專利名稱：：大環(huán)內(nèi)酯類化合物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及源于中國(guó)渤海潮間帶植物鹽地堿蓬(Sw^/"犯/sa)根內(nèi)的海洋芽孢桿菌產(chǎn)生的對(duì)植物病原菌具有拮抗活性的3個(gè)新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P、Q及其制備方法和在農(nóng)藥中的應(yīng)用。發(fā)明背景海洋微生物以其不同于陸地微生物的生長(zhǎng)環(huán)境而具有一些獨(dú)特的代謝途徑，因此產(chǎn)生大量的結(jié)構(gòu)新穎的活性代謝產(chǎn)物，這些結(jié)構(gòu)新穎的活性代謝產(chǎn)物成為開發(fā)海洋藥物的重要基礎(chǔ)和源泉。如從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)并研制成功的第一個(gè)新抗生素——頭孢菌素，開創(chuàng)了開發(fā)海洋抗生素的先河。日本又從海洋細(xì)菌中分離到了廣譜、低毒的抗生素一一伊他霉素(天神霉素)，并進(jìn)行人工修飾與合成。Gustafson等(1989)從一株深海細(xì)菌中分離得到新化合物MacrolactinA-F，MacrolactinA-F共同結(jié)構(gòu)是一個(gè)24C的大環(huán)內(nèi)酯。研究發(fā)現(xiàn)，MacrolactinA具有抗HIV活性、保護(hù)T細(xì)胞最高濃度為10ing/ml;抑制單純皰疹病毒I型、n型的ICso分別為5.0pg/ml和8.3嗎/ml;抑制B16-F10(黑色素瘤)體外復(fù)制的ICso為3.5嗎/ml。同時(shí)，MacrolactinA具有抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作用。MacrolactinB在32pg/ml時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率為85。/。。Kim等(1997)AA^c""oma血rasp.培養(yǎng)液中分離出macrolatinA，可作為一種神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)劑。Cho等(2004)從約100株微生物中篩選到一株解淀粉芽孢桿菌CHO104，從其發(fā)酵液中分離得到macrolactinA，研究發(fā)現(xiàn)該化合物能夠非常有效地抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)。Tomokazu等(1997)從一株芽孢桿菌PP19-H3中，分離得到了6個(gè)新的大環(huán)內(nèi)酯化合物MacrolactinsG-L，這些化合物本身不僅具有良好的殺菌活性，而且作為殺菌劑對(duì)產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌也非常有效。Chutima等(2000)從源于海洋的芽孢桿菌Sc026發(fā)酵液中分離得到已知結(jié)構(gòu)化合物MacrolactinF和兩個(gè)新結(jié)構(gòu)化合物7-O-succinylmacrolactinF及7-O-succinylmacrolactinA，這3個(gè)化合物對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。Tomokazu等(1997)從芽孢桿菌PP19-H3培養(yǎng)液中分離得到MacrolactinM，其對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.38|ng/ml。Yoo等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，MacrolactinN能夠抑制金黃色葡萄球菌的肽脫甲?；福銲Cso為7.5mM;同時(shí)具有抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的活性，其MIC均為100ng/ml。Magally等(2006)中分離得到一株源自土壤的枯草芽孢桿菌，從其發(fā)酵液中分離得到一個(gè)新抗生素7-(9-malonylmacrolactinA(MMA)，MMA能夠?qū)υS多耐多種藥物的革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的抑制作用，例如該物質(zhì)可抑制耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素的腸道球菌和洋蔥伯克霍爾德菌的變種。