，給定的多肽可以含有許多類型的修飾。多肽可以因遍在蛋白化而支化，并且它們可以是存在或不存在支化的環(huán)狀。環(huán)狀、分枝和分枝環(huán)狀多肽可以因翻譯后天然過程產(chǎn)生或可以通過合成方法產(chǎn)生。修飾包括例如，こ?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素?；ⅫS素的共價結(jié)合、血紅素部分的共價結(jié)合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價結(jié)合、脂類或脂類衍生物的共價結(jié)合、磷脂酰肌醇的共價結(jié)合、交聯(lián)、環(huán)化、ニ硫鍵形成、去甲基化、形成共價交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y-羧化、糖基化、GPl錨形體形成、羥化、碘化、甲基化、肉豆蘧?；?、棕櫚酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戍烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸鹽化、轉(zhuǎn)移RNA介導的添加氨基酸至蛋白質(zhì)如精氨?；⒑捅樵诘鞍谆?見，例如，Proteins—StructureandMolecularProperties,第2版，T.Ε.Creighton,ff.H.FreemanandCompany,NewYork,1993；ffold,F.,Post-translationalProteinModifications-PerspectivesandProspects(番羽譯后蛋白質(zhì)修飾展望和前景)，1_12,引自Post-translationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson編著，AcademicPress,NewYork,1983；Seifter等人，“Analysisforproteinmodificationsandnonproteincofactor(蛋白質(zhì)修飾和非蛋白質(zhì)輔因子的分析)”，MethEnzymol,182,626-646,1990,和Rattan等人，“ProteinSynthesisPost-translationalModificationsandAging(蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和衰老)”，AnnNYAcadSci，663，48-62，1992)?！皢幼印笔悄軌蛟诩毎薪Y(jié)合RNA聚合酶并且啟動下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)。如本文所用，啟動子序列在其3’末端與轉(zhuǎn)錄起始位點相結(jié)合并且向上游(5，方向)延伸，以包括可檢測水平的高于背景的啟動轉(zhuǎn)錄所需要的最少數(shù)目的堿基或元件。轉(zhuǎn)錄起點(用核酸酶SI可以容易定位確定)可以存在于啟動子序列，也可以存在于負責結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)內(nèi)部。真核啟動子可以經(jīng)常，但是不總是含有“TATA”框和“CAT”框。除-10和-35共有序列之外，原核啟動子還含有Shine-Dalgarno序列。本領(lǐng)域公知來自多種不同來源的大量啟動子，包括組成型、誘導型和阻遏型啟動子。代表性來源包括例如，病毒、哺乳動物、昆蟲、植物、酵母和細菌細胞類型，并且源自這些來源的合適啟動子是容易地可獲得的，或者可以基于在線公眾可獲得的序列、或者例如從諸如ATCC以及其他商業(yè)或個人來源的保藏物來合成產(chǎn)生。啟動子可以是單向的(即，以ー個方向啟動轉(zhuǎn)錄)或雙向的(即，以3’或5’方向啟動轉(zhuǎn)錄)。啟動子的非限制性實例包括例如T7細菌表達系統(tǒng)、pBAD(araA)細菌表達系統(tǒng)、細胞巨化病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子。誘導型啟動子包括Tet系統(tǒng)(美國專利5，464，758和5，814，618)、蛻皮激素誘導性系統(tǒng)(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93(8):3346-3351;T-REX系統(tǒng)(InvitrogenCarlsbad,CA),Lac.Switch(Stratagene,(SanDiego,CA))和Cre_ERT他莫西芬誘導性重組酶系統(tǒng)((Indra等人Nuc.Acid.Res.(1999)27(22):4324-4327；Nuc.Acid.Res.(2000)28(23):e99;美國專利7，112，715號；和Kramer和Fussenegger，MethodsMol.Biol.(2005)308=123-144)或本領(lǐng)域已知適于在合乎需要的細胞中表達的任何啟動子。如本文所用的術(shù)語“純化”指已經(jīng)在減少或消除無關(guān)物質(zhì)即雜質(zhì)存在的條件下所分離的材料，所述雜質(zhì)包括天然物質(zhì)、其中所述材料從該天然物質(zhì)獲得。例如，純化的蛋白質(zhì)優(yōu)選地基本上不含在細胞中與該蛋白質(zhì)結(jié)合的其他蛋白質(zhì)或核酸。用于純化的方法是本領(lǐng)域公知的。如本文所用，術(shù)語“基本上不含”在實踐中其在材料的分析測定的語境下被使用。優(yōu)選地，基本上不含雜質(zhì)的純化材料是至少50%純的；更優(yōu)選地是至少75%純的，并且仍更優(yōu)選地是至少95%純的。可以通過色譜法、凝膠電泳、免疫測定法、組成分析法、生物學測定法和本領(lǐng)域已知的其他方法來評估純度。術(shù)語“基本上純的”表示可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)純化技術(shù)可實現(xiàn)的最高程度的純度。術(shù)語“重組蛋白”或“重組多肽”指i)異源DNA部分地或全部編碼的蛋白質(zhì)，或ii)自表達控制序列(如啟動子或增強子)表達的蛋白質(zhì)，其中所述的表達控制序列由異源DNA完整或部分地產(chǎn)生，所述異源DNA激活內(nèi)源基因的表達。術(shù)語“序列相似性”指在可或可不共有共同進化起源的核酸或氨基酸序列之間的同一性或?qū)缘某潭?見Reeck等人，上文)。然而，在常見用途中和在本申請中，術(shù)語“同源的”當用副詞如“高度地”修飾時，可以指序列相似性并且可以或可以不涉及共同進化起源。在具體實施方案中，如已知的序列比較算法如BLAST、FASTA、DNAStrider,CLUSTAL等所確定的，當至少約85%和更優(yōu)選地至少約90%或至少約95%的核苷酸在核酸序列的限定長度范圍內(nèi)匹配吋，則兩個核酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。