右側(cè)的彩色編碼條中，越靠近上端說(shuō)明協(xié)同作用越強(qiáng)；
[0029]圖2為A E法評(píng)價(jià)伊曲康挫聯(lián)合苯下酸應(yīng)用協(xié)同抗耐藥白色念珠菌作用結(jié)果的= 維圖；ITC:伊曲康挫，PBA:苯下酸，X軸代表口C的濃度，Y軸代表苯下酸的濃度，Z軸代表的是 各個(gè)藥物組合下的AE值，高于或低于平面（AE = O)的值分別表示協(xié)同或括抗作用，平面周 圍的值表示無(wú)關(guān)作用，圖右側(cè)的彩色編碼條中，越靠近上端說(shuō)明協(xié)同作用越強(qiáng)；
[0030] 圖3為A E法評(píng)價(jià)伏立康挫聯(lián)合苯下酸應(yīng)用協(xié)同抗耐藥白色念珠菌作用結(jié)果的= 維圖;VRC:伏立康挫，PBA:苯下酸，X軸代表VRC的濃度，Y軸代表苯下酸的濃度，Z軸代表的是 各個(gè)藥物組合下的AE值，高于或低于平面（AE = O)的值分別表示協(xié)同或括抗作用，平面周 圍的值表示無(wú)關(guān)作用，圖右側(cè)的彩色編碼條中，越靠近上端說(shuō)明協(xié)同作用越強(qiáng)；
[0031] 圖4為氣康挫聯(lián)合PBA應(yīng)用時(shí)的抗耐藥白色念珠菌CA的時(shí)間-殺菌曲線;FLC:氣康 挫，PBA:苯下酸，X軸代表取樣時(shí)間點(diǎn)，Y軸代表用XTT方法測(cè)定的OD值；
[0032] 圖5為伊曲康挫聯(lián)合PBA應(yīng)用時(shí)的抗耐藥白色念珠菌CA的時(shí)間-殺菌曲線；ITC:伊 曲康挫，PBA:苯下酸，X軸代表取樣時(shí)間點(diǎn)，Y軸代表用XTT方法測(cè)定的OD值；
[0033 ]圖6為伏立康挫聯(lián)合PBA應(yīng)用時(shí)的抗耐藥白色念珠菌CA的時(shí)間-殺菌曲線;VRC:伏 立康挫，PBA:苯下酸，X軸代表取樣時(shí)間點(diǎn)，Y軸代表用XlT方法測(cè)定的OD值。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0035] 實(shí)施例苯下酸與=挫類(lèi)抗真菌藥物聯(lián)合抗真菌作用測(cè)定
[0036] 1.材料
[0037] 1.1藥品與試劑
[0038] 氣康挫(Fluconazole，F(xiàn)LC)，美侖生物有限公司；
[0039] 伏立康挫(Voriconazole，VRC)，美侖生物有限公司；
[0040] 伊曲康挫（Itraconazole，ITC)，美侖生物有限公司；
[0041 ]苯下酸(Pheny化Utyric acid,PBA):韶遠(yuǎn)化學(xué)科技(上海)有限公司；
[0042] 科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基，鄭州博賽生物工程有限公司；
[0043] TTC-沙保羅瓊脂，杭州天和微生物試劑有限公司；
[0044] 酵母膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；
[0045] 蛋白腺，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；
[0046] 葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；
[0047] 瓊脂粉，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；
[004引氨氧化鋼，國(guó)營(yíng)山東單縣有機(jī)化工廠，批號(hào)940420;
[0049] 憐酸二氨鐘，上海新寶精細(xì)化工廠，批號(hào)200602132;
[0050] 二甲基亞諷(DMSO)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；
[0化1] RPMI 1640原料藥粉，美國(guó)GIBCO公司；
[0052] 3-(N-嗎嘟代)丙橫酸(MOPS)，濟(jì)南朋遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司；
[0化3] 甲糞釀(Menadione)，美國(guó)Sigma公司；
[0054] XTT(二甲氧挫黃），南京旋光科技有限公司；
[0055] 乳酸林格氏液(復(fù)方氯化鋼溶液），山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司；
