一種高蛋白含量腦蛋白水解物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥品和保健食品領(lǐng)域，特別涉及一種腦蛋白水解物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦蛋白水解物是將動物腦組織經(jīng)酶水解后獲得的一種活性多肽，能以多種方式作 用于中樞神經(jīng)，調(diào)節(jié)和改善神經(jīng)元的代謝，促進突觸的形成，誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化，并進一步 保護神經(jīng)細胞免受各種缺血和神經(jīng)毒素的損害。
[0003] 腦蛋白水解物的基本生產(chǎn)工藝如下：動物腦組織去除表面的粘膜及血漬后，加水 勻漿，脫脂，胃蛋白酶酶解，胰蛋白酶酶解，超濾。
[0004] 采用現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)工藝所制備腦蛋白水解液含氮量低，國家藥品標準 WS1-XG-025-2000規(guī)定，干燥后物質(zhì)含氮量為8% -10%，換算成氨基酸和多肽含量在60% 左右，40%的未知物質(zhì)造成的潛在臨床風險可想而知，因此國家食品藥品監(jiān)督管理局對此 類產(chǎn)品的標準在不斷提高，逐步淘汰落后產(chǎn)品。
[0005] 此外，現(xiàn)有工藝中脫脂的目的為蛋白酶解更徹底，過濾通暢，方法一般采用丙酮或 丙酮復(fù)合溶劑脫脂，例如中國專利200410043939. 2, 94104516. 1，但因大量使用有機溶劑， 可造成環(huán)境危害和溶劑殘留。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種腦蛋白水解物的制備方法。其 包括⑴組織勻漿；（2)液化；（3)蛋白濃縮；(4)胃蛋白酶酶解；（5)胰蛋白酶酶解；(6)超 濾。
[0007] (1)組織勻漿：冷凍或新鮮哺乳動物腦，清洗，加水勻漿；
[0008] (2)液化：上述勻漿液中加入3-5倍量注射用水，0,1MNaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 5-8. 5， 攪拌 10min-20min，溫度 5°C -20°C。
[0009] (3)蛋白濃縮：將步驟（2)所得堿化液過濾，使用溫敏凝膠濃縮回收其中的水 溶性蛋白，溫敏凝膠系聚N-取代丙烯酰胺或聚N-取代丙烯酰胺共聚物，其基本結(jié)構(gòu)為 [-Ch 2-CHRCONR 'R"-]m[-A-]n[-B-]x，其中 R 為 H 或 1-5 個碳原子的烷基；R'為 H 或 2-5 個 碳原子的烷基；R"為2-5個碳原子的烷基；優(yōu)選R為H或甲基，R'和R' '為2-4個碳的烷 基；-A-為可選基團，來源于親水性單體，優(yōu)選的，-A-摩爾占比1 % -5 %;-B-基團來源于單 體雙功能交聯(lián)劑，摩爾占比0.5% -10%。η可以為0, m和X的變動范圍比較寬，根據(jù)單體 和交聯(lián)劑摩爾比確定。優(yōu)選凝膠為聚N-異丙基丙烯酰胺、聚（N-異丙基丙烯酰胺-Co-甲 基丙烯酸）鈉鹽，以N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS)為交聯(lián)劑。
[0010] 本步所用凝膠為顆粒狀，其膨脹和收縮溫度應(yīng)在5°C范圍內(nèi)，最小可膨脹為其原始 體積的5倍。步驟（3)濃縮時溫度應(yīng)低于所用溫敏凝膠的最低臨界相變溫度（LCST)，優(yōu)選 5。。-25。。。
[0011] 本步所用溫敏凝膠膨脹后可升溫收縮，回收利用，收縮溫度高于最低臨界相變溫 度（LCST)。其收縮后體積為膨脹體積的5%-20%。可使用溫敏凝膠反復(fù)濃縮，直至蛋白濃 度達 15% -25%。
[0012] 本步濃縮使用的設(shè)備為雙層圓柱狀大桶，內(nèi)層大桶盛裝溫敏凝膠，側(cè)壁開40目篩 孔，并可自由從外層桶中取出，攪拌槳深入內(nèi)層桶以便攪動溫敏凝膠。
