專利名稱：治療劑、用途和方法
治療劑、用途和方法本發(fā)明涉及用于向單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞靶向遞送免疫抑制劑的治療劑。本發(fā)明還涉及包含此類治療劑的方法、用途、試劑盒和組合物。糖皮質(zhì)激素(例如地塞米松)是最有效的已知抗炎藥物，常用于早期的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，在大部分患者中以低劑量長期使用。然而，在用于長期治療時，糖皮質(zhì)激素具有限制慢性治療的嚴(yán)重不良副作用(例如，骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、腎上腺抑制、感染風(fēng)險提高、生長阻滯、II型糖尿病等)。巨噬細(xì)胞是先天免疫防御的一部分，并且在很多感染性、自身免疫性和惡性疾病中發(fā)揮核心作用。在自身免疫性/炎性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)中，巨噬細(xì)胞是已知在疾病進(jìn)程中至關(guān)重要的炎性分子(例如TNF-a)的主要來源。在很多感染性疾病(例如TB和HIV)中，巨噬細(xì)胞藏匿感染因子。少數(shù)惡性疾病來源于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的細(xì) 胞，例如組織細(xì)胞肉瘤。⑶163是在巨噬細(xì)胞上表達(dá)的膜受體分子，其作為血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物的胞吞受體發(fā)揮功能。通過這種在生理學(xué)上非常重要的功能，⑶163每天攝取約Ig的血紅蛋白，因此，該蛋白質(zhì)可能是巨曬細(xì)胞上表達(dá)最聞的受:體。在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于向單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞靶向遞送免疫抑制劑的治療劑，其包含(a)對單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞具有特異性的結(jié)合部分(bindingmoiety);和(b)免疫抑制劑。藥物對巨噬細(xì)胞的直接靶向(例如，下調(diào)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生)能夠?qū)δ承┘膊‘a(chǎn)生顯著影響，而不影響體內(nèi)的其他細(xì)胞。因此，藥物對巨噬細(xì)胞靶向以在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮作用可降低由于對其他類型細(xì)胞的作用而導(dǎo)致的副作用。因此，靶向能夠提高藥物的治療指數(shù)。例如，將糖皮質(zhì)激素特異性地靶向到受影響組織和/或疾病改性細(xì)胞的方法可提供較低副作用的獨(dú)特前景并解決上述問題。特別地，將糖皮質(zhì)激素選擇性地指向患關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)但不傷害骨骼和軟組織可具有顯著的治療優(yōu)勢。眾所周知，單核細(xì)胞是在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的單核吞噬細(xì)胞，也就是說，它們是具有單個細(xì)胞核的白細(xì)胞，其能夠攝取外來物質(zhì)。單核細(xì)胞從血液遷移到機(jī)體組織并分化成諸如巨噬細(xì)胞的細(xì)胞。因此，所述“源自單核細(xì)胞的細(xì)胞”包括已經(jīng)從單核細(xì)胞分化而來的那些細(xì)胞類型。所述“治療劑”包括包含一個或多個分子的任何純化或分離的天然或化學(xué)合成的實(shí)體。優(yōu)選地，此術(shù)語包括一種或多種多肽和/或一種或多種小化學(xué)分子，其中所述多肽和/或小化學(xué)分子可經(jīng)或未經(jīng)化學(xué)基團(tuán)離子性和/或疏水性和/或共價加成的修飾。術(shù)語“結(jié)合部分”包括能夠通過共價和/或離子性相互作用與一種或多種其他分子的一個或多個區(qū)域可逆和/或不可逆地結(jié)合的本發(fā)明治療劑的一個或多個區(qū)域?；蛘?，可通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生作為融合化合物的治療劑，從而使一段DNA包含編碼本發(fā)明治療劑的所述兩個實(shí)體(即，上述實(shí)體(a)和(b))的各區(qū)域，所述區(qū)域彼此相鄰，或由編碼連接肽的區(qū)域分隔，所述連接肽不破壞所述治療劑的期望性質(zhì)?？尚诺?，所述治療劑的兩個部分可完全或部分重疊。所述對單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞的“結(jié)合特異性”是指結(jié)合部分能夠與單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)合。優(yōu)選所述結(jié)合部分能夠與單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞在體內(nèi)結(jié)合，即在所述細(xì)胞存在于體內(nèi)的生理?xiàng)l件下結(jié)合。此結(jié)合特異性可通過本領(lǐng)域熟知的方法確定，例如，使用表達(dá)單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞的特異性標(biāo)記或其結(jié)構(gòu)域或片段的轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過ELISA、免疫組織化學(xué)、免疫沉淀法、Western印跡以及流式細(xì)胞術(shù)(參見后附的實(shí)施例)。在另一個實(shí)施方式中，所述結(jié)合部分能夠選擇性地結(jié)合單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞。所述“能夠選擇性地結(jié)合”包括如源自抗體的結(jié)合部分，其對單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞的結(jié)合強(qiáng)度是對其他細(xì)胞類型的結(jié)合強(qiáng)度的至少10倍，例如至少50倍，或至少100倍。所述結(jié)合部分能夠在生理?xiàng)l件，例如在體內(nèi)，選擇性地結(jié)合單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞。用于測量相對結(jié)合強(qiáng)度的適合方法包括免疫分析，例如其中所 述結(jié)合部分是抗體的免疫分析(參見Harlow&Lane, “Antibodies :A Laboratory”，ColdSpring Habor Laboratory Press, New York (通過引用并入本文)。或者，可使用競爭性分析或使用 Biacore 分析(Biacore International AB, Sweden)評估結(jié)合。在其他實(shí)施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段，或它們的變體、融合物或衍生物專門結(jié)合單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種治療劑，其中對單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞具有特異性的結(jié)合部分選自以下組成的組(a)抗體或其抗原結(jié)合片段，或所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物，或所述變體或衍生物的融合物；(b)觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hb復(fù)合物)；(c)脂質(zhì)體；(d)抗體模擬物(例如，基于非抗體骨架)；(e) RNA 適體；(f)小分子；(g) CovX 體；和(h)末端甘露糖部分。CovX體通過將藥效基團(tuán)(pharmacophore)經(jīng)由連接子與專門設(shè)計(jì)的抗體的結(jié)合位點(diǎn)共價連接而產(chǎn)生，有效地對抗體進(jìn)行重編程(Tryder et al. , 2007, Bioorg. Med. Chem.Lett. ,17 :501-66)。所得到的是新型的化學(xué)實(shí)體，所形成的化學(xué)實(shí)體中，每個組分均對完整的CovX體提供期望的特性，特別地，所述實(shí)體具有肽的生物作用和抗體的長半衰期。已知末端甘露糖殘基參與提高巨噬細(xì)胞對重組葡糖腦苷脂酶，例如Cerezyme (Edmunds, Directory of Therapeutic Enzymes,McGrath and Walsh (編輯)，CRCpress Taylor and Francis Group, Boca Ranton, 2006 ;和 Mistry et al. , 1996, Lancet,348 :1555-9)的攝取。在一個實(shí)施方式中，所述結(jié)合部分對選自以下組成的組中的受體具有特異性CD163受體(見下文)；甘露糖受體(例如，人甘露糖受體，例如具有登錄號AAA60389的序列的 MARCO 甘露糖受體(參見 Elomaa et al, 1995, Cell80 :603-609 和 Elomaa et al.，1998，J. Biol. Chem. 273(8) :4530-4538)) ;M160/CD163b (參見 Gronlund et al. ,2000,J. Immunol. 165 :6406-6415);巨噬細(xì)胞清道夫受體(例如，I型或II型巨噬細(xì)胞清道夫受體)；巨噬細(xì)胞特異性的補(bǔ)體受體(例如,Fe受體)；Siglec受體(即，“唾液酸結(jié)合性Ig樣凝集素，，受體)，例如 Siglec 1> Siglec 5 或 Siglec 11 (Crocker et al. , 2007, Nat. Rev.Immunol. ,7 :255-66)。優(yōu)選地，所述結(jié)合部分對⑶163受體具有特異性。⑶163是由九個細(xì)胞外清道夫受體的富半胱氨酸(SRCR)B型結(jié)構(gòu)域組成的清道夫受體。其介導(dǎo)觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hb)復(fù)合物的清除并且參與炎癥過程的調(diào)控，所述復(fù)合物是在血管內(nèi)溶血期間血紅蛋白被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中時形成的。CD163被認(rèn)為專門表達(dá)于單核細(xì)胞系表面。其由循環(huán)系統(tǒng)中的駐留單核細(xì)胞表達(dá)，并且在向巨噬細(xì)胞成熟期間上調(diào)。其在駐留組織的巨噬細(xì)胞上以及替代性活化的巨噬細(xì)胞(M2)和TIE2+巨噬細(xì)胞上 高度表達(dá)，并顯示由造血干細(xì)胞/造血祖細(xì)胞的⑶34+亞群表達(dá)，并且還提出其表達(dá)于髓系樹突細(xì)胞亞類。優(yōu)選地，所述CD163受體是人蛋白，但其可來自任何哺乳動物，例如家養(yǎng)哺乳動物(優(yōu)選具有農(nóng)業(yè)或商業(yè)上的重要性的家養(yǎng)哺乳動物，包括馬、豬、牛、羊、犬和貓)。所述“哺乳動物蛋白”包括見于、源自和/或分離自一種或多種哺乳動物細(xì)胞的任何蛋白，例如術(shù)語“人蛋白”包括見于、源自和/或分離自一種或多種人細(xì)胞的蛋白。優(yōu)選地，所述CD163受體選自由數(shù)據(jù)庫登錄號CAB45233 ；AAY99762 ；AAH51281 ；EAW8862 ；EAW8863 ；EAW8864 ；EAW8865 ；EAW8866 ；NP_004235 ；NP_98161 ；Swiss-Prot.Q86VB7. I所定義的蛋白質(zhì)組成的組。數(shù)據(jù)庫登錄號AAH51281、NP 004325 和 Swiss-Prot. Q86VB7. I > sp|Q86VB7|C163A_人清道夫受體的富半胱氨酸I型蛋白M1300S =人GN = CD163PE = ISV = IMSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPIWFDDLICNGNESALWNCKHQGffGKHNCDHAEDAGVICSKGADLSLRLVDGVTECSGRLEVRFQGEWGTICDDGWDSYDAAVACKQLGCPTAVTAIGRVNASKGFGHIWLDSVSCQGHEPAVWQCKHHEWGKHYCNHNEDAGVTCSDGSDLELRLRGGGSRCAGTVEVEIQRLLGKVCDRGWGLKEADVVCRQLGCGSALKTSYQVYSKIQATNTWLFLSSCNGNETSLWDCKNWQWGGLTCDHYEEAKITCSAHREPRLVGGDIPCSGRVEVKHGDTffGSICDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSILGGAHFGEGNGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPEGTCSHSRDVGVVCSRYTEIRLVNGKTPCEGRVELKTLGAWGSLCNSHWDIEDAHVLCQQLKCGVALSTPGGARFGKGNGQIWRHMFHCTGTEQHMGDCPVTALGASLCPSEQVASVICSGNQSQTLSSCNSSSLGPTRPTIPEESAVACIESGQLRLVNGGGRCAGRVEIYHEGSWGTICDDSWDLSDAHWCRQLGCGEAINATGSAHFGEGTGPIWLDEMKCNGKESRIWQCHSHGWGQQNCRHKEDAGVICSEFMSLRLTSEASREACAGRLE
VFYNGAWGTVGKSSMSETTVGVVCRQLGCADKGKINPASLDKAMSIPMWVDNVQCPKGPDTLWQCPSSPWEKRLASPSEETWITCDNKIRLQEGPTSCSGRVEIWHGGSWGTVCDDSWDLDDAQVVCQQLGCGPALKAFKEAEFGQGTGPIWLNEVKCKGNESSLWDCPARRWGHSECGHKEDAAVNCTDISVQKTPQKATTGRSSRQSSFIAVGILGVVLLAIFVALFFLTKKRRQRQRLAVSSRGENLVHQIQYREMNSCLNADDLDLMNSSENSHESADFSAAELISVSKFLPISGMEKEAILSHTEKENGNL[SEQ ID NO :7] 數(shù)據(jù)庫登錄號AAY99762 CAB45233, NP 98161 和 Swiss-Prot. Q86VB7. 2 > sp I Q86VB7-3 | C163A_清道夫受體的富半胱氨酸I型蛋白M130的人同種型短尾變體0S=人 GN = CD163MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPIWFDDLICNGNESALWNCKHQGffGKHNCDHAEDAGVICSKGADLSLRLVDGVTECSGRLEVRFQGEWGTICDDGWDSYDAAVACKQLGCPTAVTAIGRVNASKGFGHIWLDSVSCQGHEPAVWQCKHHEWGKHYCNHNEDAGVTCSDGSDLELRLRGGGSRCAGTVEVEIQRLLGKVCDRGWGLKEADVVCRQLGCGSALKTSYQVYSKIQATNTWLFLSSCNGNETSLWDCKNWQWGGLTCDHYEEAKITCSAHREPRLVGGDIPCSGRVEVKHGDTffGSICDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSILGGAHFGEGNGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPEGTCSHSRDVGVVCSRYTEIRLVNGKTPCEGRVELKTLGAWGSLCNSHWDIEDAHVLCQQLKCGVALSTPGGARFGKGNGQIWRHMFHCTGTEQHMGDCPVTALGASLCPSEQVASVICSGNQSQTLSSCNSSSLGPTRPTIPEESAVACIESGQLRLVNGGGRCAGRVEIYHEGSWGTICDDSWDLSDAHWCRQLGCGEAINATGSAHFGEGTGPIWLDEMKCNGKESRIWQCHSHGWGQQNCRHKEDAGVICSEFMSLRLTSEASREACAGRLEVFYNGAWGTVGKSSMSETTVGVVCRQLGCADKGKINPASLDKAMSIPMWVDNVQCPKGPDTLWQCPSSPWEKRLASPSEETWITCDNKIRLQEGPTSCSGRVEIWHGGSWGTVCDDSWDLDDAQVVCQQLGCGPALKAFKEAEFGQGTGPIWLNEVKCKGNESSLWDCPARRWGHSECGHKEDAAVNCTDISVQKTPQKATTGRSSRQSSFIAVGILGVVLLAIFVALFFLTKKRRQRQRLAVSSRGENLVHQIQYREMNSCLNADDLDLMNSSGGHSEPH[SEQ ID NO 8]數(shù)據(jù)庫登錄號 Swiss-Prot. Q86VB7. 3> sp|Q86VB7-2|C163A_清道夫受體的富半胱氨酸I型蛋白M130的人同種型長尾變體2 :0S =人 GN = CD163MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPIWFDDLICNGNESALWNCKHQGWGKHNCDHAEDAGVICSKGADLSLRLVDGVTECSGRLEVRFQGEWGTICDDGWDSYDAAVACKQLGCPTAVTAIGRVNASKGFGHIWLDSVSCQGHEPAVWQCKHHEWGKHYCNHNED
AGVTCSDGSDLELRLRGGGSRCAGTVEVEIQRLLGKVCDRGWGLKEADVVCRQLGCGSALKTSYQVYSKIQATNTWLFLSSCNGNETSLWDCKNWQWGGLTCDHYEEAKITCSAHREPRLVGGDIPCSGRVEVKHGDTffGSICDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSILGGAHFGEGNGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPEGTCSHSRDVGVVCSRYTEIRLVNGKTPCEGRVELKT
LGAWGSLCNSHWDIEDAHVLCQQLKCGVALSTPGGARFGKGNGQIWRHMFHCTGTEQHMGDCPVTALGASLCPSEQVASVICSGNQSQTLSSCNSSSLGPTRPTIPEESAVACIESGQLRLVNGGGRCAGRVEIYHEGSWGTICDDSWDLSDAHWCRQLGCGEAINATGSAHFGEGTGPIWLDEMKCNGKESRIWQCHSHGWGQQNCRHKEDAGVICSEFMSLRLTSEASREACAGRLEVFYNGAWGTVGKSSMSETTVGVVCRQLGCADKGKINPASLDKAMSIPMWVDNVQCPKGPDTLWQCPSSPWEKRLASPSEETWITCDNKIRLQEGPTSCSGRVEIWHGGSWGTVCDDSWDLDDAQVVCQQLGCGPALKAFKEAEFGQGTGPIWLNEVKCKGNESSLWDCPARRWGHSECGHKEDAAVNCTDISVQKTPQKATTGRSSRQSSFIAVGILGVVLLAIFVALFFLTKKRRQRQRLAVSSRGENLVHQIQYREMNSCLNADDLDLMNSSGLWVLGGSIAQGFRSVAAVEAQTFYFDKQLKKSKNVIGSLDAYNGQE[SEQ ID NO :9]數(shù)據(jù)庫登錄號 Swiss-Prot. Q86VB7. 3> sp|Q86VB7-4|C163A_清道夫受體的富半胱氨酸I型蛋白M130的人同種型4 :0S =人 GN = CD163MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPIWFDDLICNGNESALWNCKHQGWGKHNCDHAEDAGVICSKGADLSLRLVDGVTECSGRLEVRFQGEWGTICDDGWDSYDAAVACKQLGCPTAVTAIGRVNASKGFGHIWLDSVSCQGHEPAVWQCKHHEWGKHYCNHNEDAGVTCSDGSDLELRLRGGGSRCAGTVEVEIQRLLGKVCDRGWGLKEADVVCRQLGCGSALKTSYQVYSKIQATNTWLFLSSCNGNETSLWDCKNWQWGGLTCDHYEEAKITCSAHREPRLVGGDIPCSGRVEVKHGDTWGSICDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSILGGAHFGEGNGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPEGTCSHSRDVGVVCSSKTQKTSLIGSYTVKGTGLGSHSCLFLKPCLLPGYTEIRLVNGKTPCEGRVELKTLGAWGSLCNSHWDIEDAHVLCQQLKCGVALSTPGGARFGKGNGQIWRHMFHCTGTEQHMGDCPVTALGASLCPSEQVASVICSGNQSQTLSSCNSSSLGPTRPTIPEESAVACIESGQLRLVNGGGRCAGRVEIYHEGSWGTICDDSWDLSDAHVVCRQLGCGEAINATGSAHFGEGTGPIWLDEMKCNGKESRIffQCHSHGffGQQNCRHKEDAGVICSEFMSLRLTSEASREACAGRLEVFYNGAWGTVGKSSMSETTVGVVCRQLGCADKGKINPASLDKAMSIPMWVDNVQCPKGPDTLWQCPSSPWEKRLASPSEETWITCDNKIRLQEGPTSCSGRVEIWHGGSWGTVCDDSWDLDDAQWCQQLGCGPALKAFKEAEFGQGTGPIWLNEVKCKGNESSLWDCPARRWGHSECGHKEDAAVNCTDISVQKTPQKATTGRSSRQSSFIAVGILGVVLLAIFVALFFLTKKRRQRQRLAVSSRGENLVHQIQYREMNSCLNADDLDLMNSSGGHSEPH[SEQ ID NO :10]
方便地，所述⑶163受體定位于細(xì)胞的表面上，優(yōu)選表達(dá)⑶163受體的惡性細(xì)胞，免疫調(diào)控細(xì)胞，發(fā)炎細(xì)胞或感染細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述CD163受體定位于單核細(xì)胞的表面上和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞的表面上，其可有利地選自以下組成的組單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、源自單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞亞型(例如，Ml, M2)?！岸ㄎ挥诩?xì)胞的表面上”包括的含義為⑶163受體與細(xì)胞結(jié)合，從而使⑶163受體的一個或多個區(qū)域存在于所述細(xì)胞表面的外表面上。例如，CD163受體可插入到細(xì)胞質(zhì)膜中(即，定位為跨膜蛋白)，且一個或多個區(qū)域存在于細(xì)胞外表面上。或者，整個CD163受體可在細(xì)胞外側(cè)，并通過共價和/或離子相互作用使其定位到所述細(xì)胞表面的一個或多個特定區(qū)域。細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解術(shù)語“免疫調(diào)控細(xì)胞”，其包括能夠改變或調(diào) 控免疫反應(yīng)的細(xì)胞。此類細(xì)胞包括輔助T細(xì)胞、Y S T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)、肥大細(xì)胞和樹突細(xì)胞。細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解術(shù)語“感染細(xì)胞”，其包括被感染性或致病性微生物侵襲或與感染性或致病性微生物相關(guān)的任何細(xì)胞。此類微生物包括細(xì)胞內(nèi)病原體，例如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和人免疫缺陷病毒(HIV)。細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解術(shù)語“發(fā)炎細(xì)胞”，其包括已經(jīng)被誘導(dǎo)出炎性反應(yīng)的任何細(xì)胞。最優(yōu)選地,所述細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。免疫學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，巨噬細(xì)胞是源自單核細(xì)胞的吞噬細(xì)胞，且其功能在于破壞某些細(xì)菌、原生動物和腫瘤細(xì)胞，釋放刺激其他免疫細(xì)胞的物質(zhì)，并參與抗原呈遞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種治療劑，其中所述結(jié)合部分包含對CD163受體具有結(jié)合特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段，或保留了對CD163受體的結(jié)合特異性的所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物或所述變體或衍生物的融合物，或由它們組成。“抗體”包括基本完整的抗體分子，以及嵌合抗體、人源化抗體、人抗體(其中相對于天然存在的人抗體至少一個氨基酸發(fā)生突變)、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同源二聚體和異源二聚體，及其抗原結(jié)合片段和衍生物。例如，所述抗體或其抗原結(jié)合片段，或它們的變體、融合物或衍生物可包含完整抗
體，由完整抗體組成或基本由完整抗體組成。所述“基本由......組成”是指所述抗體或
其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物由足以保留對CD163受體的結(jié)合特異性的完整抗體的一部分組成。“保留結(jié)合特異性”是指所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物能夠結(jié)合CD163受體。例如，在一個實(shí)施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物顯示的結(jié)合親和力(Kd)為所述抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合親和力的50%或以上。在一個實(shí)施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物結(jié)合于選自以下組成的組中的CD163受體的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域I、結(jié)構(gòu)域2、結(jié)構(gòu)域3、結(jié)構(gòu)域4、結(jié)構(gòu)域5、結(jié)構(gòu)域6、結(jié)構(gòu)域7、結(jié)構(gòu)域8和結(jié)構(gòu)域9。
優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物結(jié)合于CD163受體的結(jié)構(gòu)域I。在可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物結(jié)合于CD163受體的結(jié)構(gòu)域3。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物顯示出在鈣存在下對CD163受體的結(jié)合親和力高于鈣不存在時的情況。本文描述了可用于測定結(jié)合部分對CD163受體的結(jié)合親和力的方 法，其可見于后附的實(shí)施例中。術(shù)語“抗體”還包括所有類型的抗體,包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。因此,所述抗體可以是IgG分子，例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4分子。優(yōu)選地，所述抗體是IgG抗體，例如IgG2或IgG4抗體。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體是IgG4抗體，其中在241位的絲氨酸已經(jīng)被脯氨酸殘基取代(即，S241P)，已知此取代穩(wěn)定了 IgG4分子中的二硫鍵,從而產(chǎn)生更為穩(wěn)定的抗體(Angal et al. , 1993,Mol.Tmmun01.，30 105-8)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段、它們的變體、融合物或衍生物是分離和/或純化的形式。在一個實(shí)施方式中，所述抗體是非天然存在的抗體。當(dāng)然，在所述抗體是天然存在抗體的情況下，將其以分離的形式提供(即，不同于其天然存在的形式)。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物能夠誘導(dǎo)⑶163受體和/或所述治療劑的內(nèi)化(internalisation)。所述“能夠誘導(dǎo)內(nèi)化”是指所述結(jié)合部分能夠引起與將分子從細(xì)胞的細(xì)胞外表面轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)表面的過程相關(guān)的分子、生物化學(xué)和細(xì)胞事件。負(fù)責(zé)分子的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化的過程是分子和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，能夠參與細(xì)胞外分子(例如激素、抗體和有機(jī)小分子)、膜相關(guān)分子(例如細(xì)胞表面受體)和與細(xì)胞外分子結(jié)合的膜相關(guān)分子的復(fù)合物(例如，與跨膜受體結(jié)合的配體，或與膜相關(guān)分子結(jié)合的抗體)的內(nèi)化。在一個實(shí)施方式中，所述結(jié)合部分是完整的抗體。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合特異性是由存在于重鏈和輕鏈成分的可變區(qū)內(nèi)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)所賦予的?？贵w的重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)參與抗原識別，這是首先通過早期蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)而認(rèn)識到的事實(shí)。通過嚙齒類抗體的“人源化”發(fā)現(xiàn)了進(jìn)一步的證據(jù)。源于嚙齒類的可變區(qū)可與源于人的恒定區(qū)融合，從而使所得的抗體保留嚙齒源抗體的抗原特異性(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851-6855)。根據(jù)涉及均包含一種或多種可變區(qū)的抗體片段的細(xì)菌表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，已知抗原特異性由可變區(qū)賦予，并且與恒定區(qū)無關(guān)。這些分子包括Fab樣分子(Better et al (1988)Science 240,1041) ;Fv 分子(Skerra et al (1988) Science 240,1038);通過柔性寡妝連接 Vh 和 Vl 配偶區(qū)的單鏈 Fv (ScFv)分子(Bird et al (1988) Science 242,423 ；Huston etal (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,5879)和包含分離的 V 區(qū)的單域抗體(dAb) (Wardet al (1989) Nature 341, 544)。涉及合成保留其特異結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段的技術(shù)的綜述可見于 ffinter&Milstein (1991) Nature 349，293-299。由此，術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指能夠結(jié)合CD163受體的抗體的功能性片段。
