專利名稱：含有喹唑啉酮衍生物的冠脈內(nèi)斯滕特固定模的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涂敷有包含喹唑啉酮的組合物的冠脈內(nèi)斯滕特固定模(Stents)。更具體地說，本發(fā)明涉及涂敷有用于抑制再狹窄的組合物的斯滕特固定模，該組合物包含在其中作為活性成分的如本文中定義的喹唑啉酮衍生物。
本發(fā)明是以色列說明書No.110,831中描述的發(fā)明的修飾和改進(jìn)，該文的教導(dǎo)僅結(jié)合在本文中作為背景技術(shù)。
在1967年公開的美國(guó)專利3,320,124中描述并請(qǐng)求保護(hù)用喹唑啉酮衍生物治療球蟲病的方法。
在美國(guó)Cyanamid公司的上述專利中首次描述并請(qǐng)求保護(hù)鹵夫酮，也稱作7-溴-6-氯-3-[3-(3-羥基-2-哌啶基)-2-氧丙基]-4(3H)-喹唑啉酮，它也是該專利提出的優(yōu)選化合物，并且是該文中描述和請(qǐng)求保護(hù)的衍生物中被商品化的一個(gè)。
后來，美國(guó)再批準(zhǔn)專利26,833和美國(guó)專利4,824,847；4,855,299；4,861,758和5,215,993均涉及鹵夫酮的殺球孢子菌性能，而美國(guó)專利4,340,596指出它還可用于對(duì)抗泰累爾梨漿蟲病。
在美國(guó)專利No.5,449,678中描述并請(qǐng)求保護(hù)一種抗纖維變性的組合物，它包含適量的作為其中活性成分的式Ⅰ化合物及其生理學(xué)上可接受的鹽
其中n是1或2；
R1是下列基團(tuán)中的一員氫，鹵素，硝基，苯并，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2是下列基團(tuán)中的一員羥基，乙酰氧基，和低級(jí)烷氧基，和R3是下列基團(tuán)中的一員氫和低級(jí)鏈烯氧基-羰基，它可有效地抑制Ⅰ型膠原的合成。
經(jīng)過進(jìn)一步的研究和開發(fā)，我們發(fā)現(xiàn)上述式Ⅰ化合物在再狹窄的抑制中是有效的，而通常認(rèn)識(shí)上其對(duì)纖維變性病癥無效。
動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制涉及被巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和鑲嵌在粘著糖蛋白、蛋白聚糖和膠原的胞外基質(zhì)(EMC)中的平滑肌細(xì)胞(SMC)的異常遷移和增生〔V.Fuster等人，“冠狀動(dòng)脈疾病和急性冠脈綜合征的發(fā)病機(jī)制”，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，326卷，242-250頁(yè)(1992)；R.Ross，“動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制九十年代的展望”，自然，362卷，801-809頁(yè)(1993)〕。在生理學(xué)條件下，大部分動(dòng)脈SMC仍處于Go相，且細(xì)胞的生長(zhǎng)由內(nèi)源性增生刺激和增生抑制因子間的平衡控制。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞因致動(dòng)脈粥樣化危險(xiǎn)因子(即高血壓，高脂蛋白血癥，糖尿病)而擾亂后，血小板和非血小板衍生生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞因子釋放并刺激單核細(xì)胞和SMC遷移以及SMC增生(V.Fuster等人，出處同上；R.Ross，出處同上)。這些生長(zhǎng)因子是血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)〔G.A.A.Ferns.