衍生自MCoTI-II變體的人matriptase的高效力抑制劑的制作方法
【專利說(shuō)明】衍生自MCoTMI變體的人matriptase的高效力抑制劑
[0001] 本發(fā)明涉及胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶matriptase的新型高效力肽類抑制劑。
[0002] 胰蛋白酶是在脊椎動(dòng)物的小腸中普遍發(fā)現(xiàn)的最突出的消化酶之一。其耐人尋味的 分子結(jié)構(gòu)包括著名的催化三聯(lián)ASP-His-Ser作為核心特征實(shí)施其蛋白水解活性。該原型架 構(gòu)和切割堿性殘基之后的肽鍵的能力構(gòu)成了被稱為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的整類的生 物催化劑的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。該酶家族的成員參與多種生物過(guò)程和以可溶形式或作為膜錨 定實(shí)體存在。II型跨膜絲氨酸蛋白酶（TTSP)，例如，也通過(guò)N-末端結(jié)合于細(xì)胞表面，并已 被表征為各種效應(yīng)分子的細(xì)胞外周行進(jìn)和活化的重要調(diào)節(jié)子。[Antalis, Prog. Mol. Biol. Transl. Sci.,99(2011),l-50 ； Antal is, Biochem. J. , 428 (2010), 325 - 346 ；Bugge, J. Biol. Chem.，284(2009)23177-23181]。通過(guò)經(jīng)由特定TTSP的內(nèi)切蛋白酶切割從無(wú)活性前 體通過(guò)產(chǎn)生肽類激素、生長(zhǎng)和分化因子、受體、酶和粘附分子的活性形式。因此，它們?cè)诩?xì)胞 發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡的維持中起著關(guān)鍵作用。
[0003] 具有藥學(xué)相關(guān)性的膜-錨定的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的充分研究的實(shí)例是 matriptase。它在健康組織中的上皮細(xì)胞表面上廣泛表達(dá)，其中其蛋白水解活性受天然蛋 白酶抑制劑如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子抑制劑-1和2 (HAI-1、HAI-2)精確調(diào)控。然而，該生理抑制 劑-蛋白酶平衡的失調(diào)被認(rèn)為會(huì)促進(jìn)病理進(jìn)程。實(shí)際上，許多研究將matriptase的過(guò)表達(dá) 與上皮腫瘤以及骨關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展聯(lián)系起來(lái)。此外，Napp等人在鼠常 位胰腺腫瘤模型中觀察到顯著的體內(nèi)matriptase活性，并顯示活性位點(diǎn)抑制劑的施用顯 著減少了底物分析物的蛋白水解。因此，強(qiáng)效和選擇性的matriptase抑制劑具有巨大的治 療意義，并且其開發(fā)是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了許多呈現(xiàn)個(gè)位數(shù)納摩 爾至亞納摩爾抑制常數(shù)的小的合成的有機(jī)化合物以及大的抗體片段。
[0004] 本申請(qǐng)涉及微蛋白（microprotein)，優(yōu)選形成胱氨酸結(jié)的微蛋白（即屬于抑制劑 胱氨酸結(jié)（ICK)多肽的家族），或者編碼所述微蛋白的多核苷酸用于制備藥物組合物的用 途以及相應(yīng)的治療方法，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防可通過(guò)抑制matriptase的活性 來(lái)治療或預(yù)防的疾病。本發(fā)明還涉及微蛋白用于抑制matriptase活性，用于純化微蛋白， 作為matriptase的載體分子和用于檢測(cè)或定量樣品中的matriptase的用途，包括相應(yīng)的 診斷應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的化合物作為matriptase的抑制劑是有活性的并且特異性結(jié)合 matriptase。
[0006] 相信這些化合物可用于預(yù)防或治療癌性病況，其中matriptase的活性惡化所述 癌性病況。