本發(fā)明的示例性抗原結(jié)合片段可選自Fv片段(例如,單鏈Fv和二硫鍵鍵合的Fv)和Fab樣片段(例如，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)ab'片段和F(ab)2片段)組成的組。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合片段是scFv。使用抗體片段而非完整抗體具有數(shù)倍的優(yōu)勢。所述片段較小的尺寸可產(chǎn)生改進(jìn)的藥理學(xué)性質(zhì)，例如更好的實(shí)體組織穿透性。此外，抗原結(jié)合片段，例如Fab、Fv、ScFv和dAb抗體片段能夠在大腸桿菌(E. coli)或酵母中表達(dá)并分泌，由此可容易地生產(chǎn)大量的所述片段。本發(fā)明的范圍還包括抗體及其抗原結(jié)合片段的修飾形式，例如通過共價連接聚乙二醇或其他合適聚合物的修飾。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合片段是域抗體(dAb)，例如納米抗體(nanobody)。所述“域抗體”是指對應(yīng)于人抗體重鏈可變區(qū)(Vh)或輕鏈可變區(qū)的多肽。域抗體具有約13kDa的分子量，或小于完整抗體尺寸的十分之一。與常規(guī)抗體不同，域抗體在細(xì)菌、酵母和哺乳細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)良好。此外，很多dAb高度穩(wěn)定，并且即便在經(jīng)歷嚴(yán)酷 條件，例如凍干或熱變性后仍保持活性。這些特征使得域抗體可適應(yīng)廣泛的藥物制劑條件和制造過程。此外，dAb的小尺寸允許每克產(chǎn)品中更高的摩爾數(shù)量，其能夠提供顯著提高的每劑量藥效，并降低整體的制造成本?？蓪⑨槍μ囟ò袠?biāo)選擇的域抗體用作構(gòu)建單元以產(chǎn)生具有常規(guī)抗體或蛋白質(zhì)無法獲得的獨(dú)特特征的治療產(chǎn)品，例如在一個易于生成的分子中與兩種治療性靶標(biāo)結(jié)合的雙靶向dAb，具有可控血清半衰期的dAb，用于肺或胃腸(GI)道疾病的肺或口服給藥的dAb，以及針對無法由IgG輕易解決的靶標(biāo)的dAb。此類抗體可通過重組產(chǎn)生，但也已知存在于駱騎(Curr. Opin. Pharmacol. ,8,(2008) ,600-608)和鯊魚(例如，IgNAR ；Curr. Opin. Pharmacol. ,8, (2008)，600-608)中。其他優(yōu)選的抗體變體包括分離的重鏈可變區(qū)(Vh)或分離的輕鏈可變區(qū)(')，例如來自人抗體(Curr. Opin. Pharmacol.，8，(2008)，600-608)，和 iMab (W0 03/050283)。因此，所述域抗體可選自來自駱駝的單域抗體、來自鯊魚的單域抗體和來自人的分離的Vh或\域。用于產(chǎn)生抗體和抗體片段的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，抗體的產(chǎn)生可通過采用誘導(dǎo)抗體分子的體內(nèi)產(chǎn)生、篩選免疫球蛋白庫的多種方法中的任一種(Orlandi.et al,1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 :3833-3837 ；Winter et al.，1991，Nature 349 293-299)，或通過培養(yǎng)的細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆抗體分子。這些包括但不限于雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EB病毒(EBV)-雜交瘤技術(shù)(Kohler et al. , 1975. Nature 256 4950497 ；Kozbor et al., 1985.J.Immunol. Methods 81 :31-42 ;Cote et al.,1983.Proc.Natl. Acad. Sci. USA 80 :2026-2030 ；Cole et al. , 1984. Mol. Cell. Biol. 62 :109-120)。所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的衍生物可通過重組的方式產(chǎn)生(即，所述抗體為重組抗體)。優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體。可通過已知的技術(shù)制備針對所選抗原的適合的單克隆抗體，例如在“MonoclonalAntibodies A manual of techniques”， H Zola(CRC Press,1988)和“MonoclonalHybridoma Antibodies !Techniques and Applications，，, J G RHurrell (CRC Press, 1982)中公開的那些，以上文獻(xiàn)通過引用并入本文?？贵w片段還可通過使用本領(lǐng)域熟知的方法獲得(參見，例如Harlow&Lane，1988，“Antibodies A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbor Laboratory, New York,該文獻(xiàn)通過引用并入本文)。例如，本發(fā)明的抗體片段可通過抗體的蛋白水解或通過在大腸桿菌或哺乳動物細(xì)胞(例如，中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物或其他蛋白表達(dá)系統(tǒng))中表達(dá)編碼所述片段的DNA來制備?；蛘?，可通過常規(guī)方法由完整抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解獲得抗體片段。或者，如本領(lǐng)域所知，可通過無細(xì)胞的體外表達(dá)獲得抗體片段。如本文的定義，所述結(jié)合部分可以是抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物，只要所述變體、融合物或衍生物保留了對CD163受體的結(jié)合特異性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的蛋白質(zhì)工程和定點(diǎn)突變的方法，使用重組多核苷酸制備變體(參見，例如Molecular Cloning a Laboratory Manual,第 3 版，Sambrook&Russell, 2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,通過引用并入本文)。所述“融合物”包括與任何其他多肽融合的抗體或其抗原結(jié)合片段(如本文定義)。例如，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可以與諸如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或蛋白A的 多肽融合，以有利于其純化。此類融合物的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。類似地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段可以與寡聚組氨酸標(biāo)簽例如His6或由其他抗體識別的表位(例如熟知的Myc標(biāo)簽表位)融合。所述融合物可包含賦予本發(fā)明所述抗體或其抗原結(jié)合片段期望特征的其他部分，例如所述部分可用于檢測或分離所述抗體或其抗原結(jié)合片段，或促進(jìn)所述抗體或其抗原結(jié)合片段的細(xì)胞攝取。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，所述部分可以是，例如生物素部分、放射性部分、熒光性部分，例如小熒光團(tuán)或綠色熒光蛋白(GFP)熒光團(tuán)。所述部分可以是免疫原性標(biāo)簽，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的Myc標(biāo)簽，或者可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的能夠促進(jìn)細(xì)胞攝取的親脂性分子或多肽域。用于使其他部分與抗體(或其融合物、變體或衍生物)偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域熟知的。不例性的方法描述于 Bioconjugate Techniques,第 2 版(2008) ；Hermanson (AcademicPress, Inc.)和 Veronese et al.，(1999 ；Farmaco 54(8) :497-516) ；Stayton et al.，(2005 ；0rthod Craniofac Res 8(3) :219-225) ；Schrama et al., (2006 ；Nat Rev DrugDiscov 5(2) 147-159) ；Doronina et al. (2003 ；Nat Biotechnol 21(7) :778-784)；Carter et al. , (2008 ；Cancer J 14(3) 154-169) ；Torchilin(2006 ；Annu Rev BiomedEng 8 :343-375) ；Rihova (1998 ；Adv Drug Deliv Rev 29 (3) :273-289) ；Goyal etal. (2005 ；Acta Pharm 55(1) :1-25) ；Chari(1998 ；Adv Drug Deliv Rev 31(1-2)89-104) ；Garnett(2001 ；Adv Drug Deliv Rev 53(2) :171-216) ;Allen(2002 ;Nat RevCancer 2(10) :750-763)。本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的所述“變體”包括保守或非保守性的插入、刪除和取代。特別地，其包括所述抗體或其抗原結(jié)合片段的序列的變體，其中的所述變化基本不改變所述抗體或其抗原結(jié)合片段的活性。特別地，其包括所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體，其中所述改變基本不改變對CD163受體的結(jié)合特異性。所述多肽變體可具有與本文定義的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的一種或多種氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列，例如，與如本文定義的本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段的一種或多種氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
可使用適合的計(jì)算機(jī)程序確定兩條多肽之間的序列同一性百分比，例如University of Wisconsin Genetic Computing Group 的 GAP 程序，并且應(yīng)理解，所述同一性百分比是相對于其序列經(jīng)最佳比對的多肽而計(jì)算的。或者，也可以使用Clustal W程序(如 Thompson et al. , 1994, Nucl. Acid Res. 22 4673-4680中所述，該文獻(xiàn)通過引用并入本文)進(jìn)行比對。所用的參數(shù)可如下-快速成對比對參數(shù)K元組(字)大小，I;窗口大小，5 ;空位罰分，3 ;上對角線(top diagonals)的數(shù)量，5 ;計(jì)分方法，x百分比。-多比對參數(shù)空位開放罰分，10;空位延伸罰分，0.05。-計(jì)分矩陣BL0SUM。 或者，可使用BESTFIT程序測定局部序列的比對。本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、或它們的變體、融合物或衍生物可包含經(jīng)修飾或衍生化的一個或多個氨基酸?？赏ㄟ^與官能側(cè)基的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)一個或多個氨基酸的化學(xué)衍生。此類衍生化的分子包括，例如其中的游離氨基經(jīng)衍生形成胺的鹽酸鹽，P-甲苯磺?；Ⅳ然锦Ｑ趸?、叔丁氧基羰基、氯乙?；蚣柞；?。游離羧基可經(jīng)衍生形成鹽，甲基酯和乙基酯或其他類型的酯和肼類。游離羥基可經(jīng)衍生形成0-?；?-烷基衍生物?；瘜W(xué)衍生物還包括包含20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在氨基酸衍生物的那些肽。例如可由4-羥基脯氨酸取代脯氨酸；由5-羥基賴氨酸取代賴氨酸；由3-甲基組氨酸取代組氨酸；由高絲氨酸取代絲氨酸，以及由鳥氨酸取代賴氨酸。衍生物還包括包含一個或多個添加或刪除的肽，只要必需的活性得到保留。所包括的其他修飾為酰胺化、氨基末端?；?例如，乙?；驇€基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如，使用氨或甲胺)，以及類似的末端修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解擬肽化合物也是有用的。因此，本發(fā)明包括能夠結(jié)合CD163受體的擬肽化合物。術(shù)語“擬肽”是指模擬作為治療劑的具體肽的構(gòu)象和期望特征的化合物。例如，本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合片段、它們的變體、融合物或衍生物不僅包含其中的氨基酸殘基通過肽鍵(-C0-NH-)連接的分子,還包括其中的肽鍵被反轉(zhuǎn)(reversed)的分子。此類反轉(zhuǎn)型(retro-inverso)擬肽可使用本領(lǐng)域已知的方法制備,例如Meziere etal. (1997) J. Immunol. 159,3230-3237中描述的那些，該文獻(xiàn)通過引用并入本文。此方法包括制備包含涉及骨架變化但側(cè)鏈定位不變的擬肽。包含替代CO-NH肽鍵的NH-CO鍵的反轉(zhuǎn)肽對蛋白水解的抗性高很多。或者，本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合片段、它們的變體、融合物或衍生物可以是擬肽化合物，其中一個或多個氨基酸殘基通過-y (CH2NH)-鍵而不是常規(guī)酰胺鍵連接?；蛘?，可無需所述肽鍵，只要使用保留了氨基酸殘基的碳原子之間的間隙的適合的連接子部分；連接子部分具有與肽鍵基本相同的電荷分布和基本相同極性是有利的。應(yīng)理解，可方便地封閉本發(fā)明抗體、抗原結(jié)合片段、它們的變體、融合物或衍生物的N末端或C末端，從而有助于降低對外切蛋白酶降解的易感性?，F(xiàn)已使用多種非編碼的或修飾的氨基酸，例如D-氨基酸和N-甲基氨基酸，來修飾哺乳動物肽。此外，可通過共價修飾來穩(wěn)定推測的生物活性構(gòu)象，例如環(huán)化，或通過引入內(nèi)酰胺或其他類型的橋鍵，例如參見Veber et al. , 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636和 Thursell et al. , 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. Ill :166,該兩篇文獻(xiàn)通過引用并入本文。很多合成策略中的常見主題是向基于肽的骨架中引入一些環(huán)狀部分。所述環(huán)狀部分限制肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)象空 間，這常常導(dǎo)致肽對特定生物受體的特異性提高。這種策略的額外優(yōu)點(diǎn)是將環(huán)狀部分引入到肽中還可產(chǎn)生對細(xì)胞肽酶的敏感性降低的肽。因此，示例性的本發(fā)明抗體、抗原結(jié)合片段、它們的變體、融合物或衍生物可包含末端的半胱氨酸。此類多肽可通過末端半胱氨酸的巰基形成的二硫鍵以雜環(huán)形式(heterodetic cyclic form)存在，或通過末端氨基酸之間形成酰胺肽鍵以均環(huán)形式(homodetic form)存在。如上所述,通過N末端和C末端半胱氨酸之間的二硫鍵或酰胺鍵使小肽環(huán)化可以通過減少蛋白水解且還提高結(jié)構(gòu)剛性以產(chǎn)生特異性更高的化合物，而克服了有時見于線性肽中特異性和半衰期的問題。通過二硫鍵環(huán)化的多肽具有游離的氨基和羧基末端，其仍可能對蛋白降解敏感，而通過在N-末端氨基和C-末端羧基之間形成酰胺鍵環(huán)化的肽由此不再包含游離的氨基或羧基末端。因此，肽可通過C-N鍵或二硫鍵連接。本發(fā)明不以任何方式受限于用于對肽進(jìn)行環(huán)化的方法，而是包括其環(huán)狀結(jié)構(gòu)可通過任何適合的合成方法獲得的肽。因此，雜鍵(heterodetic linkage)可包括但不限于通過二硫鍵橋、亞烷基橋或硫鍵橋形成的雜鍵。合成包含二硫鍵橋、硫鍵橋和亞烷基橋的均環(huán)肽和雜環(huán)肽的方法公開在US 5，643，872，該文獻(xiàn)通過引用并入本文。US 6，008，058中討論并公開了環(huán)化方法的其他實(shí)例，該文獻(xiàn)通過引用并入本文。用于合成環(huán)狀的穩(wěn)定擬肽化合物的其他方法是閉環(huán)復(fù)分解反應(yīng)(RCM)。此方法包括合成肽前體和使其與RCM催化劑接觸以產(chǎn)生構(gòu)象限制性肽的步驟。適合的肽前體可包含兩個或更多的不飽和C-C鍵。此方法可使用固相肽合成技術(shù)進(jìn)行。在此實(shí)施方式中，使錨定在固體支持物上的前體接觸RCM催化劑，隨后從所述固體支持物切出產(chǎn)物以獲得構(gòu)象限制性肽。由 D. H. Rich 在 Protease Inhibitors, Barrett and Selveson 編輯，Elsevier (1986)(通過引用并入本文)中公開的另一種方法通過將過渡態(tài)類似物的概念應(yīng)用于酶抑制劑設(shè)計(jì)而設(shè)計(jì)出了肽模擬物。例如，已知staline的仲醇模擬了胃蛋白酶底物的易切割酰胺鍵的四面體過渡態(tài)?？傊阎┒诵揎椨兄诮档蛯Φ鞍酌附到獾囊赘行?，并由此延長肽在溶液中的半衰期，特別是在其中具有蛋白酶的生物流體中的半衰期。因?yàn)橥ㄟ^環(huán)化形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，以及對于見于環(huán)狀肽的生物活性的考慮，多肽環(huán)化也是有用的修飾。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗體、抗原結(jié)合片段，它們的變體、融合物或衍生物能夠與選自以下組中的抗體分子競爭結(jié)合CD163受體Mac2_158(下劃線為 CDR)VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAffNffIRQFPGNKLEWMGYITYSGITNYNPSLKSQISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVSGTYYFDYffGQGTTLTVSS[SEQ ID NO:I]VL
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RFTGSGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRA[SEQ ID NO :2]Mac2_48(下劃線為 CDR)VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAffNVIRQFPGNKLEWMGFISYSGITSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCVSGTYYFDYffGQGTTLTVSS[SEQ ID NO :3] VL SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASOSVSHDVSffFQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAIYFCQQDYSSPRTFGGGTKLEIKRA[SEQ ID NO 4]示例件人源化mAb (下劃線為⑶R)VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAffNffIRQFPGKKLEWMGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCVSGTYYFDYffGQGTTLTVSS[SEQ ID NO :5]VL DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSDVAffFQQKPGKSPKPLIYYASNRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRA[SEQ ID NO :6]優(yōu)選地，所述抗體、抗原結(jié)合片段，它們的變體、融合物或衍生物能夠與選自Mac2-158、Mac2-48和示例性人源化mAb組成的組中的抗體競爭結(jié)合相同的表位?；蛘?所述抗體、抗原結(jié)合片段，它們的變體、融合物或衍生物源自于選自Mac2-158、Mac2_48和示例性人源化mAb的抗體。例如，所述抗體、抗原結(jié)合片段，它們的變體、融合物或衍生物可結(jié)合的CD163受體表位與本發(fā)明的一種或多種示例性抗體(即，如后附實(shí)施例中所述的Mac2-158、Mac2-48、5C6-FAT和/或BerMac3)結(jié)合的CD163受體表位相同。Mac2_158 可得自于荷蘭的 IQ Products,(貨號CD163~158U. http: //www.iqproducts.nl/cataloR/index.php pr = 782)Mac2_48 可得自于荷蘭的 IQ Products,(貨號CD163~48U. http: //www.iqproducts.nl/cataloR/index.php pr = 783)所述能夠與本文定義的抗體分子(或保留了對CD163受體的結(jié)合特異性的所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物或所述變體或衍生物的融合物)“競爭”結(jié)合CD163受體，是指所測試的抗體、抗原結(jié)合片段、它們的變體、融合物或衍生物能夠至少部分地抑制或干擾本文定義的抗體分子(或所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物，或所述變體或衍生物的融合物)的結(jié)合。例如，所述抗體或其抗原結(jié)合片段，它們的變體、融合物或衍生物，或所述變體或衍生物的融合物能夠至少10%地抑制本文定義的抗體分子(例如，Mac2-158、Mac2-48、5Cd-FAT 或 BerMac3)的結(jié)合，例如至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、35%乃至100%抑制?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法測定競爭性結(jié)合，例如ELISA (如本文所述)和/或SPR (如后附實(shí)施例所述)。在“夾心ELISA”中，在包被96孔板(例如，如Maxisorp Nunc )時，使用例如適量的靶向CD163受體的胞質(zhì)尾的多克隆抗體，例如IOii g/ml的多克隆兔抗體作為捕獲抗體。根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行包被。使用于TBS-T中的3% BSA，在例如室溫下，將孔封閉I小時。隨后，在分析緩沖液(例如，補(bǔ)充了 0. I % BSAUmM MgCl2 IOuM CaCl2的TBS-T)中稀釋細(xì)胞提取物，所述細(xì)胞提取物來自用表達(dá)CD163受體的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ffiK細(xì)胞，或來自表達(dá)CD163的細(xì)胞。隨后，在每孔中添加適量的稀釋的細(xì)胞提取物，例如50 iil，并溫育以使其與包被的抗體結(jié)合，例如在室溫溫育I小時。隨后，使用TBS-T洗板三次。隨后，添加適量(例如在分析緩沖液中2iig/ml)的與生物素偶聯(lián)的一級抗體(例如，Mac2-48、Mac2_158、5C6FAT、BerMac3或?qū)φ湛贵w)。隨后，盡可能將平板溫育足夠的時間以允許Mac2-48、Mac2-158、5C6FAT或BerMac3以及對照抗體結(jié)合，例如在室溫溫育I小時，隨后在TBS-T中清洗三次。在使用生物素化的一級抗體的情況下，可使用鏈霉親和素-HRP抗體(DAKO)并相應(yīng)地在分析緩沖液中稀釋(I 5000)，并加入到孔中。隨后，將平板溫育足夠的時間，例如，在室溫溫育I小時，以形成鏈霉親和素-生物素復(fù)合物。清洗(例如用TBS-T清洗三次)后，使用過氧化物酶底物(例如，OPD SigmaFast, Sigma)使平板顯色。在適合的波長(在此情況下為490nm)測定色度變化吸光度。如果一級抗體未偶聯(lián)，可更換使用與HRP直接偶聯(lián)的抗人IgG4的二級抗體來溫育相同的ELISA，例如，來自例如Serotec的小鼠抗人IgG4_HRP，或者，如果未偶聯(lián)，則繼而使用來自例如DAKO的HRP偶聯(lián)的抗小鼠抗體。隨后，清洗平板，并按照上文所述顯色。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，其他方法包括反轉(zhuǎn)上述的夾心ELISA，并且使用⑶163 抗體(例如，Mac2-48、Mac2-158、5C6FAT、BerMac3)作為捕獲抗體代替。以上ELISA試驗(yàn)可用于評估表位修飾性或封閉性抗體。適合用于鑒定競爭性抗體的其他方法公開在Antibodies A Laboratory Manual,Harlow&Lane,該文獻(xiàn)通過引用并入本文(例如，參見 567 569 頁，574 576 頁，583 頁和 590 612 頁，1988，CSHL，NY, ISBN0-87969-314-2)。本文中的“表位”旨在表示分子與抗體結(jié)合的位置，即抗原的分子區(qū)域。表位可以是線性表位，其通過例如抗原的氨基酸序列(即一級結(jié)構(gòu))確定，或者是三維表位，其由抗原的二級結(jié)構(gòu)限定，例如肽鏈折疊成P片層或a螺旋，或通過抗原的三級結(jié)構(gòu)限定，例如螺旋或片層折疊或排列以產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)。有利地，本發(fā)明提供了一種治療劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人的或人源化的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，人源化抗體可用于人的治療或診斷。人源化形式的非人(例如鼠)抗體是基因工程化的嵌合抗體或具有源自非人抗體的極小部分的抗體片段。人源化抗體包括這樣的抗體即，其中人抗體(受者抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)被來自具有期望功能性的非人物種，例如小鼠、大鼠或兔(供體抗體)的互補(bǔ)決定區(qū)的殘基取代的抗體。在一些情況下，人抗體的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。人源化抗體還可包含既沒有見于受者抗體中，也沒有見于引入的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或框架序列中的殘基。通常，人源化抗體可包含基本全部的至少一個且通常兩個可變域，其中全部或基本全部的互補(bǔ)決定區(qū)對應(yīng)于非人抗體的那些，且全部或基本全部的框架區(qū)對應(yīng)于相關(guān)的人共有序列的那些。最佳地，人源化抗體還包括至少一部分的抗體恒定區(qū)，例如Fe區(qū)，其通常源自人抗體(參見，例如 Jones et al. , 1986. Nature 321 :522-525 ；Riechmann et al. , 1988, Nature 332 323-329 ；Presta, 1992，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596,該兩篇文獻(xiàn)通過引用并入本文)。用于將非人抗體人源化的方法是本領(lǐng)域熟知的。通常，所述人源化抗體具有弓IA其中的來自非人來源的一個或多個氨基酸殘基。這些常被稱作引入殘基的非人氨基酸殘基通常來自引入的可變域。人源化可基本按照文獻(xiàn)描述(參見，例如Jones et al. , 1986,Nature 321 :522-525 ；Reichmann et al.,1988.Nature 332 :323-327 ；Verhoeyen et al.,1988，Science 239 :1534-15361 ;US4，816，567，這些文獻(xiàn)通過引用并入本文)，通過使用對應(yīng)的嚙齒類互補(bǔ)決定區(qū)取代人的互補(bǔ)決定區(qū)而進(jìn)行。因此，此類人源化抗體為嵌合抗體，其中，基本小于完整的人可變域的序列已經(jīng)被來自非人物種的對應(yīng)序列取代。實(shí)際上，人源化抗體通?？梢允瞧渲幸恍┗パa(bǔ)決定區(qū)殘基、且可能地一些框架殘基被來自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代的人抗體。也可以使用本領(lǐng)域中已知的多種技術(shù)鑒定人抗體，包括噬菌體展示文庫(參見，例如 Hoogenboom&ffinter, 1991, J. Mol. Biol. 227 :381 ；Marks et al. , 1991, J. Mol.Biol. 222 581 ；Cole et al. ,1985, Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss,第 77 頁；Boerner et al. , 1991. J. Immunol. 147 :86-95 ；Soderlind et al. , 2000,Nat Biotechnol 18 :852-6和WO 98/32845，這些文獻(xiàn)通過引用并入本文)?！┇@得適合的抗體，可檢測其活性，例如所述抗體的結(jié)合特異性或生物活性，例如，通過ELISA、免疫組織化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)、免疫沉淀法、Western印跡等。所述生物活性可在讀出該具體特征的不同試驗(yàn)中檢測。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療劑和/或其結(jié)合部分組分是多肽(即，氨基酸聚合物)。本文使用的術(shù)語“氨基酸”包括20種遺傳編碼的氨基酸及其相應(yīng)的'D'型(與天然的'L'型相比)立體異構(gòu)體，W-氨基酸，其他非天然存在氨基酸，非常規(guī)氨基酸(例如，a，a -雙取代的氨基酸，N-烷基氨基酸等)和化學(xué)衍生化的氨基酸(見下文)。除非另有明確指明，氨基酸在專門列出時，例如“丙氨酸”或“Ala”或“A”，此術(shù)語是指L-丙氨酸和D-丙氨酸二者。其他非常規(guī)氨基酸也可以是本文定義的多肽序列的組分，只要所述多肽序列保留了期望的功能性質(zhì)。對于本文顯示的多肽序列，在適合的情況下，每個編碼的氨基酸殘基由對應(yīng)于常規(guī)氨基酸的俗名的單個字母名稱表示。 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽包含L-氨基酸或由其組成。用于生產(chǎn)多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的(例如，參見Molecular Cloning aLaboratory Manual,第 3 版，Sambrook&Russell, 2000, Cold Spring Harbor LaboratoryPress，該文獻(xiàn)通過引用并入本文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的治療劑可包含抗體及其片段之外的結(jié)合部分。、
在可選的實(shí)施方式中，所述結(jié)合部分是觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hb)復(fù)合物。如上所述，CD163介導(dǎo)Hp-Hb復(fù)合物的清除，所述復(fù)合物是在血管內(nèi)溶血期間，血紅蛋白被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中時形成的，并且還參與炎癥過程的調(diào)控。CD163被認(rèn)為專門表達(dá)在單核細(xì)胞系表面上。其由循環(huán)系統(tǒng)中的駐留單核細(xì)胞表達(dá)，并且在向巨噬細(xì)胞成熟期間上調(diào)。其在駐留組織的巨噬細(xì)胞上以及替代性活化的巨噬細(xì)胞(M2)和TIE2+巨噬細(xì)胞上高度表達(dá)。因此，CD163對Hb-Hp復(fù)合物的親和カ使其成為有效的單核細(xì)胞靶向部分。Hp-Hb復(fù)合物的制備和應(yīng)用描述于WO 02/32941。在另ー個可選實(shí)施方式中，所述結(jié)合部分包含脂質(zhì)體或由其組成。例如，所述結(jié)合部分包含與靶向性抗體(例如，抗CD163抗體)偶聯(lián)的脂質(zhì)體(負(fù)載了免疫抑制剤)。用于制備此類脂質(zhì)體-抗體偶聯(lián)物的方法描述于Avnir et al. , 2008, ArthritisRheum. 58 :119-129 和 Torchilin et al. , 2001, Biophys Acta 1511 :397-411 中。 在另ー個可選的方面，本發(fā)明提供了ー種治療劑，其中所述結(jié)合部分是抗體模擬物(例如，非抗體骨架)。應(yīng)理解，抗體模擬物(例如，具有高度的穩(wěn)定性并可在某些位點(diǎn)引入可變性的非抗體骨架結(jié)構(gòu))可用于產(chǎn)生可衍生出結(jié)合部分的分子文庫。生物化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉很多此類分子。此類分子可用作本發(fā)明治療劑中的結(jié)合部分。Skerra et al. (2007, Curr. Opin. Biotech. , 18 :295-304),Nuttall&ffalsh(2008,Curr. Opin. Biotech.，8 :309-615)和 Gill&DAmle(2006，Curr. Opin. Biotech.，17 :653-8)中討論了適合的抗體模擬物及其制備方法。示例性的抗體模擬物包括親和體(affibodies)(也稱為Trinectin ；Nygren,2008, FEBS J,275,2668-2676) ；CTLD(也稱為 Tetranectin ;Innovations Pharmac.Technol. (2006),27-30) ；adnectin(也稱為單體(monobodies) ；Meth. Mol. Biol.,352(2007),95-109) ；anticalin (Drug Discovery Today(2005),10,23-33) ；DARPin(錨蛋白類(ankyrins) ；Nat. Biotechnol. (2004),22,575-582) ；avimers(Nat. Biotechnol.