這種序列的實例是本發(fā)明特定基因的等位基因或物種變體。也可以通過雜交，例如在諸如相對于這個特定系統(tǒng)所定義的嚴格條件下在DNA印跡雜交實驗中鑒定出基本上同源的序列。類似地，在本發(fā)明的特定實施方案中，當多于90%的氨基酸殘基相同時，則兩個氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。當多于約95%的氨基酸殘基相似吋，兩個序列是功能上相同的。優(yōu)選地，通過使用例如GCG(GeneticsComputerGroup,第7版，Madison,ffis.)程序包或使用上述任何程序和算法進行比對，以鑒定出相似或同源的多肽序列。所述程序可以使用Smith和Waterman局部同源性算法，采用默認值空位產(chǎn)生罰分=-(1+1/k)，k是空位延伸數(shù)目，平均匹配=I，平均錯配=-O.333。如本文定義，術(shù)語“持續(xù)釋放”、“延長的釋放”或“貯庫制劑”指藥物如增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽從持續(xù)釋放組合物或持續(xù)釋放裝置中被釋放，所述釋放與直接靜脈內(nèi)或皮下施用單次劑量增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽后本來可獲得神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的時間相比，它在更長的時間范圍內(nèi)發(fā)生。在ー個方面，持續(xù)釋放將是在至少約I周至2周的時間范圍內(nèi)發(fā)生的釋放。在另ー個方面，持續(xù)釋放將是在至少約4個月的時間范圍內(nèi)發(fā)生的釋放。釋放的持續(xù)性和釋放的水平可以受持續(xù)釋放裝置的類型(例如，可編程泵或滲透驅(qū)動泵)或所用的持續(xù)釋放組合物(例如，単體比率、分子量、嵌段組成、和聚合物組成是否多祥性)、多肽載量和/或產(chǎn)生所需作用的賦形劑的選擇所影響，如本文中充分描述。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”指將ー個或多個核酸分子轉(zhuǎn)移至宿主細胞或生物中。將核酸分子導入宿主細胞中的方法包括例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖介導轉(zhuǎn)染法、微量注射法、陽離子脂類介導轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、劃痕負載法(scrapeloading)、射彈導入法或病毒或其他感染介質(zhì)感染法?！稗D(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)導的”或“轉(zhuǎn)基因的”在細胞的語境下，是指已經(jīng)導入有重組或異源核酸分子(例如，ー個或多個DNA構(gòu)建體或RNA或siRNA對應物)的宿主細胞或生物。核酸分子可以穩(wěn)定地表達(即，以有功能的形式在細胞中維持超過約三個月)或以有功能的形式在細胞中非穩(wěn)定地維持不足三個月，即，瞬時表達。例如，“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)化體”、和“轉(zhuǎn)基因”細胞已經(jīng)經(jīng)歷轉(zhuǎn)化過程并且含有外來核酸分子。術(shù)語“未轉(zhuǎn)化的”指未曾經(jīng)歷轉(zhuǎn)化過程的細胞。術(shù)語“治療性”或“治療”意指至減輕、減緩、延遲、減弱、逆轉(zhuǎn)、改善、控制或防止患者中某病狀的至少ー個癥狀。術(shù)語“治療性”也可以意指停滯、延遲發(fā)作(即，在疾病臨床表現(xiàn)之前的時間段)和/或降低某病狀發(fā)展或加重的風險。如本文所用，術(shù)語“治療有效量”、“預防有效量”或“診斷有效量”是為了在施用后產(chǎn)生所需生物學反應所需要的該活性試劑的量，所述活性試劑例如是增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽、包含有編碼此類增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子其核苷酸序列的多核苷酸、或表達重組增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子的宿主細胞。術(shù)語“變體”指與參比多核苷酸或多肽不相同，但是仍保持ー些其基本性能的多核苷酸或多肽。常見的多肽變體在氨基酸序列上與參比多肽不同。通常，改變是有限的，從而參比多肽和變體的序列是總體相似的，并且在許多區(qū)域內(nèi)是相同的。變體和參比多肽可以因一個或多個置換、插入或缺失，以其任意組合在氨基酸序列上不同。置換或插入的氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸殘基。術(shù)語“野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子”或“前神經(jīng)營養(yǎng)因子原”指編碼氨基酸序列(表D3中的SEQIDNO26)的基因。術(shù)語“成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子”或“成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子”指編碼已經(jīng)通過移除分泌信號和前蛋白該加工過的氨基酸序列(表D2中的SEQIDN05)的基因。術(shù)語“NRTN”指編碼野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因。除非另外說明，本發(fā)明的實施將采用化學、分子生物學、微生物學和重組DNA和免疫學的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍。文獻中解釋了此類技術(shù)。見例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,MolecularCloningALaboratoryManual,桌2版，ト3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.