專利名稱：通過調(diào)節(jié)自噬增強(qiáng)基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)自噬的方法
通過調(diào)節(jié)自噬增強(qiáng)基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)自噬的方法相關(guān)申請本申請要求2009年9月30日提交的美國臨時(shí)申請61/247，251，以及2009年9月30提交的美國臨時(shí)申請61/247，309的優(yōu)先權(quán)。其全部內(nèi)容在此參考并入。政府資助本發(fā)明是在美國政府支持下完成的，美國國家衛(wèi)生研究院授予的研究基金號為AG012859和AG027916的。政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
自噬是一種以溶酶體依賴性的方式介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)組分更新的分解代謝過程(Levineand Klionsky, (2004)Dev Cell 6,463-377)。自噬由隔離膜的形成而啟動，其擴(kuò)展吞沒部分細(xì)胞質(zhì)從而形成雙層囊泡，該雙層囊泡被稱為自噬體。然后自噬體與溶酶體融合形成自溶酶體，在自溶酶體中，捕獲的物質(zhì)與內(nèi)膜被溶酶體水解酶降解。因此，自噬對于清除大蛋白復(fù)合物和有缺陷的細(xì)胞器是至關(guān)重要的，并且在細(xì)胞生長、存活和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。已有的自噬研究主要在單細(xì)胞真核生物中，已知單細(xì)胞真核生物對于在饑餓狀態(tài)下存活是至關(guān)重要的。在營養(yǎng)缺乏的條件下培養(yǎng)單細(xì)胞真核生物時(shí)，細(xì)胞可以使用自噬降解的產(chǎn)物，例如氨基酸、脂肪酸和核苷酸作為結(jié)構(gòu)組分和能量來源(Levine andKlionsky, (2004)Dev Cell 6, 463-377;Levine and Kroemer, (2008), Cell 132,27-42)。復(fù)雜的多細(xì)胞真核生物(例如哺乳動物)的細(xì)胞在正常的生理?xiàng)l件下很少有營養(yǎng)缺乏。但是，當(dāng)這些細(xì)胞發(fā)生營養(yǎng)缺乏或細(xì)胞應(yīng)激時(shí)，自噬通常被正調(diào)節(jié)，這會提高細(xì)胞存活性。由于癌細(xì)胞的快速生長和遺傳不穩(wěn)定性，它們的存活和生長比未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞更依賴于自噬(Ding et al. , (2009), Mol. Cancer Ther.，8 (7)，2036-2045)。另外，自噬在癌細(xì)胞中被頻繁激活作為存活機(jī)制，以響應(yīng)由化學(xué)治療劑引起的細(xì)胞應(yīng)激。因此，自噬抑制劑可以單獨(dú)或與其他癌癥治療相結(jié)合作為抗癌治療藥物(Maiuri et al. , (2007)Nat. Rev. CellBiol. 8, 741-752;Amaravadi et al. , (2007)J. Clin. Invest. 117，326-336)。自噬除了在響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激方面有作用外，其還是重要的維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，所述的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是通過功能失常的、老化的或損壞的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的更新維持的(Levine and Kroemer, (2008), Cell 132,27-42)。因此，自噬水平的降低通過增加折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)的累積促成了神經(jīng)退行性病變(Haraet al. , (2006), Nature, 441, 885-889; Komatsu etal.，(2006), ature, 441，880-884)。已經(jīng)證明自卩遼上調(diào)能降低累積蛋白質(zhì)的水平并減輕神經(jīng)退行性疾病的癥狀(Rubinsztein et al. , (2007), Nat. Rev. Drug Discov. 6，304-312)。因此，增強(qiáng)細(xì)胞自噬的試劑可以作為治療和預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的藥物。除了癌癥和神經(jīng)退行性疾病之外，自噬調(diào)節(jié)也是多種其他疾病和紊亂的治療策略。例如，與折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)累積有關(guān)的多種肝病、心臟病和肌肉疾病。在所述疾病中，增加細(xì)胞自噬的試劑可以增強(qiáng)由疾病引起的聚集物的清除性，從而有助于治療和減輕疾病、的嚴(yán)重程度(Levine and Kroemer, (2008)，Cell, 132，27-42)。另外，也已經(jīng)在胰腺疾病中觀察到了自噬水平的升高，并且已經(jīng)證明，自噬水平升高是急性胰腺炎進(jìn)程中的早期事件(Fortunato and Kroemer, (2009)，Autophagy, 5 (6))。因此，自卩遼抑制劑可以作為胰腺炎治療中的治療藥物。因此，有大量的證據(jù)證明自噬調(diào)節(jié)是治療大范圍疾病和紊亂的有用方法。但是，因?yàn)閷Σ溉閯游镒允烧{(diào)節(jié)基因和通路還知之甚少，所以經(jīng)證實(shí)可以作為開發(fā)所述疾病治療新藥物和治療方法的靶點(diǎn)的自噬調(diào)控劑還較少。相應(yīng)地，迫切需要自噬調(diào)節(jié)和自噬相關(guān)疾病治療的新方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)自噬和治療自噬相關(guān)疾病的新方法，所述疾病包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和胰腺炎。為了確定本發(fā)明的方法，使用了人類siRNA文庫的 高通量的，基于圖像的全基因組篩選來確定236個(gè)自噬相關(guān)基因。聯(lián)合使用高通量檢測、低通量檢測和生物信息學(xué)分析對這些基因進(jìn)行廣泛地表征。根據(jù)這些研究的結(jié)果，確定了可用于調(diào)節(jié)這些基因及其基因產(chǎn)物的生物試劑和藥物，并開發(fā)了調(diào)節(jié)自噬和治療自噬相關(guān)疾病的新方法。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的方法，所述方法包括將細(xì)胞與抑制本發(fā)明中自噬抑制基因產(chǎn)物活性的試劑接觸。在某些實(shí)施例中，所述自噬抑制基因選自表
I、表3、表5、表7、

