Glp-1衍生物顆粒復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種GLP-I衍生物顆粒復(fù)合物及其制備方法 與應(yīng)用、以及一種降血糖和/或降體重的組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是當(dāng)前威脅全球人類健康的最重要的慢性非傳染性疾病之一。我國(guó)糖尿 病患者已超過一億，成為全球糖尿病患者最多的國(guó)家。糖尿病新型藥物的研發(fā)近年來一 直是醫(yī)藥研發(fā)中重要的一環(huán)，而胰高血糖素樣肽-1，即Glucagon-like peptide 1，縮寫 為GLP-1，類新型藥物成為糖尿病醫(yī)藥研發(fā)的焦點(diǎn)。GLP-I是一種強(qiáng)效的降血糖激素，并 且具有葡萄糖依賴性的刺激胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌功能，降低了低血糖的危 險(xiǎn)[Vilsboll T. Diabetes Obes Metab. 2009Dec: 11]。此外，GLP-1 還能刺激膜島細(xì)胞再 生，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，是新型2型糖尿病靶點(diǎn)特異性小肽[Vella A. Diabetes. 2000A pr:49(4) :611-7] 〇
[0003] 但GLP-I進(jìn)入體內(nèi)后由于DPPIV等酶的降解，其半衰期僅為2分鐘[Knudsen LB. Int J Clin Pract Suppl. 0ct:64(167) :4-11]。這使得將 GLP-I 直接做為臨床藥物不 切合實(shí)際，因此大量的研宄工作用作修飾GLP-I的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，產(chǎn)生了一系列的類似物與 衍生物。目前已被FDA批準(zhǔn)上市的藥物，如諾華諾德公司研制的利拉魯肽，其34位精氨酸 替換為賴氨酸，26位的賴氨酸處連接1個(gè)16C脂肪酸側(cè)鏈；禮來研制的艾塞那肽，是由蜥蜴 (鈍尾毒蜥）分泌的具有39個(gè)氨基酸的多肽，與GLP-I具有59%的同源性；葛蘭素史克研 制的阿必魯肽，其為GLP-I二聚體與人白蛋白重組體。而國(guó)內(nèi)藥物公司還未有被批準(zhǔn)上市 的相關(guān)藥物，使得該類藥物價(jià)格昂貴，給病人造成大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0004] 但是，利拉魯肽由于其化學(xué)修飾，在臨床試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)有致癌風(fēng)險(xiǎn)，被FDA黑 框警告[Parks M. N Engl J Med 2010;362:774-7];艾塞那肽由于其低同源性，被發(fā) 現(xiàn)有惡心、嘔吐等腸胃道副反應(yīng)[Ruiz Grande C. Can J Physiol Pharmacol. 1990D ec :68 (12) : 1568-73]，以及胰腺炎報(bào)告案例，同樣被FDA黑框警告；阿必魯肽雖然可一周給 藥一次，但面臨的腸胃道副反應(yīng)也更加嚴(yán)重[Richard E. The Lancet Diabetes & Endocri nology，2014, 2 (4) : 289-297]。所以，還需要研制一種更為經(jīng)濟(jì)，安全，長(zhǎng)效的新型GLP-1衍 生物。