等人(1995年和定期增補內(nèi)容；CurrentProtocolsinMolecularBiology,第9、13和6章，Johnffiley&Sons,NewYork,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,Johnffiley&Sons；J.M.Polak和amesO’D.McGee,1990,InSituHybridization!PrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress;M.J.Gait(編者)，1984,OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.I,編者EdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManual,EdHarlow(編者)，DavidLane(編者)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-3,4-2),1855.HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes編著(2001，NewYork，N.Y.,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9);和LabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams和LindaRodgers編著，2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些通用教材的每一部通過引用的方式并入本文。除非另外定義，本文中所用的全部技術(shù)術(shù)語及科學術(shù)語，具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。盡管與本文所述相似或等效的任何方法、組合物、試齊U、細胞，都可以用于實施或檢驗本發(fā)明，然而優(yōu)選的方法和材料是在本文中所描述的。上文所討論的出版物僅提供在本申請的提交日期之前的相關(guān)公開內(nèi)容。不應解釋為本發(fā)明因為利用在先發(fā)明，而不能被給予對于此類公開具有占先權(quán)的權(quán)利。將本說明書中引用的全部出版物和參考文獻，包括但不限于專利和專利申請，通過引用方式完整并入本文，如同特別地和逐一地指明，將每份単獨的出版物或參考文獻通過引用方式，如充分所述的那樣并入本文。本申請要求優(yōu)先權(quán)的任何專利申請也通過引用的方式，以上述針對出版物和參考文獻的方式完整并入本文。概述本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)這樣的增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子分子，其具有降低的肝素和硫酸こ酰肝素結(jié)合能力，但意外地仍保留一旦與受體復合物結(jié)合就誘導RET蛋白磷酸化的能力。因此，在不同的實施方案中，本發(fā)明包括純化的多肽、編碼增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重組載體、和表達增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的宿主，其中所述增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽擁有誘導RET磷酸化的能力和擁有降低的肝素結(jié)合親和力。另夕卜，本發(fā)明中包括這些多種實施方案在治療人類疾病和病癥中的用途。I.神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽如本文所用的術(shù)語“增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽”或“增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子”或“增強的NRTN”包括全部天然存在形式的和合成形式的神經(jīng)營養(yǎng)因子，它們與相應的成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子SEQIDNO:5相比區(qū)別在于，所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子在包含第51至第63位氨基酸的區(qū)域內(nèi)，具有至少ー個帶正電荷氨基酸的突變，并且與成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，顯示出降低的肝素親和力。在另ー個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子與相應的成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子SEQIDNO5區(qū)別在于所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子在包含第51至第63氨基酸的區(qū)域內(nèi)至少兩個帶正電荷的氨基酸突變，并且與成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，顯示出降低的肝素親和力。在另ー個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子與相應的成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子SEQIDNO5區(qū)別在于，所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子在包含第51至第63氨基酸的區(qū)域內(nèi)至少三個帶正電荷的氨基酸突變，并且與成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，顯示出降低的肝素親和力。在另ー個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子與相應的成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子SEQIDNO5區(qū)別在于，所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子在包含第51至第63氨基酸的區(qū)域內(nèi)至少五個帶正電荷的氨基酸突變，并且與成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，顯示出降低的肝素親和力。在一個實施方案中，術(shù)語“增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽”指一種多肽，該多肽與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子(SEQIDNO:5)在所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子的氨基酸序列范圍內(nèi)至少90%相同，但成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子第51至第63位殘基所包括的13個氨基酸除外。