4-甲氧基芐醇在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及4-甲氧基節(jié)醇在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病率比較高，對(duì)患者的危害也比較大。如腦卒中是一組突然 起病，W局灶性神經(jīng)功能缺失為共同特征的急性腦血管病，死亡率能達(dá)到10%，嚴(yán)重威脅著 人類(lèi)健康。神經(jīng)保護(hù)劑治療已成為腦卒中治療的研究熱點(diǎn)，許多神經(jīng)保護(hù)劑目前正在臨床 開(kāi)發(fā)試驗(yàn)中，其作用機(jī)制在于通過(guò)阻斷由缺血所致各種有害病理過(guò)程的發(fā)生，從而防止或 局限缺血所引起的腦損害，減少腦組織死亡和促進(jìn)功能恢復(fù)。由于神經(jīng)保護(hù)劑可減少腦梗 死面積，不引發(fā)出血，無(wú)溶栓、抗凝治療出血的并發(fā)癥，用前無(wú)需進(jìn)行詳細(xì)的病因鑒別診斷， 使得早期治療成為可能，因而神經(jīng)保護(hù)劑的治療效果和前景，是令人鼓舞的然而，迄今為止 還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)已證明為安全有效的神經(jīng)保護(hù)劑，而正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的、具有潛在臨床應(yīng)用 前景的藥物有：巧通道阻滯劑（CCB)、巧通道調(diào)節(jié)劑、谷氨酸釋放抑制劑、GABA受體激動(dòng)劑、 自由基清除劑、抗細(xì)胞間黏附分子抗體、神經(jīng)保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)的藥物。
[0003] 4-甲氧基節(jié)醇，無(wú)色或微黃色液體。烙點(diǎn)23-25.5°C，沸點(diǎn)159°C，相對(duì)密度 1. 113(15/15°C)，折光率1. 5442。易溶于醇和酸，幾乎不溶于水，其化學(xué)式為：CsHi?；?，結(jié)構(gòu) 式為、/fw。目前4-甲氧基節(jié)醇通常作為食用香料食用，未見(jiàn)其用于神經(jīng)保護(hù)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供4-甲氧基節(jié)醇在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的用途。
[0005] 本發(fā)明提供了 4-甲氧基節(jié)醇在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的用途。
[0006]其中，所述神經(jīng)保護(hù)藥物是提高神經(jīng)細(xì)胞存活率、減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷、抗神經(jīng)細(xì)胞 調(diào)亡和/或促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)的藥物。
[0007]其中，所述藥物是W4-甲氧基節(jié)醇為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而 成的制劑。
[000引其中，所述制劑為口服制劑。
[0009]其中，所述口服制劑是膠囊劑、片劑。
[0010]本發(fā)明還提供了抑制神經(jīng)保護(hù)藥物，它是W4-甲氧基節(jié)醇為活性成分，加上藥學(xué) 上可接受的輔料制備而成的制劑。其中，所述制劑為口服制劑。
[0011] 其中，所述口服制劑是膠囊劑、片劑。
[001引 4-甲氧基節(jié)醇能減輕大鼠胎鼠原代皮層神經(jīng)元0GD/R巧損傷，神經(jīng)元形態(tài)結(jié) 構(gòu)受損，提高OGD/Rep損傷皮層的存活率；減少OGD/Rep損傷皮層神經(jīng)元NO釋放，提高細(xì) 胞內(nèi)SOD的活性、抑制MDA生成，且可通過(guò)顯著上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白及 Caspase-3蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡，具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，可W制成神經(jīng) 保護(hù)藥物，減輕神經(jīng)損傷；另一方面，4-甲氧基節(jié)醇能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的突觸生長(zhǎng)，上調(diào)突觸 生長(zhǎng)有關(guān)蛋白，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，治療神經(jīng)損傷。
[0013] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限 審IJ，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1皮層神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果圖片（10X40倍）。
[0015] 圖2皮層神經(jīng)元NSE鑒定結(jié)果圖（10X40倍）。
[0016] 圖3皮層神經(jīng)元MAP-2鑒定結(jié)果圖（10X40倍）。