等人，“PDGF的抗體對(duì)血管成形術(shù)后新內(nèi)膜平滑肌蓄積的抑制”，科學(xué)，253卷，1129-1132頁(yè)(1991)〕，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)〔V.Lindner等人，“堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在血管損害形成中的作用”，循環(huán)系研究，68卷，106-113頁(yè)(1991)〕，和白細(xì)胞介素-1(IL-1)〔H.Loppnow和P.Libby，“增生或白細(xì)胞介素-1活化人血管平滑肌細(xì)胞分泌大量的白細(xì)胞介素6”，臨床研究雜志，85卷，731-738頁(yè)(1990)〕。巨噬細(xì)胞和血小板還釋放消化ECM的各種成分的酶(即彈性蛋白酶，膠原酶，乙酰肝素酶)，并釋放bFGF以及儲(chǔ)藏于基底膜和ECM中的可能的其他生長(zhǎng)因子(TGFb)〔I.Vlodavsky等人，“胞外基質(zhì)結(jié)合生長(zhǎng)因子，酶及血漿蛋白質(zhì)”，見基底膜的分子和細(xì)胞情況，細(xì)胞生物學(xué)中的專論，D.H.Rohrbach和R.Timpl編，Academic Press,紐約，美國(guó)，327-346頁(yè)(1993)〕?？赡艽嬖谟谘鼙谥械哪冈谝欢l件下也會(huì)對(duì)SMC施加有力的促生長(zhǎng)活性〔R.Bar-Shavit等人，“固定于胞外基質(zhì)的凝血酶是血管平滑肌細(xì)胞的有絲分裂原非酶促作用方式”，細(xì)胞研究，1卷，453-463頁(yè)(1990)；S.M.Schwartz，“血清衍生生長(zhǎng)因子是凝血酶？”臨床研究雜志，91卷，4頁(yè)(1993)〕。妨礙這些生長(zhǎng)因子的促生長(zhǎng)活性的分子可以減弱致動(dòng)脈粥樣化過程的發(fā)展。
隨內(nèi)皮損傷而引發(fā)的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMC)的增生是經(jīng)皮透過腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)后冠狀動(dòng)脈再狹窄過程中的基本情況〔V.Fuster等人，出處同上〕。冠狀動(dòng)脈分流術(shù)和血管成形術(shù)是用來重新打開因心臟病而變得狹窄的冠狀動(dòng)脈。這兩個(gè)過程中的主要問題是約30％經(jīng)歷了血管成形術(shù)的患者和約10％分流術(shù)后的患者的動(dòng)脈迅速再阻塞。通常血管SMC受到動(dòng)脈的由血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的光滑的內(nèi)里的保護(hù)。然而，在分流術(shù)或血管成形術(shù)后，SMC經(jīng)常暴露在外。在無效的修補(bǔ)創(chuàng)口的努力中，細(xì)胞增生并阻塞動(dòng)脈。
根據(jù)以色列說明書No.110,831中請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明，它提供了包含上文中所定義的、通過抑制血管平滑肌增生而防止再狹窄的藥物有效量的式Ⅰ化合物的藥物組合物，并與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。
在所述發(fā)明的優(yōu)選組合物中，所述化合物是鹵夫酮。
眾所周知，15年前提出的常用的氣囊血管成形術(shù)一直受到兩個(gè)問題的困擾手術(shù)期間的突然血管閉合和術(shù)后期間的再狹窄。1986年已在人類臨床研究中引入了采用冠脈內(nèi)斯滕特固定模的機(jī)械式措施，之后FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)用于防止氣囊血管成形術(shù)后再狹窄的冠脈斯滕特固定模，該裝置的銷售額已從1994年的2.2億美元不斷增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到1996年在全球范圍內(nèi)的收益將達(dá)到10億美元〔W.Diller，“技術(shù)策略-冠脈斯滕特固定模打開J&J的市場(chǎng)封鎖”，Start-Up,20-26頁(yè)(1996年5月)〕。