[0005] 同時(shí)，肥胖癥是21世紀(jì)威脅人類健康的另一大病癥，1997年世界衛(wèi)生組織已將肥 胖正式宣布為一種疾病并作為一種嚴(yán)重的慢性疾病而進(jìn)行重點(diǎn)防治[許榕仙.肥胖的病因 與防治.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002, 8 (5): 1-33]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)全球肥胖癥患者已經(jīng)超過 3億人，11億人體重過重，中國(guó)的肥胖癥患者已經(jīng)超過七千萬人，列在全球肥胖病發(fā)病率排 行榜第10位。而肥胖癥給患者帶來巨大的健康隱患：增加腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，肥胖癥患者 容易發(fā)生大腦動(dòng)脈粥樣硬化；增加糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，肥胖是發(fā)生2型糖尿病的重要危險(xiǎn)因素 之一，在長(zhǎng)期肥胖的人群中，糖尿病的患病率明顯增加，可高達(dá)普通人群的4倍，而2型糖尿 病人中，80%是肥胖者；引起骨關(guān)節(jié)疾病，肥胖可能引起的骨關(guān)節(jié)疾病主要有三種：骨性關(guān) 節(jié)炎、糖尿病性骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，肥胖與某些癌癥的發(fā)生密切 相關(guān)[吳麗明，中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011 (2) :25-26]。
[0006] 但現(xiàn)有的減肥藥物主要由于安全性低，負(fù)面報(bào)道頻現(xiàn)。過去的40年內(nèi)，有5種減 肥藥因安全隱患而退出市場(chǎng)。其中最著名的兩種藥物一一惠氏公司的Pondimin芬氟拉明和 Redux右芬氟拉明，被發(fā)現(xiàn)有增加心臟瓣膜病變風(fēng)險(xiǎn)，在上市一年后便退出市場(chǎng)；賽諾菲的 Acomplia利莫那班由于可能引發(fā)抑郁癥或自殺于2008年退市；Servier公司的Mediator 苯氟雷司由于引發(fā)心臟瓣膜病變于2009年退市；在我國(guó)，由于副反應(yīng)明顯，國(guó)家食品藥品 監(jiān)督管理局禁止了西布曲明制劑和原料藥在中國(guó)的生產(chǎn)、銷售和使用，結(jié)束了以"曲美"為 代表的減肥藥物長(zhǎng)達(dá)10年的銷售史。因此，需要研制更為安全、有效的減肥藥物。
[0007] γ_聚谷氨酸，即γ-PGA，是由谷氨酸的α -氨基和γ-羧基縮合而成的線性大分 子，由于其生物相容性高，在體內(nèi)能被降解為內(nèi)源性谷氨酸，不易產(chǎn)生積蓄和毒副作用，安 全可靠，而成為一種理想的藥物載體[李睿.高分子材料科學(xué)與工程，2014, 30(1) : 11-14]。 但γ-PGA其側(cè)鏈帶有大量的游離羧基，與水高度親和，無法在水中自聚形成顆粒。本發(fā)明 巧妙地將γ -PGA進(jìn)行疏水性修飾，即通過將L-苯丙氨酸乙酯，即L-PAE，的氨基與γ -PGA 側(cè)鏈的羧基通過肽鍵縮合反應(yīng)相連接，使其成為新型的兩親性共聚物γ -PGA-L-PAE，其中 γ -PGA作為水溶性的骨架、L-PAE作為疏水性區(qū)域，因而在水中能自聚形成由內(nèi)部疏水區(qū) 域和外部親水區(qū)域所組成的穩(wěn)定顆粒。根據(jù)這樣的特性，該復(fù)合物在水溶液形成顆粒的過 程中，能將水溶液中的GLP-I衍生物包裹在顆粒中，裝載成為藥物-顆粒復(fù)合物，該過程的 形成示意圖如圖1所示。裝載的兩種GLP-I衍生物已有專利授權(quán)保護(hù)：aGLP-Ι，專利申請(qǐng)?zhí)?為CN200910045188,其在給藥后體內(nèi)降血糖活性為440min，其序列如SEQ ID No :1所示； mGLP-1，專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N200610024355,其在給藥后體內(nèi)降血糖活性為180min，其序列如 SEQ ID No : 2 所示。