圖14、圖15、圖39、圖44、和/或圖55所列基因。在其他實(shí)施例中，所述自噬抑制基因是 TRPM3、TMPRSS5、IRAK3、ADMR、FGFRl、UNC13B、PTGER2、AGER、BGN、GABBR2、PPARD, GHSR、BAIAIP2、S0RCS2、PAQR6、EPHA6、TRHR、C5AR1、BAI3, TLR3、PTPRH、ADRA1A、UTS2R、RORC,CHRND,TACR2、P2RX1、PLXNA2、PTPRU、FCER1A、CD300C、TNFRSF19L CLCFl、LIF、FGF2、SDFl或IGF。在本發(fā)明的某些方面，所述試劑是抗體、siRNA分子、shRNA分子和/或反義RNA分子。在其他方面，所述試劑是TK1258、PF 04494700、PMX53、坦洛新、多沙唑嗪、鹽酸哌唑嗪、鹽酸阿夫唑嗪、烏洛滕生II、鹽酸美卡拉明、ISIS 3521、吉西他濱、LY900003、MK-5108、U73122 或D609。本發(fā)明的某些實(shí)施例涉及抑制細(xì)胞自噬的方法，所述方法包括將細(xì)胞與抑制本發(fā)明自噬增強(qiáng)基因產(chǎn)物活性的試劑接觸。在一些實(shí)施例中，所述自噬增強(qiáng)基因選自表2、表4和/或表6。在其他實(shí)施例中，所述自噬增強(qiáng)基因是1 1 、6 1 18、1^14或即1^。在某些實(shí)施例中，所述試劑是抗體、siRNA分子、shRNA分子和/或反義RNA分子。在某些方面，本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞自噬的方法，所述方法包括將細(xì)胞與增強(qiáng)本發(fā)明自噬抑制基因產(chǎn)物活性的試劑接觸。在一些實(shí)施例中，所述自噬抑制基因選自表I、表3、表5、表7、圖14、圖15、圖39、圖44和/或圖55所列基因。在其他實(shí)施例中，所述自噬抑制基因是 TRPM3、TMPRSS5、IRAK3、ADMR、FGFRl、UNC13B、PTGER2、AGER、BGN、GABBR2、PPARD、GHSR、BAIAIP2、S0RCS2、PAQR6、EPHA6、TRHR、C5AR1、BAI3, TLR3、PTPRH、ADRA1A、UTS2R、RORC, CHRND, TACR2、P2RX1、PLXNA2、PTPRU, FCER1A、CD300C、TNFRSF19L CLCFU HF, FGF2、SDFl或IGF。在某些實(shí)施例中，所述試劑是抗體。在某些實(shí)施例中，所述試劑是FGF-I、酸性卩6 -1、乂1^0038、1^^ 6 、61501516、伊布莫侖敏使朗、1^-1021^3 1572、1冊、5-0373、聚ICR、CQ-07001或隱丹參酮。在某些實(shí)施例中，所述試劑是生長因子。在其他實(shí)施例中，所述生長因子是 CLCFl、LIF、FGF2、SDFl 或 IGFl。
本發(fā)明的某些實(shí)施例涉及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的方法，所述方法包括將細(xì)胞與增強(qiáng)本發(fā)明中自噬增強(qiáng)基因產(chǎn)物活性的試劑接觸。在某些實(shí)施例中，所述自噬增強(qiáng)基因選自表2、表4和/或表6所列基因。在其他實(shí)施例中，所述自噬增強(qiáng)基因是TPR、GPR18、RelA或NF k B。在一些實(shí)施例中，所述試劑是抗體。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及治療主體神經(jīng)退行性疾病和/或蛋白質(zhì)病的方法，所述方法包括給予所述主體一種抑制本發(fā)明自噬抑制基因產(chǎn)物活性的試劑。在一些實(shí)施例中，所述自噬抑制基因選自表I、表3、表5、表7、圖14、圖15、圖39、圖44和/或圖55所列基因。在其他實(shí)施例中，所述自噬抑制基因是TRPM3、TMPRSS5、IRAK3、ADMR、FGFR1、UNC13B、PTGER2、AGER、BGN、GABBR2、PPARD、GHSR、BAIAIP2、S0RCS2、PAQR6、EPHA6、TRHR、C5AR1、BAI3、TLR3、PTPRH、ADRA1A、UTS2R、RORC, CHRND, TACR2、P2RX1、PLXNA2、PTPRU、FCER1A、CD300C、TNFRSF19L CLCFl、SDFl、LIF、FGF2或IGF。在一些實(shí)施例中，所述試劑是抗體、siRNA分子、shRNA分子和/或反義RNA分子。在其他實(shí)施例中，所述試劑是TK1258、PF 04494700、 PMX53、坦洛新、多沙唑嗪、鹽酸哌唑嗪、鹽酸阿夫唑嗪、烏洛滕生II、鹽酸美卡拉明、ISIS3521、吉西他濱、LY900003、MK-5108、U73122 或 D609。本發(fā)明的某些實(shí)施例涉及治療主體神經(jīng)退行性疾病和/或蛋白質(zhì)病的方法，所述方法包括給予所述主體一種增強(qiáng)本發(fā)明中自噬增強(qiáng)基因產(chǎn)物活性的試劑。在某些實(shí)施例中，所述自噬增強(qiáng)基因選自表2、表4和/或表6所列基因。在其他實(shí)施例中，所述自噬增強(qiáng)基因是TPR、GPR18、RelA或NF K B。在某些實(shí)施例中，所述試劑是抗體。在某些實(shí)施例中，所述神經(jīng)退行性疾病是腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥、酒精中毒、亞歷山大氏病、阿耳珀病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、運(yùn)動失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、貝敦氏癥、牛海綿狀腦病、卡納萬病、大腦性麻痹、科克因綜合癥、皮質(zhì)基底核退化癥、克雅氏病、家族性致命性失眠、額顳葉退化、亨廷頓病、人類免疫缺陷病毒伴發(fā)性癡呆、肯尼迪氏疾病、球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、路易體癡呆、神經(jīng)萊姆病、馬-約病、多系統(tǒng)萎縮、多發(fā)性硬化、發(fā)作性睡病、尼曼匹克癥、帕金森病、佩-梅二氏病、皮克氏病、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、朊病毒病、進(jìn)行性核上麻痹、植烷酸貯積癥、山德霍夫氏病、謝耳德病、惡性貧血繼發(fā)性亞急性脊髓混合變性、斯皮爾梅伊爾-沃格特-肖格倫-巴滕病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓性肌萎縮、進(jìn)行性核上性麻痹、脊髓癆、中毒性腦病以及這些疾病的組合。在某些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)病是a I-抗胰蛋白酶缺乏、散發(fā)性包涵體肌炎、2B型角膜緣帶肌營養(yǎng)不良和三好氏肌肉病變、阿爾茨海默氏病、帕金森病、路易體癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、亨廷頓病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、脊髓延髓肌萎縮以及這些疾病的組合。本發(fā)明的一些實(shí)施例涉及治療主體癌癥或胰腺炎的方法，所述方法包括給予所述主體一種抑制本發(fā)明自噬增強(qiáng)基因產(chǎn)物活性的試劑。在某些實(shí)施例中，所述自噬增強(qiáng)基因選自表2、表4和/或表6所列基因。在其他實(shí)施例中，所述自噬增強(qiáng)基因是TPR、GPR18、RelA或NFk B。在一些實(shí)施例中，所述試劑是抗體、siRNA分子、shRNA分子和/或反義RNA分子。在一些方面，本發(fā)明涉及治療主體中癌癥或胰腺炎的方法，所述方法包含給予所述主體一種增強(qiáng)本發(fā)明中自噬抑制基因產(chǎn)物活性的試劑。在某些實(shí)施例中，所述自噬抑制基因選自表I、表3、表5、表7、圖14、圖15、圖39、圖44和/或圖55所列基因。在其他實(shí)施例中，所述自噬抑制基因是 TRPM3、TMPRSS5、IRAK3、ADMR、FGFRl、UNC13B、PTGER2、AGER、BGN、GABBR2、PPARD、GHSR、BAIAIP2、S0RCS2、PAQR6、EPHA6、TRHR、C5AR1、BAI3、TLR3、PTPRH、ADRA1A、UTS2R、RORC, CHRND, TACR2、P2RX1、PLXNA2、PTPRU、FCER1A、CD300C、TNFRSF19LCLCF1、SDF1、LIF、FGF2或IGF。在一些實(shí)施例中，所述試劑是抗體。在某些實(shí)施例中，所述試劑是 FGF-1、酸性 FGF-I、XRP0038、RhaFGF, GW501516、伊布莫侖敏使朗、KP-102LN、EP1572、TRH、S-0373、聚ICR、CQ-07001或隱丹參酮。在某些實(shí)施例中，所述試劑是生長因子。在更具體的實(shí)施例中，所述生長因子是CLCF1、LIF、FGF2、SDF1或IGFl。