從海洋生物中尋找新的生物農(nóng)藥是一種有效的途徑，日本從海洋沙蠶中提取沙蠶毒素，并成功開發(fā)成一種廣譜高效殺蟲劑——巴丹，占日本殺蟲劑總消耗量的20%，并大量輸出國(guó)外。然而，本領(lǐng)域中仍然需要從海洋生物中尋找新的高效的生物農(nóng)藥。本發(fā)明涉及的海洋細(xì)菌是一株海洋芽孢桿菌5"c///^man'"^，有文獻(xiàn)報(bào)道可以從采自海洋的芽孢桿菌中分離得到Macrolactin系列化合物。本發(fā)明報(bào)道了一株海洋芽孢桿菌5ac/〃wmflW"wB-9987產(chǎn)生的3個(gè)新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P和Q，研究發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)新化合物對(duì)交鏈孢和稻瘟霉具有很好的抑制活性。此外還發(fā)現(xiàn)，含有該類物質(zhì)的海洋芽孢桿菌5aa7/^m"〃'm^B-9987發(fā)酵濃縮液可有效抑制植物病原菌的生長(zhǎng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明者從海洋芽孢桿菌^ac///^m『/m^B-9987發(fā)酵產(chǎn)物中得到了具有新結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P和Q，這些化合物對(duì)稻瘟霉和交鏈孢抑制作用明顯，而且，含有該類化合物的粗提物也可有效地抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明第一方面提供具有新的結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P和Q，所述化合物選自具有以下結(jié)構(gòu)的化合物當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的化合物"或類似術(shù)語(yǔ)的含義不僅包括了上述結(jié)構(gòu)式所定義的化合物，還包括了它們的鹽。所述鹽可以是水溶、脂溶或可分散產(chǎn)物的形式，其可通過和無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸或堿反應(yīng)形成。這些酸加成鹽的例子包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、十二垸基磺酸鹽、鹽酸鹽、草酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽。堿性鹽包括銨鹽，堿金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽，有機(jī)堿的鹽，如二環(huán)己胺鹽等。本發(fā)明的化合物也可以其互變異構(gòu)形式存在。盡管未在這里描述的化合物中明確指出這些形式，但它們也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。除非另有說明，這里所述化合物的化學(xué)名包括所有可能的、所述化合物可包含的立體化學(xué)異構(gòu)形式的混合物。所述混合物可含有所述化合物基礎(chǔ)分子結(jié)構(gòu)的所有非對(duì)映異構(gòu)體和/或?qū)τ钞悩?gòu)體。本發(fā)明化合物所有的立體化學(xué)異構(gòu)形式可以是純化形式，或者是相互混合的形式，這都包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明第二方面提供了制備上述化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)保藏號(hào)為CGMCCNo.2095的海洋芽孢桿菌ma〃'"usB-9987;(b)從步驟(a)獲得的發(fā)酵液經(jīng)離心得其上清液；(c)用溶劑萃取從所述上清液中分離獲得所述化合物。本發(fā)明方法中所涉及的菌株為海洋芽孢桿菌5ac///wwflWm^B-9987,該菌株是從中國(guó)渤海潮間帶植物鹽地堿蓬(Swe^w^a)根內(nèi)分離得到的，已于20076或年6月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2095。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵"或"培養(yǎng)"具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常熟知且承認(rèn)的含義。