4年12月9日，所述菌株 分類命名為：灰樹花GrT· 01 (Griflola frondosa) 〇
[0031] GrT· 01 (Griflola frondosa)的形態(tài)特征： 菌絲在roA和馬鈴薯半組合培養(yǎng)基上生長旺盛，濃密，白色，絨毛狀至絮狀，菌落厚;微 觀特征包括多數(shù)為簡單分隔、少數(shù)為節(jié)狀分隔的薄壁菌絲、厚壁的纖維菌絲。
[0032] 實(shí)施例1菌株的篩選與鑒定 1、產(chǎn)酶菌株的篩選 本發(fā)明是自京東地區(qū)板栗產(chǎn)區(qū)采集十余株灰樹花菌篩選產(chǎn)灰樹花多糖的生產(chǎn)菌株，將 在roA和馬鈴薯半組合培養(yǎng)基上生長旺盛，濃密，白色的菌絲挑取培養(yǎng)用于灰樹花多糖的發(fā) 酵生產(chǎn)，菌株經(jīng)鑒定后冷藏保存于PDA培養(yǎng)基中。具體步驟如下： 將自京東地區(qū)板栗產(chǎn)區(qū)采集十余株灰樹花菌接種于roA和馬鈴薯半組合培養(yǎng)基上，置 于25°C~30°C下培養(yǎng)5~15天，選取生長旺盛的菌絲，獲得的發(fā)酵菌株挑選產(chǎn)多糖含量最高 的一株經(jīng)鑒定為Griflola frondosa，命名為Griflola frondosa GrT.Olo [0033] 2、GrT.01(Griflola frondosa)的形態(tài)特征： 菌絲在roA和馬鈴薯半組合培養(yǎng)基上生長旺盛，濃密，白色，絨毛狀至絮狀，菌落厚;微 觀特征包括多數(shù)為簡單分隔、少數(shù)為節(jié)狀分隔的薄壁菌絲、厚壁的纖維菌絲。
[0034] 3、菌株的基因組學(xué)鑒定 鑒定步驟：1)、真菌基因組提取 用三博遠(yuǎn)志真菌基因組提取試劑盒提取基因組。說明書見三博遠(yuǎn)志網(wǎng)站 2) 、通用引物擴(kuò)增ITS序列 常用引物 ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC 35UL體系，55°C退火溫度，35cycle 3) 、純化PCR產(chǎn)物 用真菌膠回收試劑盒純化。
[0035] 4)、DNA測序獲得ITS序列 純化產(chǎn)物送測序。
[0036] 5)、與數(shù)據(jù)庫中已知真菌比較獲得樣品種屬信息 測序結(jié)果可信區(qū)域NCBI進(jìn)行比對。
[0037] 6)、選取近似菌種序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 將獲得的序列用MEGA4軟件進(jìn)行構(gòu)建，采用Neighbor-Joining法的Complete Deletion模式，Bootstrap進(jìn)行檢驗(yàn)，并重復(fù)1000次。
[0038] 圖1是菌種系統(tǒng)發(fā)育樹。分析結(jié)果見表1，結(jié)果表明菌種為Grifola frondosa。
[0039] 表1鑒定結(jié)果 實(shí)施例2對篩選獲得的菌株GrT. 01進(jìn)行發(fā)酵灰樹花菌絲體的最適條件的實(shí)驗(yàn)測定： 1)對發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的選擇測定實(shí)驗(yàn)： 首先，設(shè)置為10個實(shí)驗(yàn)組，其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中除碳源外，均在氮源 為麩皮汁，pH值為6，KH2P〇4和MgS〇4質(zhì)量百分比濃度分別為0.3%和0.15%，生長因子0.2% 和溫度為25°C條件下進(jìn)行發(fā)酵，單獨(dú)碳源分別用質(zhì)量百分比濃度為2%的葡萄糖、蔗糖、可溶 性淀粉、玉米淀粉、玉米粉、土豆泥，復(fù)合碳源在葡萄糖濃度2%基礎(chǔ)上分別添加2%濃度的可 溶性淀粉、玉米粉、玉米淀粉、土豆泥。
[0040] 上述十個實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束之后，分別測定各實(shí)驗(yàn)組菌絲體生物量，試驗(yàn)不同 碳源對生物量的影響。如圖2所示，結(jié)果表明，添加復(fù)合碳源葡萄糖和玉米粉的一組相比于 其他組生物量顯著提高，因此選擇葡萄糖和玉米粉為最佳碳源。
[0041] 2)對發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的選擇測定實(shí)驗(yàn)： 首先，設(shè)置為四個實(shí)驗(yàn)組，其中發(fā)酵培養(yǎng)基中除氮源外，均在碳源為葡萄糖2%、玉米粉 3%，pH6，KH2P〇4和MgS〇4質(zhì)量百分比濃度分別為0.3%和0.15%，生長因子0.2%和溫度為25°C條 件下進(jìn)行發(fā)酵，所述氮源分別為〇. 3 %的蛋白胨和酵母粉，3%麩皮汁，1.5%黃豆粉。
[0042] 上述四個實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束之后，分別測定各實(shí)驗(yàn)組菌絲體生物量，試驗(yàn)氮源 對生物量的影響。如圖3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加麩皮汁的實(shí)驗(yàn)組生物量最高。添加酵母粉和蛋 白胨的實(shí)驗(yàn)組相近，但酵母粉比蛋白胨價格更低一些，因此最佳氮源選擇麩皮汁和酵母粉。 [0043] 3)無機(jī)鹽濃度對產(chǎn)酶的影響： 首先，設(shè)置為五個實(shí)驗(yàn)組，其中，所述五個實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵培養(yǎng)基除KH2P〇4和MgS〇4濃度 外，pH值為6，均在碳源葡萄糖2%和玉米粉3%，氮源麩皮汁3%，酵母粉0.3%在25°C條件下進(jìn) 行，所述五個實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵培養(yǎng)基中KH 2P〇4和MgS〇4濃度(w/v)依次為0.1 %和0.05%、0.15 % 和0.075%、0.2%%和0.1%、0.3%和0.15%、0.4%和0.2%，培養(yǎng)7d后測定菌絲體生物量，試驗(yàn)無 機(jī)鹽濃度對生物量的影響。如圖4所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該菌生物量在KH 2P〇4和MgS〇4濃度為 0.3%和0.15%下最高，選取KH2P〇4和MgS〇4濃度為0.3%和0.15%作為發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。