在某些實(shí)施例中，治療癌癥的方法進(jìn)一步包括已知的癌癥治療療法，例如給予化學(xué)治療劑和/或放射治療。在某些實(shí)施例中，所述化學(xué)治療劑是六甲蜜胺、天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)、硫酸博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、2-氯脫氧腺苷、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、咪唑羧酰胺、更生霉素、柔紅霉素、地塞米松、阿霉素、依托泊苷、氟尿苷、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺、氟達(dá)拉濱、戈舍瑞林、羥基脲、鹽酸伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、干擾素a、干擾素a 2a、干擾素a 2b、干擾素a n3、伊立替康、亞葉酸鈣、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、甲地孕酮、美法侖、左旋苯丙氨酸氮芥、鹽酸美法侖、美司鈉、氮芥、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、巰嘌呤、紫杉醇、普卡霉素、潑尼松、丙卡巴肼、鏈佐星、他莫昔芬、6-硫鳥嘌呤、塞替派、托泊替康、長春堿、長春新堿或酒石酸長春瑞濱。本發(fā)明的其他實(shí)施例涉及確定試劑是否是自噬抑制劑的方法，所述方法包括將細(xì)胞與試劑接觸的步驟，其中所述細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的異源性自噬增強(qiáng)基因，借以細(xì)胞中的自噬降低表明試劑是自噬抑制劑。在一些方面，所述試劑是小分子、抗體或抑制性RNA分子。本發(fā)明的某些實(shí)施例涉及確定試劑是否是自噬抑制劑的方法，所述方法包括將細(xì)胞與試劑接觸的步驟，其中本發(fā)明中自噬抑制基因的表達(dá)在所述細(xì)胞中被抑制，借以細(xì)胞中的自噬降低表明試劑是自噬抑制劑。在一些方面，所述試劑是小分子、抗體或抑制性RNA分子。在某些實(shí)施例中，所述細(xì)胞包括自噬相關(guān)基因的突變。在其他實(shí)施例中，所述自噬相關(guān)基因被抑制性RNA或小分子抑制。附圖簡述圖IA為熒光顯微鏡圖片，其描述了 H4細(xì)胞中GFP表達(dá)的位置，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)LC3-GFP并用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或針對mTOR或Atg5的siRNA轉(zhuǎn)染。圖IB顯示了使用抗LC3抗體或抗微管蛋白抗體和H4細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行的免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果，所述H4細(xì)胞用非靶向性對照siRNA (ntRNA)或針對mTOR或Atg5的siRNA轉(zhuǎn)染。圖2顯示了 H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)GFP的定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)LC3-GFP并用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或針對mTOR或Atg5的siRNA轉(zhuǎn)染。星號表示指定水平和被ntRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞水平之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3顯示了本發(fā)明自噬調(diào)節(jié)基因的基因符號、基因編號、Genbank登記號和名稱。圖4顯示的示意圖描述了用于鑒定和表征本發(fā)明中自噬調(diào)節(jié)基因的篩選和表征的檢測的選擇。圖5顯示了測量mTORCl活性的原位細(xì)胞免疫印跡測定系列的定量結(jié)果。星號表示指定樣品和ntRNA對照樣品之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖6顯示了基因的基因符號、基因編號、Genbank登記號以及基因名稱，抑制所述基因產(chǎn)物導(dǎo)致mTORC表達(dá)減少。
圖7顯示了基因的基因符號、基因編號、基因的名稱，抑制所述基因產(chǎn)物導(dǎo)致mTORC表達(dá)減少和在有雷帕霉素存在情況下自噬下調(diào)。圖8A顯示的熒光顯微鏡圖片描述了在H4細(xì)胞中RFP表達(dá)的位置，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Lampl-RFP并且用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或針對mTOR的siRNA轉(zhuǎn)染。圖8B顯示了 H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)RFP的定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)LC3-GFP并且用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或者針對mTOR或Atg5的siRNA轉(zhuǎn)染。星號表示指定水平和ntRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的水平間具有顯著性差異。圖9顯不了基因符號、基因編號、Genbank的登記號以及基因名稱。所述基因廣物的抑制會引起Lampl-RFP表達(dá)細(xì)胞中自噬相關(guān)的Lampl-RFP水平發(fā)生顯著改變。圖IOA顯示的熒光顯微鏡圖片描繪了在H4細(xì)胞中dsRed表達(dá)的位置，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)FYVE-dsRed并且用針對Vprs34或mTOR的siRNA轉(zhuǎn)染。圖IOB顯示了 H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)dsRed的定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)FYVE-dsRed并用針對Vprs34或mTOR的siRNA轉(zhuǎn)染。星號表示指定水平和ntRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的水平間具有顯著性差異。圖10C顯示了 H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)dsRed的定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)FYVE-dsRed并用針對Raptor 或 mTOR 的 siRNA 轉(zhuǎn)染。圖11顯不了基因符號、基因編號、Genbank的登記號以及基因名稱。抑制所述基因產(chǎn)物會引起PtdIns3P水平發(fā)生顯著改變。圖12顯示的文氏圖描繪了基因的細(xì)分，抑制這些基因的產(chǎn)物會誘導(dǎo)自噬體成為功能類型(functional categories),所述功能類型是基于其對III型PI3激酶活力、溶酶體的功能和mTORCl的活性的依賴性。圖13顯示自噬體相關(guān)基因靶向的siRNAs (H4)轉(zhuǎn)染的野生型H4細(xì)胞相對于自噬體相關(guān)基因靶向的siRNAs (H4+Bcl-2)轉(zhuǎn)染的表達(dá)Bcl_2的H4細(xì)胞的相對平均存活率。星號表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖14顯示了相對存活率、基因符號、基因編號以及基因名稱。抑制所述基因的產(chǎn)物會增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)細(xì)胞的自噬。圖15顯示了相對存活率、基因符號、基因編號以及基因名稱。抑制所述基因的產(chǎn)物會增強(qiáng)野生型細(xì)胞的自噬而不增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)細(xì)胞的自噬。圖16顯示了細(xì)胞免疫印跡檢測定量結(jié)果，其證明衣霉素處理后的H4細(xì)胞中GRP78和GRP94水平增加。星號表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