所述"發(fā)酵液"或"培養(yǎng)液"可通過在適合生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的海洋芽孢桿菌Sac7'//^man7rnsB-9987，使其生長(zhǎng)至一定的細(xì)菌濃度來(lái)獲得。用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源沒有特別的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)公知的技術(shù)來(lái)選擇合適的碳源、氮源和其它營(yíng)養(yǎng)源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麥皮、酵母粉、玉米漿、銨鹽以及其它有機(jī)或無(wú)機(jī)含氮化合物。另外，培養(yǎng)基中還可適當(dāng)加入一些無(wú)機(jī)鹽類，如氯化鈉、磷酸鹽(如磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀等)、硫酸銨、硫酸錳、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽。通?？刹捎酶鞣N已知的常規(guī)培養(yǎng)基，如LB瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和牛肉浸汁瓊脂培養(yǎng)基等。下文實(shí)施例中給出了一個(gè)最適培養(yǎng)基的配方。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不局限于本文中列舉的這些具體培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)本發(fā)明中的菌株的溫度、pH、氣液比、罐壓、轉(zhuǎn)速等條件沒有特別嚴(yán)格的限制，只要該條件適合該菌的生長(zhǎng)即可。在培養(yǎng)時(shí)可采用豆油、泡敵等消泡劑進(jìn)行消泡。在一些較佳的實(shí)施方案中，pH宜控制在5.58.0之間，培養(yǎng)溫度宜在2035t:之間。培養(yǎng)時(shí)間通常在12h200h之間，最終的菌濃度通常可高達(dá)5xlO、fU/mllxl()Hcfu/ml。在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，通過以下方法培養(yǎng)所述海洋芽孢桿菌來(lái)得到發(fā)酵液在含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，在通氣量控制在氣液比為0.2:12:1、轉(zhuǎn)速在100r/min或以上，培養(yǎng)所述海洋芽孢桿菌24小時(shí)以上，其中所述碳源選自葡萄糖、蔗糖、淀粉和大米粉中的l種或幾種，所述氮源選自蛋白粉、酵母粉、花生餅粉和大豆粉中的l種或幾種，所述無(wú)機(jī)鹽包括常規(guī)的無(wú)機(jī)鹽(如MgS。4、(NH4)2S04、MgCl2、KC1、KH2P04、NaCl、K2HPO^CaC03)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所用的培養(yǎng)基具有以下組成葡萄糖0.1%~1%、蔗糖0.1%~2%、酵母粉0.01%~1.5%、蛋白粉0.1%~1%、MgCl20.001%~0.1%、KC10.01%~0.5%、1012040.01%0.5%和NaCl0.1%~6%、pH6.0~7.0。上述列舉的這些參數(shù)只是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的較佳方案。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在上述范圍以外選擇合適的培養(yǎng)條件也能獲得本發(fā)明的發(fā)酵液。在獲得了上述發(fā)酵液后，可采用常規(guī)的分離手段如離心過濾等，將所述發(fā)酵液分離為上清液和菌絲體。與上清液相比，菌絲體中本發(fā)明所述的化合物的含量較少，因此較優(yōu)的方法是對(duì)上清液作進(jìn)一步分離純化。作為分離純化的一個(gè)較佳的實(shí)施方案，從所述上清液獲得所述化合物的步驟包括，首先脫鹽，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，然后用乙酸乙酯/石油醚梯度洗脫乙酸乙酯萃取部分，分別收集20%60%和70%100%乙酸乙酯/石油醚洗脫部分，再用SephadexLH-20和HPLC等多次制備獲得所述化合物。在一個(gè)更為優(yōu)選的方案中，所述從上清液獲得本發(fā)明化合物的方法包括如下步驟(1)上清液經(jīng)薄膜蒸發(fā)得到濃縮液，再減壓蒸發(fā)至干。