(2005),23,1556-1561) ；iMab (WO 03/050283);微體(FEBS J, (2007), 274,86-95);肽適體(Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797) ；Kunitz 域(J. Pharmacol. Exp. Ther.
(2006)318，803-809)；affilin(Trends. Biotechnol. (2005)，23，514-522)。因此，優(yōu)選所述抗體模擬物選自包含下述的組或由下述組成的組親和體、tetranectin (CTLD) > adnectin (單體)、anticalin、DARPin (ankyrin)、avimer、iMab、微體、妝適體、Kunitz域和affilin。在另ー個可選實(shí)施方式中，所述結(jié)合部分是RNA適體。RNA適體代表了治療劑的獨(dú)特新類型(Que-Gewirth et al, Gene Ther. 74 283(2007) ；Ireson et al,Mol. Cancer Ther. 5 :2957 (2006))。其為相對短(12-30 個核苷酸)的單鏈RNA寡核苷酸，其呈現(xiàn)穩(wěn)定的三維形狀，從而緊密且特異地結(jié)合所選的蛋白靶標(biāo)以引發(fā)生物反應(yīng)。與反義寡核苷酸不同，RNA適體能夠有效地靶向細(xì)胞外靶標(biāo)。與抗體類似，適體具有低納摩爾至皮摩爾范圍的結(jié)合親和力。此外，適體對熱穩(wěn)定，無免疫原性，且具有極小的批間差異性?；瘜W(xué)修飾，例如在嘧啶2’位的氨基或氟取代，可以減少核酸酶的降解。適體的生物分布和清除也可通過諸如聚こニ醇和膽固醇的部分的化學(xué)添加而改變。
適體可通過重復(fù)的選擇方法開發(fā)，例如SELEX(指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)以通過良好確定的互補(bǔ)三維結(jié)構(gòu)的方式特異地識別其靶標(biāo)并與其緊密結(jié)合。此外，SELEX(和其他此類方法)可進(jìn)行文庫選擇，從而產(chǎn)生對純化的生物靶標(biāo)具有高親和カ的寡核苷酸配體。近期，適體哌加他尼(pegaptanib)被批準(zhǔn)用于年齡相關(guān)性黃斑變性的治療(Wong etal, Lancet 370:204(2007))。在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，最近證實(shí)了源自人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的DNA 適體 GBI-10 結(jié)合朝粘素-C(tenascin-C) (Daniels et al, Proc. Natl Acad. ScL USA100 :15416(2003))。類似地，現(xiàn)已證明RNA適體靶向Ku DNA修復(fù)蛋白，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對依托泊式(etoposide)致感(Zhang et al, Int. J. Mol. Med. 74 :153(2004))。在另ー種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了ー種治療劑，其中所述結(jié)合部分是小分子。所述“小分子”是指900道爾頓或更小的小分子量有機(jī)化合物。盡管大的生物聚合物，例如核酸、蛋白和多糖(例如淀粉或纖維素)不包含在“小分子”中，但其組成単體(分別為，核糖核苷酸或脫氧核苷酸、氨基酸和單糖)和寡聚體(即，短聚合物，例如二核苷酸，肽，例如抗氧化劑谷胱甘肽，和ニ糖，例如蔗糖)包括在內(nèi)。小分子的制備描述于Mayes&Whitcombe, 2005, Adv. Drug Deliv. Rev. 57 1742-78和 Root-Bernstein&Dillon, 2008, Curr. Pharm. Des. 14 :55_62。優(yōu)選地，所述結(jié)合部分是分離和/或純化的形式。本發(fā)明第一方面的治療劑的第二個關(guān)鍵成分是免疫抑制劑。在一個實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑是抗炎劑。例如，所述免疫抑制劑可以選自包含以下的組或由以下組成的組糖皮質(zhì)激素、皮質(zhì)類固醇、氨甲喋呤、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、環(huán)孢霉素、他克莫司(tacrolimus)、霉酹酸嗎啉こ酯(mycophenolate mofetil)、西羅莫司(sirulimus)、依維莫司(everolimus),能夠抑制促炎細(xì)胞因子(例如TNF)合成的siRNA分子、非留體抗炎藥(NSAID，例如阿斯匹林、布洛芬)、類固醇(例如，維生素D)、調(diào)節(jié)疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD,例如青霉胺、柳氮磺胺批唳(sulfasalazin)、環(huán)孢霉素)。更優(yōu)選地，所述免疫抑制劑是糖皮質(zhì)激素。
示例性的糖皮質(zhì)激素可選自包含以下的組或由以下組成的組可的松及其衍生物(例如氫化可的松)；強(qiáng)的松及其衍生物(例如強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍醋酸酷、甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸酷)；地塞米松及其衍生物；去炎松及其衍生物(例如，己酸去炎松(triamcinolonehexacetonuid)、醋酸去炎松)；帕拉米松；倍他米松；氟氫化可的松(fIuhydrocortisone);醋酸Hl1 輕松(fluocinolone acetonide；;氟輕松(fIuocinolone)。在一個實(shí)施方式中，所述糖皮質(zhì)激素是地塞米松。在另ー個實(shí)施方式中，所述糖皮質(zhì)激素是強(qiáng)的松龍。在另ー個實(shí)施方式中，所述糖皮質(zhì)激素是甲基強(qiáng)的松龍。在另ー個實(shí)施方式中，所述糖皮質(zhì)激素是醋酸氟輕松。在可選的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑是糖皮質(zhì)激素-半琥珀酸酯衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑是通過組織蛋白酶B敏感性連接子與ー種或多種其他蛋白連接的糖皮質(zhì)激素。例如，在一個實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑是與ー種或多種部分還原的蛋白連接的糖皮質(zhì)激素。在可選的實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，所述脂質(zhì)體包含能夠靶向所述脂質(zhì)體的治療劑或部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述結(jié)合部分和所述免疫抑制劑可通過任何已知的方式連接。然而，優(yōu)選所述結(jié)合部分與所述免疫抑制劑共價連接。有利地，糖皮質(zhì)激素分子與結(jié)合部分分子之比在6和16之間，或I和12之間，例如8和12之間或I和8之間，或3和5之間或7和9之間。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述治療劑包含以下組分或由以下組分組成(a)對單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞具有特異性的所述結(jié)合部分是對CD163受體具有結(jié)合特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段，或保留了對CD163受體的結(jié)合特異性的所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物或所述變體或衍生物的融合物；和

(b)所述免疫抑制劑是糖皮質(zhì)激素。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明第一方面的治療劑可進(jìn)ー步包含可檢測部分和/或細(xì)胞毒性部分。因此，在一個實(shí)施方式中，所述治療劑進(jìn)ー步包含可檢測部分。所述“可檢測部分”包括的含義為在將本發(fā)明的治療劑施用給患者后，當(dāng)所述部分位于靶位點(diǎn)時，所述部分能夠被檢測，通常從體外和靶標(biāo)的定位位點(diǎn)通過非侵入的方式檢測。所述可檢測部分可以是單個原子或分子，其可以直接或間接地參與所述可檢測物的生成。因此，本發(fā)明的此實(shí)施方式的治療劑可用于成像和診斷。適合的可檢測部分是醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域已知的，而且，將這些部分與多肽和蛋白進(jìn)行連接也是本領(lǐng)域熟知的?？蓹z測部分的實(shí)例包括，但不限于以下放射性同位素(例如，3H、14C、35S、123I、125I、131I、99TC、mIn、9°Y、188Re)jjat_I (例如，11C、18F、64Cu)、熒光標(biāo)簽(例如，F(xiàn)ITC、若丹明、鑭系元素磷光劑、羰花青)、酶標(biāo)簽(例如，辣根過氧物酶、β_半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光劑、生物素基團(tuán)和由第二報告子識別的預(yù)定多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、ニ級抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合域、表位標(biāo)簽)。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)簽通過不同長度的間隔臂(spacer arm)連接以減少潛在的空間位阻。優(yōu)選地，所述可檢測部分包含放射性原子，例如選自由以下組成的放射性原子得-99、得-99m、鵬-123、鵬-124、鵬-131、鋼-111、氣-18、氣-19、碳-11、碳-13、銅-64、氣-13、氣-15、氧-15、氧-17、神-72、禮、猛、鐵、氣、氣、半乙-86、錯-89?？赏ㄟ^已知的方式將放射性標(biāo)簽或其他標(biāo)簽摻入到本發(fā)明的治療劑中。例如，如果所述結(jié)合部分是多肽，其可經(jīng)生物合成，或使用適合的氨基酸前體(包括例如氟-19取代氫)通過化學(xué)氨基酸合成法而合成。例如99mTc、123I、186Rh、188Rh和111In的標(biāo)簽可，例如通過所述結(jié)合部分中的半胱氨酸殘基連接。釔-90可通過賴氨酸殘基連接。可使用I0D0GEN法(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80,49-57,其通過引用并入本文)慘入1231。參考文獻(xiàn)(“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”,J-F Chatal,CRCPress, 1989，其通過引用并入本文)詳細(xì)描述了其他的方法。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 ー種治療劑，其還包含細(xì)胞毒性部分。所述“細(xì)胞毒性部分”包括的含義是所述部分是能夠在體內(nèi)或體外(例如在施用給患者吋)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的部分。所述細(xì)胞毒性部分可以是單個原子或分子，其可以直接或間接地參與誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此，本發(fā)明此實(shí)施方式的治療劑可用于治療(例如，在期望除去或破壞個體中的一種或多種細(xì)胞的情況下)。
適合的細(xì)胞毒性部分是醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域已知的，而且，將這些部分與多肽和蛋白進(jìn)行連接也是本領(lǐng)域熟知的。例如，當(dāng)本發(fā)明治療劑的各部分是多肽時，可通過交聯(lián)多肽的任意常規(guī)方式將所述兩部分連接在一起，例如O' Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100,100-108中大致描述的那些。例如，所述結(jié)合部分可富含巰基，且另一部分與能夠與這些巰基反應(yīng)的ニ官能劑反應(yīng)，例如碘こ酸(NHIA)的N-羥基琥珀酰亞胺酷，或N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基ニ硫代)丙酸酯(STOP)。酰胺和硫醚鍵，例如使用間馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯獲得的鍵，在體內(nèi)通常比ニ硫鍵更穩(wěn)定。細(xì)胞毒性部分的實(shí)例包括，但不限于以下放射性同位素(例如，123I、125I、mI、mIn、9°Y)，烷化劑(例如，順鉬)，抗代謝物(例如，氨甲喋呤)，抗有絲分裂劑(例如，長春新堿)，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，依托泊式)和毒素(例如，卡奇霉素(calicheamicin))。在一些實(shí)施方式中，通過不同長度的間隔臂連接細(xì)胞毒性部分以減少潛在的空間位阻。在一個實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒性部分包含放射性原子，例如選自以下組成的組中的放射性原子碘-123、碘-125、碘-131、銦-111、溴-77、銅-67、神-77、砹-211、 錒-225、鉍-212、鉍-213、镥-177、欽-166、磷-33、鉬-193、鉬-195、錸-186、錸-188、鍶-89、釔-90。在另ー個實(shí)施方式中，所述細(xì)胞毒性部分包括選自以下組成的組中的藥物烷化劑(例如，順鉬、卡鉬)，抗代謝物(例如，咪唑硫嘌呤、氨甲喋呤)，抗有絲分裂劑(例如，長春新堿)，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，阿霉素(doxorubicine)、依托泊式)和毒素(例如,卡
奇霉素)。本發(fā)明的治療劑在炎性和/或自身免疫性病變和病癥的治療中具有功效。所述“治療”包括對受試者/患者的治療性和預(yù)防性處理。術(shù)語“預(yù)防性”用于包括本文所述的治療劑、藥物或藥用制劑的應(yīng)用，其用于預(yù)防患者或受試者中炎性和/或自身免疫性病變或病癥或降低患者或受試者中炎性和/或自身免疫性病變或病癥的可能性。應(yīng)理解，為了預(yù)防或治療病變或病癥，治療劑的適合劑量可取決于待治療的病變或病癥的類型，所述病變或病癥的嚴(yán)重性和病程，所述治療劑的施用是出于預(yù)防性還是治療性的目的，此前療法的療程，以及患者的病史和對所述治療劑的反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的另ー個實(shí)施方式，本發(fā)明治療劑的功效在于緩解癥狀，對所述病變或病癥的預(yù)防或治療可通過連續(xù)給藥，或與對所述病變或病癥有效的其他治療劑(例如已知用于目標(biāo)治療指征的常規(guī)治療劑)組合給藥而改迸。在一個實(shí)施方式中，所述病癥或病變可選自以下組成的組關(guān)節(jié)炎疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎)、慢性炎性腸道疾病(IBD，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、牙周炎、銀屑病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、結(jié)締組織病、自身免疫性肝病(例如，膽汁性肝硬化)、膿毒癥、噬血細(xì)胞綜合癥、肝病、肝功能衰竭、肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、關(guān)節(jié)炎、炎癥誘導(dǎo)的軟骨損傷、肝硬變、器官移植、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、結(jié)節(jié)病、葡萄膜炎、HLA-B27陽性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎。有利地，所述病癥或病變是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一個實(shí)施方式中，所述病癥或病變是主要涉及肝臟的炎性病癥或病變，例如非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、膿毒癥。在另ー個實(shí)施方式中，所述病癥或病變是部分或主要涉及受累器官接觸內(nèi)毒素/LPS的炎性病癥或病變，例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、膿毒癥。在一個實(shí)施方式中，所述治療劑顯示的治療功效是不存在所述結(jié)合部分的對應(yīng)免疫抑制劑的至少10倍。優(yōu)選地，在治療有效劑量下，所述治療劑的副作用譜低于不存在所述結(jié)合部分的對應(yīng)免疫抑制劑的副作用譜。用于測試治療劑的相對功效或副作用的方法是本領(lǐng)域熟知的。用于測試治療劑相對功效的適合的方法描述在后附的實(shí)施例中。另ー方面，本發(fā)明提供了ー種藥物組合物，其包含有效量的本文定義的治療劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。根據(jù)本發(fā)明，本文使用的“藥物組合物”是指在治療上有效的制劑。本文使用的“治療有效量”或“有效量”或“治療上有效的”是指對給定的病癥和·給藥方案提供治療作用的量。其為經(jīng)計(jì)算以與所需的添加劑和稀釋劑(即載體或給藥賦形齊IJ)組合而產(chǎn)生期望的治療作用的活性物質(zhì)的預(yù)定量。此外，其還指足以降低或預(yù)防宿主的活動、功能和反應(yīng)的臨床顯著性缺陷的量?；蛘?，治療有效量足以導(dǎo)致宿主中的臨床顯著病癥的改進(jìn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，化合物的量可根據(jù)其具體活性而改變。適合的劑量可包含經(jīng)計(jì)算與所需稀釋劑組合而產(chǎn)生期望的治療作用的活性組合物的預(yù)定量。在用于制備本發(fā)明組合物的方法和用途中，提供了治療有效量的所述活性成分。如本領(lǐng)域所熟知的，普通醫(yī)藥或獸醫(yī)工作者可基于患者的特征，例如年齡、體重、性別、健康狀態(tài)、并發(fā)癥、其他疾病等確定治療有效量。可使用可注射的緩釋給藥系統(tǒng)遞送本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物。這些經(jīng)過專門設(shè)計(jì)以降低注射的頻率。此類系統(tǒng)的實(shí)例是Nutropin D印ot，其將重組人生長激素(rhGH)包封在可生物降解的微球中，其ー經(jīng)注射，即在較長的時期中緩慢地釋放rhGH。優(yōu)選地，通過肌肉內(nèi)(i.m.)和/或皮下(s.c.)和/或靜脈內(nèi)(i. V.)進(jìn)行遞送?？赏ㄟ^將藥物直接釋放到所需位點(diǎn)的手術(shù)植入裝置施用本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物。例如，Vitrasert將更昔洛韋直接釋放到眼中以治療巨細(xì)胞病毒(CMV)視網(wǎng)膜炎。將此毒性劑直接應(yīng)用到患病位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了有效的治療，而沒有藥物的顯著的全身副作用。也可應(yīng)用電穿孔治療(EPT)系統(tǒng)來施用本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物。向細(xì)胞施加脈沖電場的裝置提高了所述細(xì)胞膜對藥物的可透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物遞送顯著增強(qiáng)。還可通過電引入(electro-incorporation, EI)遞送本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物。EI發(fā)生在皮膚表面上直徑達(dá)30微米的小顆粒受到與用于電穿孔相同或類似的電脈沖的情況下。在EI中，這些顆粒被驅(qū)動穿過角質(zhì)層，并進(jìn)入皮膚的較深層。所述顆粒可負(fù)載或包被藥物或基因，或能夠僅充當(dāng)在皮膚中產(chǎn)生使藥物能夠由此進(jìn)入的孔的“子弾”。用于遞送本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物的可選方法是熱敏的ReGel注射系統(tǒng)。低于體溫吋，ReGel是可注射的液體，而在體溫下，其立即形成緩慢消蝕并溶解成已知安全的可生物降解聚合物的凝膠庫?；钚晕镔|(zhì)隨著生物聚合物的溶解而隨時間遞送。
本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物還可以通過ロ服遞送。此方法利用了 ロ服攝取維生素B12和/或維生素D以在體內(nèi)共遞送蛋白和肽的天然過程。借助維生素B12和/或維生素D攝取系統(tǒng)，本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物能夠移動通過腸壁。在維生素B12類似物和/或維生素D類似物與藥物之間合成復(fù)合物，所述藥物既保留了復(fù)合物的維生素B12部分和/或維生素D部分中對內(nèi)因素(IF)的顯著親和力，還保留了所述復(fù)合物的活性物質(zhì)的顯著生物活性。本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物可通過“特洛伊肽(Trojan peptide) ”引入到細(xì)胞。這是被稱作“穿透素(penetratin) ”的一類多肽,其具有轉(zhuǎn)位性質(zhì),并且能夠攜帶親水化合物跨過質(zhì)膜。此系統(tǒng)可以引導(dǎo)寡肽靶向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，并且具有非細(xì)胞類型特異性和高效性。參見 Derossi et al. (1998)，Trends Cell Biol 8,84-87。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物和/或藥物組合物是包含日劑量或単位、日亞劑量或其適合的小部分的活性成分的單位劑型。
本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物通常通過ロ服或任何胃腸外途徑施用，其可以是藥學(xué)可接受的劑型的包含活性成分的藥物組合物的形式，其中任選地，所述活性成分是無毒的有機(jī)酸或無機(jī)酸，或有機(jī)堿或無機(jī)堿，加成鹽的形式。根據(jù)待治療的病變和患者，以及給藥途徑，所述組合物可以以不同劑量施用。在對人的治療中，本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物可以單獨(dú)施用，但通常與根據(jù)給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐而選擇的適合藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合施用。例如，本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物可以以片劑、膠囊劑、栓劑(ovule)、酏齊U、溶液或懸浮液的形式經(jīng)ロ服、頰部或舌下施用，其可包含調(diào)味劑或著色劑，以用于速釋、緩釋或控釋應(yīng)用。本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物還可以通過海綿體內(nèi)注射施用。此類片劑可包含賦形劑，例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸；崩解劑，例如淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、淀粉こ醇酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素納和某些復(fù)合硅酸鹽；以及?；澈蟿?，例如聚こ烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外，還可包含潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油山崳酸酯和滑石。近似類型的固體組合物也可以用作明膠膠囊中的填充物。在此方面，優(yōu)選的賦形劑包括乳糖(lactose)、淀粉、纖維素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚こニ醇。對于水懸浮液和/或酏劑，本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物可以組合多種甜味劑或調(diào)味劑、著色劑或染料，以及乳化劑和/或懸浮劑，以及稀釋劑，例如水、こ醇、丙ニ醇和甘油，及其組合。本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物可以經(jīng)胃腸外施用，例如經(jīng)靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用，或者通過輸注技術(shù)施用。其最好以無菌水溶液的形式使用，所述無菌水溶液包含其他物質(zhì)，例如，足以使所述溶液與血液等滲的鹽或葡萄糖。如果必要，所述水溶液應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)木彌_(優(yōu)選緩沖至pH 3-9)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)容易地在無菌條件下制備適合的胃腸外制劑。適合胃腸外施用的藥物和藥物組合物包括含水和無水的無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使所述制劑與目標(biāo)受者血液等滲的溶質(zhì)；還包括含水和無水的無菌懸浮液，其可包含懸浮劑和增稠劑。所述藥物和藥物組合物可以存在于單位劑量或多劑量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可在冷凍干燥(凍干)的條件下貯存，僅需要在臨用前添加無菌液體載體，例如注射用水。即用型注射溶液和懸浮液可以由此前描述的各種無菌粉末、顆粒和片劑制備。對于人患者的ロ服和胃腸外施用，本發(fā)明治療劑、藥物和藥物組合物的日劑量水平通?？梢允敲總€成年人每天以單個劑量或分開的劑量施用5至1500mg。因此，例如，本發(fā)明治療劑、藥物和藥物組合物可包含5mg至1400mg(例如，7mg至1400mg,或5mg至IOOOmg)的活性劑，并可優(yōu)選包含5mg至200mg的活性劑，以供單次施用，或者，適當(dāng)?shù)?，毎次施用兩份或更多?