圖17顯示了基因符號、基因編號以及基因名稱。抑制所述基因的產(chǎn)物會增強(qiáng)自噬并改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。圖18顯示的免疫印跡描述了 pBabe-Bcl-2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和嘌呤霉素選擇后，H4LC3-GFP細(xì)胞和H4FYVE-dsRed細(xì)胞中Bcl_2的表達(dá)。圖19A顯示了 H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)的GFP定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)LC3-GFP和Bcl-2并且用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或針對mTOR的siRNA轉(zhuǎn)染。星號表示指定水平和ntRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞水平間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖19B顯示H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)dsRed的定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)FYVE-dsRed和Bcl_2并且用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或針對mTOR的siRNA轉(zhuǎn)染。星號表示指定水平和ntRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞水平間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖19C顯示了 H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)的dsRed定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)FYVE-dsRed并且用針對自噬相關(guān)基因產(chǎn)物的siRNA轉(zhuǎn)染，所述自噬相關(guān)基因產(chǎn)物不表達(dá)Bcl-2 (H4)，或者表達(dá)Bcl-2 (H4+Bcl-2)。星號表示指定水平間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。圖20顯示自噬相關(guān)基因的細(xì)分，對所述自噬相關(guān)基因的敲除能誘導(dǎo)自噬體在低Ptdlns3p條件下成為功能類型，所述功能類型式是基于自噬體上調(diào)III型PI3激酶活性的能力或改變?nèi)苊阁w功能的能力。圖21A顯不本發(fā)明選定的自卩遼相關(guān)基因廣物如何與特定蛋白復(fù)合物相關(guān)。圖21B顯示本發(fā)明選定的自噬相關(guān)基因產(chǎn)物如何與轉(zhuǎn)錄因子和染色體修飾酶的網(wǎng)絡(luò)相關(guān)。圖22顯示本發(fā)明選定的自曬相關(guān)基因產(chǎn)物如何與核心自曬裝置(machinery)相互作用。圖23顯示本發(fā)明選定的自噬相關(guān)基因產(chǎn)物如何在軸突導(dǎo)向調(diào)節(jié)通路中相互作用。圖24顯示發(fā)明選定的自噬相關(guān)基因產(chǎn)物如何在肌動蛋白-細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路中相互作用。圖25A顯示本發(fā)明的自噬相關(guān)基因根據(jù)分子功能類別的細(xì)分。圖25B顯示根據(jù)圖25A分類為受體的本發(fā)明的自噬相關(guān)基因的進(jìn)一步受體細(xì)分。圖26顯示了本發(fā)明的自噬相關(guān)基因的分子功能類別、基因符號、基因編號以及基因名稱。圖27A顯示本發(fā)明的自噬相關(guān)基因根據(jù)生物過程類別的細(xì)分。圖27B顯示根據(jù)圖27A分類為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)的本發(fā)明的自噬相關(guān)基因的進(jìn)一步信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)分。圖28顯示指定生長因子(IGF1、FGF2、LIF、CLCFl和SDF1)存在條件下生長的H4LC3-GFP細(xì)胞中自噬體相關(guān)GFP的定量水平。星號表明顯示的水平和未處理細(xì)胞水平間
具有顯著性差異。圖29顯示的熒光顯微鏡圖片描述了 H4細(xì)胞中GFP表達(dá)的位置，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)LC3-GFP并且H4細(xì)胞或者在營養(yǎng)不足條件下不經(jīng)處理(未處理)，或者在正常生長條件下不經(jīng)處理(血清)，或者在營養(yǎng)不足條件下經(jīng)CLCFl、LIF、FGF2或IGF處理(分別為CLCFl、LIF、FGF2 和 IGF)。圖30顯示在雷帕霉素存在或不存在的條件下，細(xì)胞因子能抑制自噬。H4細(xì)胞培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中，之后加入Att Docket編號HV-195. 26的100ng/mL IGFl (A)、50ng/mLFGF2(B)、50ng/mL LIF(C)或 50ng/mL CLCFl (D)和 10 y g/mL E64d(E)。需要指出的是，在加入細(xì)胞因子I小時(shí)前，細(xì)胞先經(jīng)50nM雷帕霉素預(yù)處理。通過使用抗LC3抗體的免疫印跡測定自噬水平；用抗磷酸化-S6 (235/236位絲氨酸，P-S6)和抗磷酸化-S6激酶(389位蘇氨酸，P-S6K)的抗體測定mTORCl的活性。LC3II/微管蛋白比值的定量測定如圖所示。圖31A顯示了在有5、20、100* 200ng/ml的TNFa或雷帕霉素的條件下生長的H4LC3-GFP細(xì)胞中自噬體相關(guān)GFP的定量結(jié)果。星號表示顯示的水平和未處理細(xì)胞水平間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖31B顯示的免疫印跡描述了 H4細(xì)胞中p62的水平，所述H4細(xì)胞或者在營養(yǎng)不足條件下不經(jīng)處理(_)，或者在正常生長條件下不經(jīng)處理(血清)，或者經(jīng)雷帕霉素處理(Rap )，或者在營養(yǎng)不足條件下經(jīng)5ng/ml TNFa處理。圖32顯示的熒光顯微鏡圖片描述了 H4細(xì)胞中GFP表達(dá)的位置，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定、表達(dá)LC3-GFP并且用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或?qū)elA具有特異性的四種不同的siRNA轉(zhuǎn)染。圖33顯示H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)GFP水平的定量結(jié)果，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)LC3-GFP并且用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或?qū)elA具有特異性的四種不同的siRNA轉(zhuǎn)染。星號表示顯示的水平和ntRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞水平間具有顯著性差異。圖34么顯示檢測114細(xì)胞中1^認(rèn)mRNA水平的RT-PCR半定量結(jié)果，H4細(xì)胞用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或?qū)elA具有特異性的四種不同的siRNA中的一種轉(zhuǎn)染。