用無(wú)水Na2S04干燥過的甲醇脫鹽，得到的甲醇溶液減壓蒸發(fā)至干，再溶于1000ml水中。然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別減壓濃縮得各萃取部分干膏(5.0g)。(2)乙酸乙酯萃取部分上硅膠柱層析用乙酸乙酯/石油醚1%100%梯度洗脫，分別收集20%60%乙酸乙酯/石油醚洗脫部分(簡(jiǎn)稱A部分，0.7g)和70%100%乙酸乙酉旨/石油醚洗脫部分(簡(jiǎn)稱B部分，0.6g)。(3)對(duì)A部分用SephadexLH-20分別用100%甲醇和氯仿:甲醇(1:1)進(jìn)行洗脫，收集氯仿:甲醇洗脫部分上反相硅膠柱(ODS)，以70%甲醇水溶液洗脫得到A-l和A-2兩部分，A-l用HPLC制備得到化合物MacrolactinO(制備條件為60%甲醇水溶液)；A-2再用HPLC制備得到化合物MacrolactinP(制備條件為70%甲醇水溶液)。對(duì)B部分用SephadexLH-20分別用100%甲醇和氯仿:甲醇(1:1)系統(tǒng)洗脫，收集氯仿:甲醇洗脫部分上硅膠柱色譜分離，收集氯仿:甲醇(10:1.5)部分，再用HPLC制備得到化合物MacrolactinQ(制備條件為70%甲醇水溶液)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其完全能夠根據(jù)常規(guī)技術(shù)采用其它的分離手段、溶劑或洗脫劑來(lái)分離得到本發(fā)明的化合物。例如，在對(duì)上清液進(jìn)行溶劑萃取時(shí)，還可根據(jù)不同的極性采用其它溶劑(如氯仿、醋酸丁酯等)萃取。因此，本發(fā)明方法的范圍并不局限于說明書實(shí)施例中所用的具體方法。在另一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，在所述步驟(c)中，還包括在用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取前，用脫鹽處理，這是因?yàn)楹Ｑ笱挎邨U菌屬于海洋微生物，其培養(yǎng)需要依賴一定比例的鹽分。而這些鹽分的存在將使得后續(xù)的色譜分離的效果變差。在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用無(wú)水硫酸鈉干燥過的甲醇進(jìn)行脫鹽處理，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員也可采用其它常規(guī)手段(如sephedexG-15、G-25、LH-20、大孔吸附樹脂、離子交換樹脂等)進(jìn)行脫鹽處理。本發(fā)明另一方面還提供了一種農(nóng)藥組合物，所述組合物包含本發(fā)明上述的化合物作為活性組分，以及農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述組合物含有權(quán)利要求1中所述的化合物的粗提物。本發(fā)明的所述農(nóng)藥組合物可用來(lái)防治菌核病、灰霉病、白粉病、紋枯病、赤霉病、白葉枯病、稻瘟病、立枯病、白銹病、霜霉病、斑枯病、葉霉病、早疫病、黑斑病等植物病害。因此，本發(fā)明另一方面還涉及一種防治植物病害、尤其是菌核病、灰霉病、白粉病、紋枯病、赤霉病、白葉枯病、稻瘟病、立枯病、白銹病、霜霉病、斑枯病、葉霉病、早疫病、黑斑病等植物病害的方法，該方法包括將本發(fā)明所述的化合物或農(nóng)藥組合物施加到所述植物上的步驟。所述化合物或農(nóng)業(yè)組合物可以直接以發(fā)酵液形式施用，也可將其適當(dāng)稀釋(例如稀釋10倍、IOO倍、IOOO倍或更高)以稀釋液形式施用。本發(fā)明的化合物或其組合物可以施加到植物的根、葉、莖等部位上。施加方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，例如可以是在播種時(shí)浸種，移栽前將植物根部浸在發(fā)酵液或其稀釋液中，或者直接將發(fā)酵液或稀釋液潑澆在苗床上?？啥ㄖ矔r(shí)進(jìn)行灌根，也可在植物生長(zhǎng)過程中灌根。如果所述農(nóng)藥組合物是以載體形式保存的，則可在臨用前用水稀釋后再進(jìn)行施加。至于本發(fā)明的最適施藥劑量，本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需經(jīng)過過多試驗(yàn)即可確定。