在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明治療劑、藥物和藥物組合物的給藥劑量從O. 02mg/kg至2mg/kg,頻率范圍從姆周兩次至姆月一次。本發(fā)明治療劑、藥物和藥物組合物還可以經(jīng)鼻內(nèi)或通過吸入施用，并以使用適合的推進(jìn)劑由加壓容器、泵、噴器或噴霧器噴送提供的干粉吸入劑或氣霧劑形式方便地遞送，所述適合的推進(jìn)劑，例如ニ氯ニ氟甲烷、三氯氟甲烷、ニ氯四氟こ烷，氫氟烷，例如1，1，1，2-四氟こ烷(HFA 134A3)或1，1，1，2，3，3，3_七氟丙烷(HFA 227EA3)，ニ氧化碳或其他適合的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可通過提供閥門以遞送經(jīng)計(jì)量的量來確定劑量単位。所述加壓容器、泵、噴器或噴霧器可包含所述活性劑的溶液或懸浮液，例如使用こ醇和所述推進(jìn)劑的混合物作為溶劑，其還可包含潤滑劑，例如脫水山梨醇三油酸酷。用于吸入器或吹入器中的膠囊和藥筒(例如由明膠制成)可經(jīng)配制而包含本發(fā)明治療劑和適合的粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。優(yōu)選地，氣霧劑或干粉制劑的配置使得每個計(jì)量的劑量或毎“噴”包含至少Img的本發(fā)明治療劑以遞送給患者。應(yīng)理解，使用氣霧劑的總?cè)談┝繉Ω鱾€患者各不相同，并且可在全天中以單個劑量，或更常見地，以分開的劑量施用。或者，本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物可以以栓劑或陰道栓劑的形式施用，或以洗劑、溶液、乳劑、凝膠、軟膏或粉劑的形式局部施用。本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物還可以透皮施用，例如，通過使用皮膚貼劑施用。其還可以通過經(jīng)眼途徑施用，特別是用于治療眼睛的疾病。對于眼科應(yīng)用，本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物可配制成于等滲的、pH經(jīng)調(diào)節(jié)的無菌鹽水中的微粉化懸浮液，或優(yōu)選地，配制成于等滲的、pH經(jīng)調(diào)節(jié)的無菌鹽水中的溶液，并任選地，與諸如苯扎氯銨的防腐劑組合。或者，可將其配制在諸如礦脂的軟膏中。對于用于皮膚的局部應(yīng)用，可將本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物配制成包含所述活性劑的適合軟膏，所述活性劑懸浮或溶于，例如包含以下一種或多種物質(zhì)的混合物中礦物油、液體礦脂、白礦脂、丙ニ醇、聚氧こ烯聚氧丙烯劑，乳化蠟和水。或者，可將其配制成適合的洗劑或乳劑，懸浮或溶于，例如以下一種或多種物質(zhì)的混合物中礦物油、脫水山梨醇單硬脂酸酷、聚こニ醇、液體石蠟、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。適合在ロ中局部施用的制劑包括包含在調(diào)味基(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)中的活性成分的糖錠(lozenge);包含在惰性基(例如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)中的活性成分的錠劑(pastille),以及包含在適合的液體載體中的活性成分的漱ロ液。通常，對于人，ロ服或胃腸外施用本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物是優(yōu)選的途徑，其最為便利。對于獸醫(yī)應(yīng)用，將本發(fā)明的治療劑、藥物和藥物組合物作為適合的可接受劑型，根據(jù)通常的獸醫(yī)實(shí)踐來施用，獸醫(yī)可確定對具體動物最適合的給藥方案和施用途徑。本發(fā)明的治療劑可配制成不同的濃度，其取決于所使用化合物的功效/毒性，例如，如后附實(shí)施例中的描述。對于體外應(yīng)用，制劑可包含較低濃度的本發(fā)明化合物。因此，本發(fā)明提供了ー種藥物組合物，其包含一定量的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段，或它們的變體、融合物或衍生物，以治療各種病癥(如上下文所述)。優(yōu)選地，所述藥物組合物適合經(jīng)胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肺、肌肉內(nèi)或皮下)，經(jīng)鼻內(nèi)，通過吸入或經(jīng)眼內(nèi)遞送。
本發(fā)明還包括包含藥學(xué)可接受的本發(fā)明的多肽結(jié)合部分的酸或堿加成鹽的藥物組合物。用于制備可用于本發(fā)明的上述基礎(chǔ)化合物的藥學(xué)可接受酸加成鹽的酸是形成無毒酸加成鹽的那些，即包含藥學(xué)可接受的陰離子的鹽，例如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、こ酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、酒石酸氫鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、糖質(zhì)酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、こ磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和撲酸鹽(即，1，Γ -亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽)等。藥學(xué)可接受的堿加成鹽也可用于制備藥學(xué)可接受的鹽形式的本發(fā)明治療劑?？捎米髦苽浔景l(fā)明酸性性質(zhì)治療劑的藥學(xué)可接受堿鹽的試劑的化學(xué)堿是與此類化合物形成無毒堿鹽的那些。此類無毒堿鹽包括，但不限于源自藥理學(xué)可接受陽離子的那些，例如堿金屬陽離子(例如，鉀和鈉)和堿土金屬陽離子(例如，鈣和鎂)、銨或水溶性胺加成鹽，例如N-甲基葡糖胺_(甲葡胺)，和低級烷醇銨，以及藥學(xué)可接受的有機(jī)胺的其他堿鹽等?？蓪⒈景l(fā)明的治療劑和/或多肽結(jié)合部分凍干以貯存，并在使用前復(fù)溶在適合的載體中?？刹捎萌魏芜m合的凍干方法(例如，噴霧干燥、濾餅干燥(cake drying))和/或復(fù)溶技木。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，凍干和復(fù)溶會導(dǎo)致不同程度的抗體活性損失(例如，對于常規(guī)免疫球蛋白，IgM抗體的活性損失往往大于IgG抗體)，因此，可能必須上調(diào)使用水平以進(jìn)行補(bǔ)償。在一個實(shí)施方式中，凍干(冷凍干燥)的多肽結(jié)合部分在復(fù)溶時損失不超過約20 %，或不超過約25 %，或不超過約30 %，或不超過約35 %，或不超過約40 %，或不超過約45 %,或不超過約50 %的活性(凍干前)。在另一方面，本發(fā)明提供了包含本文定義的治療劑或藥物組合物的試劑盒。因此，本發(fā)明提供了用于治療性處理本文定義的病癥的試劑盒?；蛘?，所述試劑盒可包含適合用于診斷的本發(fā)明的可檢測抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。此類診斷試劑盒可包含足以進(jìn)行至少一次檢測的量的，作為獨(dú)立包裝試劑的診斷治療劑。通常，還包含關(guān)于包裝試劑的應(yīng)用的說明書。此類說明書通常包括描述試劑濃度和/或至少ー個檢測方法參數(shù)，例如試劑與待混合樣品的相對量、試劑/樣品混合物的保持時間段、溫度、緩沖條件等的明確表述。另ー方面，本發(fā)明提供了醫(yī)用治療劑。因此，所述治療劑可用于炎性病癥或病變的治療。在一個實(shí)施方式中，所述治療劑用于自身免疫性疾病的治療。
例如，所述病癥、病變或疾病可選自以下組成的組關(guān)節(jié)炎疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎)、慢性炎性腸道疾病(IBD，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、牙周炎、銀屑病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、結(jié)締組織病、自身免疫性肝病(例如，膽汁性肝硬化)、膿毒癥、噬血細(xì)胞綜合癥、肝病、肝功能衰竭、肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、關(guān)節(jié)炎、炎癥誘導(dǎo)的軟骨損傷、肝硬化、器官移植、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、結(jié)節(jié)病、葡萄膜炎、HLA-B27陽性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎。有利地，所述病癥、病變或疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一個實(shí)施方式中，所述病癥或病變是主要涉及肝臟的炎性病癥或病變，例如非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、膿毒癥。
在另ー個實(shí)施方式中，所述病癥或病變是部分或主要涉及受累器官接觸內(nèi)毒素/LPS的炎性病癥或病變，例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、膿毒癥。使用諸如本發(fā)明治療劑的活性劑制備藥物的方法是醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的治療劑在用于治療在本文中均有定義的炎性病癥或病變和/或自身免疫性疾病，或增殖性病癥或病變，或遺傳性病癥或病變，或由微生物導(dǎo)致的病癥或病變中的用途。一個實(shí)施方式提供了本發(fā)明的治療劑在用于治療自身免疫性疾病中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了治療劑在制備用于治療在本文中均有定義的炎性病癥或病變和/或疾病，或增殖性病癥或病變，或遺傳性病癥或病變，或由微生物導(dǎo)致的病癥或病變的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述用途是用于治療自身免疫性疾病。有利地，所述病癥、病變或疾病選自以下組成的組關(guān)節(jié)炎疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎)、慢性炎性腸道疾病(IBD，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、牙周炎、銀屑病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、結(jié)締組織病、自身免疫性肝病(例如，膽汁性肝硬化)、膿毒癥、噬血細(xì)胞綜合癥、肝病、肝功能衰竭、肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、關(guān)節(jié)炎、炎癥誘導(dǎo)的軟骨損傷。優(yōu)選地，所述病癥、病變或疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一個實(shí)施方式中，所述病癥或病變是主要涉及肝臟的炎性病癥或病變，例如非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、膿毒癥。在另ー個實(shí)施方式中，所述病癥或病變是部分或主要涉及受累器官接觸內(nèi)毒素/LPS的病癥或病變，例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、膿毒癥。在另一方面，本發(fā)明提供了用于降低和/或緩解在本文中均有定義的炎性病癥或病變和/或自身免疫性病癥或病變，或增殖性病癥或病變，或遺傳性病癥或病變，或由微生物導(dǎo)致的病癥或病變的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用有效量的本發(fā)明的治療劑或藥物組合物的步驟。優(yōu)選地，所述方法用于治療自身免疫性疾病(優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。有利地，所述病癥、病變或疾病選自以下組成的組關(guān)節(jié)炎疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎)、慢性炎性腸道疾病(IBD，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、牙周炎、銀屑病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、結(jié)締組織病、自身免疫性肝病(例如，膽汁性肝硬化)、膿毒癥、噬血細(xì)胞綜合癥、肝病、肝功能衰竭、肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、關(guān)節(jié)炎、炎癥誘導(dǎo)的軟骨損傷、肝硬化、器官移植、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、結(jié)節(jié)病、葡萄膜炎、HLA-B27陽性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎。優(yōu)選地，所述病癥、病變或疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一個實(shí)施方式中，所述病癥或病變是主要涉及肝臟的炎性病癥或病變，例如非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝 炎、自身免疫性肝病、膿毒癥。在另ー個實(shí)施方式中，所述病癥或病變是部分或主要涉及受累器官接觸內(nèi)毒素/LPS的病癥或病變，例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、自身免疫性肝病、膿毒癥。除非另有明確說明，本文使用的単數(shù)形式(“a”、“and”和“the”)包括復(fù)數(shù)的對象。因此，例如“抗體”包括多個此類抗體，且所述“劑量”包括ー個或多個劑量，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同物，等等。本說明書中對明顯為此前公開文獻(xiàn)的列舉或討論不一定等于承認(rèn)所述文獻(xiàn)是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或是公知常識。優(yōu)選地，將參考以下附圖描述體現(xiàn)本發(fā)明某些方面的非限定實(shí)施例圖I :使用不同抗⑶163克隆，外周血單核細(xì)胞⑶163在新鮮抽取樣品中的分布。在前向散射[FSC]與側(cè)散射[SSC]中對單核細(xì)胞進(jìn)行門控(gating)處理后，使用CD14APC與CD163PE克隆重新標(biāo)繪經(jīng)門控的細(xì)胞(A)MAC2-158，SRCR域-1 ; (B) R-20，SRCR域-4 ; (C)GHI/61，SRCR 域-7 和(D) RM3/1, SRCR 域-9。圖2 :使用不同的抗⑶163克隆，在不同抗凝劑影響下血液樣品中單核細(xì)胞⑶163表達(dá)。在使用三種常用抗凝劑穩(wěn)定的新鮮抽取全血中，研究不同的細(xì)胞外鈣濃度對單核細(xì)胞表面CD163表達(dá)測定的影響㈧EDTA ;(B)檸檬酸鹽和(C)肝素。在前向散射[FSC]與側(cè)散射[SSC]中對單核細(xì)胞進(jìn)行門控處理后，使用CD14APC與CD163PE克隆重新標(biāo)繪經(jīng)門控的細(xì)胞(左圖)MAC2-158, SRCR 域-1 ;(第二圖)R_20，SRCR 域-4 ;(第三圖)GHI/61，SRCR 域-7 ;和(右圖)RM3/1, SRCR 域-9。圖3 :使用不同的抗⑶163mAb，在由EDTA、檸檬酸鹽和肝素抗凝的樣品中的單核細(xì)胞CD163表達(dá)的圖示。在前向散射[FSC]與側(cè)散射[SSC]中對單核細(xì)胞進(jìn)行門控處理后，使用⑶14APC與⑶163PE克隆重新標(biāo)繪經(jīng)門控的細(xì)胞。隨后，評估(A)⑶163陽性的單核細(xì)胞的比例和(B)平均姆個細(xì)胞結(jié)合的R-藻紅蛋白偶聯(lián)⑶163抗體數(shù)。使用QuantibritePE珠將細(xì)胞群的FL2線性熒光染色轉(zhuǎn)化成反映受體密度的平均每個細(xì)胞結(jié)合的CD163R-藻紅蛋白分子數(shù)。結(jié)果表示為一式三份樣品的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(SE)。所顯示的數(shù)據(jù)代表了多個獨(dú)立進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。圖4 :在2mM游離Ca2+(實(shí)線)或IOmM EDTA (虛線)中與固定化CD163結(jié)合的mAb。除了 R-20 和 5C6-FAT(10 μ g/ml)和 GHI/61 (20 μ g/ml)之外，mAb 的濃度為 5 μ g/ml。圖5 :不同的125I標(biāo)記單克?、?63抗體克隆的細(xì)胞結(jié)合和攝取。為了比較不同的單克?、?63抗體克隆的胞吞能力，將⑶163轉(zhuǎn)染的Flp-In CHO細(xì)胞與不同的125I標(biāo)記CD163抗體一起溫育。在未轉(zhuǎn)染的Flp-In CHO細(xì)胞中檢測的細(xì)胞相關(guān)放射性的程度不顯著。圖6 :⑶163抗體在人巨噬細(xì)胞中的結(jié)合和攝取。將源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞與結(jié)合⑶163的免疫熒光性mAb —起溫育O或30分鐘，使用熒光激光顯微鏡檢測?？梢奙Ac2_158顯示了最佳的結(jié)合和攝取。圖7A和B :⑶163抗體在表達(dá)⑶163的CHO細(xì)胞和對照CHO細(xì)胞中的結(jié)合和攝取。將細(xì)胞與結(jié)合⑶163的免疫熒光性mAb —起溫育O或30分鐘，使用共焦顯微鏡檢測?？梢?Mac2-48和MAc2_158顯示了最佳的結(jié)合和攝取。圖8A和B :與Mac2_158的競爭。A和B中的小圖顯示了完整的傳感圖，而放大部分則顯示了展示不同mAb與Mac2-158飽和的⑶163芯片結(jié)合的部分傳感圖。由圖8A可見，在2mM游離鈣緩沖液中，Mac2-158、Mac2-48、Ber-Mac3和GHI/61不能結(jié)合由Mac2_158飽和的⑶163-Fc。除GHI/61之外，所有的mAb均結(jié)合SRCR域1，而GHI/61在富鈣環(huán)境中沒有顯示結(jié)合。無論是否飽和，單克隆抗體EdHU-I、Ki-M8、RM3/l和R20均能夠結(jié)合⑶163_Fc，因此，不與Mac2-158競爭結(jié)合CD163。圖9 :表達(dá)巨噬細(xì)胞清道夫受體⑶163的未知組織成分的鑒定。在前向散射[FSC]與側(cè)散射[SSC]的標(biāo)繪圖中，對CD163陽性細(xì)胞進(jìn)行門控處理(Gl) (A)，并使用⑶14APC與⑶163PE重新標(biāo)繪經(jīng)門控的細(xì)胞。在仍未鑒定的⑶14-⑶163+細(xì)胞群周圍設(shè)定門控(G2) (B)，并使用CD163PE與HLA-DRFITC重新標(biāo)繪(C)。在FSC/SSC標(biāo)繪圖(D)中的⑶14-HLA-DR+⑶163+細(xì)胞(環(huán)繞的散點(diǎn)圖覆蓋層)的反向門控(backgating)分析顯示定位在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的相對不同的細(xì)胞群。

圖10 :外周血中樹突細(xì)胞上⑶163表達(dá)的流式細(xì)胞分析。在前向散射[FSC]與側(cè)散射[SSC]中，對單核細(xì)胞簇進(jìn)行門控處理(Gl) (A)，并使用⑶14APC與ILT3PE-Cy5重新標(biāo)繪經(jīng)門控的細(xì)胞(B)，并在⑶14-ILT3+細(xì)胞(樹突細(xì)胞；G2)周圍設(shè)定門控。使用⑶163PE與HLA-DR FITC重新標(biāo)繪經(jīng)門控的樹突細(xì)胞，標(biāo)繪出兩個亞類的CD163+樹突細(xì)胞(C)。在FSC/SSC標(biāo)繪圖⑶中的⑶14-ILT3+HLA-DR+⑶163+細(xì)胞(環(huán)繞的散點(diǎn)圖覆蓋層)的反向門控分析顯示了樹突細(xì)胞在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的預(yù)期定位。同種型匹配的非特異性PE偶聯(lián)IgGl用作陰性染色對照(E)。圖11 :使用不同⑶163mAb，對外周血樹突細(xì)胞⑶163表達(dá)的流式細(xì)胞分析。在對單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞(⑶14-ILT3+)進(jìn)行門控處理后，使用⑶163PE與HLA-DR FITC重新標(biāo)繪經(jīng)門控的細(xì)胞，其中使用抗CD163的GHI/61(A)或MAC2_158(C)克隆。FSC/SSC標(biāo)繪圖(D)中，使用MAC2-158的CD14-ILT3+HLA-DR+CD163+細(xì)胞(灰色散點(diǎn)圖覆蓋層)的反向門控分析顯示了比FSC/SSC標(biāo)繪圖⑶中使用GHI/61(10. 5% [95% Cl :8. 0-12. 5%])(紅色散點(diǎn)圖覆蓋層)吋，顯著較高比例的表達(dá)⑶163的外周血樹突細(xì)胞(32.3% [95% Cl 19. 6-45. 1% ])。
圖12 :表達(dá)⑶163的外周血樹突細(xì)胞的表型分析。外周血中樹突細(xì)胞上⑶163、HLA-DR、ILT3、⑶11c、⑶16和⑶91的流式細(xì)胞分析。在對單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞(CD14-ILT3+)進(jìn)行門控處理后，使用 CD163PE 與(A)HLA-DR PerCP ； (B) ILT3PE_Cy5 ； (C)CDllc FITC ;(D)CD16FITC和(E) CD91FITC重新標(biāo)繪經(jīng)門控的細(xì)胞。圖13 =HIV-I感染中的樹突細(xì)胞⑶163表達(dá)。與健康成年人相比，來自HIV-I患者的外周血中的樹突細(xì)胞上⑶163表達(dá)的流式細(xì)胞分析。(a)正常對照(η = 31)和HIV-I感染患者(η = 15)中的⑶163+樹突細(xì)胞的比例。方框圖顯示了中值、25-75百分位數(shù)值和范圍。(b)對照和HIV-I感染患者中⑶163在⑶163ffi和⑶163胃亞群中的表達(dá)水平。(c)對照和HIV-I感染患者中⑶163在⑶163ffi和⑶163胃亞群中的表達(dá)水平。使用QuantibritePE珠將細(xì)胞群的FL2線性熒光染色轉(zhuǎn)化成平均每個細(xì)胞結(jié)合的CD163PE分子數(shù)。結(jié)果表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。< O. 001。圖14 =HIV-I感染中樹突細(xì)胞⑶163表達(dá)的典型標(biāo)繪圖。(a)在對單核細(xì)胞和樹 突細(xì)胞(⑶14-ILT3+)進(jìn)行門控處理后，使用⑶163PE與HLA-DRFITC重新標(biāo)繪經(jīng)門控的細(xì) 胞(㈧，⑶和(C))。源自三位不同患者的標(biāo)繪圖代表了在HIV-I感染患者(η = 15)中調(diào)查的樹突細(xì)胞⑶163表達(dá)。表I :使用不同的⑶163mAb，在使用EDTA、檸檬酸鹽和肝素抗凝的樣品中的單核細(xì)胞CD163表達(dá)的概況。在類似于生理學(xué)上鈣水平的肝素穩(wěn)定血樣品中的單核細(xì)胞CD163表達(dá)與使用鈣螯合剤、EDTA和檸檬酸抗凝的樣品進(jìn)行比較。數(shù)值在95%置信區(qū)間(95% Cl)，且使用t檢驗(yàn)分析EDTA數(shù)值分別與肝素和檸檬酸酯數(shù)值之間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。表2 :使用不同的⑶163mAb，在使用EDTA、檸檬酸鹽和肝素抗凝的樣品中的單核細(xì)胞CD163表達(dá)的概況。在類似于生理學(xué)上鈣水平的肝素穩(wěn)定血樣品中的單核細(xì)胞CD163表達(dá)與使用鈣螯合剤、EDTA和檸檬酸抗凝的樣品進(jìn)行比較。數(shù)值在95%置信區(qū)間(95% Cl)，且使用t檢驗(yàn)分析肝素數(shù)值分別與EDTA和檸檬酸酯數(shù)值之間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。圖15 :在人源化過程期間產(chǎn)生的擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠。1%瓊脂糖凝膠分析顯示了用于擴(kuò)增工作可變區(qū)的PCR。左圖Mac2-158(100bp標(biāo)記物，重鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū))。右圖Mac2-48(100bp標(biāo)記物，3x重鏈可變區(qū)，3x輕鏈可變區(qū))。圖16 :所測試的序列變體。用于％和ん的模板是全序列的最佳匹配，且種系(Germline)是在種系V-序列中的最佳匹配。其他序列是在表達(dá)和ELISA中檢測的序列。圖17 :與K8輕鏈或NRY輕鏈配對的重鏈的反應(yīng)性比較。Cy (cgamma) (6) /K8和Cy (6)/NRY獲得了針對⑶163的明顯類似的反應(yīng)性?？贵w樣品Cy (6)/K8包含約兩倍的抗體以獲得如Cy (6)/NRY所獲得的相同反應(yīng)性。圖18 :人源化重鏈變體的結(jié)合。人源化重鏈變體KN2、KN1IN5、VR1和DQ2 (均與輕鏈NRY配對)對⑶163具有相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性。*或#試驗(yàn)在相同ELISA平板上進(jìn)行。圖19 :KN2/NRY和Mac2_158與固定在Biacore芯片上的人CD163的結(jié)合的表面等離子共振檢測。實(shí)際上，兩種mAb顯示了類似的親和力。圖20 :由HisTrap 純化的所表達(dá)的scFv的級分的ELISA。將每個級分樣品以I 10稀釋在1% BSA, PBS中。隨后，將稀釋的樣品加入到⑶163包被的孔中。圖21 :重折疊的scFv樣品的ELISA。將重折疊的scFv加入到孔中，并進(jìn)行2倍的系列稀釋。直至在I % BSA，PBS中稀釋128倍，重折疊的scFv仍與⑶163結(jié)合。非稀釋樣品(無BSA的緩沖液中的scFv)具有高背景(左側(cè)的灰色柱)。圖22 =ELISA中直接檢測的細(xì)胞培養(yǎng)上清。即便對于非稀釋上清，ELISA信號也非常低。圖23 =ELISA中檢測的30倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)上清。30倍濃縮上清的ELISA信號證實(shí)了 Fab片段的存在。