專利名稱：一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬提純蛋白酶抑制劑的方法，特別是涉及一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑 的方法。
背景技術(shù)：
半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)廣泛分布于植物、細(xì)菌、病毒、原生動物和哺乳動 物體內(nèi)，早在20世紀(jì)60年代末，F(xiàn)ossum和Whitake就已從雞蛋清中分離得到半胱氮酸蛋 白酶抑制劑，并發(fā)現(xiàn)其具有抑制無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及二肽酶的活力。
半胱氨酸蛋白酶抑制劑除了獨特的抑制半胱氨酸蛋白酶的活性，形成有力的、非共價 結(jié)合的競爭性抑制外，動物體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑還參與各種生理和病理過程，如 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎衰竭、骨質(zhì)疏松癥、感染與免疫、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等。植物半胱氨酸 蛋白酶抑制劑具有很好的生物防御作用，可抑制致病真菌，如赤霉菌、稻瘟病菌等的生長， 其作用機制可能與半胱氨酸蛋白酶抑制劑抑制了半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶的水解作用有關(guān)，有 些半胱氨酸蛋白酶抑制劑本身就是植物對害蟲及病原體侵染的一種天然防御體系，因此， 植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑在植物防治病蟲方面將有廣泛的應(yīng)用前景。
目前，分離純化半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法包括粗分離和精制分離，其中粗分離包 括鹽析法、等電點沉淀法、有機溶劑分級分離法等，精制分離包括凝膠過濾、離子交換層 析、吸附層析、疏水層析以及共價層析等。盡管這些方法都有一定的優(yōu)點，但都存在操作 繁瑣、樣品活性回收率低、純化效果不理想等缺點，尤其是從大體積的稀溶液中提取少量 的生物活性物質(zhì)時。
親和膜色譜技術(shù)的應(yīng)用可使蛋白質(zhì)純化倍數(shù)提高，而且具有選擇特異性好、壓降小、 耗時短、生物大分子在分離過程中變性幾率小、允許較快的加料速度、可以重復(fù)利用有效 降低成本等特點，與柱親和色譜相比，更易實現(xiàn)規(guī)?；兓蛛x。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用先進的親和膜色譜技術(shù)快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑 的方法，該方法快速、簡便、分離量大、提取的酶抑制劑活性好，適用于規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，包括下列步驟 (1)活化后的尼龍膜，浸入殼聚糖溶液中，室溫反應(yīng)后，80-9(TC烘干，用1vo1.g/o醋 酸和去離子水沖，進行尼龍膜的改性；(2) 改性后的尼龍膜浸入0.05M Tris—HCl緩沖液(含激活劑)中，保溫30-50min 后，加入木瓜蛋白酶溶液和交聯(lián)劑戊二醛溶液，調(diào)pH值，繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)，冷卻，用 去離子水和0.05MTris—HCl緩沖液充分洗滌，得木瓜蛋白酶為配基的尼龍親和膜；
(3) 乙酸鈉緩沖液中的土豆汁，上樣于尼龍親和膜，Tris—HCl緩沖液沖洗后，用尿 素洗脫，得到半胱氨酸蛋白酶抑制劑；
(4) 測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。
所述的尼龍膜活化是指尼龍膜在25-3(TC 1MHC1中水解后，用甲醛進行活化； 所述的殼聚糖溶液是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的殼聚糖溶液(以Wol.。/。醋酸溶解)； 所述的木瓜蛋白酶溶液是0.5mg/ml 15mg/ml，優(yōu)選8mg/ml 12mg/ml; 所述的戊二醛濃度為0.083% 1%，優(yōu)選0.4% 0.6%; 所述的pH值為5.0 10.0，優(yōu)選pH8.5 10.0; 所述的溫度是指15。C 55。C，優(yōu)選4(TC 50。C; 所述的反應(yīng)時間是1-10小時，優(yōu)選6小時；
所述的乙酸鈉緩沖液是指0.005M 0.4mol/L， pH 5.0 6.0的乙酸鈉緩沖液；