[0017] 圖4不同濃度Na2S2〇4對(duì)皮層神經(jīng)元存活率的影響。注：與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義，*沖< 0. 01 ;不同濃度化2S204對(duì)皮層神經(jīng)元形態(tài)的影響（10X40倍）。
[0018] 圖5 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)Bax蛋白表達(dá)的Western-blot結(jié)果。
[0019] 圖6 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的Western-blot結(jié)果。
[0020] 圖7 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)化spase-3蛋白表達(dá)的Western-blot結(jié)果。
[0021] 圖8 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)原代皮層神經(jīng)元突觸長(zhǎng)度的影響。
[0022] 圖9 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)GAP-43蛋白表達(dá)的影響。注：與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 AAP<〇. 01 ;與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義沖<0. 05 ;*沖<0. 01。
[0023] 圖10 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)GAP-43蛋白表達(dá)的Western-blot結(jié)果。
[0024] 圖11 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)SYP蛋白表達(dá)的影響。注：與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 AAP<〇. 01 ;與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義沖<0. 05 ;*沖<0. 01。
[00巧]圖12 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)SYP蛋白表達(dá)的Western-blot結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)驗(yàn)例1 4-甲氧基節(jié)醇對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響
[0027] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0028] 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0029]SD大鼠雌性大鼠和雄性大鼠，體重180±220g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動(dòng)物研 究所提供，合格證號(hào)：〇〇14842。
[0030]1. 2實(shí)驗(yàn)試劑
[0031] 化?-5%Try的n-EDTA 蘭HBi(，logic;tiIndu加ic:s欠i,'J北 1402635 Poly-LLysine 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SL目G4596V 高糖DMEM培養(yǎng)基 購(gòu)自虹vitrogen公司，批號(hào)：8113326 低糖DMEM培養(yǎng)基 購(gòu)自Invitrogen公司，批號(hào)：81140巧 D-Hanks 購(gòu)自solarbio公司，巧k號(hào)：20140183 B-217Scn.im-r--reeSiippicmcnt 峭HImi肺gen公！'J.jit''J': 1490173 Neiirobasalmedium(NBM) 購(gòu)自Invitrogen公司，批號(hào)：1552941 特級(jí)胎牛血清（FBS) 購(gòu)自W色列Biological虹du化ies公司，批號(hào)：14323% 青鏈霉素雙抗 頓自Hyclone公司，批號(hào)：J140031 神經(jīng)元特異性絲醇酶（NSE) 購(gòu)自武漢博±德，貨號(hào)：BA0535; SABC(免IgG)-PODKit 購(gòu)自Solarbio公司，貨號(hào)：SA0021; Mayer,蘇木素染液 購(gòu)自Solarbio公百]，貨號(hào)：G1080 Aquaguard-1 購(gòu)自 &色列扭ologica]industries，批號(hào)：1350569 Aquaguard~2 購(gòu)自t(色列BiologicalIndustries,批號(hào)：1325052 MAP-2 抗體 購(gòu)自Proteinte油，批號(hào)；17490-I-AP F打C費(fèi)光二抗 購(gòu)自博奧森生物科技公司，批號(hào)：150421 DAPI 購(gòu)自Solarbio公司，批號(hào)：20141204 山羊血清； 購(gòu)自Solarbio公司，批號(hào)：20121006
[0032] 1. 3實(shí)驗(yàn)儀器