所述強(qiáng)度與100ng/ml完整長度的IgG4抗體標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)。圖24 :65354 的 SDS-PAGE 分析泳道 M :分子量標(biāo)記物(Cat. No. MM0900,GenScript);泳道I :粗收獲物；泳道2 :流通物(Flow through);泳道3 :50mM咪唑的洗脫物；泳道4-5 :IOOmM咪唑的洗脫物；泳道6_8 :250mM咪唑的洗脫物；泳道9 :500mM咪唑的洗脫物。此方法產(chǎn)生了約6. Omg的小鼠⑶163可溶蛋白域1-3，其在SDS-PAGE分析中的純度超過80%。圖25 cDNA珠上VJ3CR的PCR產(chǎn)物的I %瓊脂糖凝膠電泳。泳道M IOObp標(biāo)記物。 泳道2顯示了大小約400bp的產(chǎn)物。通過凝膠提取純化此條帯，隨后測序。圖26 cDNA珠上Vh PCR的PCR產(chǎn)物的I %瓊脂糖凝膠電泳。泳道M IOObp標(biāo)記物。泳道7顯示了大小約500bp的產(chǎn)物。通過凝膠提取純化此條帶，隨后測序。圖27 KN2/NRY和Mac2_158的表位繪圖，敲入和敲除表位。A 以下樣品的Western印跡SeeBlue plus2預(yù)染標(biāo)記物(泳道I);人CD163wt (泳道 2);人 CD163R60D (泳道 3);人 CD163VKVQEE—> LKIHEK (泳道 4);人 CD163雙突變體(泳道5)和陰性轉(zhuǎn)染對照(泳道6)。使用多克隆兔抗人CD163抗體和作為ニ級抗體的與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔抗體，進(jìn)行蛋白表達(dá)的檢測。B 以下樣品的Western印跡SeeBlue plus2預(yù)染標(biāo)記物(泳道I);人CD163wt (泳道 2);人 CD163R60D (泳道 3);人 CD163VKVQEE—> LKIHEK (泳道 4);人 CD163雙突變體(泳道5)和陰性轉(zhuǎn)染對照(泳道6)。使用mac2-158檢測表位，并使用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠抗體作為ニ級抗體。C 以下樣品的Western印跡SeeBlue plus2預(yù)染標(biāo)記物(泳道I);人CD163wt (泳道 2);人 CD163R60D (泳道 3);人 CD163VKVQEE—> LKIHEK (泳道 4);人 CD163雙突變體(泳道5)和陰性轉(zhuǎn)染對照(泳道6)。使用KN2/NRY-HRP檢測表位。D 以下樣品的 Western 印跡(泳道 I)小鼠 CD163 1-5LKIHDK— > VKVQEE，Y60R突變體；(泳道2)小鼠CD163 l-5wt ；(泳道3)陰性轉(zhuǎn)染對照；(泳道4) SeeBlue plus2預(yù)染標(biāo)記物；(泳道5)陽性印跡對照(小鼠CD163，與V5標(biāo)簽重組)。所使用的ー級抗體是抗V5抗體。使用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠抗體作為ニ級抗體進(jìn)行所結(jié)合的ー級抗體的檢測。E 以下樣品的 Western 印跡(泳道 I)小鼠 CD163 1-5LKIHDK— > VKVQEE，Y60R突變體；(泳道2)小鼠CD163 l-5wt ；(泳道3)陰性轉(zhuǎn)染對照；(泳道4) SeeBlue plus2預(yù)染標(biāo)記物；(泳道5)陽性印跡對照(人⑶163)。所使用的ー級抗體是Mac2-158。使用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠抗體作為ニ級抗體進(jìn)行所結(jié)合的ー級抗體的檢測。圖28 :地塞米松和地塞米松-NHS標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(A)，和游離地塞米松/地塞米松-NHS(B)以及ED2-地塞米松偶聯(lián)物樣品中的總地塞米松(C)的測定。地塞米松-NHS在柱上轉(zhuǎn)化成地塞米松-半琥珀酸酷，因此，地塞米松-NHS與地塞米松-半琥珀酸酯之間沒有區(qū)別。
表3A :不同抗體-皮質(zhì)類固醇-NHS偶聯(lián)物的偶聯(lián)參數(shù)。B :不同抗體-MVCP-地塞米松偶聯(lián)物的偶聯(lián)參數(shù)。圖29 A KN2/NRY和KN2/NRY-NHS-地塞米松偶聯(lián)物的SDS-PAGE。泳道I :分子量標(biāo)記物；泳道2 KN2/NRY ;和泳道3 KN2/NRY-NHS-地塞米松。B :顯示KN2/NRY和KN2/NRY-NHS-地塞米松偶聯(lián)物(使用NHS-地塞米松與伯胺偶聯(lián))的CD163結(jié)合的傳感圖。C :用于偶聯(lián)以產(chǎn)生KN2/NRY-NHS-地塞米松的地塞米松-NHS分子的圖示結(jié)構(gòu)。D :左側(cè)KN2/NRY和KN2/NRY-MVCP-地塞米松偶聯(lián)物的SDS-PAGE。泳道I :分子量標(biāo)記物；泳道2 KN2/NRY ;和泳道4 :還原的KN2/NRY ;泳道5 :KN2/NRY_MVCP (非還原)。E :顯示KN2/NRY和KN2/NRY-地塞米松偶聯(lián)物(偶聯(lián)至限制性還原的KN2/NRY的游離SH基團(tuán))的⑶163結(jié)合的傳感圖。A和B顯示偶聯(lián)后僅非常有限降低的親和力，和偶聯(lián)后聚集沒有増加。F :用于偶聯(lián)以產(chǎn)生KN2/NRY-MVCP-地塞米松的地塞米松-MVCP分子的圖示結(jié)構(gòu)。圖30 :觸珠蛋白-地塞米松偶聯(lián)物對人單核細(xì)胞的作用A :顯示與地塞米松偶聯(lián)的觸珠蛋白對從血沉棕黃層(buffy coat,過期血衆(zhòng))分離的人單核細(xì)胞的作用，以及此后與血紅蛋白復(fù)合以誘導(dǎo)偶聯(lián)物與CD163結(jié)合的數(shù)據(jù)。所測量的作用是通過地塞米松誘導(dǎo)CD163mRNA合成。Hp-地塞米松后的數(shù)字是指Hp-地塞米松的不同批次。B :顯示IOnM地塞米松對分離自血沉棕黃層(過期血漿)的人單核細(xì)胞中⑶163表達(dá)的作用的時間研究。圖31 Mac2-158地塞米松偶聯(lián)物對人巨噬細(xì)胞的作用。A :顯示與地塞米松偶聯(lián)的Mac2_158對分離自血沉棕黃層(過期血漿)的體外成熟的人巨噬細(xì)胞的作用的數(shù)據(jù)。所測量的作用是對LPS誘導(dǎo)的TNF產(chǎn)生的抑制。B:顯示在相同設(shè)置下IOnM地塞米松的作用的時間研究。圖32 KN2/NRY與人單核細(xì)胞的結(jié)合A-C):使用 Mac2-158-FITC、抗 CD14-PE 抗體和 KN2/NRY_Alexa Fluor647 對分離自血沉棕黃層的人單核細(xì)胞染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析D)。包括使用IgG-FITC染色的陰性對照和與AlexaFluor647(ATNP-Alexa Fluor647)偶聯(lián)的無關(guān)抗體。圖33 KN2/NRY-地塞米松與表達(dá)⑶163的CHO細(xì)胞的結(jié)合。將表達(dá)人⑶163的CHO細(xì)胞與KN2/NRY (灰色柱狀圖)或KN2/NRY-地塞米松偶聯(lián)物(黒色柱狀圖)一起溫育，清洗并用抗人IgG抗體染色，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。白色柱狀圖表示了使用抗人IgG抗體-FITC染色的陰性對照。圖34 KN2/NRY-地塞米松在體外抑制LPS介導(dǎo)的TNF α。培養(yǎng)人單核細(xì)胞，并與系列稀釋的KN2/NRY-NHS-地塞米松、KN2/NRY-MVCP-地塞米松或游離地塞米松一起溫育15分鐘，清洗并溫育過夜。在LPS刺激4小時后分析細(xì)胞上清的TNF α。圖35 ED2與大鼠巨噬細(xì)胞的結(jié)合。使用抗大鼠⑶172a_PE抗體(ED9)和抗大鼠⑶163-FITC抗體(ED2)對腹膜巨噬細(xì)胞染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析(左側(cè)散點(diǎn)圖)。⑶163-FITC陽性巨噬細(xì)胞的百分比顯示在右上象限中。還包括了使用IgG-FITC染色的陰性對照(右側(cè)散點(diǎn)圖)。圖36 ED2-地塞米松與表達(dá)⑶163的CHO細(xì)胞的結(jié)合。將表達(dá)大鼠⑶163的CHO細(xì)胞與ED2(灰色柱狀圖)或ED2-NHS-地塞米松偶聯(lián)物(黒色柱狀圖)一起溫育，清洗并用抗小鼠IgG抗體染色，隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。白色柱狀圖表示了使用抗小鼠IgG抗體-FITC染色的陰性對照。圖37 ED2-地塞米松在體外抑制LPS介導(dǎo)的TNFa刺激。將大鼠腹膜巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液與I μ g/ml ED2-NHS-地塞米松、地塞米松、ED2或PBS —起溫育3小時，隨后以LPS刺激20小吋。通過BD 流式微球陣列(CBA)Flex Set試驗(yàn)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF α濃度(一式三份)。圖38 :LPS介導(dǎo)的脾細(xì)胞TNFa誘導(dǎo)的滴定。培養(yǎng)大鼠脾細(xì)胞，并與系列稀釋的ED2-NHS-地塞米松偶聯(lián)物或游離的地塞米松一起溫育(A) 15分鐘、(B) 30分鐘或(C) 60分鐘，清洗并溫育過夜。在LPS刺激4小時后分析細(xì)胞上清的TNF α。 圖39 ED2-地塞米松在體內(nèi)抑制LPS介導(dǎo)的TNF α刺激。在靜脈注射LPS前20小時，對雌性Lewis大鼠靜脈注射ED2-NHS-地塞米松(η = 4)，游離地塞米松(以地塞米松-21-醋酸酷的形式以提高溶解性，濃度類似的地塞米松和地塞米松-21-醋酸酷的作用相同(數(shù)據(jù)未顯示))(η = 4)或賦形劑(η = 4)。Α)在注射LPS后2小時測定血清樣品中的TNF α濃度。在夾心ELISA試驗(yàn)中分析血清樣品，一式三份。B) LPS注射后2天的胸腺重量。C) LPS注射后2天的脾重量。 圖40 :與連接氨基和連接Cys的偶聯(lián)物相比，ED2-地塞米松在體內(nèi)抑制LPS介導(dǎo)的TNF α刺激。(A)培養(yǎng)大鼠脾細(xì)胞，并與系列稀釋的ED2-NHS-地塞米松偶聯(lián)物或游離的地塞米松一起溫育15分鐘，清洗并溫育過夜。在LPS刺激4小時后分析細(xì)胞上清的TNF α。在靜脈(i. V.)注射LPS前20小時，對雌性Lewis大鼠靜脈注射ED2-NHS-地塞米松(η =5)，ED2-MVCP-地塞米松(η = 5)，游離地塞米松(以地塞米松-21-醋酸酷的形式以提高溶解性)(η = 5)或賦形劑(η = 5)。(B)在注射LPS后2小時測定血清樣品中的TNF α濃度。在夾心ELISA試驗(yàn)中分析血清樣品，一式三份。(C) LPS注射后2天的胸腺重量。(D) LPS注射后2天的脾重量。組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異以P值表示。圖41 :醋酸氟輕松和強(qiáng)的松龍偶聯(lián)的ED2對LPS介導(dǎo)的體內(nèi)TNFa產(chǎn)生的作用。在靜脈a. V.)注射LPS前20小時，對雌性Lewis大鼠靜脈注射ED2-醋酸氟輕松(η = 4)，ED2-強(qiáng)的松龍(η = 4)，游離的醋酸氟輕松(η = 4)，游離的強(qiáng)的松龍(η = 4)或賦形劑(η=4)。在注射LPS后2小時測定血清樣品中的TNF α濃度。在夾心ELISA試驗(yàn)中分析血清
樣品，一式三份。圖42 :不同3E10B10-地塞米松偶聯(lián)物的體外和體內(nèi)作用。(A)培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞，并與系列稀釋的3E10B10-地塞米松偶聯(lián)物或游離的地塞米松一起溫育15分鐘，清洗并溫育過夜。在LPS刺激4小時后分析細(xì)胞上清的TNF α。(B)在靜脈(i. V.)注射LPS前20小時，對雌性Balbc/A小鼠靜脈注射3E10B10-NHS-地塞米松(n = 5)，3ΕIOBIO-MVCP-地塞米松(η = 5),游離的地塞米松(以地塞米松-21-醋酸酯的形式以提高溶解性)(η = 5)或賦形劑(η = 5)。在注射LPS后2小時測定血清樣品中的TNF α濃度。在夾心ELISA試驗(yàn)中分析血清樣品，一式三份。圖43 :對小鼠膠原抗體誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的治療作用。對大鼠每個爪的關(guān)節(jié)炎癥候評分，每周6次。(A)總關(guān)節(jié)炎評分定義為每天所有爪的評分和。此圖顯示了所有處理組中平均臨床關(guān)節(jié)炎總分與時間的關(guān)系圖。每個點(diǎn)代表組平均值(η = 5)。(B)累積的關(guān)節(jié)炎評分定義為從第O天至第14天獲得的總臨床關(guān)節(jié)炎評分之和。*代表甲基強(qiáng)的松龍組與賦形劑組相比，P < O. 05 ;和#代表甲基強(qiáng)的松龍-3Ε10Β10組與賦形劑組相比，P < O. 05。圖44 :地塞米松-MVCP合成途徑的概況。
圖45 :地塞米松-NHS合成途徑的概況。
圖46 :CD163序列的比較。圖47 :處理對體重的影響。對各大鼠個體稱重，每周6次，并且計(jì)算每個處理組的平均體重。每個點(diǎn)代表組平均值(η = 4)。注兩圖中均顯示了相同的賦形劑和O. 01mg/kg地塞米松組。圖48 :處理對發(fā)病日的影響。發(fā)病日定義為觀察到> O的臨床評分的連續(xù)三天中的第一天。如果大鼠在試驗(yàn)期間沒有發(fā)病，則將發(fā)病日任意地定為第21天。各條表示組平均值土SD。*表示與賦形劑組相比，P < O. 05。Dexa =地塞米松；Dexa_conj =地塞米松_偶聯(lián)物。圖49 :處理對發(fā)病率的影響。疾病定義為每天> O的臨床評分。此圖顯示了所有處理組中發(fā)病率與時間的關(guān)系圖。圖50 :處理對總臨床關(guān)節(jié)炎評分的影響。對大鼠每個爪的關(guān)節(jié)炎癥候評分，每周6次?？傟P(guān)節(jié)炎評分定義為每天所有爪的評分和。此圖顯示了所有處理組中平均臨床關(guān)節(jié)炎總分與時間的關(guān)系圖。每個點(diǎn)代表組平均值(η = 4)。注兩圖中均顯示了相同的賦形劑和O. 01mg/kg地塞米松組。圖51 :處理對累積臨床關(guān)節(jié)炎評分的影響。此圖顯示了累積關(guān)節(jié)炎評分，其定義為從第O天至第14天獲得的總臨床關(guān)節(jié)炎評分之和。各條表示組平均值土SD。*表示與賦形劑組相比，P < O. 05 ；#表示地塞米松組與O. 01mg/kg地塞米松-偶聯(lián)物相比，P < O. 05。Dexa =地塞米松；Dexa_conj =地塞米松-偶聯(lián)物。圖52 :處理對左后爪厚度的影響。采用激光掃描測微計(jì)測量后爪的厚度。爪厚度每周測量5次。每個點(diǎn)代表組平均值(n = 4)。注兩圖中均顯示了相同的賦形劑和O. Olmg/kg地塞米松組。圖53 :處理對累積左后爪腫脹的影響。此圖顯示了累積的爪腫脹，其定義為從第10天至第21天的△厚度值之和(△厚度是爪厚度減去基線值的差值，所述基線值是第O天至第9天的平均值)。各條表示組平均值土SD。*表示與賦形劑組相比，P <0.05。Dexa=地塞米松；Dexa_conj =地塞米松-偶聯(lián)物。圖54 :處理對右后爪厚度的影響。采用激光掃描測微計(jì)測量后爪的厚度。爪厚度每周測量5次。每個點(diǎn)代表組平均值(n = 4)。注兩圖中均顯示了相同的賦形劑和O. Olmg/kg地塞米松組。圖55 :處理對累積右后爪腫脹的影響。此圖顯示了累積的爪腫脹，其定義為從第10天至第21天的△厚度值之和(△厚度是爪厚度減去基線值的差值，所述基線值是第O天至第9天的平均值)。各浮標(biāo)表示組平均值土SD。*表示與賦形劑組相比，P < O. 05 ；#表示與O. 01mg/kg地塞米松-偶聯(lián)物相比,P < O. 05。Dexa =地塞米松；Dexa_conj =地塞米松_偶聯(lián)物。圖56:處理對器官重量的影響。在處死時收集脾、胸腺和肝臟并稱重。針對體重對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。各條表示組平均值土SD。*表示與賦形劑組相比，P < O. 05 ·’#表示地塞米松組與O. 01mg/kg地塞米松-偶聯(lián)物相比，P < O. 05。Dexa =地塞米松；Dexa_conj =地塞米松-偶聯(lián)物。
實(shí)施例實(shí)施例I :抗CD163受體的SRCR域I的抗體序言⑶163是由九個細(xì)胞外清道夫受體的富半胱氨酸(SRCR)B型域組成的清道夫受 體。其介導(dǎo)觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hb)復(fù)合物的清除并且還參與炎癥過程的調(diào)控(3 ；4)，所述復(fù)合物是在血管內(nèi)溶血過程中血紅蛋白被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中時形成的(I ;2) ο CD163被認(rèn)為專門表達(dá)于單核細(xì)胞系表面。其由循環(huán)系統(tǒng)中的駐留單核細(xì)胞表達(dá)(5;6)，并且在向巨噬細(xì)胞成熟期間上調(diào)。其在駐留組織的巨噬細(xì)胞(6-10)上，以及替代性活化的巨噬細(xì)胞(M2) (11-14)和TIE2+巨噬細(xì)胞(15 ；16)上高度表達(dá)。此タ卜，⑶163還顯示由造血干/祖細(xì)胞的⑶34+亞群(17)表達(dá)，并且還提出其表達(dá)在髓系樹突細(xì)胞的亞類(18 ；19)上。為了響應(yīng)Toll樣受體(TLR)活化，通過蛋白酶介導(dǎo)的釋放機(jī)制，將⑶163從細(xì)胞膜切下(20-22)，形成可溶性⑶163(s⑶163)，現(xiàn)已證明血清中的s⑶163可用于診斷，例如膿血癥和噬血癥(23-25)。⑶163局限于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的嚴(yán)格表達(dá)已得到越來越多的關(guān)注?，F(xiàn)已積累了大量證據(jù)，證明炎性疾病、惡性疾病和感染疾病中的細(xì)胞和可溶性CD163的水平顯著變化(11 ；23 ；24 ；26-31)。CD163可以作為影響單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的病癥的診斷標(biāo)記，并且作為治療候選物。然而，盡管已經(jīng)詳細(xì)描述了 s⑶163的正常濃度范圍、生物變異和分子結(jié)構(gòu)(21 ;32 ;33)，但系統(tǒng)闡述單核細(xì)胞CD163表達(dá)的現(xiàn)有研究有限。重要的是，使用不同抗凝劑、抗體克隆和通用測試條件，流式細(xì)胞研究一直顯示出顯著差異的單核細(xì)胞CD163表達(dá)水平，報道其在極少至99%之間變化(3 ；5-7 ；34-41)。最近，闡述了單核細(xì)胞⑶163表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)評估根據(jù)測試條件而顯著不同(38)，且本發(fā)明人此前掲示，在使用不同抗體克隆吋，樹突細(xì)胞CD163表達(dá)可顯示差異(18)。顯然，單核細(xì)胞CD163表達(dá)作為診斷工具和治療候選物的應(yīng)用依賴于對病理和生理?xiàng)l件二者的可比且可靠的測量。材料和方法抗體和其他試劑以下單克隆抗體(mAb)用于流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、SPR分析以及使用125I標(biāo)記的抗CD163抗體的胞吞實(shí)驗(yàn)抗CD163抗體(MAC2-158) ,APC-偶聯(lián)的抗CD14抗體(UCHMl)和R-PE偶聯(lián)的小鼠IgG1 ；k同種型對照(MCGl)得自于荷蘭格羅寧根的IQ Products。抗⑶163抗體(GHI/61)得自于 BD Biosciences, CA, USA。抗 CD163 抗體(R-20)得自于 TrilliumDiagnostics, LLC, Scarborough, Maine, USA?？?CD163 抗體(RM3/1)得自于 BioLegend,San Diego，CA，USA。所購買的所有⑶163mAb克隆均為純化且R-PE偶聯(lián)的。山羊抗小鼠偶聯(lián)的 Alexa-Fluor 488 得自于 Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA。小鼠抗人 CD163 抗體 Ki-M8 和 5C6_Fat 得自于德國 Acris Antibodies (貨號 BM4112 和 BM4041，http://www. acris-antibodies. com/BM4112. htm, http://www. acris-antioodies. com/bm4041. htm)。小鼠抗人 CD163EDHu_l 得自于德國 Acris Antibodies (貨號 SM2160P，http: //www. acris-antibodies. com/SM2160P. htm)?？?CD163 抗體 Mac2_48 得自于荷蘭IQ Products,貨號 CD163-48U, http://www. iqproducts.nl/catalog/index.php pr =783) ο 小鼠抗人 CD163 抗體 R20 得自于 Trillium，Maine，USA(貨號 CD163-20U，http//trilliumdx.com/products/content.DhD products id = 33)。小鼠手幾人 CD163 饑體Ber-Mac3 可得自于 MBL, MA, USA,(貨號 K-0147，http: / / www. mb I inti, com/mb Ii/account/search results, asp search = K0147-J)。血樣品和PBMC的制備 在Venoject 真空米血管(Terumo Europe NV, Leuven, Belgium)中，通過標(biāo)準(zhǔn)的靜脈穿刺從健康供體獲得由EDTA、檸檬酸鹽和肝素穩(wěn)定的外周血樣品。使用AccuspinSystem Histopaque -1077 (Sigma-Aldrich Denmark A/S, Broendby, Denmark),通過梯度分離離心，從富含白細(xì)胞的血沉棕黃層分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。血沉棕黃層由CPD-A(Baxter,Munich,Germany)抗凝的健康志愿者捐獻(xiàn)的全血單位(約472ml)制備。此研究得到了地區(qū)倫理委員會的批準(zhǔn)(j. nr. 20040068)。定量流式細(xì)胞術(shù)在4°C，使用同種型匹配的對照抗體或相關(guān)抗體對新鮮抽取的外周全血樣品或PBMC (約3xl06個細(xì)胞)避光染色I(xiàn)小吋。在全血染色吋，使用4°C冷氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞15分鐘。在需要間接免疫熒光染色時，先將細(xì)胞與未偶聯(lián)的ー級CD163抗體一起在4°C溫育I小時，用D-PBS(pH 7.4)清洗三次，隨后與山羊抗小鼠偶聯(lián)的AleXa-Fluor 488(l 200稀釋；Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 一起在 4°C避光溫育 I 小時。用 D-PBS (pH 7. 4)清洗染色細(xì)胞兩三次，重懸在 400 μ I FACSf low (Becton Dickinson，SanJose,CA,USA)中，并在冰上靜置直至分析。使用FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析所有樣品，并使用用于8. 3版Macintosh軟件的FlowJo (TreeStar, San Carlos, CA)補(bǔ)償光譜重疊。對于⑶163密度的定量,按照廠商的推薦，使用Quantibrite PE珠(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)進(jìn)行抗體結(jié)合/細(xì)胞(ABC)的流式細(xì)胞術(shù)評估。如下文詳述，在細(xì)胞染色后，在獲取樣品前，使用ー套4支預(yù)標(biāo)定的熒光標(biāo)記珠進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。Quantibrite PE珠在與測試相同的儀器設(shè)定下運(yùn)行，并將使用Quantibrite PE珠獲得的線性回歸用于將細(xì)胞群的FL2線性熒光染色轉(zhuǎn)化成每個細(xì)胞(ABC)結(jié)合的(CD163)PE分子數(shù)。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)按照此前的描述(32)，使用內(nèi)部(in-house) ELISA測定測量可溶性CD163。源自人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的制備、刺激和溫育根據(jù)廠商提供的說明書,使用來自Dynal的磁珠(Dynabeads MyPure MonocyteKit 2 ；Invitrogen A/S, Taastrup, Denmark),通過陰性選擇從PBMC分離單核細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)確定單核細(xì)胞制備物的純度大于95% (CD14+)。使用磷酸緩沖鹽水清洗分離的細(xì)胞兩次。通過將單核細(xì)胞(約I X IO7個細(xì)胞)在5% CO2和37°C，帶有包含100ng/mlM-CSF 的 20% FCS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基(RPMI 1640+25mM HEPES+1-谷氨酰胺)(InvitrogenCorporation, Carlsbad, CA，USA)中培養(yǎng)4天來制備源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞(MDM)。隨后，通過與細(xì)胞分離緩沖劑(Invitrogen A/S, Taastrup, Denmark) —起在4°C溫育30分鐘，隨后沖洗并剝離，從而使MDM從培養(yǎng)瓶脫離。隨后，將所述細(xì)胞在37°C，95%空氣和5% CO在 Lab-Tek 腔室培養(yǎng)玻片(Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark)中的補(bǔ)充了包含 100ng/ml M-CSF 的 20 % FCS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基(RPMI 1640+25mM HEPES+1-谷氨酉先胺)(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)中培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)期間，添加200nM 地塞米松(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)以提高 CD163 表達(dá)。如此前所述(2),將如上所述表達(dá)全長人CD163的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞培養(yǎng)在包含300 μ g/ml潮霉素B的無血清CHO培養(yǎng)基(HyQ-CCM，HyClone, Logan, UT)中。如下文所述，使用4°C的冷D-PBS(pH 7. 4)清洗細(xì)胞，重懸并對⑶163表達(dá)染色。熒光標(biāo)記⑶163抗體的細(xì)胞結(jié)合和攝取在Lab-Tek 腔室培養(yǎng)玻片(ThermoFisher Scientific,Roskilde,Denmark)中，使用包含I % BSA的4°C冷D-PBS (pH 7. 4)清洗MDM或CHO細(xì)胞。隨后，將所述細(xì)胞與10 μ g/ml的不同抗⑶163抗體克隆一起在4°C溫育I小吋，隨后使用帶有I % BSA的D-PBS(pH