[0化6] 丙酬，上海振興化工一廠，批號(hào)200209510;
[0057] XTT(3,3'-[l-(苯氨酷基)-3,4-四氮挫]-二(4-甲氧基-6-硝基）苯橫酸鋼)-甲糞 釀溶液的配制：用分析天平稱取XTT粉末0.0500g，溶解于100mL已滅菌的林格氏液配成 0.5mg/ml的溶液，用0.22皿濾膜針頭濾過(guò)滅菌;加入10山的lOmmol/L的甲糞釀丙酬溶液(取 甲糞釀0.0860g溶解于5ml丙酬），使其終濃度為1皿ol/L，搖勻，4°C避光保存。
[0058] 藥物溶液:氣康挫用無(wú)菌蒸饋水溶解，伊曲康挫、伏立康挫、與苯下酸用二甲基亞 諷(DMSO)溶解，分別配成2，56化g/ml的儲(chǔ)備液，用0.22皿微孔濾膜針頭過(guò)濾，分裝到1.5ml 的無(wú)菌EP管中。所有藥液于-20°C冰箱保存，備用。
[0059] PBS(憐酸鹽緩沖液）：用北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司的PBS憐酸鹽緩沖劑(粉 劑），小包裝一袋溶于IL蒸饋水中，即配成0.01M，PH7.4的PBS憐酸鹽緩沖液，可常溫狀態(tài)下 長(zhǎng)期保存，用前121°C高溫高壓濕熱滅菌30min，冷卻備用。
[0060] RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640液體培養(yǎng)液：用天平稱取RPMI 1640(含心谷氨酷胺，不含碳酸氨鋼)粉末4.16肖，加入8.00肖分析純葡萄糖(含糖終濃度2%) 及M0PS(3-(N-嗎嘟基)丙橫酸)粉13.16g，加蒸饋水至400ml，混合均勻后，加入8.00g的碳酸 氨鋼，在22°C用lmol/1的氨氧化鋼溶液調(diào)節(jié)抑為7.0±0.1，，放入4°C的冰箱中，用前用無(wú)菌 的0.22WI1混合纖維膜過(guò)濾滅菌。
[0061 ] 1.2 儀器 AB204-N電子天平 梅特勒-托利（上海）公司 SV巨-4A1超凈工作臺(tái) 新加坡ESCO公司 的CUCELL 55恒溫培養(yǎng)箱德國(guó)MMM公司 VENTICELL %干熱滅菌箱 德國(guó)MMM公司 枯S-撕41高溫高壓滅菌器 韓國(guó)HANSH的給司 不誘鋼過(guò)濾器口 OOOml) 江蘇天和化器廠
[0062] 96孔培養(yǎng)板 美國(guó)COSTA民公司 可調(diào)戎移鞭器 Thermo Electron讓海)么司 SC-329常媼冰箱 中國(guó)海爾公司 -2〇r低溫冰柜 中國(guó)海爾公司 巧-56:胞潤(rùn)旋擺合器 美屆Si給司 Mulliscan MK3 1'郵:小化 東 W Thermo 1 油!systems 公-i ,'J
[0063] 1.3實(shí)驗(yàn)菌株
[0064] 質(zhì)控菌株：白念珠菌ATCC10231，山東大學(xué)藥理教研室惠贈(zèng)；
[0065] 實(shí)驗(yàn)菌株:省立醫(yī)院、千佛山醫(yī)院臨床分離的白色念珠菌；
[0066] 菌株鑒定:實(shí)驗(yàn)用菌株在科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基35°C下培養(yǎng)48小時(shí)，菌落呈綠 色或翠綠色的所有菌株再經(jīng)山東省疾病預(yù)防控制中屯、微生物研究室W標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)方法 鑒定為白色念珠菌。
[0067] 菌液制備:-20°C下保存的白色念珠菌室溫下解凍，接種到TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基 上，35°C培養(yǎng)24~4她，取發(fā)育良好的單一菌落再次接種，35°C培養(yǎng)2地，W保證菌株處于生 長(zhǎng)期。選取若干單個(gè)較大菌落，PBS配制成菌懸液，經(jīng)滿旋器振蕩均勻后W中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo) 準(zhǔn)管比濁，調(diào)整樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管濁度一致，此時(shí)白色念珠菌的菌濃度約為5 X IO6CFlVml，系 列稀釋即得到工作菌液，并W活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行濃度驗(yàn)證。
[006引 2.內(nèi)容與方法