[0013] (4)胃蛋白酶酶解：將步驟⑶所得濾渣加水勻衆(zhòng)，鹽酸調(diào)整pH = 1-3,升溫至 35°C -45°C，加入腦重量1%?3%的胃蛋白酶，攪拌，水解10-20小時，冷卻，過濾，得胃酶水 解液；優(yōu)選的，調(diào)節(jié)pH = 2，溫度40 °C，加入腦重量1. 5 %的胃蛋白酶，水解15小時。
[0014] (5)胰蛋白酶酶解：將步驟（4)胃酶水解液用NaOH調(diào)整pH = 7-9,升溫至 40°C -60°C，加入腦重量1 % -3 %的胰蛋白酶酶解，攪拌，水解2-10小時，完畢加熱微沸 IOmin滅活，冷卻，過濾，得胰蛋白酶水解液；優(yōu)選的，調(diào)節(jié)pH = 7. 6-8. 0,溫度45°C，加入 2%腦重量的胰蛋白酶，水解5小時。
[0015] (6)超濾：將步驟（5)所得酶解液，調(diào)節(jié)pH值至中性（6. 5-7. 5)，用截留分子量為 10000道爾頓的超濾器進行超濾，收集分子量小于10000道爾頓的液體，所得超濾液即腦蛋 白水解物。
[0016] 本發(fā)明所述的哺乳動物系指人除外的其他哺乳動物，包括豬、牛、馬、羊、兔、狗等， 優(yōu)選豬、牛、羊。
[0017] 本發(fā)明進一步要求保護本發(fā)明的腦蛋白水解物與一種或多種載體和/或稀釋劑 制的藥物及保健品組合物，可以制成市場上可接受的任一劑型。
[0018] 用于口服時，可制成常規(guī)的固體制劑，如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑等：也可制成 口服液體制劑，如口服溶液劑、口服混懸劑、糖漿劑等。制成口服制劑時，可以加入適宜的填 充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等。用于腸胃外給藥時，可制成注射劑，包括注射液、注射用無 菌粉末與注射用濃溶液。制成注射劑時，可采用現(xiàn)有制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法生產(chǎn)，配制注射 劑時，可以不加入附加劑，也可根據(jù)藥物的性質(zhì)加入適宜的附加劑。
[0019] 本發(fā)明進一步要求保護本發(fā)明的腦蛋白水解物在制備治療和/或預(yù)防腦功能障 礙的藥物和/或保健品中的應(yīng)用。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：
[0021] (1)本發(fā)明選用N-取代聚丙烯酰胺或N-取代聚丙烯酰胺共聚物溫敏凝膠濃縮蛋 白，有效去除小分子雜質(zhì)，降低產(chǎn)品臨床或日常使用的風險。。
[0022] (2)本發(fā)明解決腦蛋白水解物蛋白含量問題的同時，意外的發(fā)現(xiàn)，不使用溶劑脫 月旨，本發(fā)明同樣解決了蛋白酶解徹底性問題，且后續(xù)工藝過濾順暢，最終產(chǎn)品脂肪含量低。
【具體實施方式】
[0023] 下面詳細敘述本發(fā)明的實施例，需要說明的是，本實施例是敘述性的，不是限定性 的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0024] 比較實施例1
[0025] 分別采用不同工藝進行實驗，比較最終產(chǎn)品收率、活性多肽含量、過濾難易、溶劑 殘留、脂肪含量。
[0026] 現(xiàn)有工藝步驟如下：（1)豬腦勻漿；（2)脫脂；（3)胃蛋白酶酶解；(4)胰蛋白酶酶 解；（5)超濾，即得。
[0027] 本發(fā)明工藝步驟如下：（1)豬腦勻漿；（2)液化；（3)凝膠濃縮蛋白；(4)胃蛋白酶 酶解；（5)胰蛋白酶酶解；(6)超濾，即得。
[0028] 不同工藝對應(yīng)獲得的產(chǎn)品如表中所示：
[0029]
【主權(quán)項】