7.4)清洗三次。然后，使用4%甲醛在4°C固定細(xì)胞I小吋，或在95%空氣和5% CO的潮濕氣氛下，在37°C溫育30分鐘。隨后，將溫育30分鐘的細(xì)胞用包含I % BSA的D-PBS (pH 7. 4)清洗三次，并使用4%甲醛在4°C固定I小時。將所有細(xì)胞用D-PBS (pH 7.4)清洗一次，并在室溫下用包含0. 05% Triton X-100 (Merck)的D_PBS(pH 7.4)滲透15分鐘。此后，將細(xì)胞與山羊抗小鼠偶聯(lián)的 Alexa-Fluor 488 (I : 200 稀釋；Molecular Probes, Invitrogen,Carlsbad, CA, USA) 一起在室溫下溫育 I 小時，用包含 0.05% Triton X-100 的 D_PBS(pH
7.4)清洗五次。使用包含V W -ニ脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield 封固劑(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)封固玻片以鑒定細(xì)胞核。使用帶有xl00倍油浸物鏡的 Zeiss Axiovert 200M顯微鏡(Carl Zeiss GmbH, Jena,Germany)觀察突光。使用AxioCam MRm數(shù)碼相機(jī)(Carl Zeiss GmbH, Jena,Germany)獲取代表性圖片。或者，使用Zeiss LSM-510共焦顯微鏡(Carl Zeiss GmbH, Jena,Germany),通過共焦免疫突光顯微鏡檢查分析免疫染色的細(xì)胞。使用NIH ImageJ軟件(I. 38w版)和Adobe Photoshop CS4進(jìn)行圖片處理。125I標(biāo)記的抗⑶163抗體的細(xì)胞結(jié)合和攝取按文獻(xiàn)所述(Madsen,M. , Moller, H. J. , Nielsen, M. J. , Jacobsen, C. , Graversen,J. H. , van den Berg, T. and Moestrup, S. K. (2004)Molecular characterization ofthe haptoglobin, hemoglobin receptor CD163. Ligand binding properties of thescavenger receptor cysteine-rich domain region.J.Biol.Chem. ,279,51561-51567),在⑶163轉(zhuǎn)染的Flp-In中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和模擬轉(zhuǎn)染的Flp-In中研究125I標(biāo)記的抗⑶163抗體的胞吞。數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析由范圍值或95%置信區(qū)間完成所有評估。使用t檢驗(yàn)分析數(shù)值間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。對于缺少數(shù)值高斯分布的較小組之間的比較，使用非參數(shù)的Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。在P < O. 05時，認(rèn)為差異顯著。使用Window系統(tǒng)的STATA統(tǒng)計(jì)包(版本10)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。mAb⑶163結(jié)合的表面等離子共振(SPR)分析在Biacore2000 儀器(Biacore, Uppsala, Sweden)上進(jìn)行mAb 與 CD163 結(jié)合的 SPR分析。使用于水中的O. 2M N-こ基-N' -(3-ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺和O. 05M N-羥基琥珀酰亞胺的I : I混合物活化Biacore傳感芯片(CM5型)。將純化的重組⑶163在IOmMこ酸鈉(pH 4.0)中固定，使用IMこ醇胺(pH8. 5)封閉剩余的結(jié)合位點(diǎn)。由固定的重組CD163蛋白產(chǎn)生的SPR信號對應(yīng)于40-70fmol的蛋白/mm2。使用5_100nM范圍的mAb濃度產(chǎn)生傳感圖。使用I. 6M甘氨酸-HCl (pH 3)再生流動細(xì)胞。用于試驗(yàn)的運(yùn)行緩沖劑為CaHBS IOmM H印es、150mM NaCl,3. OmM CaCl2U. OmM EGTA 和 O. 005% Tween20 (pH 7.4)或IOmM HepesU50mM NaCl、3.0mM EDTA和 O. 005% Tween20 (pH 7· 4)，將mAb 樣品溶于與所用運(yùn)行緩沖劑相同的緩沖劑中。使用Biamolecular Interaction Analysis評估程序(版本
3.I)分析所有結(jié)合數(shù)據(jù)。 與Mac2_158表位結(jié)合的競爭為了評估一系列mAb與⑶163的結(jié)合中是否存在競爭，本發(fā)明人首先通過注射50 μ L 50 μ g/ml Mac2_158，由 Mac2_158 飽和 CD163-芯片，隨后，注射 5 μ g/ml 的相關(guān)mAb。結(jié)合緩沖劑為 CaHBS IOmM H印es、150mM NaCl,3. OmM CaCl2U. OmM EGTA 和 O. 005% Tween20 (pH 7. 4)。結(jié)果使用不同的單克隆抗體克隆測定人外周血單核細(xì)胞上的表面CD163表達(dá)使用將單核細(xì)胞限定為⑶14+細(xì)胞的特異mAb對EDTA穩(wěn)定的新鮮抽取全血染色，從而使用覆蓋多個SRCR域的⑶163mAb克隆研究單核細(xì)胞表面的⑶163表達(dá)。相對于分別結(jié)合 SRCR 域 4、7 和 9 的 R-20 (75. 93 % [95 % Cl -J2. 49-79. 38% ] ；p < O. 005)(圖 IB)，GHI/61 (63. 03 % [95 % Cl :54. 34-71. 73% ] ;p < O. 001)(圖 1C)和 RM3/1 (O. 33 % [95 %Cl 0. 068-0. 59] ；p < O. 0001)(圖ID)，結(jié)合SRCR域I的MAC2-158克隆識別顯著較大部分的外周血單核細(xì)胞(84. 06% [95% Cl 76. 20-91. 92% ])(圖 1A)。與 R-20(l, 650[95%Cl 1, 139-2，163] ；p < O. 0001)(圖 IB)、GHI/61 (I, 030 [95% Cl :807-1, 253] ；p < 0. 0001)(圖 1C)和 RM3/1(101[95% Cl :28-175] ；p < 0. 0001)(圖 ID)相比，使用 MAC2-158 時，所測量的每個單核細(xì)胞的CD163受體密度顯著較高(17，725 [95% Cl :13，335-22，133])。為了比較，使用同種型匹配的非特異性IgG評估非特異性結(jié)合，且顯示了低背景染色(94[95%Cl :76-112])(未顯示)。在先后使用未偶聯(lián)的ー級⑶163抗體克隆和Alexa Fluor 488ニ級抗體偶聯(lián)物對全血染色時，觀察到類似的CD163表達(dá)變化模式(未顯示)。通過密度梯度離心分離的外周血單核細(xì)胞上的單核細(xì)胞表面⑶163表達(dá)純化外周血單核細(xì)胞以評估histopaque梯度分離對單核細(xì)胞表面⑶163表達(dá)的影響。流式細(xì)胞分析顯示了與利用EDTA穩(wěn)定的新鮮抽取全血所示類似的CD163表達(dá)模式。在使用MAC2-158時，對⑶163染色的⑶14+單核細(xì)胞的比例為81. 10% [95% Cl
73.95-88. 25 % ]，在使用 RM3/1 時，為 2. 50 % [95 % Cl 0. 29-4. 71 % ] (2. 50 % [95 %Cl 0. 29-4. 71% ])。然而，在密度梯度離心后，對于R-20克隆和GHI/61克隆，CD163染色為陽性的⑶14+單核細(xì)胞的比例顯著下降。在分離后，使用R_20，54.40% [95 % Cl 29. 10-79. 70% ]的CD14.單核細(xì)胞為⑶163染色陽性，這顯著低于EDTA穩(wěn)定的新鮮抽取全血(P <0.05)。使用GHI/61，⑶163陽性的單核細(xì)胞比例顯著減少，幾乎不可測(I. 26% [95% Cl :0.91-1.61% ])。所測試的每個單核細(xì)胞的⑶163受體密度顯示出類似的模式MAC2-158(11, 417[95 % Cl :8，058-14，777])，p < O. 01 ；R-20 (836. 7 [95 %Cl 654. 4-1，019] ；p < O. 0001) ；GHI/61 (108. O [95 % Cl :81. 71-134. 3] ；p < 0. 0001)和RM3/1 (132. 3[95% Cl :66. 97-197. 7] ；p < 0. 05)。不同抗凝劑對單核細(xì)胞表面⑶163表達(dá)的影響為了研究不同的細(xì)胞外鈣濃度對單核細(xì)胞表面CD163表達(dá)的影響，使用不同的mAb克隆，測量在使用三種常用抗凝劑穩(wěn)定的新鮮抽取的全血樣品中的CD163水平(圖2和3，和表I)。使用MAC2-158克隆，無論細(xì)胞外鈣濃度如何，⑶163染色為陽性的⑶14+單核細(xì)胞比例均不受影響以EDTA為抗凝劑，⑶163染色為陽性的⑶14+單核細(xì)胞比例為87. 23%[95% Cl 81. 10-93. 37 % ];使用檸檬酸鹽，為 83. 97 % [95% Cl 80. 52-87. 41 % ];在使用肝素時，為84.43% [95% Cl 77. 82-91.05% ](圖2左側(cè)；圖3A和表I)。每個單 核細(xì)胞的受體密度顯示出類似的模式，使用EDTA作為抗凝劑，顯示為17，725[95% Cl
13,335-22, 133]的受體，在使用檸檬酸鹽時，為17, 726 [95% Cl : 14，675-20，777]，在使用肝素時，為 18，929 [95% Cl :14，26 ト 23，597](圖 2 左側(cè)；圖 3B 和表 I)。使用R-20克隆對CD163染色，在使用EDTA為抗凝劑時，75. 93 % [95 %Cl 72. 49-79. 38 % ]的⑶14+單核細(xì)胞為⑶163染色陽性，在使用檸檬酸鹽時，為
74.73% [95% Cl :70.36-79. 11 % ];然而，使用肝素時則顯著較低(63. 03% [95% Cl 60. 38-65. 69% ] ；p < O. 005)(圖2，中左側(cè)；圖3A和表I)。所測試的每個單核細(xì)胞的CD163 受體密度為=EDTA Φ I, 760[95% Cl :1，600-1，920]，檸檬酸鹽中 I, 988[95% Cl 1，750-2，226];但在肝素穩(wěn)定樣品中，預(yù)想不到地較高(3，019 [95% Cl :2，648-3，390])(圖2，中左側(cè)；圖3B和表I)。然而，在使用GHI/61克隆時，⑶163染色為陽性的⑶14+單核細(xì)胞比例明顯受到抗凝劑的影響，與使用EDTA(63. 03% [95% Cl :54. 34-71. 73% ] ；p < O. 0001)和檸檬酸鹽(64. 37% [95% Cl 58. 17-70. 56% ] ；p < O. 0001)抗凝的血樣相比，在使用肝素作為抗凝劑時，表現(xiàn)出顯著較低的單核細(xì)胞表面⑶163表達(dá)(O. 82% [95% Cl 0. 55-1. 08% ])(圖2，中右側(cè)；圖3A和表I)。此發(fā)現(xiàn)得到了每個單核細(xì)胞的CD163受體密度的驗(yàn)證肝素中的該密度為 58. 33 [95 % Cl 24. 42-92. 24]，而 EDTA 中為 1，030 [95 % Cl :806. 9-1, 252] (p< O. 0001)，檸檬酸鹽穩(wěn)定的樣品中為 I, 152[95% Cl :962. 9-1，342] (p < O. 0001)(圖 2，中右側(cè)；圖3B和表I)。使用RM3/1，流式細(xì)胞分析顯示非常小比例的⑶163染色陽性⑶14+細(xì)胞，在EDTA穩(wěn)定的血樣中為O. 33% [95% Cl 0. 068-0. 59% ]，在檸檬酸鹽中為12. 50% [95% Cl 9. 57-15. 43% ]，且在肝素中為 3. 33% [95% Cl 1. 84-4. 82% ](圖 2 右側(cè)；和圖 3A)。在使用RM3/1克隆時，所測定的單核細(xì)胞表面⑶163表達(dá)也非常低EDTA中為86. 00[95%Cl 66. 28-105. 7]，檸檬酸鹽中為 207. O[95% Cl :167. 0-247. O]，肝素中為 210. 3[95% Cl 163. 3-257. 4]，而與細(xì)胞外鈣濃度無關(guān)(圖2右側(cè)；圖3B和表I)。所測表面表達(dá)的變化不是由于⑶163脫落(shedding)造成的在使用不同抗凝劑穩(wěn)定的相同新鮮抽取全血樣品中測量可溶性CD163(sCD163)的水平。經(jīng)過樣品制備期間的稀釋調(diào)整，使用ELISA測定的s⑶163水平EDTA穩(wěn)定的血樣中為832. I μ g/1,朽1檬酸鹽穩(wěn)定的血樣中為738. 3 μ g/1,肝素穩(wěn)定的血樣中為897. 8 μ g/1，表明所使用的抗凝劑(和因此存在的鈣)不影響SCD163的脫落。與CD163的結(jié)合Mac2-48、Mac2-158、5C6_Fat、Ki_M8、EdHul 和 BerMac3 在 2mM 游離 Ca2+ 和 IOmMEDTA二者中均與⑶163結(jié)合，然而，在Ca2+和EDTA緩沖劑之間顯示出某程度的不同親和力，但所有的親和カ都在納摩爾或亞納摩爾的范圍。名為GHI/61的mAb卻僅在含鈣緩沖劑中顯示對CD163的極弱結(jié)合，但其在IOmM EDTA中顯示29n M表觀Kd的結(jié)合。RM3/1在EDTA緩沖劑中沒有顯示與⑶163的結(jié)合，而在2mM游離Ca2+中的表觀Kd為O. 6nM。圖4顯示了典型的傳感圖，比較了在鈣和EDTA中的結(jié)合。125I標(biāo)記的⑶163抗體在穩(wěn)定⑶163轉(zhuǎn)染的Flp-In CHO細(xì)胞中的胞吞作用為了比較胞吞能力，用125I標(biāo)記mAb克隆并與表達(dá)⑶163的Flp-In CHO細(xì)胞一起溫育至提高的時間點(diǎn)。如圖5A所示，對于大多數(shù)抗體，細(xì)胞相關(guān)的放射性(結(jié)合或內(nèi)化)的時間進(jìn)程在溫育I小時后達(dá)到平臺，但在使用125I標(biāo)記的GHI/61吋，細(xì)胞相關(guān)的放射性水平為低水平，表明胞吞減少或沒有胞吞。相比之下，在與125I標(biāo)記的Mac2-48和Mac2_158 —起溫育時，細(xì)胞相關(guān)的放射性的時間進(jìn)程在溫育2小時、甚至4小時后都沒有達(dá)到平臺。使用MAC2-158，細(xì)胞相關(guān)的放射性百分比在穩(wěn)定⑶163轉(zhuǎn)染的Flp-In CHO細(xì)胞中達(dá)到61. 27%[95% Cl 56. 56-0. 6597% ]0作為比較，使用相同的mAb克隆，細(xì)胞相關(guān)的放射性百分比在非轉(zhuǎn)染的 Flp-In CHO 細(xì)胞中達(dá)到 1.37% [95% Cl :0.426-2.31% ]。使用 R-20 (18. 97%[95 % Cl 18. 09-19. 84 % ]與 O. 97 % [95 % Cl 0. 59-1. 35 % ])、GHI/61 (I. 23 % [95 %Cl 0. 854-1. 61 % ]與 I. 23 % [95 % Cl 0. 72-1. 75 % ])和 RM3/1 (7. 77 % [95 % Cl
4.11-11. 43% ]與I. 47% [95% Cl 0. 099-2. 84% ])所達(dá)到的細(xì)胞相關(guān)的放射性百分比較低。如所期望的，如圖5B所示，在非轉(zhuǎn)染的Flp-In CHO細(xì)胞中檢測的細(xì)胞相關(guān)放射性程度對于所有單克隆抗體均較低。熒光⑶163抗體在源自人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中的胞吞作用由外周血單核細(xì)胞制備源自單核細(xì)胞的人巨噬細(xì)胞，并使用200nM地塞米松刺激以評估不同CD163mAb的結(jié)合和攝取。MAC2_158、R-20、GHI/61和RM3/1能夠結(jié)合人巨噬細(xì)胞表面上的CD163受體，該CD163受體由免疫熒光染色顯示。然而，熒光顯微鏡檢查表明，使用MAC2-158和R-20的染色顯示了比GHI/61和RM3/1明顯的細(xì)胞表面染色(圖6上部)。在溫育30分鐘后，免疫熒光染色顯示出獨(dú)特斑點(diǎn)狀(punctuate)的亞細(xì)胞染色，其是所研究的所有⑶163mAb的特征(圖6下部)。然而，與R20、GHI/61和RM3/1相比，使用MAC2-158時，細(xì)胞內(nèi)染色密度顯示最為明顯(圖6下部)，表明MAC2-158的攝取更為有效。通過共焦激光掃描顯微分析，在CD163轉(zhuǎn)染的FIp-In CHO細(xì)胞觀察到類似模式的表面染色和細(xì)胞攝取(未顯示)。在表達(dá)⑶163的CHO細(xì)胞上進(jìn)行類似的試驗(yàn)，使用共焦顯微術(shù)篩選較大組的mAb (圖 7a 和 7b)。與Mac2-I58 的競爭圖8顯示了不同⑶163mAb與首先用Mac2_158飽和的⑶163傳感芯片結(jié)合的傳感圖，這意味著實(shí)際上用于Mac2-158的所有表位都已經(jīng)被mAb結(jié)合，因此，與Mac2_158競爭結(jié)合的mAb應(yīng)當(dāng)不能結(jié)合固定在芯片上的CD163并誘導(dǎo)所測量的反應(yīng)單位的進(jìn)ー步提高，而不競爭結(jié)合的mAb應(yīng)當(dāng)能夠結(jié)合固定的CD163，并由此提高所測量的反應(yīng)單位。由圖8可見，在2mM游離鈣緩沖劑中，Mac2-158、Mac2-48、Ber-Mac3和GHI/61不能結(jié)合Mac2_158飽和的⑶163-Fc。除GHI/61之外，所有的mAb均結(jié)合SRCR域1，GHI/61在富鈣環(huán)境中沒有表現(xiàn)出結(jié)合。無論是否飽和，mAb EdHU-U Κ -Μ8和RM3/1均能夠結(jié)合⑶163_Fc，因此不與Mac2-158競爭結(jié)合⑶163。因此，可見結(jié)合域I的所有單克隆抗體均與Mac2_158競爭結(jié)合。討論對用于診斷目的的CD163的關(guān)注不斷増加，促使本發(fā)明人詳細(xì)檢查影響通過流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中單核細(xì)胞CD163表達(dá)的因素。此前的研究已經(jīng)報道了不同的結(jié)果，提出從僅僅極少至99%的單核細(xì)胞表達(dá)⑶163(3 ；5-7 ;34_41)。這些研究使用了對分布于9個細(xì)胞外SRCR域的不同表位具有特異性的各種單克隆CD163抗體克隆(42)。本發(fā)明人此前證明了使用識別SRCR域I中的表位的MAC2-158吋，單核細(xì)胞和樹 突細(xì)胞表面CD163表達(dá)高于使用識別定位接近細(xì)胞膜的SRCR域7的GHI/61的情況(18)。這促使本發(fā)明人設(shè)想反應(yīng)性的差別可能是由于結(jié)合接近細(xì)胞膜時的空間位阻造成的。因此，本發(fā)明人基于其不同的表位特異性(分別為域1、4、7和9) (42)選擇了 4個抗體(MAC2-158、R-20、GHI/61和RM3/1)，并且研究其在流式細(xì)胞術(shù)中評估外周血單核細(xì)胞表面⑶163表達(dá)的性能。實(shí)際上，本發(fā)明人觀察到了依賴于SRCR域的結(jié)合模式，其可以解釋大量研究者提出的單核細(xì)胞CD163表達(dá)中的巨大不一致性(3 ；5-7 ;34_41)。有趣的是，在使用已知識別位于SRCR域9中的表位的RM3/1時，只有很小部分的單核細(xì)胞被染色。相反，在使用識別SRCR域I的MAC2-158克隆時，始終能夠鑒別大比例的表達(dá)⑶163的循環(huán)單核細(xì)胞(> 80% )。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測的受體密度顯示了類似的模式，這進(jìn)ー步證實(shí)了上述觀察結(jié)果。因此，可猜測，針對定位接近細(xì)胞膜的SRCR域而產(chǎn)生的抗體的親和カ較低可能部分反映了本發(fā)明人此前提出的空間位阻(18)。此外，關(guān)于使用不同克隆的⑶163mAb的反應(yīng)性變化還有其他解釋。此現(xiàn)象可能僅僅表明了使用熒光染料-蛋白偶聯(lián)物對抗體的標(biāo)記程度不同。為了保持最佳的偶聯(lián)度以給出最大的熒光強(qiáng)度，使用可商購的偶聯(lián)ー級抗CD163抗體進(jìn)行所有的直接免疫熒光染色。此外，偶聯(lián)蛋白的熒光強(qiáng)度并不隨偶聯(lián)度線性變化，而是在相對低的偶聯(lián)度時達(dá)到最大。因此，產(chǎn)生最大熒光的最低偶聯(lián)度是優(yōu)選的，因?yàn)槠渌鶎?dǎo)致的抗體物理和生物性能的變化最小(43-46)。然而，在使用未偶聯(lián)ー級CD163抗體克隆和相同的熒光二級抗體偶聯(lián)物評估間接免疫熒光染色時，通過免疫熒光顯微術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)觀察到了類似模式的CD163細(xì)胞表面免疫染色。熒光淬滅是在使用針對定位接近細(xì)胞膜的SRCR域而產(chǎn)生的抗體時單核細(xì)胞CD163表達(dá)減少的另ー種可信解釋。在常規(guī)的有機(jī)熒光染料(例如FITC和PE)中，分子間相互作用和分子之間的能量轉(zhuǎn)移能夠使熒光強(qiáng)度自淬滅，導(dǎo)致吸收的激發(fā)能損失和熒光強(qiáng)度降低(47)。在最近的研究中，作者發(fā)現(xiàn)，使用兩種不同的抗CD163抗體克隆，在由EDTA抗凝的血樣中的單核細(xì)胞CD163細(xì)胞表達(dá)顯著高于使用肝素抗凝的情況(38)。在一定程度上，本發(fā)明人在EDTA和肝素穩(wěn)定的血樣中觀察到了類似模式的所測定的單核細(xì)胞CD163表達(dá)。在使用GHI/61時，⑶163染色陽性的⑶14陽性單核細(xì)胞的比例的差異最為顯著。然而，在使用MAC2-158時，CD163染色陽性的CD14陽性單核細(xì)胞的比例不受所使用的抗凝劑的影響。已知基質(zhì)金屬蛋白酶將⑶163從細(xì)胞膜切下，導(dǎo)致可溶形式⑶163的釋放(20 ;48)。此外，通過證明所研究的樣品中可溶性CD163的水平不受影響，發(fā)明人排除了使用不同抗凝劑的⑶163表達(dá)差異是由⑶163脫落造成的。由于肝素穩(wěn)定的血樣類似于生理的鈣水平，而EDTA穩(wěn)定的血樣中除去了游離的鈣，本發(fā)明人猜想，CD163表達(dá)的變化可能是由于鈣依賴性結(jié)合親和カ的損失造成的。SPR分析清楚地證明這一點(diǎn)，其顯示在使用GHI/61時，配體結(jié)合活性在鈣的存在下幾乎完全喪失。使用RM3/1觀察到相反的模式，其在介質(zhì)中存在鈣時顯示結(jié)合活性。R-20略受鈣影響，而無論細(xì)胞外鈣水平如何，MAC2-158均顯示出結(jié)合活性，這與使用流式細(xì)胞術(shù)時的觀察結(jié)果一致。鈣依賴性配體結(jié)合還見于⑶163與其唯一已知生理相關(guān)配體的結(jié)合；Hp-Hb復(fù)合物與SRCR域3的結(jié)合(42)。包含蛋白凝集素的SRCR域與IgA的結(jié)合 是由B型SRCR域以鈣依賴的方式介導(dǎo)的(49)，而且，現(xiàn)已確定介導(dǎo)鈣依賴性配體結(jié)合的來自MARCO的A型SRCR域的結(jié)構(gòu)(50)。發(fā)現(xiàn)MARCO的SRCR的三個殘基，即Asp447、Asp 448和Glu511，對鈣連接至關(guān)重要。所述域的鈣結(jié)合位點(diǎn)不與配體相互作用，但表明鈣結(jié)合具有促進(jìn)正確結(jié)構(gòu)構(gòu)象以使配體能夠結(jié)合的作用(50)。MARCO的SRCR域與⑶163的SRCR域的序列比對(未顯示)證明，⑶163的SRCR域2、3、4、7和9保持了這三個殘基，而在SRCR域1、5、6和8中，這三個殘基中的ー個或多個具有非保守的取代。盡管這四個域中的其他殘基能夠代替作為用于ニ價陽離子的配體，但序列觀察的結(jié)果與本發(fā)明人的如下觀察結(jié)果相符即，鈣對SRCR域I的mAb (MAC2-158)的結(jié)合影響較小，而鈣對域4、7和9的mAb的結(jié)合影響較大。盡管除SRCR域3之外，⑶163的具體SRCR域的功能和可能的配體是已知的，但可以猜想鈣在這些相互作用中的功能，而且其可能不參與SRCR域1、5、6和8的配體結(jié)合?，F(xiàn)已提出，⑶163介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對Hb-Hp復(fù)合物的內(nèi)化作用可能是研發(fā)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的表達(dá)CD163的贅生性細(xì)胞中的靶特異性藥物遞送的機(jī)制(51)。涉及細(xì)胞攝取的大多數(shù)研究在穩(wěn)定CD163轉(zhuǎn)染的FIp-In CHO細(xì)胞(2 ;4 ；42)中進(jìn)行，或使用熒光偶聯(lián)的Hb-Hp復(fù)合物(4 ；51)。然而，CD163轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不類似于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞，而且，使用單克隆抗體而不使用Hb-Hp復(fù)合物，可使未來的藥物標(biāo)記更為可行。因此，本發(fā)明人著手研究和評估不同的單克隆CD163抗體克隆在源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞攝取，所述源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞代表了具有功能性和免疫活性的CD163表達(dá)細(xì)胞。