根據(jù)所述文章，當(dāng)只施行血管成形術(shù)時(shí)，可能導(dǎo)致40％或更高的再狹窄率，一些研究指出，根據(jù)疾病的種類和部位，在血管成形術(shù)后使用斯滕特固定模，將這一比率降到了20-30％。
顯然，20-30％的再狹窄率也是不期望的，因此在文獻(xiàn)中已提出，并且現(xiàn)在已有生產(chǎn)和出售，涂敷有企圖減少再狹窄的物質(zhì)的斯滕特固定模。由此，例如，JoHnson & Johnson國(guó)際網(wǎng)絡(luò)銷售一種涂敷肝素形式的Palmaz-Schartz斯滕特固定模，Medtronic InterventionalVascular銷售一種涂敷血纖蛋白的Wiktor斯滕特固定模。BiotronikGmbH已出售了涂敷有抗血栓形成的碳化硅物質(zhì)的斯滕特固定模。其他的建議包括用聚合物作金屬斯滕特固定模的涂層以減小它們的血栓形成性能，用尼龍篩，以及用醫(yī)用級(jí)二氧化硅聚合物。還報(bào)道了藥物洗脫聚合物涂層〔參見，例如Tao Peng等人，“聚合物在改善冠狀動(dòng)脈內(nèi)斯滕特固定模效果中的作用”，生物材料1996,17卷，No.7,685-694頁(yè)(1996)〕。因此，所述文章提出了聚合物斯滕特固定?？杉尤牖蚪Y(jié)合隨后會(huì)在靶部位局部控制釋放的藥物，這將抑制血栓形成和新內(nèi)膜增殖，還提出正在研究各種藥物包括尿激酶、肝素、紫杉酚、水蛭素和肽的局部給藥以預(yù)防血栓形成和再狹窄。
考慮到上述現(xiàn)有技術(shù)的狀況，現(xiàn)今已意識(shí)到利用本質(zhì)上已知的方法將在以色列說明書110,831中提出的組合物加入到冠脈內(nèi)斯滕特固定模上作為涂層，這是一種特別有效的利用其的方式。
因此，按照本發(fā)明，它提供了涂敷有式Ⅰ的喹唑啉酮衍生物的冠脈內(nèi)斯滕特固定模，其中R1是下列基團(tuán)中的一員氫，鹵素，硝基，苯并，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2是下列基團(tuán)中的一員羥基，乙酰氧基，和低級(jí)烷氧基，和R3是下列基團(tuán)中的一員氫和低級(jí)鏈烯氧基-羰基，它用于預(yù)防血管成形術(shù)后的再狹窄。
如上所述，當(dāng)本文中進(jìn)行描述、舉例和闡明時(shí)，以色列說明書No.110,831的主題并不構(gòu)成本發(fā)明的一部分，并明確地將其放棄。
現(xiàn)在具體參考詳細(xì)的實(shí)施例，應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是具體的描述是通過實(shí)施例進(jìn)行的，并且目的僅僅是為了闡明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，也是為了提供相信是對(duì)本發(fā)明的本質(zhì)和概念方面的最有用和最容易理解的描述。在本文中，要注意的是僅有包含在后面所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)的，無論是以該權(quán)利要求中定義的方式還是與此類似的方式，和涉及如權(quán)利要求中定義的主要特征的主題是將確定為包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的，而以色列說明書110,831的主題，盡管對(duì)其進(jìn)行了描述和例舉，但這是為了提供背景技術(shù)和對(duì)本發(fā)明的更好理解，而并不想將其作為本發(fā)明的部分。
附圖簡(jiǎn)述在附圖中