[0044] 實(shí)施例3所述產(chǎn)灰樹花多糖的菌株用于產(chǎn)灰樹花多糖的方法，包括以下步驟:制 備種子液:將篩選得到的菌株GrT.01接種于種子培養(yǎng)基，在23~28°C下發(fā)酵5~8d到達(dá)對數(shù)生 長期，停止發(fā)酵，獲得種子液； 菌株大量繁殖:將所述種子液接種于一次發(fā)酵培養(yǎng)基后，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基在pH為4 ~8和溫度為23~28°C的條件下進(jìn)行連續(xù)5~8d發(fā)酵，從而使所述菌株進(jìn)行大量繁殖生產(chǎn)多糖。 發(fā)酵完成后灰樹花生物量37g/L(干重），其中多糖含量達(dá)到17%。
[0045] 圖5為本發(fā)明所述菌株在不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物量比較圖。圖6 為本發(fā)明所述采集菌株不同多糖含量的對比測定圖。圖7是灰樹花菌種的平板型態(tài)和發(fā)酵 菌球形態(tài)圖。由圖5-7可以看出本發(fā)明所獲得菌株生物量和多糖含量較高，菌球均一密實(shí)， 是一株可以應(yīng)用于大工業(yè)生產(chǎn)的菌株。
[0046]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列 運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細(xì)節(jié)和這里示出的實(shí)施例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 產(chǎn)灰樹花多糖的菌株，其特征在于，保藏號為:CGMCC No.10116，保藏日期為:2014年 12月9日，所述菌株分類命名為:灰樹花GrT.01(Griflola frondosa)。2. 利用權(quán)利要求1所述的菌種生產(chǎn)灰樹花多糖的方法，其特征在于：將CGMCCΝ ο . 10116菌種制成種子，接種于含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和水的培養(yǎng)基(pH為4~8)中，在23~28°C 條件下連續(xù)發(fā)酵6~14天。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在灰樹花多糖生產(chǎn)階段，生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的 碳源為葡萄糖和土豆汁或玉米粉，氮源為麩皮汁和酵母粉，無機(jī)鹽的磷酸二氫鉀和硫酸鎂 的配比為2:1，生長因子VBi在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為8-10mg/L。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟： 1) 種子液制備階段:利用如權(quán)利要求1或2所述的菌株制備種子液； 2) 菌種繁殖階段:將所述種子液接種于一次發(fā)酵培養(yǎng)基后，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基在pH 為4~8和溫度為23~28°C的條件下進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵； 3) 灰樹花多糖生產(chǎn)階段：向所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基中添加玉米粉和麩皮汁，配制成生產(chǎn) 發(fā)酵培養(yǎng)基，在23~28°C條件下連續(xù)發(fā)酵6~14天。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:碳源、氮源、無 機(jī)鹽和生長因子。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖或玉米 粉，所述氮源為麩皮汁和酵母粉。7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖和玉米粉的質(zhì) 量百分比濃度各為1~6%。8. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，生長因子在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基 中的濃度為8-10mg/L，無機(jī)鹽在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為0.01-0.5%。9. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基和所述生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基 pH均為4~8。10. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基和所述生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng) 基pH均為6。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產(chǎn)灰樹花多糖的菌株及其應(yīng)用，所述菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為：CGMCC？No.？10116，保藏日期為：2014年12月9日，所述菌株分類命名為：灰樹花GrT.01（<i>Griflola</i><i>？frondosa</i>）。本發(fā)明所述菌株GrT.01是從野生環(huán)境天然子實(shí)體中分離篩選獲得，菌絲體和多糖含量高，可應(yīng)用于高效生產(chǎn)灰樹花多糖。本發(fā)明所述菌株GrT.01的發(fā)酵培養(yǎng)基配料簡單，價格低廉，是工業(yè)生產(chǎn)中非常普遍容易獲得的，發(fā)酵效果顯著，使灰樹花多糖的生產(chǎn)成本大大降低，可應(yīng)用于大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)。CGMCC No. 1011620141209
【IPC分類】C12P19/04, C12R1/645, C12N1/14
【公開號】CN105441334
【申請?zhí)枴緾N201510947483
【發(fā)明人】陳利梅, 赫榮琳, 陳樹林
【申請人】中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月17日