[0069] 2.1氣康挫、伊曲康挫、伏立康挫單用抗白色念珠菌作用測(cè)定(MIC值測(cè)定）
[0070] 根據(jù)化SI M27-A2方案的棋盤(pán)法，WRPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋藥液使其成為4倍 工作濃度，篩選化C濃度應(yīng)用范圍。用無(wú)菌水溶解的化C終濃度為512-化g/ml，用DMSO溶解的 ITC、VRC的終濃度為16-0.0化g/ml。按濃度從低到高的順序吸取FLC、ITC、VRC藥液5化l，分 別加入96孔平板的第2~10列，第1列加入50山RPMI1640,然后加入96孔平板的第C~A行各 SOiil RPMI1640培養(yǎng)液。最后除第11、12列外各孔再分別加10化1菌液。第12列加入200^1 RPMI1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。將96孔平板置35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地后，用XTT負(fù)載后 2h，W酶標(biāo)儀測(cè)定OD值并記錄結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)S次。
[0071] 用上述方法測(cè)定苯下酸單用抗白色念珠菌作用。
[0072] 2.2氣康挫、伊曲康挫、伏立康挫與苯下酸聯(lián)合抗白色念珠菌作用測(cè)定
[0073] 根據(jù)化SI M27-A2方案的棋盤(pán)法，WRPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋藥液使其成為4倍 工作濃度，篩選PBA與化C濃度應(yīng)用范圍，即PBA的終濃度分別為64~化g/ml，化C、ITC、VRC的 終濃度分別為64~0.125iig/ml，4~0.007iig/mL、4~0.007蛇/血。按濃度從低到高的順序吸 取化C、ITC、VRC藥液50iil，分別加入96孔平板的第2~11列，按濃度從低到高的順序吸取PBA 藥液50iil，分別加入96孔平板的第G~A行，除A12外各孔再分別加10化1菌液，其余不足20化 1的孔用RPMI-1640培養(yǎng)液補(bǔ)足。其中Hl為生長(zhǎng)對(duì)照，只含菌液不含藥物，第12列為空白對(duì) 照，只含藥液不含菌液20化1 RPMI1640培養(yǎng)液。將96孔平板置35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，用XlT負(fù)載后化，W酶標(biāo)儀測(cè)定OD值并記錄結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)S次。
[0074] 2.2.1時(shí)間-殺菌曲線法
[00巧]將濃度為2，56化g/ml的氣康挫、伊曲康挫、伏立康挫和PBA儲(chǔ)備液WRPMI 1640液 體培養(yǎng)基稀釋成10倍工作濃度。
[0076] 取TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基上傳代兩次的實(shí)驗(yàn)菌株，挑取單個(gè)較大菌落，WPBS制成 菌懸液，采用中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比濁，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管濃度一致時(shí)，菌液初始濃度約 為5 X IO6CFlVml，WRPMI-1640稀釋菌液為10倍工作濃度，并通過(guò)活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行濃度驗(yàn) 證。
[0077] 取上述制備的藥液50化1加入到IOml無(wú)菌的EP管內(nèi)，再加入RPMI 1640液體培養(yǎng)基 至液體總體積為4.5ml;此時(shí)取按上述方法制備的菌液50化1加入到此4.5ml含(或不含）藥 物的培養(yǎng)基內(nèi)，震蕩混勻。本實(shí)驗(yàn)分為四組，即：生長(zhǎng)對(duì)照組(不加藥）、PBA藥物單用組、氣康 挫單用組、PBA與氣康挫聯(lián)合用藥組，共4個(gè)體系。每個(gè)體系總體積為5ml，體系內(nèi)氣康挫、PBA 的終濃度分別為化g/ml和32iig/ml，體系內(nèi)伊曲康挫、PBA終濃度分別0.12化g/ml和32iig/ ml，體系內(nèi)伏立