圖1是顯示鹵夫酮對(duì)SMC增生的抑制作用的特征曲線；圖2是顯示鹵夫酮對(duì)SMC的抗增生作用的逆轉(zhuǎn)的特征曲線；圖3a和3b分別是顯示鹵夫酮對(duì)將3H-胸苷加入血管SMC的作用的線條圖和特征曲線；圖4是顯示鹵夫酮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的作用的特征曲線；圖5a和5b分別是顯示鹵夫酮對(duì)將3H-胸苷加入血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用的線條圖和特征曲線；圖6是顯示鹵夫酮對(duì)3T3成纖維細(xì)胞的抗增生作用的線條圖；圖7是顯示鹵夫酮對(duì)bFGF的促有絲分裂活性的抑制作用的線條圖；圖8a和8b是受到碾碎傷害后的兔耳的主動(dòng)脈的彩色光學(xué)顯微圖，分別顯示的是未經(jīng)處理的動(dòng)脈和按照本發(fā)明處理過的動(dòng)脈；和圖9顯示了鹵夫酮對(duì)傷害誘導(dǎo)的動(dòng)脈狹窄的作用。
實(shí)施例1)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞如以前所描述的方法從牛主動(dòng)脈中層分離出SMC〔參見，例如J.J.Castellot等人，“肝素抑制血管平滑肌細(xì)胞增生能力的結(jié)構(gòu)決定因素含有3-O-硫酸酯基團(tuán)的五糖序列的證據(jù)”，細(xì)胞生物學(xué)雜志，102卷，1979-1984頁(yè)(1986)；和A.Schmidt等人，“動(dòng)脈硫酸乙酰肝素的抗增生活性存在于富含2-0-硫酸化糖醛酸殘基區(qū)域”，生物化學(xué)雜志，267卷，19242-19247頁(yè)(1992)〕。
簡(jiǎn)而言之，在解剖顯微鏡下分離主動(dòng)脈的腹段并除去筋膜。將主動(dòng)脈徑向切開，并從血管壁仔細(xì)地剝離出小片中膜。將兩個(gè)或三個(gè)平均大小2-3mm的這樣的樣品帶置于100mm組織培養(yǎng)皿中，該皿中含有DMEM(4.5g葡萄糖/升)，并添加有10％FCS,100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素。在7-14天內(nèi)，多層細(xì)胞的大膜片從外植塊遷移。約1周后，將這些細(xì)胞傳代培養(yǎng)到100mm組織培養(yǎng)板上(4-6×105細(xì)胞/板)。用能選擇性識(shí)別肌動(dòng)蛋白的肌肉形式(HF-35)的單克隆抗體對(duì)顯示出血管SMC的典型形態(tài)學(xué)特征的培養(yǎng)物(傳代3-8)和細(xì)胞進(jìn)行特異性染色。該抗體不識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。
如D.Gospodarowicz等人以前的描述，用牛主動(dòng)脈建立血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物〔“牛內(nèi)皮細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子作為存活劑”，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，73卷，4120頁(yè)(1979)〕。儲(chǔ)存培養(yǎng)物保存在添加有10％小牛血清，50U/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素的DMEM(1g葡萄糖/升)中，在37dC下，在10％CO2濕化培養(yǎng)箱中。在活性細(xì)胞生長(zhǎng)期內(nèi)，每隔一天加入部分純化的腦源性bFGF(100ng/ml)〔D.Gospodarowicz等人，出處同上；和J.Vlodavsky等人，“在沒有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子下的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷與它們的體內(nèi)分化性能不相容的結(jié)構(gòu)和功能改變”，細(xì)胞生物學(xué)雜志，83卷，468-486頁(yè)(1979)〕。