[0007] 本發(fā)明的化合物的另一種用途是減緩癌性病況的進(jìn)展和細(xì)胞基質(zhì)的伴隨降解。
[0008] 本發(fā)明的化合物作為matriptase的絲氨酸蛋白酶活性的抑制劑是有活性的。 因此，含有適合于連接于固體/凝膠載體的位點(diǎn)的這些化合物可在體外用于親和層析， 以使用常規(guī)親和層析法從樣品純化matriptase或從樣品除去matriptase。使用常規(guī)方 法將這些化合物直接或通過(guò)適當(dāng)?shù)倪B接載體附著或偶聯(lián)于親和層析。見，例如，Current Protocols in Protein Science, John Wiley&Sons(J.E. Coligan 等，編輯，1997)和 ProteinPurificationProtocols,HumanaPress(S.Doonan，編輯，1966)和其中的參考文 獻(xiàn)。
[0009] 具有matriptase或MTSPl絲氨酸蛋白酶抑制性活性的本發(fā)明的化合物用于體外 測(cè)定來(lái)測(cè)量樣品中的matriptase或MTSPl活性和復(fù)合的與非復(fù)合的matriptase或MTSPl 的比率。這些測(cè)定還可用于監(jiān)測(cè)組織樣品（諸如來(lái)自活組織檢查）中的matriptase或 MTSPl活性水平，或監(jiān)測(cè)其中matriptase或MTSPl活性測(cè)量是有幫助的任何臨床狀況的 matriptase活性和復(fù)合的與未復(fù)合的matriptase的比率?？蓪y(cè)定樣品中的絲氨酸蛋白 酶活性的測(cè)定與ELISA組合使用，所述ELISA測(cè)定matriptase或MTSPl(無(wú)論是復(fù)合的還 是非復(fù)合的）的總量以測(cè)定復(fù)合的與非復(fù)合的matriptase的比率。
[0010] 各種動(dòng)物模型可用于評(píng)價(jià)本發(fā)明的化合物減少原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)或減少轉(zhuǎn)移的發(fā) 生的能力。
[0011] 這些模型可包括基因改變的嚙齒類動(dòng)物（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物）、最初來(lái)源于嚙齒類動(dòng)物 或人的和移植至同基因或免疫受損的宿主的可移植腫瘤細(xì)胞，或它們可包括專門的模型， 諸如下述被設(shè)計(jì)來(lái)評(píng)價(jià)化合物抑制據(jù)信是腫瘤生長(zhǎng)所必需的血管生長(zhǎng)（血管生成）的能力 的CAM模型。
[0012] 還可使用其它模型。
[0013] 適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型被選擇來(lái)基于一組相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)本發(fā)明中描述的化合物的體內(nèi) 抗腫瘤活性。例如，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可能是待檢查的特定腫瘤的matriptase或MTSPl和/或 matriptase或MTSPlmRNA的表達(dá)。滿足該標(biāo)準(zhǔn)的兩個(gè)人前列腺源性腫瘤是LnCap和PC-3 細(xì)胞系。另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可能是腫瘤來(lái)源于通常表達(dá)高水平的matriptase或MTSPl的組織。
[0014] 人結(jié)腸癌滿足該標(biāo)準(zhǔn)。第三標(biāo)準(zhǔn)同能是腫瘤的生長(zhǎng)和/或進(jìn)展依賴于matriptase 或MTSPl對(duì)底物（例如，sc-u-PA)的加工。人表皮樣癌H印-3滿足該標(biāo)準(zhǔn)。另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可 能是腫瘤的生長(zhǎng)和/或進(jìn)展依賴于需要matriptase或MTSPl活性的生物學(xué)或病理學(xué)過(guò)程。 另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可能是特定腫瘤誘導(dǎo)周圍組織的matriptase或MTSPl表達(dá)。
[0015] 其它標(biāo)準(zhǔn)也可用于選擇特定的動(dòng)物模型。
