加入反應(yīng)，于搖床中 37°C，210rpm 反應(yīng) 24 小時。 離心得白色沉淀，用超純水洗滌后再次離心，重復(fù)3次，凍干，即得γ-PGA-L-PAE。
[0020] 3)將步驟2)所得的產(chǎn)物溶于有機溶劑DMSO中，將γ -PGA-L-PAE溶液緩慢滴加于 等體積的GLP-I衍生物溶液中，形成白色乳狀體系。
[0021] 4)將步驟3)所得的產(chǎn)物，于高速冷凍離心機中16000rpm，4°C離心15min，棄去上 清，再次加水洗滌離心，重復(fù)3次，所得沉淀即為GLP-I衍生物-NPs。
[0022] 本發(fā)明中，所述大分子γ-PGA是由微生物發(fā)酵合成的，其分子量為60?100萬。 所述步驟1)中高溫降解時間3?15min。所述步驟2)中摩爾比為：y-PGA:EDC. I = L-PAE =1:2:0. 60?0. 98。所述步驟3)中γ -PGA-L-PAE溶液濃度5?40mg/ml ;GLP-1衍生物 溶液濃度0. 25?3. Omg/ml。
[0023] 本發(fā)明另一目的是提供GLP-I衍生物-NPs在制備糖尿病治療藥物中的用途。
[0024] 本發(fā)明另一目的是提供GLP-I衍生物-NPs在制備減肥藥物中的用途，所述GLP-I 衍生物-NPs可用作體重調(diào)控劑或體重調(diào)控藥物。
[0025] 本發(fā)明另一目的是提供一種組合物，用于降血糖和/或降體重，其含有所述GLP-I 衍生物顆粒復(fù)合物。所述組合物包括藥物組合物?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域公知方法制備。可包含一 種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或輔劑，包括本領(lǐng)域公知的各種稀釋劑、潤滑劑、濕潤 劑、黏合劑、崩解劑、助流劑等。可制成適用的任何劑型包括液體劑型、固體劑型、半固體劑 型等，包括普通制劑、緩釋制劑、靶向制劑等。所述GLP-I衍生物顆粒復(fù)合物或所述組合物 可以單位劑量給藥，給藥途徑包括腸道或非腸道，包括口服、注射等。可單獨使用或與其他 藥物結(jié)合使用。所述GLP-I衍生物顆粒復(fù)合物在所述組合物中的含量為0. 1?99%。在一 個具體實施方案中，所述組合物包括甘露醇、mGLP-1-Nps或aGLP-1-NPs，其含量比為50mg/ ml 甘露醇、lmg/mlmGLP-1-Nps 或 aGLP-1-NPs。
[0026] 本發(fā)明有益效果包括：
[0027] 第一，本發(fā)明的外層骨架為L-PAE修飾的γ-PGA，可在體內(nèi)被降解為內(nèi)源性的氨 基酸，不會產(chǎn)生蓄積和毒副作用，生物安全性高，避免了由于采用具有非可降解性、免疫原 性高的藥物載體而引起身體產(chǎn)生副反應(yīng)。且本發(fā)明采用的γ-PGA采用生物發(fā)酵制備，無 化學(xué)合成而產(chǎn)生的副產(chǎn)物，安全性高，成本低，克服了采用化學(xué)合成法副反應(yīng)多、結(jié)構(gòu)不均 一的缺點。第二，本發(fā)明針對GLP-I衍生物采用瞬間包裹，制備、純化工藝簡單，避免了采 用共價連接導(dǎo)致的致耗時長、引入反應(yīng)試劑多、純化復(fù)雜等諸多問題。第三，本發(fā)明不直接 針對GLP-I衍生物做化學(xué)性修飾，避免了化學(xué)性修飾可能引起的副反應(yīng)以及可能的蛋白失 活。第四，本發(fā)明制備過程中，對游離藥物包裹效率高，能高效利用游離藥物，避免了包裹率 低而導(dǎo)致的得率低、成本增加。第五，本發(fā)明制備的GLP-I衍生物-NPs顆粒均一，Zeta電 位30-35mV，能防止顆粒自聚、沉降，使其能夠在溶液中穩(wěn)定存在，為藥物的保存、輸運奠定 基礎(chǔ)。第六，本發(fā)明制備而得的GLP-I衍生物-NPs在小鼠體內(nèi)活性時間可達(dá)48-72小時， 能夠持續(xù)性有效降血糖，相比天然GLP-I體內(nèi)靜注2-3min，能夠極大程度減少患者注射次 數(shù)，減輕病人痛苦。第七，本發(fā)明GLP-I衍生物-NPs具有控制體重效果，減肥效果明顯。