圖1顯示了本發(fā)明獲得的3個(gè)新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物Macrolactin0、P禾口Q的化學(xué)結(jié)構(gòu)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:海洋芽孢桿菌5flci7/附wa/vVi附B-9987的培養(yǎng)本實(shí)施例提供了利用海洋芽孢桿菌BacZ//^B-9987來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生3個(gè)新大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P和Q的方法。海洋芽孢桿菌5ocz7/mw"r/m^B-9987生長(zhǎng)用的培養(yǎng)基可以是如下組成葡萄糖0.1%~1%、蔗糖0.1%~2%、酵母粉0.01%~1.5%、蛋白粉0.1%~1%、MgCl20.001%~0.1%、KC10.01%~0.5%、KH2P040.01%0.5%禾卩NaCl0.1%~6%、pH6.0~7.0。海洋芽孢桿菌man'm^sB-9987的培養(yǎng)條件可以如下在搖瓶或發(fā)酵罐中，溫度控制在2035。C之間；轉(zhuǎn)速控制在100rpm之上；如果是發(fā)酵罐培養(yǎng)，氣液比和罐壓可以分別控制在1:1和0.05MPa。在培養(yǎng)過程中，可以采用豆油或泡敵等消泡劑進(jìn)行消泡。培養(yǎng)時(shí)間控制在96h200h之間，此時(shí)菌體大部分是芽孢狀態(tài)即可結(jié)束培養(yǎng)。此時(shí)的B-9987發(fā)酵液中，含有大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P和Q。實(shí)施例2:從海洋芽孢桿菌5化i7/"smflr!7i附B-9987發(fā)酵液中分離新大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P、Q本實(shí)施例通過常規(guī)的分離手段從實(shí)施例1中得到的海洋芽孢桿菌Sa"7/wB-9987發(fā)酵液中獲得了新大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P禾口Q。具體分離純化步驟如下(1)根據(jù)實(shí)施例1所述，海洋芽孢桿菌Sac///^man'"MB-9987在合適的條件下培養(yǎng)得到發(fā)酵液。(2)培養(yǎng)液離心(4000rpm)得到的發(fā)酵上清液經(jīng)薄膜蒸發(fā)得到濃縮液，再減壓蒸發(fā)至干。用無(wú)水Na2S04干燥過的甲醇脫鹽，得到的甲醇溶液減壓蒸發(fā)至干，再溶于1000ml水中。分別用500mlx4的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液蒸干，分別得到石油醚部分(4.0g)、乙酸乙酯部分(5.0g)和正丁醇部分(20.0g)。(3)乙酸乙酯萃取部分上硅膠柱層析用乙酸乙酯/石油醚1%100%梯度洗脫，分別收集20%60%乙酸乙酯/石油醚洗脫部分(簡(jiǎn)稱A部分，0.7g)和70%100%乙酸乙酯/石油醚洗脫部分(簡(jiǎn)稱B部分，0.6g)。(4)對(duì)A部分用SephadexLH-20分別用100。/。甲醇和氯仿:甲醇(1:1)進(jìn)行洗脫，收集氯仿:甲醇洗脫部分上反相硅膠柱(ODS)，以70%甲醇水溶液洗脫得到A-l和A-2兩部分，A-l用HPLC制備得到化合物MacrolactinO(制備條件為60%甲醇水溶液)；A-2再用HPLC制備得到化合物MacrolactinP(制備條件為70n/。甲醇水溶液)。對(duì)B部分用SephadexLH-20分別用100n/。甲醇和氯仿:甲醇(l:l)系統(tǒng)洗脫，收集氯仿:甲醇洗脫部分上硅膠柱色譜分離，收集氯仿:甲醇(10:1.5)部分，再用HPLC制備得到化合物MacrolactinQ(制備條件為70%甲醇水溶液)。實(shí)施例3新大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P和Q的結(jié)構(gòu)鑒定和分析(1)MacrolactinO的結(jié)構(gòu)鑒定和分析本實(shí)施例將獲得的MacrolactinO進(jìn)行分析和鑒定，其結(jié)果如下MacrolactinO為無(wú)色油狀，UV254nm下紫色暗斑，茴香醛顯色劑顯墨綠色。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表2:MacrolactinP的&、"CNMR數(shù)據(jù)表(DMSO-d6)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(3)MacrolactinQ的結(jié)構(gòu)鑒定和分析本實(shí)施例將獲得的MacrolactinQ進(jìn)行分析和鑒定，其結(jié)果如下MacrolactinQ為無(wú)色油狀，UV254nm下紫色暗斑，茴香醛顯色劑顯粉紅色。