[0016] -旦選擇適當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞，就可向具有選定的腫瘤細(xì)胞的動(dòng)物施用待測(cè)試的化合 物，并隨后在對(duì)于選擇的模型是特異的確定的生長(zhǎng)期后測(cè)量腫瘤尺寸和/或轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。
[0017] 首先由Ossowski,L.，J.CellBiol.，107:2437-2445(1988)描述的CAM模型（雞 胚尿囊絨膜模型）提供了用于評(píng)價(jià)化合物的抗腫瘤和抗血管發(fā)生活性的另一種方法。
[0018] 可將不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞置于10日齡CAM上，并讓其靜置過(guò)夜。隨后如由Brooks 等人，MethodsinMolecularBiology, 129:257-269，（1999)所述，靜脈內(nèi)注射待測(cè)試的化 合物。在化合物施用后7天測(cè)量化合物抑制腫瘤生長(zhǎng)或至CAM中的侵入的能力。
[0019] 當(dāng)用作用于測(cè)量化合物抑制血管生成的能力的模型時(shí)，將含有血管生成因子諸如 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF)的濾片置于10日齡CAM 上，如由Brooks等人，MethodsinMolecularBiology, 129:257-269, (1999)描述的。在 過(guò)夜溫育后，隨后靜脈內(nèi)施用待測(cè)試的化合物。通過(guò)在施用化合物后48小時(shí)計(jì)數(shù)血管分枝 的量來(lái)測(cè)量血管生成的量（MethodsinMolecularBiology, 129:257-269, (1999))。
[0020] 本發(fā)明的化合物在體內(nèi)用于治療可通過(guò)降低的matriptase的絲氨酸蛋白酶活性 改善的病理狀態(tài)。
[0021] 據(jù)信這些化合物在減少或抑制轉(zhuǎn)移以及降解腫瘤和其它贅生物中的細(xì)胞外基質(zhì) 中是有用的。這些化合物可在治療特征在于細(xì)胞外基質(zhì)的病理性降解的病況、包括在本發(fā) 明的背景和引言中的上述疾病中用作治療劑。
[0022] 本發(fā)明包括用于預(yù)防或治療懷疑具有可通過(guò)抑制matriptase或MTSPl的絲氨酸 蛋白酶活性來(lái)減弱的病況的哺乳動(dòng)物的病況的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治 療有效量的選擇性抑制matriptase的絲氨酸蛋白酶活性的化合物或本發(fā)明的藥物組合 物。
[0023] 通常地在哺乳動(dòng)物中，優(yōu)選在人中體內(nèi)施用本發(fā)明的化合物。在體內(nèi)使用它們中， 可以以多種方式，包括口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)結(jié)腸、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻或腹膜內(nèi)，使 用多種劑型向哺乳動(dòng)物施用化合物。
[0024] 在實(shí)施本發(fā)明的方法中，將本發(fā)明的化合物單獨(dú)地施用或彼此組合地，或與其它 治療劑或體內(nèi)診斷劑組合地施用。
[0025] 如對(duì)于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員是顯而易見的，〃治療有效量〃的本發(fā)明的化合物 可視年齡、體重和待治療的哺乳動(dòng)物物種、待治療的疾病或病理狀況的階段、所使用的具體 化合物、具體施用模式和期望的效果和治療適應(yīng)癥而變化。因?yàn)檫@些因素和它們與測(cè)定該 量的相關(guān)系在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是公知的，因此治療有效劑量水平、實(shí)現(xiàn)抑制matriptase或MTSPl 絲氨酸蛋白酶活性的期望的結(jié)果所必需的量的測(cè)定在這些領(lǐng)域中的技術(shù)人員的能力范圍 內(nèi)。
[0026] 通常地，以較低劑量水平開始本發(fā)明的化合物的施用，逐漸增升高劑量水平直至 實(shí)現(xiàn)抑制matriptase活性至所需程度的期望的效果，這可確定治療有效量。對(duì)于本發(fā)明的 化合物，這樣的劑量為約0. 〇lmg/kg至約100mg/kg體重，優(yōu)選為約0. 01至約10mg/kg體重。