所述的土豆汁濃度是1.0 5.0mg/ml;
所述步驟(3)中的Tris—HCl緩沖液是指0.05M、 pH 7.0;
所述的尿素是指4M尿素。
本發(fā)明的有益效果
(1) 本發(fā)明的方法操作簡單，耗時較少，純化倍數(shù)和酶活性較高；
(2) 樣品來源方便，便于大規(guī)模提取純化。


圖1為利用尼龍親和膜從土豆汁中分離純化半胱氨酸蛋白酶抑制劑的吸附洗脫曲線；
圖2為交聯(lián)劑戊二醛反應(yīng)濃度曲線；
圖3為反應(yīng)pH的曲線；
圖4為反應(yīng)溫度曲線； 圖5為反應(yīng)時間曲線； 圖6為木瓜蛋白酶加入量反應(yīng)曲線。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一歩闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明
而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限
定的范圍。
實施例1
尼龍膜的活化和鍵合殼聚糖進行改性，具體歩驟如下
(1) 尼龍膜先在25'C lMHCl中水解24h，然后用甲醛進行活化。IO張水解的尼龍膜 浸入20ml甲醛溶液(〉36.5wt.%)，加入0.2ml磷酸(85wt.%)，于60。C反應(yīng)7h， 40-50'C熱水水洗多次。
(2) 將上述甲醛活化的尼龍膜，浸入10 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的殼聚糖溶液(以lvol.% 醋酸溶解)，室溫反應(yīng)lh，然后轉(zhuǎn)入8(TC烘箱，lh后取出，分別用lvol.。/。醋酸和 去離子水洗去未反應(yīng)的殼聚糖。尼龍膜上的殼聚糖含量可按茚三酮的方法進行測試。
實施例2
以木瓜蛋白酶為配基的尼龍親和膜的制備，具體歩驟如下
上述改性的尼龍膜浸入21ml 0.05M Tris—HC1緩沖液(含0.05M的L一cysteine和 0.02M的EDTA， pH8.0)中，在35。C水浴中保溫30min，然后加入9ml (10mg/ml)木瓜蛋 白酶溶液(pH8.0)和0.6ml (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%)戊二醛溶液，繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)8h后冷 卻，依次用去離子水和0.05MTris—HCl緩沖液(pH8.0)充分洗滌，直到洗滌液呈無色為 止，保存于0.05 M Tris—HCl緩沖液(pH 8.0)。
實施例3
以木瓜蛋白酶為配基的尼龍親和膜的條件優(yōu)化，具體歩驟如下
(1) 交聯(lián)劑戊二醛的濃度的確定。稱取5組各0.35g (干質(zhì)量，下同)殼聚糖改性的 尼龍膜，加入21mlTris—HCl緩沖液(含0.05M的L—cysteine和0.02M的EDTA， pH8.0)， 35。C水浴保溫30min，加入9ml(10mg/ml)木瓜蛋白酶溶液(pH8.0)，分別加入O.lml， 0.3ml， 0.6ml， 0.9ml， L2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液，35t:水浴振蕩反應(yīng)8h。測定酶的活 力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)戊二醛的濃度為0.5%時，酶活達(dá)到最高。
(2) 反應(yīng)pH值的確定。稱取6組各0.35g改性尼龍膜，加入的緩沖液和酶液的pH 值分別為5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， 10.0，進行固定，并測定酶的活力。當(dāng)反應(yīng)體系的pH 值為9.0時，酶活最高。
G)反應(yīng)溫度的確定。稱取5組各0.35g改性尼龍膜，分別在15°C， 25°C， 35°C， 45°C，
55"水浴振蕩進行固定，并測定酶的活力。反應(yīng)溫度在45'C時，酶的活性達(dá)到最高。
(4) 反應(yīng)時間的確定。稱取6組各0.35g改性尼龍膜，分別水浴反應(yīng)lh, 4h， 6h， 8h， 10h， llh迸行固定，測定酶的活力。最適的反應(yīng)時間選擇在6h。
(5) 給酶量的確定。稱取5組各0.35g改性尼龍膜，分別加入濃度為0.5mg/ml， 1 mg/ml' 5mg/ml， 10mg/ml， 15mg/ml (pH9.0)的木瓜蛋白酶溶液進行固定，并測定酶的 活力。最適的給酶量選擇在10mg/ml。
實施例4
以干酪素為底物的紫外分光光度法酶活的表征，具體歩驟如下