細(xì)胞增生3H-胸苷摻入將SMC接種到加有10％FCS的DMEM中(4×104細(xì)胞/16mm槽)。接種24小時(shí)后，將培養(yǎng)基替換為含有0.2％FCS的培養(yǎng)基。48小時(shí)后，再讓細(xì)胞接觸生長(zhǎng)刺激劑和3H-胸苷(1mCi/槽)24-48小時(shí)。通過測(cè)量加入到三氯乙酸不溶性物質(zhì)中的放射性來測(cè)定DNA合成〔M.Benezra等人，“芳族陰離子化合物對(duì)bFGF自泌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)”，癌癥研究，52卷，5656-5662頁(yè)(1992)〕。
生長(zhǎng)率將SMC(1.5×104細(xì)胞/槽)接種到24槽培養(yǎng)板上并暴露于如上所述的生長(zhǎng)刺激劑。接種1-6天后，用2.5％PBS中的甲醛固定這些細(xì)胞。將這些培養(yǎng)板沉浸于0.1M硼酸鹽緩沖劑(pH8.5)浴器中，用亞甲藍(lán)(1％在0.1M硼酸鹽緩沖劑中，pH8.5)染色并用水洗滌4次。這一過程實(shí)際上去除了所有非細(xì)胞結(jié)合染料。將特定的摻入了亞甲藍(lán)的細(xì)胞溶于0.5ml 0.1N Hcl(1h,25dC)并通過測(cè)量620nm處的吸光度來進(jìn)行測(cè)定(Bar-Shavit等人，出處同上)。選擇好初始細(xì)胞的涂敷密度以確保在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)細(xì)胞數(shù)和吸光度之間是線性關(guān)系。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在加入測(cè)試化合物前先將三槽培養(yǎng)物固定以測(cè)定初始平均吸光度。這個(gè)值用于計(jì)算對(duì)照細(xì)胞和藥物處理的細(xì)胞的倍增時(shí)間(DT)，利用下列等式進(jìn)行計(jì)算DT=In2/IN[(ODt/ODc)/h]其中DT=倍增時(shí)間，小時(shí)；Odt=實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)測(cè)試槽的光密度；Odc=實(shí)驗(yàn)開始時(shí)對(duì)照槽的光密度；h=培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間，小時(shí)。
用藥物處理過的細(xì)胞的倍增時(shí)間除以對(duì)照細(xì)胞的倍增時(shí)間從而計(jì)算出生長(zhǎng)率〔A.Horowitz等人，“脂質(zhì)體封裝的阿霉素的體外細(xì)胞毒性依賴于脂質(zhì)體組合物和藥物釋放”，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)，1109卷，203-209頁(yè)(1992)〕。
細(xì)胞數(shù)將SMC接種于有DMEM(4.5g葡萄糖/升)并添加了10％FCS的24槽培養(yǎng)板中(2.5×103細(xì)胞/槽)并使其吸附6小時(shí)〔A.Schmidt等人，“動(dòng)脈硫酸乙酰肝素的抗增生活性存在于富含2-0-硫酸化糖醛酸殘基區(qū)域”，生物化學(xué)雜志，267卷，19242-19247頁(yè)(1992)〕。去除該培養(yǎng)基并加入含有10％FCS的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基(有或沒有鹵夫酮)使成四倍槽數(shù)。培養(yǎng)4天后，利用Coulter計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞數(shù)(Schmidt等人，出處同上)，用下述公式計(jì)算抑制度％抑制=1-鹵夫酮存在下的凈生長(zhǎng)/對(duì)照的凈生長(zhǎng)×100用終細(xì)胞數(shù)減去初始細(xì)胞數(shù)即為凈生長(zhǎng)。