[0008] 在已經(jīng)上市的藥物中，為了增加藥物溶解度、提高藥物穩(wěn)定性，往往需要對(duì)藥物進(jìn) 行結(jié)構(gòu)改造或者使用藥物輔料，如由美國(guó)百時(shí)美-施貴寶公司研制的紫杉醇注射劑Taxol， 為提高紫杉醇的水溶性使用了聚氧乙稀蓖麻油系列衍生物CrEL[Huizing Μ, J Chromatogr Β，1998,709(1) :161-5]，而CrEL被發(fā)現(xiàn)具有急性超敏反應(yīng)、外周神經(jīng)毒性、細(xì)胞毒性等一 系列不良反應(yīng)，限制了其使用的廣度與深度[高鵬.藥學(xué)與臨床研宄，2010, 18 (1) : 61-63]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種GLP-I衍生物顆粒復(fù)合物即GLP-I衍生物-NPs， 在γ-PGA-L-PAE形成的顆粒中，包載了 GLP-I衍生物，形成一種殼核結(jié)構(gòu)復(fù)合體系。其 中，所述裝載的GLP-I衍生物包括aGLP-Ι或mGLP-1。由于裝載的內(nèi)含物不同，形成了兩種 GLP-I衍生物-NPs，即aGLP-Ι顆粒復(fù)合物aGLP-1-NPs和mGLP-1顆粒復(fù)合物mGLP-1-NPs。 兩種GLP-I衍生物-NPs即aGLP-1-NPs和mGLP-1-NPs的顆粒直徑均在100-150nm之間，呈 單分散體系，表面Zeta電位30-35mV，表明粒子能在溶液中穩(wěn)定存在。GLP-I衍生物-NPs 的外層為γ-PGA-L-PAE，為L(zhǎng)-PAE的氨基與γ-PGA的羧基通過肽鍵縮合反應(yīng)相連接形成的 復(fù)合物，L-PAE 在 γ-PGA 上的接入率為 54%?95%。γ-PGA-L-PAE 對(duì) aGLP-Ι 和 mGLP-1 的包裹率分別達(dá)78. 40 ±1. 80 %和81. 50 ±2. 50%。GLP-I衍生物經(jīng)γ-PGAL-PAE-包裹后， 能起到抵御DPPIV酶對(duì)其降解、延長(zhǎng)體循環(huán)時(shí)間與緩釋的作用，從而延長(zhǎng)GLP-I衍生物在體 內(nèi)的活性時(shí)間。
[0010] 其中，所述aGLP-Ι的序列如SEQ ID No :1所示之序列；所述mGLP-1的序列如SEQ ID No : 2所示之序列。
[0011] 其中，所述GLP-I衍生物-NPs的外殼，即修飾聚合物γ -PGA-L-PAE形成的 外殼結(jié)構(gòu)中，所述L-PAE的氨基與γ-PGA的羧基通過肽鍵縮合反應(yīng)相連接，從而形成 γ -PGA-L-PAE復(fù)合物。所述GLP-I衍生物-NPs的外殼結(jié)構(gòu)中，γ -PGA-L-PAE復(fù)合物中的 L-PAE在γ -PGA上的接入率為54 %?95 %。
[0012] 本發(fā)明另一目的是提供GLP-I衍生物-NPs的制備方法，經(jīng)L-PAE疏水性修飾的 γ -PGA具有兩親性，在水中能夠自聚形成親水基團(tuán)在外、疏水基團(tuán)在內(nèi)的顆粒，同時(shí)包裹 GLP-I衍生物進(jìn)入疏水核心，從而制備得到所述GLP-I衍生物-ΝΡ。所述方法包括以下步 驟：
[0013] 1)將由枯草芽孢桿菌Bacillus licheniformis ATCC 9945a發(fā)酵提取所得的大分 子γ -PGA高溫酸解，得到分子量15?30萬的γ -PGA ;
[0014] 2)將步驟1)得到的γ -PGA在EDC. I催化下與L-PAE反應(yīng)，得γ -PGA-L-PAE復(fù)合 物；
[0015] 3)將步驟2)所得的產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑DMSO中，將γ -PGA-L-PAE溶液緩慢滴加于 等體積的GLP-I衍生物溶液中，形成白色乳狀體系；
[0016] 4)將步驟3)所得的產(chǎn)物離心，棄去上清，加水洗滌離心，所得沉淀即為所述GLP-I 衍生物-NPs。
[0017] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：
[0018] 1)將大分子γ-PGA配制成2%的水溶液，用鹽酸將其pH值調(diào)節(jié)至3.0,于98°C水 浴中高溫降解，降解結(jié)束立即冰浴冷卻，并將其PH值用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至7. 0,于超純水 中透析72小時(shí)，冷凍干燥，得到分子量15?30萬的γ -PGA。
[0019] 2)將步驟1)中得到的15?30萬分子量的γ -PGA配制成2 %的水溶液，按照 y-PGA:EDC. I:L-PAE = 1:2:0. 60 ?0· 98