圖34B顯示H4細(xì)胞中p65水平的免疫印跡測定結(jié)果，所述H4細(xì)胞用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或?qū)elA具有特異性的四種不同的siRNA中的一種或?qū)elA具有特異性的siRNA組合轉(zhuǎn)染。圖35A顯示的免疫印跡描述了 RelA和LC3在野生型H4細(xì)胞中的水平(野生型)以及RelA+和NF B+雙敲除H4細(xì)胞中的水平(雙敲除)。圖35B顯示的免疫印跡描述了RelA, p62和LC3在H4細(xì)胞中的水平，所述H4細(xì)胞用對RelA具有特異性的siRNA、非靶向性的 siRNA (nt)、mTor 或 Atg5 轉(zhuǎn)染。圖36A顯示的流式細(xì)胞儀(FACS)柱狀圖描述了在正常生長條件下(模型)和營養(yǎng)不足條件下(饑餓)活性氧在野生型H4細(xì)胞以及RelA+和NFKLB+雙敲除(雙敲除)的H4細(xì)胞中的水平。圖36B顯示了圖36A中描述的定量數(shù)據(jù)。圖36C顯示了活性氧在處于正常條件下(+血清)或饑餓狀態(tài)下(HBSS) H4細(xì)胞中的定量水平，所述H4細(xì)胞用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或?qū)elA具有特異性的siRNA轉(zhuǎn)染。圖37顯示在營養(yǎng)不足的條件下以及在抗氧化劑(N-乙?；?L-半胱氨酸，NAC)存在或不存在條件下H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)GFP的定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)LC3-GFP并且用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或?qū)elA具有特異性的siRNA轉(zhuǎn)染。圖38顯示了本發(fā)明的自噬相關(guān)基因的基因符號、基因編號以及預(yù)測基礎(chǔ)，所述基因產(chǎn)物預(yù)測定位于線粒體上。圖39顯示了本發(fā)明的自噬相關(guān)基因的基因符號、基因編號以及名稱，所述自噬相關(guān)基因已知與氧化損傷或活性氧的調(diào)節(jié)有關(guān)。圖40A顯示的免疫印跡描述了 H4細(xì)胞中S0D1、p62和LC3的水平，所述H4細(xì)胞用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或?qū)ODl具有特異性的siRNA轉(zhuǎn)染。圖40B顯示的熒光顯微鏡圖片描述了用非靶向性對照siRNA (nt)或?qū)ODl具有特異性的siRNA轉(zhuǎn)染過或經(jīng)IOOmM叔丁基過氧化氫(TBHP)處理過的細(xì)胞中的活性氧水平。圖40C顯示了用非靶向性對照siRNA (nt)或?qū)ODl具有特異性的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中活性氧的定量水平。星號表示顯示的水平和ntRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的水平間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖41顯示了在抗氧化劑存在(NAC)或不存在(_)的條件下，H4細(xì)胞中自噬體相關(guān)GFP的定量水平，所述H4細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)LC3-GFP并且用非靶向性的對照siRNA (ntRNA)或?qū)TOR或SODl具有特異性的siRNA轉(zhuǎn)染。星號表示顯示的水平和ntRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞水平間具
有顯著性差異。圖42顯示了基因符號、基因編號以及基因名稱，所述基 因產(chǎn)物的抑制在抗氧化劑不存在條件下會弓I起自噬增強(qiáng)，而抗氧化劑存在下不會弓I起自噬增強(qiáng)。圖43顯示了在抑制本發(fā)明的自噬相關(guān)基因產(chǎn)物后III型PI3激酶平均活性的定量結(jié)果，所述自噬相關(guān)基因在抗氧化劑存在(NAC)條件下能(誘導(dǎo))或不能(不誘導(dǎo))誘導(dǎo)自曬。圖44顯示了基因符號、基因編號以及基因名稱，所述基因產(chǎn)物的抑制在抗氧化劑存在條件下會引起自噬增強(qiáng)。圖45顯示了相對于篩選中所有檢測的基因，命中基因(hit genes)中的正則通路(canonical pathways) (MSigDB)的富集分析。P值〈O. 05 (超幾何分布)即認(rèn)為具有顯著性差異。僅顯示了有至少五個(gè)基因的類別。圖46顯示加入MEK抑制劑U0126能阻礙50ng/mL FGF2引起的自噬下調(diào)。H4細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中生長，用抗LC3抗體評估lOiig/mL E64d存在下自噬的水平，用磷酸 化-ERK1/2、磷酸化-RSK和磷酸化-S6 (235/236位點(diǎn)絲氨酸)評估MEK抑制。LC3II/微管蛋白比值的定量測定如圖所示。圖47顯示了用基于基序基因進(jìn)行的順式調(diào)控元件/轉(zhuǎn)錄因子(TF)在命中基因啟動子中結(jié)合位點(diǎn)的富集分析，所述基于基序基因是根據(jù)TRANSPFAC數(shù)據(jù)庫定義的MSigDB和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)設(shè)定。突出了 SRF位點(diǎn)。圖48顯示的免疫印跡描述了 50ng/mL CLCF I處理后Stat3的磷酸化。圖49顯示了 50ng/mL LIF引起的自卩遼下調(diào)能被siRNA介導(dǎo)的Stat3敲除所阻礙。H4細(xì)胞用指定的siRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)，然后用圖46描述的方法處理細(xì)胞。Stat3的蛋白水平和磷酸化如圖所示。圖50顯示了 100ng/mL IGFl引起的自噬抑制能被Akt抑制劑VIII所阻礙。細(xì)胞處理方法如圖46所述。用抗磷酸化-Foxo3a和抗磷酸化_rpS6的抗體測定Akt的活性。圖51顯示了選定的自噬命中基因在年輕人腦樣品(〈40歲)和年老人腦樣品(>70歲)中mRNA表達(dá)水平的聚類分析。圖52顯示了如圖45所示數(shù)據(jù)的相關(guān)矩陣。圖53顯示了選定的自噬命中基因在年輕人腦樣品(〈40歲)和年老人腦樣品(>70歲)中mRNA表達(dá)水平的聚類分析(dChip)。圖54顯示了本發(fā)明中自噬相關(guān)基因的相關(guān)矩陣，所述自噬相關(guān)基因具有最顯著年齡依賴性調(diào)節(jié)作用。圖55顯示了本發(fā)明中自噬相關(guān)基因的基因符號、基因編號、倍數(shù)變化以及p值，所述自噬相關(guān)基因在老化過程中，在人腦內(nèi)被差異性調(diào)節(jié)。圖56顯示了本發(fā)明的自噬相關(guān)基因在老化過程中表達(dá)水平。圖57顯示了差異基因表達(dá)導(dǎo)致阿爾茲海默氏病中的自噬上調(diào)。如圖顯示了篩選命中基因(screen hit gene)的歸一化富集分?jǐn)?shù)(NES)弗雷斯特圖以及評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖57A顯示了所有篩選命中基因在AD腦部不同區(qū)域表達(dá)的GSEA分析結(jié)果，以年齡匹配未受影響組作為對照。圖57B和圖57C顯示了命中基因GSEA分析結(jié)果，所述命中基因證實(shí)為自噬通量負(fù)調(diào)節(jié)劑(B)或正調(diào)節(jié)劑(C)。方塊面積與各自的標(biāo)準(zhǔn)偏差成反比。圖58顯示了經(jīng)5 ii MA 0處理過H4細(xì)胞中LC3-II累積水平的比較，所述H4細(xì)胞中存在或不存在IOii ME64d。圖59顯示了 A P誘導(dǎo)PtdIns3P累積的結(jié)果。如圖58中所述方法處理FYVE-dsRed細(xì)胞，固定并成像。圖上標(biāo)明的3MA是III型PI3激酶抑制劑，于固定前8小時(shí)加入(10mM)。