2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果ⅰ)鹵夫酮對(duì)血管SMC的抗增生作用生長(zhǎng)率在不存在和存在增加濃度的鹵夫酮的情況下使稀疏接種的血管SMC接觸10％FCS。用STV離解這些細(xì)胞并每日計(jì)數(shù)。如圖1中所示，存在75ng/ml鹵夫酮時(shí)達(dá)到了對(duì)SMC增生的80-90％抑制，在125ng/ml時(shí)幾乎完全抑制。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，讓SMC接觸鹵夫酮48小時(shí)，接著除去藥物，隨后在正規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。如圖2中顯示，去除藥物所得到的加速生長(zhǎng)率的增加與未處理的SMC類似。
3H-胸苷摻入讓保持在含有10％FCS的培養(yǎng)基中的接近融合的血管SMC在不存在和存在升高濃度的鹵夫酮的情況下與3H-胸苷接觸。如圖3a所示，在0.15mg/ml鹵夫酮處觀察到了DNA合成的完全抑制，在濃度低至0.05mg/ml時(shí)也得到了65％抑制(圖3b)。
ⅱ)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和3T3成纖維細(xì)胞的抗增生作用血管內(nèi)皮細(xì)胞稀疏接種的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在不存在和存在升高濃度的鹵夫酮的情況下在含有10％FCS的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。用STV離解這些細(xì)胞并每日計(jì)數(shù)。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增生的抑制主要是在頭4天內(nèi)，在用相對(duì)高濃度(0.1-0.125mg/ml)的藥物處理的細(xì)胞中觀察到的(圖4)。與SMC的結(jié)果不同，從第5天開始，內(nèi)皮細(xì)胞幾乎恢復(fù)到了正常生長(zhǎng)率(倍增時(shí)間)，(圖4)，這表明血管EC對(duì)鹵夫酮的抑制作用不如血管SMC敏感。胸苷摻入研究顯示在0.05mg/ml鹵夫酮時(shí)DNA合成受到50％抑制(圖5)。
3T3成纖維細(xì)胞圖6顯示通過積極增加保持在含有10％FCS的培養(yǎng)基中的3T3成纖維細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的3H-胸苷摻入在0.025mg/ml鹵夫酮存在下幾乎完全受到抑制，這提示與SMC相比，成纖維細(xì)胞對(duì)藥物甚至是更敏感的。
對(duì)bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增生的作用用低濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)容易地刺激保持(48小時(shí))在含有0.5％FCS的培養(yǎng)基中的靜止的、生長(zhǎng)停滯的3T3成纖維細(xì)胞增生。與鹵夫酮(0.025mg/ml)接觸使得bFGF刺激的胸苷在生長(zhǎng)停滯的3T3成纖維細(xì)胞中的摻入幾乎完全受到抑制(圖7)。該結(jié)果提示鹵夫酮有力地對(duì)抗了bFGF的促生長(zhǎng)活性。
ⅲ)物理傷害導(dǎo)致的動(dòng)脈狹窄通過肌內(nèi)注射氯胺酮(50mg/kg)將成年新西蘭兔麻醉。從外部對(duì)每只耳朵的主要?jiǎng)用}施加物理傷害30分鐘〔Banai等人，循環(huán)系研究，69卷，748-756頁(yè)(1992)〕。手術(shù)后，按照動(dòng)物福利行為規(guī)格(Animal Welfare Act specifications)飼養(yǎng)這些兔子。壓皺后1小時(shí)在物理壓皺面積周圍皮下應(yīng)用鹵夫酮(0.2ml,0.09mg/ml)，在頭4天每24小時(shí)一次。在第14天，將這些動(dòng)物處死并用10％緩沖的甲醛將它們的耳朵固定72小時(shí)。將壓皺部位進(jìn)一步調(diào)整為1mm間距，用乙醇和二甲苯脫水，并嵌入石蠟中。用Movat五鉻法將連續(xù)的(5mm)切片染色。在損害部位和距離傷害部位2mm的相鄰的正常動(dòng)脈段進(jìn)行計(jì)算機(jī)測(cè)面積法測(cè)定。正常部位的選擇是隨機(jī)的，約二分之一是傷害部位近側(cè)的，二分之一是遠(yuǎn)端的。描畫出腔，即由內(nèi)彈性層環(huán)繞的面積(“原始腔”)和由中層的外緣環(huán)繞的面積(總血管面積)，并計(jì)算新內(nèi)膜和中層間的比率。在所有情況下，都選擇顯示出最大程度新內(nèi)膜增生的單一片段進(jìn)行測(cè)面積法測(cè)定。