在另ー個方面，用于任ー種本發(fā)明方法中的“增強的人神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽”與(成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子)SEQIDNO:5在所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子的氨基酸序列范圍內(nèi)至少95%相同，但將成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子的第51至第63位殘基所包括的13個氨基酸除外。在一個實施方案中，使用102個氨基酸長的成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子(SEQIDNO5)的編號，與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，所述增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含在第51、52、54、55、56、57、58、60、61、62或63位氨基酸處的一個或多個突變。在本發(fā)明的一個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子在成熟人神經(jīng)營養(yǎng)因子(SEQIDNO:5)第51至第63位殘基所包括的區(qū)域內(nèi)部，含有I個至13個氨基酸突變。在ー個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子將包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個氨基酸突變，所述突變在成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子(SEQIDN05)第51至第63位殘基所包括的區(qū)域內(nèi)部。在又ー個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子將包含3、5、7、9或11個氨基酸突變，所述突變在成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子第51至第63位殘基所包括的區(qū)域內(nèi)部。在增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽中任ー種的ー個方面，所述ー個或多個突變導入至少ー個中性、兩性或帶負電荷的脂族氨基酸至增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子中。在增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽中任一種的另一方面，所述ー個或多個突變導入至少ー個獨立地選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺的氨基酸至增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子中。在另ー個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含由ARLQGQGALVGS序列(SEQIDNO25)對第51至第62位氨基酸的替換。在另ー個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含選自SEQIDNO:22至25(表Dl)的序列，其中與成熟的野生型人神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，所述增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽顯示出降低的肝素親和力。表DL當插入成熟野A型神經(jīng)營養(yǎng)因子中時提供降低的肝素余和力的鉍《_I序列ISEQIDNO:_氨基酸序列_ISEQIDNO:22_RALRQARAISEQIDNO:23_RRLAO腿RLRAEAISEQIDNO:24_1ALAQARALRAJSEQIDNO:25_ARLQGQGALVGSI在本發(fā)明的又ー個方面，增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽將包含SEQIDN0:l、2、3或4(表D2)。權(quán)利要求1.ー種神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子(SEQIDNO.5)區(qū)別在于所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子在包含第51至第63氨基酸的區(qū)域內(nèi)至少ー個帶正電荷的氨基酸突變；并且其中與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有降低的肝素親和力。2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中以100ng/ml的濃度在37°C添加至成纖維細胞持續(xù)10分鐘時，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有誘導RET磷酸化的能力，其中所述成纖維細胞表達RET和GFRαI與GFRα2兩者之一。3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽在小于IMNaCl的NaCl濃度和pH7.2下從肝素親和柱洗脫。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有在選自R52、R54、R56、R58、R61和R63位置處的至少ー個突變。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有在選自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62位置處的至少ー個突變。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述突變導入至少ー個中性、兩性或帶負電荷的脂族氨基酸。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述突變導入至少ー個獨立選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R52A、R56A和R58A。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R54A、R61A和R63A。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含由序列ARLQGQGALVGS對第51至第62位氨基酸的替換。