圖60顯示了 AP誘導(dǎo)的III型PI3激酶活性可被抗氧化劑所抑制。細(xì)胞的處理方法如圖59所述，并使用抗氧化劑NAC或者不使用抗氧化劑NAC處理。圖61顯示了 AP誘導(dǎo)的自噬依賴于III型PI3激酶活性。H4GFP_LC3cells的處理方法和成像如圖59所述。圖62顯示了 AP誘導(dǎo)的自噬依賴于III型PI3激酶活性。用抗III型PI3激酶亞基Vps34的siRNA或非靶向性對照siRNA轉(zhuǎn) 染H4細(xì)胞，并用圖59所述方法處理細(xì)胞。分別用抗LC3和抗Lamp2的抗體測定自噬和溶酶體的變化。圖63顯示了本發(fā)明中選定的調(diào)控自噬相關(guān)基因小分子試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖64顯不了本發(fā)明的自嗤相關(guān)基因的Genbank登記號、名稱、基因符號和mRNA序列。發(fā)明詳述 自噬是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)組分更新，保護(hù)多細(xì)胞真核生物抵抗眾多疾病的溶酶體依賴性分解代謝過程。為了研發(fā)新方法來調(diào)節(jié)自噬和治療自噬相關(guān)疾病，利用人類siRNA文庫的，高通量的，基于圖像的全基因組篩選來識別參與自噬調(diào)控和調(diào)節(jié)的基因。該篩選得到的236個(gè)自噬相關(guān)基因，如果將其敲除，則會導(dǎo)致正常營養(yǎng)水平條件下自噬水平的增加或降低。本發(fā)明的自噬相關(guān)基因列表如圖3所示，所述基因通過高通量檢測、低通量檢測和生物信息檢測的組合方法來進(jìn)行廣泛的表征。根據(jù)上述結(jié)果，確定了調(diào)控上述基因及其產(chǎn)物的有效生物學(xué)和藥學(xué)試劑并確定了用于調(diào)控自噬和治療自噬相關(guān)疾病的新方法。因此本發(fā)明提供了調(diào)控自噬和治療自噬相關(guān)疾病的新方法，所述疾病包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、肝病、肌肉疾病和胰腺炎。定義下文及本發(fā)明中所定義的一些術(shù)語和短語是為了使本發(fā)明更易于理解。本申請中使用的冠詞“一”和“一個(gè)”是指一個(gè)或多于一個(gè)(例如，指至少一)符合文章語法的對象。舉例說明如，“一成份”指的是一種成份或多于一種成份。本申請中使用的術(shù)語“給予”是指向主體提供藥學(xué)試劑或組分，并包括但不限于，由醫(yī)學(xué)專業(yè)人員給予和自我給予。本申請中使用的術(shù)語“試劑”指的是在主體或細(xì)胞上能產(chǎn)生預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)體。本技術(shù)領(lǐng)域已有許多治療試劑并可以通過它們的效果識別出來。源于生物的治療試劑例如包括生長因子、激素和細(xì)胞因子。本技術(shù)領(lǐng)域已有許多治療試劑并可以通過它們的效果識別出來。例子包括小分子(例如藥物)、抗體、多肽、蛋白(例如細(xì)胞因子、激素、可溶性受體和非特異性蛋白)、寡核苷酸(例如編碼多肽的DNA和RNA、雙鏈RNA和反義RNA)以及擬肽。本申請中使用的術(shù)語“抗體”包括全長抗體和任意抗原結(jié)合片段(即抗原結(jié)合部分)或其單鏈。述語“抗體“包括但不限于，包括二硫鏈互聯(lián)的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白，或者是其抗原結(jié)合部分?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體；可以是異源的、同源的或合成的；可以是其修飾形式(例如擬人化、嵌合的)。本申請中使用的短語抗體的“抗原結(jié)合部分”指的是一個(gè)或多個(gè)保留了抗原結(jié)合能力的抗體片段?？贵w的抗原結(jié)合功能可以通過一個(gè)全長抗體中的片段實(shí)現(xiàn)。術(shù)語“抗原結(jié)合部分”包含了結(jié)合片段，所述結(jié)合片段的例子包括(i ) Fab片段、單價(jià)片段，其由VH、\、CL和CHl功能域組成；(ii) F(ab’)2片段、雙價(jià)片段，其包括鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩段Fab片段；(iii )由Vh和CHl功能域組成的Fd片段；(iv)Fv片段，其由抗體單臂的Vh和Vl功能域組成；(^)由 Vh 功能域組成的 dAb 片段(Ward et al. , (1989) Nature 341:544546)；以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)或(vii)由兩個(gè)或多個(gè)分離的互補(bǔ)決定區(qū)組成的組合，所述互補(bǔ)決定區(qū)可選地通過一合成的連接物連接。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)功能域Vh和'由不同的基因編碼，但它們可以通過重組方法相連接，所述重組方法通過合成的連接物使兩個(gè)功能域相連接成為一個(gè)單獨(dú)蛋白鏈，其中Vh和\功能域配對形成單價(jià)分子(稱作單鏈抗體(scFv);參見例如Bird et al. (1988) Science 242:423426; and Huston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883)。這些單鏈抗體同樣也包括在抗體的術(shù)語“抗原結(jié)合部分”中。這些抗體片段可通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)技術(shù)得到，并且通過與完整的抗體相同的篩選方式篩選這些片段的用途本申請中使用的術(shù)語“癌癥”包括但不限于，實(shí)體瘤和血源性腫瘤。術(shù)語癌癥包括皮膚的、組織的、器官的、骨骼的、軟骨的、血液和血管的病變。術(shù)語“癌癥”還包含原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌。本申請中使用的短語“基因產(chǎn)物”和“基因的產(chǎn)物”指的是由基因編碼并可以直接或間接通過基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的物質(zhì)。短語“基因產(chǎn)物”和“基因的產(chǎn)物”包括RNA基因產(chǎn)物(例如mRNA)、DNA基因產(chǎn)物(例如cDNA)和多肽基因產(chǎn)物(例如蛋白)。本申請中使用的短語基因產(chǎn)物的“活性增強(qiáng)”指的是與基因產(chǎn)物相關(guān)的特定活性的增加?；钚栽鰪?qiáng)的例子包括但不限于，mRNA翻譯增加、通過多肽或蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)以及通過酶的催化增強(qiáng)?；钚栽鰪?qiáng)的發(fā)生可以通過，例如單個(gè)基因產(chǎn)物活性量的增強(qiáng)、產(chǎn)生活性的基因產(chǎn)物的數(shù)量的增加，或是通過兩者的任意組合。如果基因產(chǎn)物增強(qiáng)了生物學(xué)過程(例如自噬)，那么這種基因產(chǎn)物的“活性增強(qiáng)”通常會增強(qiáng)該過程。相反地，如果基因產(chǎn)物起到抑制生物學(xué)過程的作用，那么這種基因產(chǎn)物的“活性增強(qiáng)”通常會抑制該過程。本申請中使用的短語基因產(chǎn)物的“活性抑制”指的是與基因產(chǎn)物相關(guān)的特定活性的降低?；钚砸种频睦影ǖ幌抻冢琺RNA翻譯減弱、通過多肽或蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱以及通過酶的催化減弱?；钚詼p弱的發(fā)生可以通過，例如單個(gè)基因產(chǎn)物活性量的減少、產(chǎn)生活性的基因產(chǎn)物的數(shù)量的減少，或是通過兩者的任意組合。如果基因產(chǎn)物增強(qiáng)了生物學(xué)過程(例如自噬)，那么這種基因產(chǎn)物的“活性抑制”通常會抑制該過程。相反地，如果基因產(chǎn)物起到抑制生物學(xué)過程的作用，那么這種基因產(chǎn)物的“活性抑制”通常會增強(qiáng)該過程。本申請中使用的術(shù)語“分離的”指的是實(shí)體(如多肽或聚核苷酸)游離的狀態(tài)，或?qū)嵸|(zhì)上游離于與其自然相關(guān)的物質(zhì)，例如其它多肽或聚核苷酸。