現(xiàn)在參考圖8a和8b，可看到外部壓皺傷害后14天時(shí)兔耳的主動(dòng)脈的光學(xué)顯微圖(代表性橫切片的Movat染色)。
在圖8a中，在未處理過的動(dòng)脈中，SMC通過破裂的內(nèi)彈性層而從中層遷移到新內(nèi)膜中，動(dòng)脈腔因突出的新內(nèi)膜而變窄?？煽闯?，有明顯的新內(nèi)膜形成，動(dòng)脈腔幾乎完全消除。
與此相反，在圖8b中可看到受到壓皺傷害和用鹵夫酮處理的兔耳動(dòng)脈。觀察到新內(nèi)膜的形成幾乎完全受到抑制。
圖9顯示了對(duì)照兔和用鹵夫酮(H)或合成擬肝素化合物(M)處理的兔子的新內(nèi)膜與中層間的比率的定量分析。每個(gè)點(diǎn)代表一只兔子。
如上文所述，式Ⅰ的喹唑啉酮衍生物，優(yōu)選鹵夫酮加入到金屬斯滕特固定模的聚合物基質(zhì)涂層中。該藥物分散或溶于聚合物溶液或熔解并通過淋濕或噴霧法而應(yīng)用到金屬斯滕特固定模上。以下實(shí)施例說明了鹵夫酮從聚合物涂層的釋放。應(yīng)注意應(yīng)選擇不會(huì)影響斯滕特固定模的正常性能的聚合物涂層，如當(dāng)其存在于血管內(nèi)時(shí)不會(huì)影響斯滕特固定模在應(yīng)用中的伸展或聚合物涂層的變形。
實(shí)施例1用聚合物基質(zhì)涂敷金屬斯滕特固定模制備聚乙烯乙酸乙烯酯(EVA,1％w/w二氯甲烷液)和0.1wt％鹵夫酮游離堿的溶液。將預(yù)期的斯滕特固定模在EVA-藥物溶液中浸漬一次并使該斯滕特固定模在室內(nèi)空氣中干燥，得到平滑均勻的約10微米厚的涂層。如果想得到更厚的涂層，可以將浸漬過程重復(fù)數(shù)次。為了改善EVA涂層在斯滕特固定模上的吸附，該固定模預(yù)先用原始聚合物涂層處理以使EVA涂層吸附。該涂層是可伸縮的并且不會(huì)影響該斯滕特固定模的可延伸性。聚合物和藥物的濃度可在0.1％到約10％聚合物濃度的范圍內(nèi)變化，藥物含量可在每聚合物重量1到約20％的范圍內(nèi)變化。利用涂敷次數(shù)或浸漬溶液中聚合物濃度可改變涂層的厚度。
聚合物載體可以是任何藥學(xué)上可接受的生物聚合物，它是不可降解的并且不溶于生物培養(yǎng)基，在生物學(xué)環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)于所選擇的斯滕特固定膜具有良好的吸附性，是可伸縮的，并且可從有機(jī)溶劑或者通過熔解方法作為涂層應(yīng)用于斯滕特固定模的表面。該聚合物載體的親水性或疏水性將由鹵夫酮從斯滕特固定模表面的釋放速率確定?？梢允褂糜H水性聚合物如甲基丙烯酸羥基乙基酯-甲基丙烯酸甲酯的共聚物和分節(jié)段聚尿烷(亞胺酯)(Hypol)。也可使用疏水性涂層如乙烯乙酸乙烯酯，硅膠體溶液，和聚尿烷(亞胺酯)的共聚物。優(yōu)選的聚合物是定為醫(yī)用級(jí)、在與血液的接觸中具有良好相容性的那些。涂層中可以包括其他抗增生劑，如肝素，類固醇和非類固醇類抗炎劑。為了改善涂敷后斯滕特固定模的血液相容性，可以使用親水性涂層如水合體(hydromer)-親水性聚尿烷(亞胺酯)。
實(shí)施例2鹵夫酮從聚合物涂層的釋放通過在37℃下將斯滕特固定模放入大量生理學(xué)溶液(0.1M磷酸鹽緩沖劑，pH7.4)中來體外測(cè)定藥物從其涂層的釋放。用HPLC定期測(cè)定藥物向溶液中的釋放。對(duì)于實(shí)施例1中所描述的涂層(在EVA中每聚合物重量用1％聚合物溶液和10％鹵夫酮浸漬一次)，在3周期間內(nèi)釋放約5-10mcg/cm2/天。當(dāng)使用限速涂層時(shí)，斯滕特固定模再在含有0和5％間的鹵夫酮的0.5％EVA溶液中浸漬。藥物釋放速率下降到?jīng)]有控速膜時(shí)釋放的約20％，然后用沒有藥物的涂層涂敷。另外，沒有瞬時(shí)釋放，藥物在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以恒定速率釋放。