[0028] 本發(fā)明采用的藥物載體為L-PAE修飾γ-PGA而成，其生物相容性高，在體內(nèi)被安 全的降解成為內(nèi)源性的谷氨酸和苯丙氨酸，可被正常生理代謝利用，不會造成生物蓄積，安 全可靠。并且本發(fā)明采用的γ-PGA通過生物發(fā)酵而成，成本低，對環(huán)境友好，而傳統(tǒng)的化學(xué) 合成法是將氨基酸逐個連接形成多肽，這一過程工藝路線長、副產(chǎn)物多，合成的γ-PGA通 常是 α型和γ型的隨機混合物，結(jié)構(gòu)難以控制。因而本發(fā)明采用的藥物載體在載體本身 及其來源均顯示很強的優(yōu)越性，為整體藥物的安全性奠定了基礎(chǔ)。
[0029] 本發(fā)明制備得到的GLP-I衍生物顆粒復(fù)合物，即GLP-I衍生物-NPs，在制 備過程中，采用的是用兩親性共聚物γ-PGA-L-PAE在水溶液中自聚瞬間包裹的形 式，整個顆粒化過程是瞬時進(jìn)行的，制備過程便捷、迅速。已有的相關(guān)報導(dǎo)大都采用 將GLP-I衍生物與藥物載體共價相連的形式，存在諸多問題。如Ji-Hyun Kong等 [Biomaterials, 2010, 31:4121 - 4128]將艾塞那肽通過乙稀砜連接到透明質(zhì)酸上，不僅制 備過程復(fù)雜，耗時長達(dá)24小時，而且在制備過程中需要引入鄰苯二甲酰丁辛酯、二異丙基 乙胺、磷酸三氯乙酯等生物毒性大的有機試劑或催化劑，給整體藥物安全性埋下隱患，需要 后續(xù)繁瑣的純化步驟；其長時間的反應(yīng)過程、反應(yīng)時堿性環(huán)境（PH9.0)、復(fù)雜的純化工藝也 不利于易降解、易變性的多肽類GLP-I衍生物的活性維持。而本發(fā)明在顆粒制備過程中，僅 在包裹時引入相對溫和、低毒性、低濃度的DMS0,包裹瞬間完成后，即可通過離心出去，既制 備快速、工藝簡單，又極大程度上保護(hù)了 GLP-I衍生物的生物活性。
[0030] 本發(fā)明GLP-I衍生物-NPs顆粒分布均一，其表面Zeta電位30-35mV，其強電位 保證了其在溶液中能夠穩(wěn)定存在，不會自聚、沉降團聚，為其后續(xù)使用過程中的儲存、運 輸?shù)於嘶A(chǔ)。γ -PGA-L-PAE對aGLP-Ι和mGLP-1的包裹率分別達(dá)78. 40 ± 1. 80 %和 81. 50±2. 50%，能高度利用游離藥物，控制生產(chǎn)成本，奠定其大規(guī)模生產(chǎn)的基礎(chǔ)。
[0031] 本發(fā)明首次將GLP-I衍生物包裹顆?；揽客鈿けＷo(hù)作用，抵御體內(nèi)DPPIV等酶 的降解；顆?；黾恿?GLP-I衍生物的直徑大小，從而抵御腎小球的清除作用；裝載成顆粒 后，減少體內(nèi)酶對外殼的降解，延長體循環(huán)時間，形成緩釋效應(yīng)，實現(xiàn)長效降血糖。實驗表 明，本發(fā)明GLP-I衍生物顆粒復(fù)合物即GLP-I衍生物-NPs，在體內(nèi)有效降血糖活性時間可達(dá) 48-72小時，而天然GLP-I靜注體內(nèi)半衰期僅為2?3min，本發(fā)明具顯著優(yōu)越性，有望2-3天 注射一次即可有效控制血糖，減緩病人頻繁注射的痛苦，提高病人的順應(yīng)性。在肥胖模型鼠 的治療中表明，本發(fā)明能夠顯著抑制體重增長，具有良好的減肥效果。在長期動物實驗中表 明，GLP-I衍生物-NPs對于糖尿病模型鼠具有良好的治療效果，且不具備藥物毒性。本發(fā)明 涉及的原料均無生物毒性，安全性高，成本低，制備工藝簡單，包裹效率高，得到的GLP-I衍 生物-NPs粒徑均勻可控，穩(wěn)定性好，體內(nèi)活性時間長，適合大批量生產(chǎn)用作長效降血糖藥 物，降低糖尿病患者頻繁注射的痛苦，同時還能顯著抑制體重增加，可用作減肥藥物。