意外的是，免疫熒光顯微術(shù)分析顯示，使用⑶163mAb克隆可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞攝取，而與其SRCR域識別無關(guān)。然而，根據(jù)流式細(xì)胞分析，使用MAC2-158，染色細(xì)胞的比例，熒光強(qiáng)度和細(xì)胞攝取明顯更好。通過使用⑶163轉(zhuǎn)染的FIp-In CHO細(xì)胞的⑶163結(jié)合和細(xì)胞攝取試驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。通過共焦激光掃描顯微鏡分析，在⑶163轉(zhuǎn)染的FIp-In CHO細(xì)胞中觀察到類似模式的表面染色和細(xì)胞攝取，表明MAC2-158識別的表位更易于接近，或可能顯現(xiàn)用于抗體結(jié)合的正確構(gòu)象。通過研究由125I標(biāo)記的不同抗⑶163克隆在⑶163轉(zhuǎn)染的FIp-InCHO細(xì)胞中的結(jié)合和胞吞作用，進(jìn)ー步證實(shí)了此觀察結(jié)果。在使用R-20和GHI/61溫育I小時后，細(xì)胞相關(guān)放射性的時間進(jìn)程達(dá)到平臺，這與評估125I標(biāo)記的Hp-Hb復(fù)合物時的細(xì)胞相關(guān)放射性的時間進(jìn)程相當(dāng)(2)。然而，在使用125I標(biāo)記的Mac2-158溫育時，細(xì)胞相關(guān)放射性的時間進(jìn)程在溫育2小時內(nèi)沒有達(dá)到平臺，并且顯示出與其他克隆相比較高百分比的攝取方式。由于現(xiàn)已提出⑶163作為急性髓細(xì)胞性白血病中藥物遞送的可能靶標(biāo)(51)，因此本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)具有重要性。使用流式細(xì)胞術(shù)，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，約5% (范圍0%至38. 5% )的M4型AML的白血病母細(xì)胞以及23% (范圍1%至77%)的M5型AML的白血病母細(xì)胞表達(dá)⑶163 (51 ;52)。然而，與⑶163在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上細(xì)胞分布的矛盾數(shù)據(jù)類似，現(xiàn)已報道了髓單核細(xì)胞性贅生性細(xì)胞上⑶163表達(dá)的差異。使用不同的方法和單克隆細(xì)胞克隆，最近的研究證實(shí)了在49%的具有單核細(xì)胞分化的AML病例中的CD163免疫活性(53)?？紤]現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，可設(shè)想髓單核細(xì)胞(M4)和單核細(xì)胞(M5)亞型的AML 二者中均有高比例的白血病母細(xì)胞表達(dá)CD163，表明此受體作為急性髓細(xì)胞性白血病中靶向特異性藥物遞送的潛在候選物。綜上，本發(fā)明人證明了，使用識別SRCR域I的MAC2-158克隆，始終能夠鑒別出大 比例的循環(huán)性表達(dá)⑶163的單核細(xì)胞。此外，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了在源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中CD163抗體介導(dǎo)的細(xì)胞攝取的能力，其在使用MAC2-158時最為有效。本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化了 CD163在影響單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的疾病中作為診斷工具和治療候選物的臨床應(yīng)用。本發(fā)明人意外地觀察到表達(dá)⑶163的細(xì)胞對Mac2_158和Mac2_48的細(xì)胞攝取和結(jié)合明顯高于其他測試的抗體(圖5)。由于Biacore研究顯示,盡管Mac2-158與⑶163結(jié)合的親和カ高，但很多其他mAb也以實(shí)質(zhì)上相似的強(qiáng)度結(jié)合，并且，例如5C6-Fat的結(jié)合甚至更強(qiáng)，所以這與那些抗體相對于其他抗體對⑶163的親和カ提高無關(guān)。由于例如5C6_Fat同樣與域I結(jié)合,并且如Biacore測量判決,其結(jié)合更強(qiáng)(圖4),但與細(xì)胞表面的結(jié)合弱于Mac2-158的觀察結(jié)果(圖5和6)，所以攝取提高也不僅是在于發(fā)生了與域I的結(jié)合。大體上，除了相當(dāng)強(qiáng)結(jié)合的Mac2-48和Mac2-158，以及在含鈣介質(zhì)中不結(jié)合的GHI/61之外，所有mAB均以實(shí)際上類似的強(qiáng)度結(jié)合展示在細(xì)胞表面上的CD163(圖5)，這與⑶163結(jié)合發(fā)生在哪個SRCR域無關(guān)。這有力地證明了 Mac2-158結(jié)合特異目標(biāo)的表位，并且Mac2-48也與細(xì)胞強(qiáng)カ結(jié)合，且由圖8可見，Mac2_48與Mac2_158競爭結(jié)合。實(shí)施例I的參考文獻(xiàn)I. 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8.0-12. 5)的外周血樹突細(xì)胞表達(dá)⑶163 (圖10C)。如圖IOC所示，表達(dá)⑶163的外周血樹突細(xì)胞可細(xì)分成兩個群高水平表達(dá)CD163的亞群(CD163*，MFI 34. 6[95% Cl :30. 5-40. 7])和染色較弱的亞群(CD163 , MFI :4. 2 [95% Cl :3.7-5. I])。為了進(jìn)行比較，基本上所有CD14+ILT3+HLA-DR+單核細(xì)胞(88. O % [95% Cl 85. 0-91. O % ])的 CD163 染色均為陽性(未顯示)，這與文獻(xiàn)I 一致。反向門控分析證明，Lin-⑶4+HLA-DR+⑶163+細(xì)胞作為屬于淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞之間樹突細(xì)胞預(yù)期定位的獨(dú)特細(xì)胞群。同種型匹配的非特異性IgGl作為陰性染色對照(MFI 1. 23[95% Cl 1. 14-1. 46])(圖 10E)。為了排除非特異性的交叉反應(yīng)性，利用抗⑶163的MAC-158克隆重復(fù)樹突細(xì)胞CD163表達(dá)分析。根據(jù)文獻(xiàn)I，與結(jié)合SRCR域7的GHI/61克隆(10. 5 % [95% Cl
8.0-12.5% ]) ( 0 I IB)相比，結(jié)合SRCR域I的MAC2-158克隆識別了顯著較高比例的外周血樹突細(xì)胞(32. 3 % [95 % Cl 19. 6-45. I % ])(圖 11D)。與 GHI/61 (22. 3[95 % Cl 19. 2-25. 4])(圖11A)相比，對于MAC2-158抗體克隆，反映每個細(xì)胞的CD163受體量的MFI也顯著較高(107. 5[95% Cl 74. 7-140. 3])(圖11C)，表明MAC2-158能夠鑒定出更多的每個細(xì)胞的⑶163受體量。為了評估兩個新型CD163表達(dá)亞類的外周血細(xì)胞的可能功能，進(jìn)行進(jìn)一歩的表型分型。表面抗原評估顯示，表達(dá)低水平⑶163的亞類還表達(dá)低水平的HLA-DR(圖12A)和ILT3(圖12B)，而表達(dá)高水平CD163的亞類高度表達(dá)HLA-DR (圖12A)和ILT3(圖12B)。兩個亞類均表達(dá)⑶11c，表明了其與髓系(DCl)的樹突細(xì)胞的關(guān)系(圖12C)。⑶163ffi亞類為⑶16+，而⑶163胃亞類為⑶16-(圖12D)。然而，兩個亞類均為⑶91+(圖12E)，從而組成了近期描述的⑶91+⑶Ilc+樹突細(xì)胞亞類的亞級分。由于已經(jīng)累積的證據(jù)顯示樹突細(xì)胞可能是HIV-I傳染和致病的重要因子，本發(fā)明人計(jì)劃研究HIV-I患者中的外周血樹突細(xì)胞的⑶163表達(dá)。一般而言，HIV-I患者中表達(dá)CD163的樹突細(xì)胞比例(19. 3% [95% Cl 14. 7-26. 3%])顯著高于健康患者(10. 5% [95%Cl 8. 0-12. 5])，P < O. 001 (圖 13A)。所研究的所有HIV-I感染患者均表達(dá)兩個亞類的⑶163+樹突細(xì)胞(⑶163ffi和⑶163高)，而約半數(shù)的健康對照僅表達(dá)⑶163 或⑶163*亞類(圖13B和圖14A-C)。
有趣的是，與健康對照相比，估計(jì)HIV-I患者中⑶163胃亞類的每個細(xì)胞⑶163受體平均數(shù)量顯著升高。討論自從發(fā)現(xiàn)⑶163是新型的巨噬細(xì)胞限定型標(biāo)記以來，已經(jīng)在影響單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的病理生理狀況中對此受體進(jìn)行了深入的研究。CD163具有作為炎性病癥中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活性的診斷標(biāo)記以及作為治療候選物的潛能。CD163表達(dá)受到促炎癥和抗炎癥刺激物的緊密調(diào)控，表明CD163的免疫調(diào)節(jié)功能，且CD163胞質(zhì)剪接變體對促炎癥刺激物產(chǎn)生不同的反應(yīng)。研究還證明了在細(xì)胞和可溶性CD163病癥，例如炎性疾病、惡性疾病和感染疾病中的顯著變化，表明單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的疾病與CD163密切相關(guān)。本發(fā)明人還顯示了，腫瘤浸潤性巨噬細(xì)胞高度表達(dá)⑶163，腫瘤中表達(dá)⑶163的巨噬細(xì)胞的密度與患者存活率差相關(guān)。此外，近期的研究顯示，直接參與血管發(fā)生的TIE2+巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的⑶163。還發(fā)現(xiàn)，⑶163在M4/M5白血病的母細(xì)胞上和乳腺癌的腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。 在生理?xiàng)l件下，⑶163在免疫細(xì)胞和惡性細(xì)胞上的細(xì)胞分布仍不清楚。多個研究者報道的不同CD163表面表達(dá)和巨大的差異影響了 CD163作為炎性病癥中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活性的診斷標(biāo)記以及作為治療候選物的應(yīng)用。在該實(shí)施例和上文的實(shí)施例中，本發(fā)明人報道了基于可靠的多色流式細(xì)胞術(shù)的試驗(yàn)的研發(fā)，其恒定地鑒定出大部分(> 80% )的表達(dá)⑶163的循環(huán)單核細(xì)胞。⑶163表達(dá)已經(jīng)成為近二十年來文獻(xiàn)中爭論的主題。使用不同的抗凝劑、抗體克隆和一般測試條件，所報道的單核細(xì)胞CD163表達(dá)水平在很少至99%之間變化(Venneri et al. ,2007 ；Backeet al. ,1991 ；Hogger et al. 1998 ；Philippidis et al. 2004 ；Sulahian et al. 2000 ；Vanden Heuvel et al. ,1999 ；Fabriek et al. 2005 ；Moniuszko et al. 2006 ；Kim et al. 2006 ；Davis et al. 2005 ；Buechler et al. 2000)。然而，本發(fā)明人證實(shí)了在使用針對不同SRCR域產(chǎn)生的多種單克隆抗體克隆時的SRCR域依賴性結(jié)合模式，其可以解釋大量研究者提出的單核細(xì)胞CD163表達(dá)的巨大差異。使用識別SRCR域I的MAC2-158抗體克隆，本發(fā)明人顯示了明顯高于R_20 (SRCR域4)、GHI/61 (SRCR域7)和RM3/1 (SRCR域9)的表達(dá)CD163的循環(huán)單核細(xì)胞比例。此觀察結(jié)果得到了平均熒光強(qiáng)度的進(jìn)ー步證實(shí)，其反映了每個細(xì)胞的CD163受體量。此現(xiàn)象可僅僅表明抗體結(jié)合親和力之間的顯著差異；然而，似乎更可能的是這種SRCR域依賴性結(jié)合模式可能部分是由于抗體結(jié)合的空間位阻造成的，所述抗體是針對定位接近于細(xì)胞膜的SRCR域而產(chǎn)生的，而MAC2-158識別可暴露的SRCR域I。在近期的研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用兩種不同的抗CD163克隆，使用EDTA抗凝的血樣中的單核細(xì)胞⑶163表達(dá)顯著高于使用肝素抗凝的情況(Fabriek et al. 2005)。在一定程度上，本發(fā)明人在EDTA和肝素穩(wěn)定的血樣中觀察到類似模式的CD163表達(dá)。在使用GHI/61時，對⑶163染色的⑶14陽性單核細(xì)胞的比例差異最為顯著。然而，在使用MAC2-158時，對CD163染色的CD14陽性單核細(xì)胞的比例與所用的抗凝劑無關(guān)。由于所研究的樣品中可溶性CD163的水平?jīng)]有受到影響，本發(fā)明人排除了使用不同抗凝劑的CD163表達(dá)差異是由CD163脫落造成的。由于肝素穩(wěn)定的血樣類似于生理的鈣水平，而EDTA穩(wěn)定的血樣中除去了游離的鈣，本發(fā)明人猜想，所觀察到的現(xiàn)象可能是由于鈣螯合劑EDTA的抗凝作用的內(nèi)在機(jī)理造成的，而肝素的作用則與鈣無關(guān)。在使用其他單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記，例如⑶36、⑶91和⑶206時，未能展示相同的鈣依賴性結(jié)合模式。然而，此前已經(jīng)表明，針對鈣結(jié)合蛋白而產(chǎn)生的ー些抗體優(yōu)先識別特異的鈣誘導(dǎo)的蛋白構(gòu)象狀態(tài)(206)，且這些抗體的免疫反應(yīng)性依賴于鈣結(jié)合狀態(tài)(Gao et al.，1997)?！┭芯恳呀?jīng)顯示，高密度的腫瘤浸潤性巨噬細(xì)胞與乳腺癌、膀胱癌和淺表食管癌的不良預(yù)后相關(guān)；然而，在其他癌癥，例如消化道惡性腫瘤中，其浸潤似乎與良好的預(yù)后相關(guān)。這些研究中的大多數(shù)利用⑶68作為巨噬細(xì)胞標(biāo)記。遺憾地，⑶68是在不同亞群(無論是抑制腫瘤或促進(jìn)腫瘤的巨噬細(xì)胞群)和新鑒定的表達(dá)Tie2的巨噬細(xì)胞之間沒有差別的通用標(biāo)記。由于目前公認(rèn)在腫瘤環(huán)境內(nèi)存在多種巨噬細(xì)胞亞群，其中ー些顯示腫瘤抑制能力，而其他顯示腫瘤促進(jìn)能力，因此，諸如CD168的通用標(biāo)記的有效性受到嚴(yán)重挑戰(zhàn)。研究表明巨噬細(xì)胞浸潤與良好預(yù)后之間的關(guān)系是有爭議的；因此，常見的觀點(diǎn)是巨噬細(xì)胞被吸引到腫瘤表面并受腫瘤細(xì)胞極化以有利于腫瘤生長和發(fā)展。使用用于具有腫瘤促進(jìn)能力的巨噬細(xì)胞的不適合的標(biāo)記可解釋所觀察到的高密度腫瘤浸潤性巨噬細(xì)胞的差異結(jié)果。 使用石蠟包埋的組織樣品，對于⑶163表達(dá)的大量免疫組織化學(xué)測定已經(jīng)認(rèn)識至|J，所述受體是正常狀況和腫瘤病癥中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞的新標(biāo)記(Shabo etal. ,2008)。然而，在造血病癥中評估⑶163免疫反應(yīng)性時，研究證明，在所檢測的46例急性單核細(xì)胞性白血病(AML-M5A)中僅有I例為CD163陽性。此外，研究者未能表明急性髓單核細(xì)胞性白血病(AML-M4)中的任何⑶163免疫反應(yīng)性(Shabo et al. ,2008) 0然而，使用流式細(xì)胞術(shù)的后續(xù)研究顯示約20%的M4型和M5型AML的白血病母細(xì)胞顯示⑶163的組成型表達(dá)(Lau et al.，2004)。近期的研究顯示了 49%具有單核細(xì)胞分化的AML病例中的CD163免疫反應(yīng)性(18)。然而，由于利用了不同的方法和識別不同SRCR域的CD163抗體，因此這些研究幾乎不可比較?；诒景l(fā)明人在流式細(xì)胞術(shù)中使用不同抗體克隆的SRCR域依賴性結(jié)合模式的觀察結(jié)果，本發(fā)明人計(jì)劃評估石蠟包埋組織樣品中的免疫組織化學(xué)CD163表達(dá)。最佳的免疫反應(yīng)性依賴于表位的保持。修復(fù)溶液的組成、pH、加熱類型和量均對表位的修復(fù)和保持程度具有顯著的影響。壓倒多數(shù)的證據(jù)證明不是所有表位都在表位修復(fù)過程期間等同地被暴露(unmasked)。更重要地，從臨床的觀點(diǎn)來看，這表明在正常狀況和腫瘤病癥中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系兩種細(xì)胞上的CD163表達(dá)都被低估了，特別是在進(jìn)行免疫組織化學(xué)吋。⑶163介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對Hb-Hp復(fù)合物的內(nèi)化作用可能是研發(fā)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的表達(dá)CD163的贅生性細(xì)胞中的靶特異性藥物遞送的機(jī)制。涉及細(xì)胞攝取的大多數(shù)研究在穩(wěn)定⑶163轉(zhuǎn)染的FIp-In CHO細(xì)胞(Bowen et al. 1997)上進(jìn)行，或使用熒光偶聯(lián)的Hb-Hp復(fù)合物(Lau et al.，2004)。然而，CD163轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞不類似于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，而且，使用單克隆抗體而不使用Hb-Hp復(fù)合物,可使未來的藥物標(biāo)記更為可行。由于CD163僅結(jié)合復(fù)合物中的Hb和Hp，這意味著呈遞了新的表位，因此，似乎合理的是，只有針對結(jié)合Hb-Hp復(fù)合物(Chakraborty et al. 2004)的SRCR域3而產(chǎn)生的抗體才能促進(jìn)CD163介導(dǎo)的胞吞。因此，本發(fā)明人最初計(jì)劃研究和評估CD163用于未來靶向治療的應(yīng)用性，評估不同的單克隆CD163抗體克隆在CD163轉(zhuǎn)染的FIp-In中國倉鼠卵巢細(xì)胞中的結(jié)合和細(xì)胞攝取。
有趣的是，共聚焦激光掃描顯微鏡分析顯示，使用單克隆CD163抗體克隆可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞攝取，而與其SRCR域識別無關(guān)。根據(jù)流式細(xì)胞分析顯示，使用MAC2-158，染色細(xì)胞的比例，熒光強(qiáng)度和細(xì)胞攝取明顯更好。由于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞代表了具有功能性和免疫活性的表達(dá)⑶163的細(xì)胞，本發(fā)明人隨后使用源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞重復(fù)了這些⑶163結(jié)合和細(xì)胞攝取試驗(yàn)。在源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中觀察到了類似模式的表面染色和細(xì)胞攝取，表明MAC2-158很可能是在用于靶向特異性藥物遞送時給出最強(qiáng)反應(yīng)的CD163克隆。⑶163被認(rèn)為是專門表達(dá)在單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞表面上(RadzunHJ. Blood. 1987 ；BackeE. J Clin Pathol. 1991 ；Pulford K. Immunology. 1992) CD163 和⑶91在單核細(xì)胞分化成抗炎性巨噬細(xì)胞表型期間高度表達(dá)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)⑶91在源自單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞中表達(dá)，而該受體在源自單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞中發(fā)揮T細(xì)胞刺激的重要功能(Hart，JP. J. Immunol. 2004)。此外，已有證據(jù)表明，作為單核⑶163表達(dá)，⑶163可由未知的組織成分表達(dá)，且s⑶163水平與單核細(xì)胞絕對量不相關(guān)(Davis. Cytometry Part BClinical cytometry. 2005 ；Zarev PV. Lab HematoI. 2004)。CD91 和 CD163 二者在鐵代謝 (Hvidberg, V. Blood. 2005 ；Kristiansen, M. Nature. 2001)和免疫調(diào)節(jié)中的雙重作用促使本發(fā)明人設(shè)想除髓單核細(xì)胞源的其他細(xì)胞之外，CD163與CD91類似，也在樹突細(xì)胞中表達(dá)。使用將樹突細(xì)胞定義為⑶14-⑶163+的簡單染色方案，本發(fā)明人鑒定出顯示樹突細(xì)胞表型特征的⑶163表達(dá)細(xì)胞群。此發(fā)現(xiàn)與此前的報道相反(Ritter.Pathobiology. 1999)，并且因?yàn)橐阎獦渫患?xì)胞的異質(zhì)性，本發(fā)明人利用了將樹突細(xì)胞定義為 CD14-ILT3+HLA-DR高或[CD3，CD14，CD19，CD20，CD56]-CD4+HLA-DR+譜系的兩種不同染色方案以證實(shí)對表達(dá)CD163的樹突細(xì)胞的觀察結(jié)果。流式細(xì)胞分析顯示了兩種不同亞類的表達(dá)⑶163的樹突細(xì)胞，即⑶163ffi和⑶163S，其共同構(gòu)成了約10. 5% (95% Cl 8. 0-12. 5)的外周血樹突細(xì)胞。然而，根據(jù)上ー個實(shí)施例，本發(fā)明人證明了使用MAC2-158克隆代替GHI/61，能夠鑒定出顯著較高比例的表達(dá)⑶163的樹突細(xì)胞(32.3% [95% Cl :19.6-45. 1% ])，表明達(dá)到幾乎半數(shù)的循環(huán)外周血樹突細(xì)胞可表達(dá)血紅蛋白清道夫受體。深入的表型分析將兩個亞類的表達(dá)⑶163的樹突細(xì)胞表征為⑶91+⑶11c+，因此，代表了近期描述的⑶91+⑶Ilc+髓系(DCl)樹突細(xì)胞亞群(Hart, JP. J. Immunol. 2004)。由于⑶91和⑶163在單核細(xì)胞上共表達(dá)，其在外周血樹突細(xì)胞的亞級分上的共表達(dá)強(qiáng)調(diào)了這兩種受體之間的關(guān)系。有趣的是，進(jìn)一歩的表型分析顯示，表達(dá)高水平⑶163的亞類還高度表達(dá)HLA-DR和ILT3，表明這種亞類具有炎性和致耐受性能力。相反，表達(dá)低水平⑶163的亞類為⑶16+且表達(dá)低水平的HLA-DR和ILT3。已報道此亞類構(gòu)成大部分的骨髓DC (MacDonald KP. Blood. 2002)，微陣列分析已經(jīng)提出toll樣受體8(TLR8)在這些細(xì)胞中最為顯著(Lindstedt M. J Immunol. 2005)，表明在ssRNA反應(yīng)中的主要作用。⑶16(FcyRIII)最先被鑒定為NK細(xì)胞限制性受體；然而，其還由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞表達(dá)(Schakel K. Eur J Immunol. 1998)。已知表達(dá)⑶16的樹突細(xì)胞顯示出比CD16陰性樹突細(xì)胞更大的吞噬和氧化活性，包括產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子(Almeida J. Clin Immunol. 2001),并且具有激活原態(tài)(nai've) T細(xì)胞的顯著能力(SchakelK.Eur J Tmmunol · 1998)。髓系樹突細(xì)胞是強(qiáng)效的抗原呈遞細(xì)胞，并且在宿主防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已知這些具有部分活化表型的細(xì)胞在無癥狀的慢性HIVl感染期間累積在淋巴組織中。樹突細(xì)胞可能對HIV-I傳染和致病的重要因子。這促使本發(fā)明人研究HIV-I患者中的外周血樹突細(xì)胞CD163表達(dá)。意外的是，HIV-I患者中表達(dá)CD163的樹突細(xì)胞比例(19. 3 % [95 % Cl