其共同存在于自然環(huán)境中或制備環(huán)境中(例如細(xì)胞培養(yǎng))。多肽或聚核苷酸可與稀釋劑或佐劑一起配制并仍可認(rèn)為是“分離的”，例如，多肽或聚核苷酸可與可藥用的載體或稀釋劑相混合用于診斷或治療。本申請中使用的術(shù)語“調(diào)控”指的是生物學(xué)活性的上調(diào)(例如活化或激活)，下調(diào)(例如抑制或阻止)，或上述兩種情況的組合或分離。本申請中使用的短語“神經(jīng)退行性障礙”和“神經(jīng)退行性疾病”指的是許多不同的疾病和/或中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)病理學(xué)，以及包括但不限于，帕金森病、阿爾茲海默氏病(AD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、神經(jīng)性萎縮、耳硬化癥、中風(fēng)、癡呆、多發(fā)性硬化癥、亨廷頓氏病、獲得性免疫缺陷病(AIDS)相關(guān)腦病以及其他與神經(jīng)細(xì)胞毒性與細(xì)胞死亡相關(guān)的疾病。本申請中使用的短語“可藥用的”指那些符合明智的醫(yī)療判斷、適合于與人類或動物組織接觸使用而沒有過度毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥、具有合理的獲益/風(fēng)險(xiǎn)比的試劑、化合物、材料、組合物和/或劑型。本申請中使用的短語“可藥用的載體”指的是藥學(xué)上可接受的材料、組合物或賦形齊IJ，例如液體或固體的充填劑、稀釋液、賦形劑或者是溶劑封裝材料，其參與運(yùn)送或運(yùn)輸試劑從一器官或身體的一部分至另一器官或身體的另一部分。每一種載體都必須“可接受”，即能與制劑的其他組分相容并且不會對病人有害。可用作可藥用載體的材料的例子包括(I)糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉類，例如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉末狀黃芪膠；(5)麥芽；
(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油類，例如花生油、棉籽油、蓖麻油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10) 二醇類，例如丙二醇；(11)多元醇類，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；
(14)緩沖試劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；
(18)林格式溶液；(19)乙醇；(20) pH緩沖溶液；(21)聚酯類、聚糖酸酯和/或聚酸酐；以及(22)其他藥學(xué)制劑中應(yīng)用的無毒生物相容的物質(zhì)。本申請中使用的短語“可藥用的鹽”指的是相對無毒的化合物的有機(jī)鹽和無機(jī)鹽。本申請中使用的術(shù)語“主體”指的是選定用于處理或治療的人類或非人類動物。本申請中使用的短語“疑似患有.....的主體”指的是表現(xiàn)出一項(xiàng)或多項(xiàng)疾病或狀態(tài)的臨床癥狀的主體。在一些實(shí)施例中，所述疾病或狀態(tài)是癌癥、神經(jīng)退行性疾病或胰腺炎。本申請中使用的短語“需要它的主體”指的是確定為需要本發(fā)明的治療或處理的主體。本申請中使用的短語“治療效果”指定是由一種試劑引起的動物，特別是哺乳動物，更特別的是人類的局部或系統(tǒng)效果。短語“治療有效量”和“有效量”指的是在至少一個(gè)細(xì)胞亞群中試劑產(chǎn)生一定預(yù)期效果的量。治療有效量包括試劑產(chǎn)生一定預(yù)期局部或系統(tǒng)效果的量，所述效果應(yīng)具有可應(yīng)用于任何治療的合理的獲益/風(fēng)險(xiǎn)比。例如，本發(fā)明的方法中使用的一些試劑可以給予足夠的量來產(chǎn)生可應(yīng)用于這些治療的合理的獲益/風(fēng)險(xiǎn)比。本申請中使用的術(shù)語“治療”主體的疾病或“治療”患有或疑似患有疾病的主體指的是向主體給予藥學(xué)處理，例如，給予試劑從而使至少疾病的一種癥狀得到減少或阻止癥狀的惡化。自嗤相關(guān)基因本發(fā)明的自噬相關(guān)基因可以分為其產(chǎn)物抑制自噬的基因(或自噬抑制基因，如表I所示)和其產(chǎn)物增強(qiáng)自噬的基因(或自噬增強(qiáng)基因，如表2所示)。調(diào)控自噬抑制基因產(chǎn)物活性的試劑在自噬相關(guān)疾病治療中很有用。抑制自噬抑制基因產(chǎn)物活性的試劑可以引起自噬水平提高并因此可以用于增強(qiáng)自噬的方法中和對自噬水平提聞有響應(yīng)的自曬相關(guān)疾病的治療中，所述疾病例如神經(jīng)退行性疾病和蛋白質(zhì)病。另一方面，增強(qiáng)自噬抑制基因產(chǎn)物活性的試劑可以引起自噬水平降低并因此可以用于抑制自噬的方法中和對自噬抑制響應(yīng)的自噬相關(guān)疾病的治療中，所述疾病例如癌癥和胰腺炎。
表I.自噬抑制基因。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞自噬的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與抑制基因產(chǎn)物活性的試劑接觸，所述基因選自由表2所列基因組成的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述基因選自由表4所列基因組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述基因選自由表6所列基因組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述試劑是siRNA、shRNA或反義RNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述基因是TPR或GPR18。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述試劑是針對所述基因產(chǎn)物的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述基因是RelA或NFK B。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述基因是RelA。
9.一種誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與增強(qiáng)基因產(chǎn)物活性的試劑接觸，所述基因選自由表2所列基因組成的組(降低自噬的命中基因)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述基因選自由表4所列基因組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述基因選自由表6所列基因組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述基因是TPR或GPR18。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述試劑是所述基因產(chǎn)物特異性的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述基因是RelA或NFκ B。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述基因是RelA。