13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一項所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與(SEQIDNO.5)在成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子的氨基酸序列范圍內(nèi)基本上同源或基本上相似，但成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子第51至第63位殘基所包括的13個氨基酸除外。14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1。15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2。16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3。17.根據(jù)權(quán)利要求7所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4。18.一種治療細胞變性或減少的方法，包括向需要治療的患者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述患者患有選自周圍神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、缺血性卒中、急性腦損傷、急性脊髓損傷、神經(jīng)病理性疼痛、糖尿病、勃起障礙、脫發(fā)、先天性巨結(jié)腸、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、聽カ下降、視網(wǎng)膜病變和感染中的疾病或病癥。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的細胞變性或減少包括造血細胞變性或減少，其選自嗜酸粒細胞減少、嗜堿粒細胞減少、淋巴細胞減少、單核細胞減少、嗜中性粒細胞減少、貧血、血小板減少和干細胞減少。21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過全身性施用法施用。22.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過鞘內(nèi)施用法施用。23.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過鼻內(nèi)施用法施用。24.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過腦實質(zhì)內(nèi)施用法施用。25.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽通過持續(xù)釋放組合物或裝置施用。26.—種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽和藥學上可接受載體。27.編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的分離的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子(SEQIDNO.5)區(qū)別在于所述成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子在包含第51至第63氨基酸的區(qū)域內(nèi)至少ー個帶正電荷的氨基酸突變；并且其中與成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子相比，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有降低的肝素親和力。28.據(jù)權(quán)利要求27所述的多核苷酸，其中以100ng/ml的濃度在37°C添加至成纖維細胞持續(xù)10分鐘時，所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有誘導RET磷酸化的能力，其中所述成纖維細胞表達RET和GFRαI與GFRα2二者之一。29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽可以在小于IMNaCl的NaCl濃度和pH7.2下從肝素親和柱洗脫。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有在選自R52、R54、R56、R58、R61和R63位置處的至少ー個突變。31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽具有在選自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62位置處的至少ー個突變。32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的多核苷酸，其中所述突變導入至少ー個中性、兩性或帶負電荷的脂族氨基酸。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的多核苷酸，其中所述突變導入至少ー個獨立選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R52A、R56A和R58A。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R54A、R61A和R63A。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含突變R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽包含由序列ARLQGQGALVGS對第51至第62位氨基酸的替換。39.根據(jù)權(quán)利要求27至38中任一項所述的多核苷酸，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與(SEQIDNO.5)在成熟野生型神經(jīng)營養(yǎng)因子的所述氨基酸序列范圍內(nèi)基本上同源或基本上相似，但成熟的人神經(jīng)營養(yǎng)因子第51至第63位殘基所包括的13個氨基酸除外。40.根據(jù)權(quán)利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQIDNO:6。41.根據(jù)權(quán)利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQIDNO:7。42.根據(jù)權(quán)利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQIDNO:8。43.根據(jù)權(quán)利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQIDNO:9。