[a]D25—56.90(c0.2,MeOH);IR(KBr)vmax(cm-1):3374,2924,2854,1705，1639,16001420，1191,1080。HRFABm/z565.3005[M+l]+表3:MacrolactinQ的&、"CNMR數(shù)據(jù)表(DMSO-d6)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例4:MacrolactinO、P、Q對(duì)交鏈孢和稻瘟霉的抑制活性本實(shí)施例考察了本發(fā)明實(shí)施例分離得到的MacrolactinO、P、Q對(duì)交鏈孢(爿/^77flWaso/a"/)和稻瘟霉(/V^cw/an'flo^zae)的抑制活性。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)大量的抗真菌和抗腫瘤化合物有明顯的致稻瘟霉菌絲彎曲作用或抑制發(fā)芽管生長(zhǎng)作用，說明化合物使稻瘟霉分生孢子或菌絲形態(tài)生長(zhǎng)異常(巻曲、膨脹、菌絲分枝過多或念珠狀等)或生長(zhǎng)抑制與其抗真菌、抗腫瘤活性之間存在一定的相關(guān)性。并且日本東京大學(xué)(KobayashiH，JAntibiotics,1996，49(9):873-879)建立了以觀察稻瘟霉的分生孢子或菌絲形態(tài)生長(zhǎng)異?；蛏L(zhǎng)抑制為指標(biāo)的簡(jiǎn)易微管活性測(cè)試體系。利用此模型，成功地篩選出多種具有抗有絲分裂、抗真菌活性的新化合物，并進(jìn)一步開發(fā)成抗腫瘤和抗真菌的新藥。因此，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外普遍采用稻瘟霉模型來(lái)初步篩選一些抗真菌、抗腫瘤的活性藥物。本實(shí)施例采用的稻瘟霉篩選模型如下將稻瘟霉接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28t:培養(yǎng)1014d，收集分生孢子，每支加入10mL無(wú)菌水使之混勻，過濾除掉菌絲體，濾液中加300pL沙氏液體培養(yǎng)基，混勻，以每孔50(iiL的量加入到96孔平板各孔中。將待測(cè)物質(zhì)50pL加入到96孔板的第l行各孔中(從第l列開始，以第ll列作空白對(duì)照，第12列作陽(yáng)性對(duì)照)，每列從第l行開始依次倍半稀釋到最后一孔(即第8L)，然后于28。C培養(yǎng)1424h，在倒置顯微鏡下觀察孢子生長(zhǎng)情況以及菌絲形態(tài)變化，計(jì)算最小抑制活性濃度(MIC)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MacrolactinO對(duì)交鏈孢和稻瘟霉的MIC分別為35.2pg/mL和12.0|ig/mL;MacrolactinP對(duì)交鏈孢和稻瘟霉的MIC分別為21.8pg/mL和36.6ng/mL;MacrolactinQ對(duì)交鏈孢和稻瘟霉的MIC分別為27.2pg/mL和36.3|ig/mL。由此可知，本發(fā)明獲得的所述新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P、Q有可能被開發(fā)成抗真菌、抗腫瘤的藥物。實(shí)施例5:含有新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P和Q的粗提物對(duì)植物病原菌的抑制活性本實(shí)施例采用平板拮抗法考察含有MacrolactinO、P、Q的粗提物對(duì)植物病原菌的抑制活性。本實(shí)施例測(cè)定所用的物質(zhì)為實(shí)施例2中得到的A部分和B部分的混合物。本實(shí)施例采用的平板拮抗法如下PDA培養(yǎng)基融化后冷卻至45t，以l:100倒入植物病原菌孢子或活菌懸浮液(濃度為1100xl()S個(gè)/mL)，混勻后傾倒到平皿中，每皿約25mL。冷卻后，用打孔器打孔(直徑7mm)，再用冷卻至適當(dāng)溫度的PDA培養(yǎng)基封底，每孔加入50)il上述A和B的混合物，25i:培養(yǎng)3天，測(cè)量抑菌圈大小，以未接菌的培養(yǎng)液作為對(duì)照。