1. 一種腦蛋白水解物的制備方法，包括如下步驟： (1) 組織勻漿； (2) 液化； (3) 蛋白濃縮； (4) 胃蛋白酶酶解； (5) 胰蛋白酶酶解； ￠)超濾。 其特征在于，步驟（3)所述的蛋白濃縮采用聚丙烯酰胺溫敏凝膠進行濃縮。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺溫 敏凝膠基本結(jié)構(gòu)為[-Ch2-CHRCONR'R"_]η[-A-]m[-B-]p，其中R為H或1-5個碳原子的烷基； R'為H或2-5個碳原子的烷基；R"為2-5個碳原子的烷基；優(yōu)選R為H或甲基，R'和R' '為 2-4個碳的烷基；-A-為可選基團，來源于親水性單體，優(yōu)選的，-A-摩爾占比1-5% ;-B-基 團來源于單體雙功能交聯(lián)劑，摩爾占比0. 5-10%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺溫 敏凝膠為聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺溫 敏凝膠為聚（N-異丙基丙烯酰胺-Co-甲基丙烯酸）鈉鹽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于，所述的聚N-異 丙基丙烯酰胺凝膠和聚（N-異丙基丙烯酰胺-Co-甲基丙烯酸）鈉鹽采用N，N'-亞甲基 雙丙烯酰胺（BIS)為交聯(lián)劑制得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于，步驟（3)濃縮時溫度 低于所用溫敏凝膠的最低臨界相變溫度，優(yōu)選5°C _25°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于，步驟（3)使用溫敏凝 膠反復(fù)濃縮，直至蛋白濃度達15% -25%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)條件 為：NaOH調(diào)pH值7. 5-8. 5，攪拌10-20min，所述步驟⑷條件為：胃蛋白酶用量1 %?3 %， pH值為1-3,酶解溫度為35°C -45°C，酶解時間10_20h ;所述步驟（5)條件為：胰蛋白酶用 量1 %?3 %，pH值為7-9，優(yōu)選pH值為7. 8，酶解溫度為40°C -60°C，酶解時間2-10h ;所述 的步驟（6)過程中，用相對截留分子量為10000道爾頓的膜超濾。
9. 一種腦蛋白水解物，其特征在于，該腦蛋白水解物是根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項 所述的方法制備得到的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的腦蛋白水解物制劑，其特征在于，其劑型為口服固體制劑或 者注射劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種高蛋白含量腦蛋白水解物的制備方法，包括(1)組織勻漿；(2)液化；(3)蛋白濃縮；(4)胃蛋白酶酶解；(5)胰蛋白酶酶解；(6)超濾。所述的步驟(3)使用N-取代聚丙烯酰胺或N-取代聚丙烯酰胺共聚物凝膠在5-25℃濃縮蛋白，LCST以上溫度回收凝膠，反復(fù)利用。本發(fā)明解決了現(xiàn)有方法腦蛋白水解物蛋白含量低的問題，同時意外解決了有機溶劑脫脂，造成溶劑殘留和環(huán)境危害的問題。本方法所得水解液多肽含量達88％以上，符合國家標準。
【IPC分類】A61P25-00, A23L1-29, A61K35-30, A61K38-01
【公開號】CN104587444
【申請?zhí)枴緾N201410842401
【發(fā)明人】林波, 吳佳鑫, 于秀玲, 劉爽, 韓風雨, 孔新穎, 李洪澤
【申請人】內(nèi)蒙古天奇生物科技有限公司, 內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司, 赤峰陸爾草中蒙藥科技有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月24日