16.一種治療主體中神經(jīng)退行性疾病的方法，所述方法包括給予所述主體一種增強(qiáng)基因產(chǎn)物活性的試劑，所述基因選自由表2所列基因組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述基因選自由表4所列基因組成的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述基因選自由表6所列基因組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述基因是TPR或GPR18。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述試劑是所述基因產(chǎn)物特異性的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述基因是RelA或NFκ B。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述基因是RelA。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病選自下組腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥、酒精中毒、亞歷山大氏病、阿耳珀病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、運(yùn)動失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、貝敦氏癥、牛海綿狀腦病、卡納萬病、大腦性麻痹、科克因綜合癥、皮質(zhì)基底核退化癥、克雅氏病、家族性致命性失眠、額顳葉退化、亨廷頓病、人類免疫缺陷病毒伴發(fā)性癡呆、肯尼迪氏癥、球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、路易體癡呆、神經(jīng)萊姆病、馬-約病、多系統(tǒng)萎縮、多發(fā)性硬化、發(fā)作性睡病、尼曼匹克癥、帕金森病、佩-梅二氏病、皮克氏病、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、朊病毒病、進(jìn)行性核上麻痹、植烷酸貯積癥、山德霍夫氏病、謝耳德病、惡性貧血繼發(fā)性亞急性脊髓混合變性、斯皮爾梅伊爾-沃格特-肖格倫-巴滕病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、脊髓性肌萎縮、進(jìn)行性核上性麻痹、脊髓癆和中毒性腦病。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性疾病是蛋白質(zhì)病。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)病選自下組阿爾茨海默氏病、帕金森病、路易體癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、亨廷頓病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)和脊髓延髓肌萎縮。
26.一種治療主體中疾病的方法，所述方法包括給予所述主體抑制基因產(chǎn)物活性的試齊U，所述基因選自由表2所列基因組成的組(降低自噬的命中基因)，其中所述疾病是癌癥或胰腺炎。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述基因選自由表4所列基因組成的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述基因選自由表6所列基因組成的組。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述試劑是siRNA、shRNA或反義RNA分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述基因是TPR或GPR18。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述試劑是所述基因產(chǎn)物特異性的抗體。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述基因是RelA或NFκ B。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述基因是RelA。
34.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，進(jìn)一步包括給予化學(xué)治療劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述化學(xué)治療劑選自下組六甲蜜胺、天冬酰胺酶、BCG、硫酸博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、2-氯脫氧腺苷、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、咪唑羧酰胺、更生霉素、柔紅霉素、地塞米松、阿霉素、依托泊苷、氟尿苷、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺、氟達(dá)拉濱、戈舍瑞林、羥基脲、鹽酸伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、干擾素α、干擾素a 2a、干擾素a 2b、干擾素αη3、伊立替康、亞葉酸鈣、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、甲地孕酮、美法侖、左旋苯丙氨酸氮芥、鹽酸美法侖、美司鈉、氮芥、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、巰嘌呤、紫杉醇、普卡霉素、潑尼松、丙卡巴肼、鏈佐星、他莫昔芬、6-硫鳥嘌呤、塞替派、托泊替康、長春堿、長春新堿和酒石酸長春瑞濱。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，進(jìn)一步包括給予放射治療。
38.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述疾病是胰腺炎。
39.一種治療主體中蛋白質(zhì)病的方法，所述方法包括給予所述主體增強(qiáng)基因產(chǎn)物活性的試劑，所述基因選自由表2所列基因組成的組。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述基因選自由表4所列基因組成的組。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述基因選自由表6所列基因組成的組。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述基因是TPR或GPR18。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述試劑是所述基因產(chǎn)物的特異性抗體。
44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述基因是RelA或NFκ B。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述基因是RelA。
46.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)病選自下組αI-抗胰蛋白酶缺乏、散發(fā)性包涵體肌炎、2Β型角膜緣帶肌營養(yǎng)不良和三好氏肌肉病變、阿爾茨海默氏病、帕金森病、路易體癡呆、ALS、亨廷頓病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)和脊髓延髓肌萎縮。
47.一種確定試劑是否是自噬抑制劑的方法，所述方法包括將細(xì)胞與所述試劑接觸的步驟，其中所述細(xì)胞表達(dá)異源性自噬增強(qiáng)基因，其中所述自噬增強(qiáng)基因選自由表2所列基因組成的組，借以所述細(xì)胞中的自噬降低表明試劑是自噬抑制劑。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述試劑是小分子。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述試劑是抗體。
50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述試劑是抑制性RNA分子。
全文摘要
本申請涉及自噬的調(diào)節(jié)方法以及自噬相關(guān)疾病的治療方法，所述疾病包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病和胰腺炎。
文檔編號C07K16/18GK102639700SQ201080054299
公開日2012年8月15日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者M·M·利平斯基, 袁君英 申請人:哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會