【附圖說明】
[0032] 圖1為GLP-I衍生物-NPs形成示意圖。
[0033] 圖2為大分子γ-PGA分別高溫酸解3, 5, 7,9,11，15min后的瓊脂糖凝膠電泳圖 譜。
[0034] 圖3為γ -PGA-L-PAE復(fù)合物的1H核磁共振圖譜。
[0035] 圖4為aGLP-1-NPs的透射電鏡圖。
[0036] 圖5為mGLP-1-NPs的透射電鏡圖。
[0037] 圖6為aGLP-1-NPs的顆粒直徑分布圖。
[0038] 圖7為mGLP-1-NPs的顆粒直徑分布圖。
[0039] 圖8為aGLP-1-NPs治療的db/db鼠體重變化率圖
[0040] 圖9為mGLP-1-NPs治療的db/db鼠體重變化率圖
【具體實施方式】
[0041] 結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容 不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變 化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實施本發(fā)明的過程、 條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識， 本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0042] 實施例1 γ -PGA的制備方法
[0043] (1)γ-PGA 的制備
[0044] 菌種活化：將凍存的芽抱桿菌（Bacillus licheniformis ATCC 9945a)從 _80°C 冰箱中取出，待融化后，按1%接種量接入種子培養(yǎng)基中，37°0、21〇1'/1^11培養(yǎng)1111。種子培 養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基）：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，酵母提取物0.5%。
[0045] 發(fā)酵培養(yǎng)：按5%接種量將上述種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、210r/min培養(yǎng) 12h 60-72h，至培養(yǎng)液呈粘稠狀。發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖5%，氯化鈉1%，酵母粉1%，谷氨酸 鈉3 %，磷酸二氫鉀0. 5 %，七水硫酸鎂0. 05 %。
[0046] γ-PGA的提取與純化：將上述發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值調(diào)為3. 0,10, 000r/min離心 30min去除菌體，得上清液，調(diào)節(jié)pH值至7. 0-8. 0。緩緩倒入3-5倍的酒精中，并用玻璃棒 不斷攪拌，獲得γ-PGA于烘箱中烘干，得γ-PGA粗產(chǎn)品。將干燥后的γ-PGA粗產(chǎn)品重新 溶于水中，配制成2%溶液，調(diào)節(jié)pH值至2. 0-3. 0,10, 000r/min，離心30min，于酒精中二次 沉淀，烘干。再次將得到的γ-PGA溶于超純水中，在4°C環(huán)境中，在超純水中透析72小時 (截留分子量麗：10000,每隔8小時換一次透析液），去除雜質(zhì)和小分子物質(zhì)，最后將溶液 冷凍干燥得到白色粉末狀物質(zhì)，此白色物質(zhì)即為大分子γ -PGA。
[0047] (2) γ-PGA 的降解
[0048] 對于大分子γ -PGA的降解采用高溫酸解法。將提取純化后的大分子γ -PGA溶于 純水中