Bcl-XS等，而B(niǎo)d-2、Bcl-x是抗調(diào)亡蛋白。研究表明，Bcl-2/Bax蛋白的比例水平 高低與調(diào)亡調(diào)控直接相關(guān)。Bax增高，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡巧cl-2增高，抑制細(xì)胞調(diào)亡。抗調(diào)亡 蛋白Bel-2與調(diào)亡前體蛋白（如Bax、tBid)結(jié)合，形成異二聚體，調(diào)控線粒體膜的通透性， 雜合二聚體可阻止細(xì)胞色素C(cytoc虹omeC)、調(diào)亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋放入胞漿，抑制 Caspase-3的活化，而B(niǎo)ax導(dǎo)致切tC釋放，激活調(diào)亡之路，故Bd-2/Bax蛋白的比例水平高 低與調(diào)亡調(diào)控直接相關(guān)。Caspase家族是細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程中的關(guān)鍵元件，其激活與超常表達(dá)均 引起細(xì)胞調(diào)亡，因此又稱(chēng)死亡蛋白酶，可通過(guò)與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細(xì)胞調(diào)亡。在 已發(fā)現(xiàn)的14個(gè)家族成員中，Caspase-3處于調(diào)亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞調(diào)亡的關(guān)鍵 執(zhí)行者，是細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，也是多種調(diào)亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，它的活 化是調(diào)亡進(jìn)入不可逆階段標(biāo)志。
[0243] 本實(shí)驗(yàn)采用Western-blot法檢測(cè)了 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)0GD/R巧損傷大鼠原代皮層 神經(jīng)元后Bd-2、Bax和化spase-3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，4-甲氧基節(jié)醇能明顯下調(diào)Bax蛋 白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，調(diào)化spase-3的表達(dá)，從而對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡。
[0244] 6.實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0245] 4-甲氧基節(jié)醇能通過(guò)下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào) Caspase-3的表達(dá)，從而對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡。
[0246] 實(shí)驗(yàn)例4 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)原代皮層神經(jīng)元突觸的影響
[0247] 缺血性腦血管病的治療，雖然在超早期溶栓和急性期神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)研究取得了重 要進(jìn)展，但對(duì)于大多數(shù)腦缺血患者而言，神經(jīng)細(xì)胞死亡不可避免，如何積極有效地促進(jìn)腦缺 血損傷后神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)仍然是目前研究的重點(diǎn)。改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能， 尤其是對(duì)影響缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)至關(guān)重要的突觸可塑性至關(guān)重要。突觸可塑性是指神經(jīng) 系統(tǒng)的功能在外環(huán)境作用下，從神經(jīng)元到神經(jīng)環(huán)路都可能發(fā)生適應(yīng)性變化來(lái)維持其相對(duì)穩(wěn) 定。突觸可塑性包括突觸前可塑性和突觸后可塑性。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白（growth-associated p;rotein-43,GAP-43)和突觸素（Synapto地ysin，SYP)是突觸可塑性過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵蛋 白，常被作為突觸重塑的標(biāo)志物。GAP-43是與神經(jīng)發(fā)育、軸突再生、突觸重建密切相關(guān)的一 種快速轉(zhuǎn)運(yùn)憐酸蛋白，其表達(dá)產(chǎn)物主要位于軸突生長(zhǎng)錐質(zhì)膜面，可通過(guò)加速生長(zhǎng)錐基部胞 漿膜的擴(kuò)展而促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。SYP是一種巧離子結(jié)合糖蛋白，分布于神經(jīng)元突觸小泡和某些 內(nèi)分泌細(xì)胞。SYP作為突觸小泡的特異性標(biāo)志蛋白，它的密度和分布可見(jiàn)接放映體內(nèi)突觸的 數(shù)量和分布情況。因此，GAP-43和SYP可作為神經(jīng)可塑性的檢測(cè)指標(biāo)用W評(píng)價(jià)藥物干預(yù)的 效果。
[024引 1.實(shí)驗(yàn)材料[0249] 1. 1實(shí)驗(yàn)試劑
[0巧0] GAP-43 抗體 Proteintech，貨號(hào)：16971-1-AP
[0 巧 1] P-Tubulin抗體 Proteintech，貨號(hào)：10094-1_AP
[0巧2]突觸素SYPProteintech，貨號(hào)：17785-1-AP
[0253] 其他實(shí)驗(yàn)試劑同實(shí)驗(yàn)例1~3。
[0巧4] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0巧5] 2. 1 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)原代皮層神經(jīng)元OGD/Rep損傷后突觸長(zhǎng)度的影響