44.ー種重組載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求27至43中任一項所述的多核苷酸。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的重組載體，還包含與所述多核苷酸有效連接的表達控制序列。46.根據(jù)權(quán)利要求44或45所述的重組載體，其中所述載體是病毒載體。47.一種治療細胞變性或減少的方法，包括向需要治療的患者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項所述的重組載體。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述患者患有選自周圍神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、缺血性卒中、急性腦損傷、急性脊髓損傷、神經(jīng)病理性疼痛、糖尿病、勃起障礙、脫發(fā)、先天性巨結(jié)腸、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、聽カ下降、視網(wǎng)膜病變和感染中的疾病或病癥。49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的細胞變性或減少包括造血細胞變性或減少，其選自嗜酸粒細胞減少、嗜堿粒細胞減少、淋巴細胞減少、單核細胞減少、嗜中性粒細胞減少、貧血、血小板減少和干細胞減少。50.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項所述的方法，其中所述重組載體通過全身性施用法施用。51.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項所述的方法，其中所述重組載體通過鞘內(nèi)施用法施用。52.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項所述的方法，其中所述重組載體通過鼻內(nèi)施用法施用。53.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項所述的方法，其中所述重組載體通過腦實質(zhì)內(nèi)施用法施用。54.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項所述的方法，其中所述重組載體通過持續(xù)釋放組合物或裝置施用。55.ー種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項所述的重組載體和藥學上可接受載體。56.—種宿主細胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求26至43中任一項所述的多核苷酸。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞已經(jīng)用根據(jù)權(quán)利要求44至46所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。58.根據(jù)權(quán)利要求56或57所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞分泌根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的多肽。59.一種治療細胞變性或減少的方法，包括向需要治療的患者施用治療有效量的權(quán)利要求56-58的宿主細胞。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述患者患有選自周圍神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、缺血性卒中、急性腦損傷、急性脊髓損傷、神經(jīng)病理性疼痛、糖尿病、勃起障礙、脫發(fā)、先天性巨結(jié)腸、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性硬化、聽カ下降、視網(wǎng)膜病變和感染中的疾病或病癥。61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的細胞變性或減少包括造血細胞變性或減少，其選自嗜酸粒細胞減少、嗜堿粒細胞減少、淋巴細胞減少、單核細胞減少、嗜中性粒細胞減少、貧血、血小板減少和干細胞減少。62.根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞通過全身性施用法施用。63.根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞通過鞘內(nèi)施用法施用。64.根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞通過鼻內(nèi)施用法施用。65.根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞通過腦實質(zhì)內(nèi)施用法施用。66.根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞通過持續(xù)釋放組合物或裝置施用。67.ー種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項所述的宿主細胞和藥學上可接受載體。68.—種藥物遞送系統(tǒng),其包含鞘內(nèi)泵和權(quán)利要求1-17中任一項所述的多肽。69.根據(jù)權(quán)利要求I至17中任一項所述的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽與另ー個蛋白質(zhì)或多肽序列融合。全文摘要本發(fā)明公開了擁有降低的肝素和硫酸乙酰肝素結(jié)合親和力、但是仍保持神經(jīng)營養(yǎng)活性的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽，編碼所述神經(jīng)營養(yǎng)因子變體的核酸，以及表達增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽的載體和宿主細胞。也公開了所述增強的神經(jīng)營養(yǎng)因子多肽、核酸和宿主細胞在治療或預防疾病中的用途。文檔編號C07K14/47GK102695723SQ201080054301公開日2012年9月26日申請日期2010年10月28日優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日發(fā)明者理查德·佩恩,皮亞·魯內(nèi)貝里-魯斯,馬克西姆·別斯帕洛夫,馬特·薩瑪申請人:中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療學公司