其結(jié)果如下表4("+"表示有抑制活性，加號(hào)越多，表示抑制活性越強(qiáng))表4:對(duì)植物病原菌的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表4的抑制活性結(jié)果可知，含有新大環(huán)內(nèi)酯類MacrolactinO、P和Q的實(shí)施例2中得到的A部分和B部分的粗提混合物不僅可有效抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，而且其抑菌譜廣。因此含有MacrolactinO、P和Q的粗提物有可能被開發(fā)成廣譜的生物農(nóng)藥。盡管上面己經(jīng)描述了本發(fā)明的具體例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。權(quán)利要求1.二十四元環(huán)內(nèi)酯類化合物，所述化合物選自具有以下結(jié)構(gòu)的化合物2.—種制備權(quán)利要求1所述的化合物的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)保藏號(hào)為CGMCCNo.2095的海洋芽孢桿菌5a"7/wman'"^B-9987;(b)從步驟(a)得到的發(fā)酵液獲得上清液；(c)從所述上清液中分離獲得所述化合物。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中，從所述上清液獲得所述化合物的步驟包括(cl)依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取所述上清液，分別減壓濃縮，將乙酸乙酯萃取部分上硅膠柱層析，用乙酸乙酯/石油醚1%100%梯度洗脫，分別收集20%60%乙酸乙酯/石油醚洗脫部分和70%100%乙酸乙酯/石油醚洗脫部分；(c2)將20X60。/。乙酸乙酯/石油醚洗脫部分用SephadexLH-20分別用100%甲醇和1:1的氯仿:甲醇進(jìn)行洗脫，收集氯仿:甲醇洗脫部分上反相硅膠柱以70%甲醇水溶液洗脫，得到A-l和A-2兩部分，A-l部分在制備條件為60%甲醇水溶液下用HPLC制備得到化合物Macrolactin0;A-2部分在制備條件為70%甲醇水溶液下用HPLC制備得到化合物MacrolactinP;(c3)對(duì)70%100%乙酸乙酯/石油醚洗脫部分用SephadexLH-20分別用100%甲醇和1:1的氯仿:甲醇系統(tǒng)洗脫，收集氯仿:甲醇洗脫部分上硅膠柱色譜分離，收集氯仿:甲醇(10:1.5)部分，在制備條件為70Q/o甲醇水溶液下用HPLC制備得到化合物MacrolactinQ。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(cl)中，還包括在用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取前，對(duì)上清液進(jìn)行脫鹽處理。5.—種農(nóng)藥組合物，其特征在于，所述組合物包含權(quán)利要求1所述的化合物作為活性組分，以及農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。6.權(quán)利要求l所述的化合物在作為農(nóng)藥中的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述農(nóng)藥用于防治選自菌核病、灰霉病、白粉病、紋枯病、赤霉病、白葉枯病、稻瘟病、立枯病、白銹病、霜霉病、斑枯病、葉霉病、早疫病、黑斑病的植物病害。8.—種防治植物病害的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求5所述的物質(zhì)施加到所述植物上。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物病害選自菌核病、灰霉病、白粉病、紋枯病、赤霉病、白葉枯病、稻瘟病、立枯病、白銹病、霜霉病、斑枯病、葉霉病、早疫病、黑斑病。全文摘要本發(fā)明涉及3個(gè)新的二十四元環(huán)內(nèi)酯類化合物MacrolactinO、P、Q及其制備方法和應(yīng)用。所述化合物是從海洋芽孢桿菌BacillusmarinusB-9987培養(yǎng)液中提取分離得到的。這3個(gè)化合物對(duì)稻瘟霉和交鏈孢均有明顯的抑制作用，并且含有該類化合物的粗提物能有效地抑制植物病原菌的生長(zhǎng)。文檔編號(hào)C07H17/08GK101333206SQ20071004279公開日2008年12月31日申請(qǐng)日期2007年6月27日優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日發(fā)明者張久明,張道敬,李元廣,林文翰,黎田,薛春美,立鄭,魏鴻剛申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第一海洋研究所;北京大學(xué);華東理工大學(xué)