[0027] 鑒于上述解釋，清楚的是：仍然存在對(duì)matriptase的有效抑制劑的持續(xù)需要。因 此，本發(fā)明背后的技術(shù)問(wèn)題是使得可獲得可用于預(yù)防或治療可通過(guò)抑制matriptase活性 來(lái)預(yù)防或治療的疾病的其它matriptase抑制劑。優(yōu)選地，此類抑制劑應(yīng)當(dāng)克服與現(xiàn)有技 術(shù)的matriptase抑制相關(guān)的缺點(diǎn)，諸如不期望的副反應(yīng)、不充足的選擇性、高毒性、低穩(wěn)定 性、低生物利用度和/或不充足的結(jié)合親和力。
[0028] 該技術(shù)問(wèn)題通過(guò)提供在權(quán)利要求中表征的實(shí)施方案來(lái)解決。
[0029] 因此，本發(fā)明涉及微蛋白或編碼所述微蛋白的多核苷酸用于制備藥物組合物的用 途，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防可通過(guò)抑制matriptase的活性來(lái)治療或預(yù)防的疾病。
[0030] 本發(fā)明基于微蛋白能夠高效力地結(jié)合matriptase的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā) 明的用途是指能夠顯著抑制matriptase的活性的微蛋白的用途。
[0031] 術(shù)語(yǔ)〃微蛋白〃通常是指具有不超過(guò)50個(gè)氨基酸的相對(duì)小的尺寸和基于 分子內(nèi)的二硫鍵的確定的結(jié)構(gòu)的多肽。微蛋白通常是高度穩(wěn)定的并且對(duì)熱、PH和蛋 白水解降解具有抗性。目前關(guān)于微蛋白，特別地關(guān)于它們的結(jié)構(gòu)和發(fā)生的知識(shí)，例如 綜述于Craik,Toxicon, 39 (2001) 43-60 ;Pallaghy,ProteinSci. 10 (1994) 1833-9; Reinwarth,Molecules17(2012), 12533-52 中。
[0032] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的微蛋白包含至少6個(gè)半胱氨酸殘基，其中6個(gè)半 胱氨酸殘基通過(guò)二硫鍵連接以形成胱氨酸結(jié)。
[0033] 此類微蛋白也稱為抑制劑胱氨酸結(jié)（ICK)多肽，并且也如在下列解釋中那樣稱 謂。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"胱氨酸結(jié)"是指由ICK多肽形成的三維結(jié)構(gòu)，其特征在于通過(guò)三_二硫鍵 框架穩(wěn)定的小的三重P折疊，其包括由兩個(gè)二硫鍵和其連接主鏈區(qū)段形成的嵌入環(huán)，第 三二硫鍵穿過(guò)該環(huán)。優(yōu)選地，胱氨酸結(jié)由六個(gè)保守的半胱氨酸殘基與所述連接主鏈區(qū)段 形成，其中第一二硫鍵在第一與第四半胱氨酸殘基之間，第二二硫鍵在第二與第五半胱氨 酸殘基之間，第三二硫鍵在第三與第六半胱氨酸殘基之間，第三二硫鍵穿過(guò)由其它兩個(gè) 二硫鍵與其連接主鏈區(qū)段形成的環(huán)。如果認(rèn)為合適，則二硫鍵可被其化學(xué)等同物替代， 所述化學(xué)等同物同樣地確保胱氨酸結(jié)的整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的形成。用于測(cè)試給定的微蛋白是 否已形成了正確的胱氨酸結(jié)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可確定哪些胱氨酸殘基彼此相連。這 可以，例如，根據(jù)Goransson(J.Biol.Chem. 278 (2003) ,48188-48196)和11〇?1〇.81〇1. Chem. 279(2004)，35867-35878)中描述的技術(shù)來(lái)進(jìn)行。具有胱氨酸結(jié)的微蛋白例如描述于 Craik(2001);Pallaghy(1994)和Craik(J.Mol.Biol. 294 (1999) ,1327-1336)中。
[0035] 結(jié)合本發(fā)明使用的微蛋白可具有擁有開放或環(huán)狀構(gòu)象的肽主鏈。開放構(gòu)象優(yōu)選 指在N末端上具有氨基并且在C末端上具有羧基的微蛋白。然而，末端的任何