游離酶活力的測定將木瓜蛋白酶溶解在0.05MTris—HCl緩沖液(pH8.0)中，制成 濃度為0.2mg/ml的溶液。取O.lml的上述酶液，加入0.7ml0.05M Tris—HCl緩沖液(pH 8.0)， 再加入0.2ml的木瓜蛋白酶激活劑(上述緩沖液內(nèi)含0.5M的L一cysteine和0.02M的 EDTA， pH8.0) 35。C保溫恒定，加入同樣預(yù)熱的1% (W/V)酪蛋白溶液(上述緩沖液配 制)lml， 35。C反應(yīng)15mim，加入3ml5X三氯乙酸(TCA)溶液終止反應(yīng)(對照組實驗先 加TCA后加底物)。靜置，8000轉(zhuǎn)/分離心20min，取濾液于280nm波長下比色。
固定酶活力的測定在一定量的固定化酶膜中加入1.6ml上述緩沖液，加入0.4ml木 瓜蛋白酶激活劑，按上述方法測定固定化酶的活力。
實施例5
利用尼龍親和膜從土豆汁中分離純化半胱氨酸蛋白酶抑制劑，具體歩驟如下-
15張尼龍親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入緩沖液和洗脫液，首先以0.05 M、 pH為7.0的Tris—HCl緩沖液平衡15 min，流速為1.0 ml/min，隨后以蠕動泵送入 35 ml的1.0 mg/ml的土豆汁通過膜橋，然后以0.05 M、 pH 7.0的Tris—HCl緩沖液洗去 未吸附上的蛋白質(zhì)；最后以4M的尿素進行洗脫，得到目標(biāo)蛋白質(zhì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑。
權(quán)利要求
1.一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，包括下列步驟(1)活化后的尼龍膜，浸入殼聚糖溶液中，室溫反應(yīng)后，80-90℃烘干，用1vol.％醋酸和去離子水沖，進行尼龍膜的改性；(2)改性后的尼龍膜浸入0.05M Tris-HCl緩沖液(含激活劑)中，保溫30-50min后，加入木瓜蛋白酶溶液和交聯(lián)劑戊二醛溶液，調(diào)pH值，繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)，冷卻，用去離子水和0.05M Tris-HCl緩沖液充分洗滌，得木瓜蛋白酶為配基的尼龍親和膜；(3)乙酸鈉緩沖液中的土豆汁，上樣于尼龍親和膜，Tris-HCl緩沖液沖洗后，用尿素洗脫，得到半胱氨酸蛋白酶抑制劑；(4)測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所 述的尼龍膜活化是指尼龍膜在25-30°C 1 MHC1中水解后，用甲醛進行活化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所 述的殼聚糖溶液是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的殼聚糖溶液，以lvol.M醋酸溶解。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所 述的反應(yīng)是0.5mg/ml 15mg/ml木瓜蛋白酶溶液，0.083% 1 %戊二醛，pH值5.0 10.0， 15。C 55。C反應(yīng)1-10小時。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所 述的反應(yīng)是8mg/ml 12mg/ml木瓜蛋白酶溶液，0.4% 0.6%戊二醛，pH8.5 10.0， 4CTC 5(TC反應(yīng)6小時。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所 述的乙酸鈉緩沖液是指0.005M 0.4mol/L， pH 5.0 6.0的乙酸鈉緩沖液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所 述的土豆汁濃度是1.0 5.0mg/ml。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所 述頻(3)中的Tris—HCl緩沖液是指0.05M、 pH7.0。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于所 述的尿素是指4M尿素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速提純半胱氨酸蛋白酶抑制劑的方法，步驟包括(1)尼龍膜的活化和鍵合殼聚糖進行改性；(2)制備木瓜蛋白酶為配基的尼龍親和膜；(3)利用尼龍親和膜從土豆汁中大量分離純化半胱氨酸蛋白酶抑制劑；(4)測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計算純化倍數(shù)。該方法快速、簡便、分離量大、提取的酶抑制劑活性好，適用于規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號C07K14/81GK101100484SQ20071004188
公開日2008年1月9日 申請日期2007年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日
發(fā)明者朱利民, 聶華麗, 蘇賽男, 陳天翔 申請人:東華大學(xué)