[0巧6] 原代皮層神經(jīng)細(xì)胞按1X106個(gè)/血接種于包被好的的6孔板中，培養(yǎng)7d后，設(shè)正 常組、模型組、給藥組：4-甲氧基節(jié)醇化125、6. 25、12. 5、25yg/mL)，成分D(0. 2、0. 4、0. 8、 1. 6yg/mL)每個(gè)給藥組設(shè)3個(gè)平行孔，正常組和模型組每孔加入等量的神經(jīng)培養(yǎng)液，培養(yǎng) 板置于C〇2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2地后造模，復(fù)制0GD/R巧損傷模型，造模結(jié)束；用倒置相差顯微鏡 觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照，在照片中選擇幾個(gè)點(diǎn)，用ImageJ軟件測(cè)量細(xì)胞突觸的長(zhǎng)度，用SPSS 統(tǒng)計(jì)。裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，用BSA法測(cè)定蛋白濃度。
[0巧7] 2. 2 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)原代皮層神經(jīng)元0GD/R巧損傷后突觸生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43、 SYP蛋白表達(dá)的影響
[0巧引細(xì)胞的接種、培養(yǎng)、造模同實(shí)驗(yàn)例2,蛋白的提取、濃度的測(cè)定同實(shí)驗(yàn)例3。
[0巧9] 3.統(tǒng)計(jì)方法
[0260] 實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果W均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差±s)表 不，方差齊者義用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊者義用Tamhane'S法檢驗(yàn)。利用ImageJ進(jìn)行圖像 處理。
[0261] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0262] 4. 1 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)原代皮層神經(jīng)元0GD/R巧損傷后突觸長(zhǎng)度的影響
[0263] 正常對(duì)照組皮層神經(jīng)細(xì)胞胞體飽滿(mǎn)，折光性好，突起較長(zhǎng)且完整伸展，細(xì)胞平鋪相 互連成網(wǎng)狀；模型組與給藥組在缺糖缺氧復(fù)糖復(fù)氧損傷后，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化明顯，胞 體折光性下降，胞體邊緣模糊，有的細(xì)胞甚至出現(xiàn)細(xì)胞壁破損，突起結(jié)構(gòu)回縮甚至斷裂，細(xì) 胞皺縮成球形（見(jiàn)附圖）。
[0264] 與模型組相比，4-甲氧基節(jié)醇干預(yù)的細(xì)胞胞體破損的較少，細(xì)胞突觸長(zhǎng)度較 模型組長(zhǎng)，細(xì)胞損傷程度較模型組小，用imageJ測(cè)量細(xì)胞的突觸長(zhǎng)度，有顯著的差異 (P<0. 05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8和表8。
[0265] 表8 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)原代皮層神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度的影響
[0266]
[0267] 注：與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義&&P<0. 01;與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義中<0. 05; 叮<0. 01。
[026引 4. 2 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)原代皮層神經(jīng)元突觸生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的影響
[0269] 4. 2. 1 4-甲氧基節(jié)醇（12. 5yg/mL)可明顯上調(diào)原代皮層神經(jīng)元0GD/R巧損傷后 GAP-43蛋白的表達(dá)
[0270]結(jié)果顯示，4-甲氧基節(jié)醇在濃度12.5yg/血濃度下，能明顯的促進(jìn)GAP-43的表 達(dá)，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<〇. 05)，在濃度3. 125yg/mL~6. 25yg/mL，25yg/mL 下，與模型組相比，有促進(jìn)GAP-43表達(dá)的趨勢(shì)，結(jié)果如圖9和10。
[027d 4. 2. 2 4-甲氧基節(jié)醇（3. 125yg/mL~25yg/mL)對(duì)原代皮層神經(jīng)元OGD/Rep損 傷后SYP蛋白表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)
[0272] 結(jié)果顯示，4-甲氧基節(jié)醇在濃度3. 125yg/mL~25yg/mL濃度范圍內(nèi)，有促進(jìn) SYP表達(dá)的趨勢(shì)，結(jié)果如圖11和12。
[0273] 5.實(shí)驗(yàn)討論
[0274] 缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)非常有限，研究表明，缺血后可見(jiàn)缺血周邊區(qū)軸突出 芽和突觸可塑性，促進(jìn)軸突出芽和突觸發(fā)生有助于神經(jīng)功能恢復(fù)。而生長(zhǎng)相關(guān)蛋白 43 (growth-associatedp;rotein43,GAP-43)和突觸素（SYPapto地ysin，SYP)作為軸突生 長(zhǎng)錐和突觸發(fā)生標(biāo)記，其表達(dá)水平常被用來(lái)放映腦梗死后神經(jīng)軸突再生和突觸發(fā)生。
[0275]SYP是一種重要的囊泡膜標(biāo)志蛋白，參與多種突觸相關(guān)活動(dòng)，如參與化化依賴(lài)性 神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程，并與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（longtermpotentiation,L1T0的誘導(dǎo)與維持有關(guān)。 顆粒樣P38免疫反應(yīng)產(chǎn)物基本上反映了被檢測(cè)區(qū)域突觸的分布和密度，作為突觸囊泡膜上 的特異性蛋白質(zhì)，研究顯示出芽神經(jīng)元表達(dá)SYP在反應(yīng)性的突觸發(fā)生過(guò)程中起作用，可作 為突觸前終末的特異性標(biāo)記物，用來(lái)檢測(cè)突觸的密度和分布。SYP不僅能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋 放，還參與神經(jīng)元極性的建立、突觸的形成W及突觸的維持作用，因此在突觸可塑性的發(fā) 生過(guò)程中具有重要作用。