通過改變涂層厚度，聚合物載體，藥物在聚合物中的含量，涂層的組分(親水性或疏水性添加劑；聚合物的摻合物)，藥物在涂層的各層中的含量，斯滕特固定模的結(jié)構(gòu)，以及控速膜的性能就可改變藥物釋放曲線和藥物釋放的持續(xù)時(shí)間。通過在斯滕特固定模的特定部位如僅在外表面上進(jìn)行涂敷(可通過選擇性噴霧涂敷或通過遮蓋住該固定模的內(nèi)面來實(shí)現(xiàn))或涂敷固定模的某個(gè)部分如邊緣也可能獲得足夠的效果。
結(jié)論目前的研究是利用肝素，蘇拉明，各種促生長(zhǎng)因子的抗體，抗凝血酶劑，以及最近的反義DNA技術(shù)來抑制血管SMC的增生。肝素是一種有力的抗凝劑，其抗增生活性相對(duì)較小且根據(jù)來源和制造公司的不同會(huì)有較大變化。蘇拉明在有效劑量時(shí)毒性也高，而抗體則是昂貴的，半衰期短且可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。關(guān)于反義途徑的信息是新的，目前還非常有限。
本發(fā)明，在其最優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用高效、低廉且無毒的化合物來抑制各種生長(zhǎng)因子包括bFGF的活性，并抑制血管SMC和成纖維細(xì)胞的自泌生長(zhǎng)。另外，鹵夫酮是可口服給藥的低分子量化合物。該化合物已被F.D.A.批準(zhǔn)用于飼養(yǎng)場(chǎng)動(dòng)物。這些特性使得鹵夫酮是最有前景的在臨床上用于抑制再狹窄的藥物。
因此，本發(fā)明提供了鹵夫酮作為無毒化合物有效地抑制SMC增生的用途，由此提供了抑制動(dòng)脈粥樣硬化、冠脈血管成形術(shù)后的再狹窄和隱靜脈移植物中新內(nèi)膜增生的病理生理學(xué)的有效對(duì)策。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，很顯然，本發(fā)明并不限于上述說明性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，并且在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)的情況下本發(fā)明還可以其他具體方式來實(shí)現(xiàn)，因此，期望的是本實(shí)施方案和實(shí)施例在所有方面都認(rèn)為是舉例說明性的而非限制性的，因此在權(quán)利要求的等效的含義和范圍內(nèi)所進(jìn)行的所有變化都包括在本文中。
權(quán)利要求
1．用于預(yù)防血管成形術(shù)后的再狹窄的涂敷有式Ⅰ的喹唑啉酮衍生物及其生理學(xué)上可接受的鹽的冠脈內(nèi)斯滕特固定模
其中n是1或2；R1是下列基團(tuán)中的一員氫，鹵素，硝基，苯并，低級(jí)烷基，苯基和低級(jí)烷氧基；R2是下列基團(tuán)中的一員羥基，乙酰氧基，和低級(jí)烷氧基，和R3是下列基團(tuán)中的一員氫和低級(jí)鏈烯氧基-羰基。
2．按照權(quán)利要求1的斯滕特固定模，其中所述喹唑啉酮衍生物是鹵夫酮。
全文摘要
本發(fā)明提供了涂敷有式(Ⅰ)的喹唑啉酮衍生物及其生理學(xué)上可接受的鹽的冠脈內(nèi)斯滕特固定模,式(Ⅰ)中n為1或2,R
文檔編號(hào)A61L31/10GK1219125SQ97194218
公開日1999年6月9日 申請(qǐng)日期1997年8月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月30日
發(fā)明者A·納格勒, S·斯拉溫, E·哈蘇姆, I·夫勞達(dá)夫斯基, E·蓋勒, M·琵尼斯 申請(qǐng)人:以色列農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究組織, 哈達(dá)西特醫(yī)藥研究服務(wù)與發(fā)展公司