14.7-26. 3% ])顯著高于健康個體(10. 5% [95% Cl 8. 0-12. 5]), p < O. 001。這些發(fā)現(xiàn)與顯示HIV-I感染患者中⑶163+⑶16+單核細(xì)胞的頻率高于血清反應(yīng)陰性的個體的近期研究相符。因此，⑶163+⑶16+單核細(xì)胞可以成為HIV-I感染的有效生物標(biāo)記以及用于治療干預(yù)的可能靶標(biāo)。此外，另ー項(xiàng)近期研究證明，已知在銀屑病發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且在慢性發(fā)炎組織中積累的炎性髓系真皮樹突細(xì)胞可能源自表達(dá)CD163的外周血樹突細(xì)胞前體(CDllc+HLA-DR+CD16+)。該作者猜想，這些“促炎癥樹突細(xì)胞”可以遷移到皮膚中以響應(yīng)趨化因子梯度或其他刺激物。因此，提示這些誘導(dǎo)性炎性樹突細(xì)胞可代表銀屑病的新型治療革巴標(biāo)(Zaba. J Invest Dermatol. 2009)。 通過特異性表面受體直接靶向樹突細(xì)胞是增強(qiáng)疫苗免疫原性的有前景的方法(Gamvrel I is. Immunol. Cell Biol. 2004)。CD163在樹突細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞上的受限表達(dá)強(qiáng)化了 CD163作為診斷工具以及用于靶向特異性藥物遞送的推定候選物的應(yīng)用性。實(shí)體瘤不僅包含惡性細(xì)胞，還包含大量炎性浸潤細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞，其駐留在原發(fā)腫瘤和次發(fā)腫瘤二者的微環(huán)境中(Albini A. Nat Rev Cancer. 2007)。綜上，本實(shí)施例和上文的實(shí)施例已經(jīng)鑒定出表達(dá)血紅蛋白清道夫受體⑶163的未知組織成分，其由兩種不同亞類的表達(dá)⑶163的樹突細(xì)胞——⑶163ffi和⑶163胃組成，合計(jì)構(gòu)成高達(dá)50%的外周血樹突細(xì)胞。所鑒定表達(dá)⑶163的樹突細(xì)胞亞類之一(ILT3srai63*)潛在地具有炎性和致耐受性特征。本發(fā)明人顯示在HIV-I感染患者中的表達(dá)⑶163的樹突細(xì)胞比血清反應(yīng)陰性個體顯著提高，這進(jìn)一歩支持了所提出的CD163的免疫調(diào)控作用。此外，本發(fā)明人還證明了，使用識別SRCR域I的MAC2-158克隆，始終能夠鑒別出大比例(> 80% )的循環(huán)性表達(dá)⑶163的單核細(xì)胞。此外，本發(fā)明人還顯示了⑶163轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞二者中的CD163-抗體介導(dǎo)的細(xì)胞攝取的能力，其在使用MAC2-158時最為顯著。本發(fā)明的數(shù)據(jù)提出了⑶163作為涉及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的病理生理狀況的診斷工具的臨床應(yīng)用性，其著重于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞上的限定性⑶163表達(dá)。通過提出CD163作為推定候選物用于在血液學(xué)惡性腫瘤和實(shí)體瘤以及涉及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的其他疾病中的靶向特異性藥物遞送的應(yīng)用性，腫瘤促進(jìn)型巨噬細(xì)胞和惡性細(xì)胞上的⑶163表達(dá)使得血紅蛋白清道夫受體⑶163成為惡性疾病中的雙刃劍。本發(fā)明的數(shù)據(jù)還意味著使用CD163作為靶的預(yù)期副作用譜與目前可用的相當(dāng)大的治療作用相比潛在的臨床意義不大。實(shí)施例2的參考文獻(xiàn)I.Albini A，Sporn MB. Fhe tumour microenvironment as a target forchemoprevention. 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表達(dá)載體克隆引物
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重鏈SLIM引物
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K-N FTTGGAGTGGATGGGCTACA
TCACCTACAGCGGCAGC
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權(quán)利要求
1.用于向單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞靶向遞送免疫抑制劑的治療劑，其包含: (a)對單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞具有特異性的結(jié)合部分；和 (b)免疫抑制劑。
2.如權(quán)利要求I所述的治療劑，其中所述對單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞具有特異性的結(jié)合部分選自以下組成的組 (a)抗體或其抗原結(jié)合片段，或所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物，或所述變體或衍生物的融合物； (b)觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hb復(fù)合物)； (c)脂質(zhì)體； (d)抗體模擬物(例如，基于非抗體骨架)；(e)RNA 適體； (f)小分子；(g)CovX 體；和 (h)末端甘露糖部分。
3.如權(quán)利要求I或2所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分對選自以下組成的組中的受體具有特異性CD163受體、甘露糖受體、MARCO, M160、巨噬細(xì)胞特異性的補(bǔ)體受體(例如Fe受體)；Siglec 受體,例如 Siglec 1> Siglec 5 或 Siglecll。
4.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分對CD163受體具有特異性。
5.如權(quán)利要求4所述的治療劑，其中所述CD163受體是人CD163受體。
6.如權(quán)利要求4或5所述的治療劑，其中所述CD163受體選自由數(shù)據(jù)庫登錄號CAB45233、AAY99762、AAH51281、EAW8862、EAW8863、EAW8864、EAW8865、EAW8866、NP_004235、NP_98161和Swiss-Prot Q86VB7. I限定的蛋白質(zhì)組成的組。
7.如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述CD163受體定位在單核細(xì)胞表面上和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞表面上。
8.如權(quán)利要求7所述的治療劑，其中所述細(xì)胞選自由以下組成的組單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、源自單核細(xì)胞的樹突細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞亞型(例如，M1、M2)和表達(dá)CD163的惡性細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的治療劑，其中所述細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，例如Kuppfer細(xì)胞。
10.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分是對CD163受體具有結(jié)合特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段，或保留了對CD163受體的結(jié)合特異性的所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物或所述變體或衍生物的融合物，或所述變體或衍生物的融合物。
11.如權(quán)利要求10所述的治療劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物結(jié)合選自以下組成的組中的⑶163受體域域I、域2、域3、域4、域5、域6、域7、域8和域9。
12.如權(quán)利要求11所述的治療劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物結(jié)合CD163受體的域I。
13.如權(quán)利要求11所述的治療劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物結(jié)合CD163受體的域3。
14.如權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物顯示出在鈣存在下對CD163受體的結(jié)合親和力高于鈣不存在時。
15.如權(quán)利要求2-14中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物能夠誘導(dǎo)CD163受體和/或所述治療劑的胞吞。
16.如權(quán)利要求2-15中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分是完整抗體。
17.如權(quán)利要求2-15中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物包含選自Fv片段(例如單鏈Fv、二硫鍵鍵合的Fv和域抗體)和Fab樣片段(例如，F(xiàn)ab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)組成的組中的抗原結(jié)合片段或由選自Fv片段(例如單鏈Fv、二硫鍵鍵合的Fv和域抗體)和Fab樣片段(例如，F(xiàn)ab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)組成的組中的抗原結(jié)合片段組成。
18.如權(quán)利要求17所述的治療劑，其中所述抗原結(jié)合片段是scFv。
19.如權(quán)利要求17所述的治療劑，其中所述抗原結(jié)合片段是域抗體。
20.如權(quán)利要求19所述的治療劑，其中所述域抗體選自以下組成的組來自駱駝的單域抗體、來自鯊魚的單域抗體和來自人的分離的VH或VL域。
21.如權(quán)利要求2-20中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述抗體是IgG抗體。
22.如權(quán)利要求21所述的治療劑，其中所述IgG抗體是IgG2或IgG4抗體，例如241位的絲氨酸被脯氨酸殘基取代的IgG4抗體。
23.如權(quán)利要求2-22中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述抗體是重組抗體。
24.如權(quán)利要求2-23中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述抗體是單克隆抗體。
25.如權(quán)利要求2-24中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段是人的或人源化的。
26.如權(quán)利要求2-25中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述抗體、其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物能夠與選自以下組中的抗體分子競爭結(jié)合CD163受體 Mac2-158(下劃線為 CDR) VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAffNffIRQFPGNKLEWMGYITYSGITNYNPSLKSQISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVSGTYYFDYffGQGTTLTVSS VL SVVMTQTPKSLLISI⑶RVTITCKASQSVSSDVAWFQQKPGQSPKPLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRMac2-48(下劃線為CDR) VH DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAffNVIRQFPGNKLEWMGFISYSGITSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDSATYYCVSGTYYFDYffGQGTTLTVSS VL SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSHDVSffFQQKPGQSPKLLIYYTSNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAIYFCQQDYSSPRTFGGGTKLEIKRA 示例性人源化m Ab (下劃線為CDR) VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAffNVIRQFPGKKLEWMGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCVSGTYYFDYffGQGTTLTVSS VL DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSDVAffFQQKPGKSPKPLIYYASNRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCGQDYTSPRTFGGGTKLEIKRA。
27.如權(quán)利要求26所述的治療劑，其中所述抗體、其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物能夠結(jié)合的表位與選自Mac2-158、Mac2_48和示例性人源化mAb組成的組中的抗體結(jié)合的表位相同。
28.如權(quán)利要求26或27所述的治療劑，其中所述抗體、其抗原結(jié)合片段或它們的變體、融合物或衍生物是或源自選自Mac2-158、Mac2-48和示例性人源化mAb組成的組中的抗體。
29.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分是觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hb)復(fù)合物。
30.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分是脂質(zhì)體。
31.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分是抗體模擬物(例如，非抗體骨架)。
32.如權(quán)利要求31所述的治療劑，其中所述抗體模擬物選自親和體、tetranectin (CTLD)、adnectin (單體)、anticalin、DARPin (ankyrin)、avimer、iMab、微體、肽適體、Kunitz域和affilin組成的組。
33.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分是RNA適體。
34.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分是小分子，或具有一個或多個末端甘露糖殘基的碳水化合物結(jié)構(gòu)。
35.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分是分離和/或純化的形式。
36.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述免疫抑制劑是抗炎劑。
37.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述免疫抑制劑選自包含以下的組或由以下組成的組糖皮質(zhì)激素、皮質(zhì)類固醇、氨甲喋呤、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、環(huán)孢霉素、他克莫司、霉酚酸嗎啉乙酯、西羅莫司、依維莫司，能夠抑制促炎細(xì)胞因子(例如TNF)合成的siRNA分子、非甾體抗炎藥(NSAID，例如阿斯匹林、布洛芬)、類固醇(例如，維生素D)、調(diào)節(jié)疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD，例如青霉胺、柳氮磺胺吡啶、環(huán)孢霉素。
38.如權(quán)利要求37所述的治療劑，其中所述免疫抑制劑是糖皮質(zhì)激素。
39.如權(quán)利要求38所述的治療劑，其中所述糖皮質(zhì)激素選自以下組成的組可的松及其衍生物(例如氫化可的松)；強(qiáng)的松及其衍生物(例如強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍醋酸酯、甲基強(qiáng)的松龍琥珀酸酯)；地塞米松及其衍生物；去炎松及其衍生物(例如，己酸去炎松、醋酸去炎松)；帕拉米松；倍他米松；氟氫化可的松；醋酸氟輕松；以及氟輕松。
40.如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述免疫抑制劑是糖皮質(zhì)激素半琥珀酸酯衍生物。
41.如權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述糖皮質(zhì)激素經(jīng)由組織蛋白酶敏感的肽連接子連接。
42.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述糖皮質(zhì)激素是地塞米松。
43.權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述糖皮質(zhì)激素是強(qiáng)的松龍。
44.如權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述糖皮質(zhì)激素是醋酸氟輕松。
45.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述結(jié)合部分與所述免疫抑制劑共價連接。
46.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述糖皮質(zhì)激素分子與所述結(jié)合部分分子的比例在6和16之間，或I和12之間，例如8和12之間或I和8之間，或3和5之間或7和9之間。
47.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中 (a)所述對單核細(xì)胞和/或源自單核細(xì)胞的細(xì)胞具有特異性的結(jié)合部分是對CD163受體具有結(jié)合特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段，或保留了對CD163受體的結(jié)合特異性的所述抗體或其抗原結(jié)合片段的變體、融合物或衍生物，或所述變體或衍生物的融合物；和 (b)所述免疫抑制劑是糖皮質(zhì)激素。
48.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述治療劑在炎性病癥或病變的治療中具有功效。
49.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述治療劑在自身免疫性疾病的治療中具有功效。
50.如權(quán)利要求48或49所述的治療劑，其中所述病癥或病變選自以下組成的組關(guān)節(jié)炎疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎)、慢性炎性腸道疾病(IBD，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、牙周炎、銀屑病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、結(jié)締組織病、自身免疫性肝病(例如，膽汁性肝硬化)、膿毒癥、噬血細(xì)胞綜合癥、肝病、肝功能衰竭、肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、關(guān)節(jié)炎、炎癥誘導(dǎo)的軟骨損傷、肝硬變、器官移植、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、結(jié)節(jié)病、葡萄膜炎、HLA-B27陽性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎。
51.如權(quán)利要求50所述的治療劑，其中所述炎性病癥或病變是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
52.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中所述治療劑顯示的治療功效是不存在所述結(jié)合部分的對應(yīng)免疫抑制劑的至少10倍。
53.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的治療劑，其中，在治療有效劑量下，所述治療劑的副作用譜低于不存在所述結(jié)合部分的對應(yīng)免疫抑制劑的副作用譜。
54.一種藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
55.如權(quán)利要求54所述的藥物組合物，其適合通過胃腸外(例如，經(jīng)靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、經(jīng)鼻內(nèi)、通過吸入或經(jīng)眼內(nèi)遞送。
56.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑或權(quán)利要求54或55所述的藥物組合物。
57.如權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑，其用于醫(yī)藥中。
58.如權(quán)利要求57所述的治療劑，其用于治療炎性病癥或病變。
59.如權(quán)利要求58所述的治療劑，其用于治療自身免疫性疾病。
60.如權(quán)利要求58或59所述的治療劑，其中所述病癥、病變或疾病選自以下組成的組關(guān)節(jié)炎疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎)、慢性炎性腸道疾病(IBD，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、牙周炎、銀屑病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、結(jié)締組織病、自身免疫性肝病(例如，膽汁性肝硬化)、膿毒癥、噬血細(xì)胞綜合癥、肝病、肝功能衰竭、肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性能肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、關(guān)節(jié)炎、炎癥誘導(dǎo)的軟骨損傷、肝硬變、器官移植、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、結(jié)節(jié)病、葡萄膜炎、HLA-B27陽性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎。
61.如權(quán)利要求60所述的治療劑，其中所述病癥、病變或疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
62.權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑用于治療炎性病癥或病變的用途。
63.權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑用于治療自身免疫性疾病的用途。
64.權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑在制造用于治療炎性病癥或病變的藥物中的用途。
65.權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑在制造用于治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。
66.如權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)所述的用途,其中所述病癥、病變或疾病選自以下組成的組關(guān)節(jié)炎疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎)、慢性炎性腸道疾病(IBD，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、牙周炎、銀屑病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、結(jié)締組織病、自身免疫性肝病(例如，膽汁性肝硬化)、膿毒癥、噬血細(xì)胞綜合癥、肝病、肝功能衰竭、肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、關(guān)節(jié)炎、炎癥誘導(dǎo)的軟骨損傷、肝硬變、器官移植、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、結(jié)節(jié)病、葡萄膜炎、HLA-B27陽性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎。
67.如權(quán)利要求66所述的用途，其中所述病癥、病變或疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
68.用于降低和/或緩解個體中的炎性病癥或病變的方法，其包括向有此需要的個體施用有效量的權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑或權(quán)利要求54或55所述的藥物組合物的步驟。
69.用于降低和/或緩解個體中的自身免疫性疾病的方法，其包括向有此需要的個體施用有效量的權(quán)利要求1-53中任一項(xiàng)所述的治療劑或權(quán)利要求54或55所述的藥物組合物的步驟。
70.如權(quán)利要求68或69所述的方法，其中所述病癥、病變或疾病選自以下組成的組關(guān)節(jié)炎疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎)、慢性炎性腸道疾病(IBD，例如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)、牙周炎、銀屑病、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、自身免疫性慢性炎性疾病、結(jié)締組織病、自身免疫性肝病(例如，膽汁性肝硬化)、膿毒癥、噬血細(xì)胞綜合癥、肝病、肝功能衰竭、肝炎、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、急性酒精性肝炎、關(guān)節(jié)炎、炎癥誘導(dǎo)的軟骨損傷、肝硬變、器官移植、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、結(jié)節(jié)病、葡萄膜炎、HLA-B27陽性葡萄膜炎、急性葡萄膜炎、巨噬細(xì)胞活化綜合癥、巨細(xì)胞關(guān)節(jié)炎。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述病癥、病變或疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
72.參考本說明書基本如本文所述的治療劑。
73.參考本說明書基本如本文所述的藥物組合物。
74.參考本說明書基本如本文所述的試劑盒。
75.參考本說明書基本如本文所述的治療劑的用途。
76.參考本說明書基本如本文所述的治療方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于向單核細(xì)胞和/或衍生自單核細(xì)胞的細(xì)胞靶向遞送免疫抑制劑的治療劑，其包含免疫抑制劑和對單核細(xì)胞和/或衍生自單核細(xì)胞的細(xì)胞具有特異性的結(jié)合部分。在一個實(shí)施方式中，所述治療劑是糖皮質(zhì)激素-抗體偶聯(lián)物。本發(fā)明還涉及包含所述治療劑的方法、用途、試劑盒和組合物。
文檔編號C07K16/28GK102725002SQ201080054136
公開日2012年10月10日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者加布里埃爾·安東, 尼爾斯·喬納斯·海爾斯考·格拉弗森, 彼得·阿斯楚普·克里斯滕森, 皮亞·斯文森, 索倫·克拉格·莫斯楚普, 霍爾格·喬恩·默勒 申請人:賽托蓋德公司