[0276]GAP-43是高活性的調(diào)節(jié)蛋白，位于生長(zhǎng)錐的質(zhì)膜面，在引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)軸突 形成新的聯(lián)系上起關(guān)鍵作用。在發(fā)育早期神經(jīng)元生長(zhǎng)期，GAP-43高水平表達(dá)，但在成年期表 達(dá)水平通常較低，而在損傷等應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)。GAP-43是神經(jīng)元膜上一種特異性憐蛋 白，在腦中分布廣泛但不均一，在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)過(guò)程中，常能監(jiān)測(cè)到GAP-43在蛋白 水平上的明顯升高，在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GAP-43的表達(dá)是評(píng)估神經(jīng)元損傷后軸突再生反 應(yīng)的重要指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，4-甲氧基節(jié)醇（3. 125~25yg/mL)P<0. 05)可促進(jìn)原代皮層 神經(jīng)元0GD/R巧損傷后突觸的生長(zhǎng)，與模型組比較，4-甲氧基節(jié)醇（12. 5yg/mL) (P<0. 05) 能明顯上調(diào)GAP-43的表達(dá)，對(duì)SYP的表達(dá)有上調(diào)的趨勢(shì)。
[0277] 6.實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0278] 4-甲氧基節(jié)醇能促進(jìn)原代皮層神經(jīng)元0GD/R巧損傷后突觸的生長(zhǎng)，對(duì)突觸生長(zhǎng)相 關(guān)蛋白GAP-43和SYP的表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，可W促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，治療神經(jīng)損傷。
[0279] 綜上，4-甲氧基節(jié)醇能減輕大鼠胎鼠原代皮層神經(jīng)元0GD/R巧損傷，神經(jīng)元形 態(tài)結(jié)構(gòu)受損，提高0GD/R巧損傷皮層的存活率，減少0GD/R巧損傷皮層神經(jīng)元NO釋放，提 高細(xì)胞內(nèi)SOD的活性、抑制MDA生成；通過(guò)顯著上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白及 Caspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡；4-甲氧基節(jié)醇能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的突觸生 長(zhǎng)，上調(diào)突觸生長(zhǎng)有關(guān)蛋白，具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，可W制備成為神經(jīng)保護(hù)藥物，減輕 神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 4-甲氧基芐醇在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述神經(jīng)保護(hù)藥物是減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷、 抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、提高神經(jīng)細(xì)胞存活率和/或促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)的藥物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述藥物是以4-甲氧基芐醇為活性 成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述制劑為口服制劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于：所述口服制劑是膠囊劑、片劑。6. -種神經(jīng)保護(hù)藥物，其特征在于：它是以4-甲氧基芐醇為活性成分，加上藥學(xué)上可 接受的輔料制備而成的制劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述制劑為口服制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于：所述口服制劑是膠囊劑、片劑。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了4-甲氧基芐醇在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的用途。4-甲氧基芐醇能減輕大鼠胎鼠原代皮層神經(jīng)元OGD/Rep損傷，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)受損，提高OGD/Rep損傷皮層的存活率；減少OGD/Rep損傷皮層神經(jīng)元NO釋放，提高細(xì)胞內(nèi)SOD的活性、抑制MDA生成，且可通過(guò)顯著上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白及Caspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，可以制成神經(jīng)保護(hù)藥物，減輕神經(jīng)損傷；另一方面，4-甲氧基芐醇能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的突觸生長(zhǎng)，上調(diào)突觸生長(zhǎng)有關(guān)蛋白，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，治療神經(jīng)損傷。
【IPC分類(lèi)】A61K31/085, A61P25/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105213357
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510278057
【發(fā)明人】段小花, 李秀芳, 林青, 李艷
【申請(qǐng)人】云南中醫(yī)學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年5月27日