[0033] C02細(xì)胞培養(yǎng)箱（311])， 美國(guó)Thermoscientific公司 生物安全柜（BSC-1300IIA2)， 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 倒置相差顯微鏡（Ti-S), 日本Nikon公司 超純水系統(tǒng)（ZMQS50F01)， 美國(guó)Millipore公司 酶標(biāo)儀（InfiniteM200PRO)， 瑞：fcTecan公司 臺(tái)式離也機(jī)（KA-1000 )， 上海安亭科學(xué)儀器廣 髙壓蒸汽滅菌器（SN310C)， 日本Yamato公司 藥品冷藏箱（YY-1200)， 沈巧市醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng) 真空安全吸液系統(tǒng)（VACUSAFE：)， 瑞±irrte巧a-biosciences(舊S)公司
[0034] 1.4試劑的配制
[0035] 1. 4. 1 0. 01%P化溶液
[0036] 0. 1%的多聚賴(lài)氨酸溶液用無(wú)菌雙蒸水稀釋10倍，配制成0. 01%的多聚賴(lài)氨酸溶 液，放置4°C冰箱備用。
[0037] 1. 4. 2D-Hanks液
[0038] D-Hanks液中加入0. 5ml的雙抗，使其最終的濃度為lOU/ml，放4°C冰箱保存。
[0039] 1. 4. 3終止消化液
[0040]DMEM培養(yǎng)液FBSw9:1的比例混勻，配制成含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)液，加入終濃 度為lOU/mL的雙抗，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 1.4. 4神經(jīng)元培養(yǎng)液
[0042]化urobasalmedium加入終濃度為 2% 的B27、0. 5mmol/L的kglutamine、lOU/mL 雙抗，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0043] 1. 4. 5 4 %多聚甲醒溶液
[0044] 稱(chēng)取多聚甲醒2g，加入40血的PBS緩沖液，在60°CW下加熱攬拌使其完全溶解， 冷卻，用PBS緩沖液定容到50ml，調(diào)PH值為7. 2-7. 4,0. 22ym濾膜過(guò)濾除菌，放入4°C冰箱 保存?zhèn)溆谩?br>[0045] 1. 4. 6 0. 5%TritonX-100
[0046] 取50yLTritonX-100,溶于10血雙蒸水中溶解。
[0047] 1.4.7 1%BSA
[004引取0.IgBSA溶于10血雙蒸水中置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0049] 1. 4. 8MAP-2 抗體稀釋液
[0050]取2yL的MAP-2抗體，溶于在600yL的PBS中（使其比例為1 :300)，4°C冰箱待 用。
[0051] 1. 4. 9FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體稀釋液
[005引按照1 :60比例稀釋抗體，避光條件下取2yL抗體，溶于120yL1 %BSA中，置于 4°C冰箱保存待用。
[005引 1. 5藥物的配制
[0054] 4-甲氧基節(jié)醇先用DMS0溶解，分裝凍存于-20°C，現(xiàn)用現(xiàn)配，先用神經(jīng)元培養(yǎng)液稀 釋成所需的最高濃度，用0. 22ym濾膜過(guò)濾除菌，最后用神經(jīng)元培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度，DMS0在培養(yǎng)液中的終濃度應(yīng)低于0. 1 %。
[00財(cái) 2實(shí)驗(yàn)方法
[0056] 2. 1原代皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)
[0057] 2. 2. 1培養(yǎng)板的包被
[0058] 培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元的細(xì)胞板每孔加入一定量（能將培養(yǎng)板底部覆蓋）0. 01%多 聚賴(lài)氨酸（PLL)溶液，輕輕搖晃，使均勻的覆蓋在培養(yǎng)板底部，置于37°(：、5%0)2、95%空 氣、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱內(nèi)解育30min，然后吸走化L在超凈工作臺(tái)內(nèi)涼干后用無(wú)菌水清 洗2-3次（洗去游離的化L)，于超凈工作臺(tái)涼干備用。
[0059] 2. 2. 2原代皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)
[0060] 取成年SD大鼠雌雄各一只，在晚上同時(shí)放入雙層大鼠籠，第二天早觀(guān)察鼠籠底層 是否有陰栓，于見(jiàn)到陰栓之日為受孕第0天計(jì)算，觀(guān)察到陰栓的雌鼠取出來(lái)單獨(dú)飼養(yǎng)，取 妊娠18~19日大鼠的胚胎供實(shí)驗(yàn)用。
[006。 取妊娠18~19日的孕鼠，將孕鼠麻醉，用75%酒精消毒腹部，用無(wú)菌的綴子和剪 子取出胎鼠，放入含75%酒精的燒杯中浸泡3min，再將胎鼠取出放入預(yù)冷的含D-Hank's液 的培養(yǎng)皿中，蓋好放入超凈工作臺(tái)中。在裝有預(yù)冷D-Hank'S的培養(yǎng)皿