專利名稱：氨基苯駢二氮雜的制作方法
技術領域：
本發(fā)明有關于具有式Ⅰ結構的氨基苯駢二氮雜
及其藥物上可接受的鹽類
其中R1是氫，NO2，鹵素，CF3，低級烷基，OH，低級烷氧基或CN，R2是氫或CH3。
本發(fā)明的目的是上述化合物本身以及將它們用作治療藥物，特別是治療或預防病毒感染，尤其是反錄病毒感染，諸如HIV1和/或HIV2感染，或使細胞免遭這類感染;
本發(fā)明還有關于制造這些化合物以及含有一種這類化合物及任意一種第二類抗病毒藥劑，特別是逆轉錄酶抑制劑在內的藥劑的方法，這第二類抗病毒藥劑可以是ddC，AZT，HIV-蛋白酶抑制劑，α-，β-和/或γ-干擾素，白介細胞素-2和/或GM-CSF。
本發(fā)明還包括應用這些化合物來制造藥劑，特別是治療和預防病毒感染，尤其是反錄病毒感染，諸如HIV1和/或HIV2感染，或使細胞免遭這類感染的藥劑。
上面所用的術語“低級”烷基是指直鏈或支鏈的，不超過7個碳原子的烴鏈，比如甲基，乙基，丙基和異丙基等。
藥物上可接受的鹽可以是那些和有機酸如乳酸，醋酸，蘋果酸，或對甲苯磺酸形成的鹽類，或者是和無機酸如鹽酸或硫酸形成的鹽類。
上述化合物可能以立體異構或互變異構的形式存在，它們都被包括在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明中優(yōu)選的化合物是那些R1是氯的化合物，特別是7-氯-N-甲基-5-(1H-吡咯-2-基)-3H-1，4-苯駢二氮雜
-2-胺。
具有式Ⅰ所示結構的化合物可以用具有式Ⅱ結構的苯駢二氮雜
或相應的酰胺(即氧替代了硫)與結構式為R2-NH2的化合物反應來制備。反應可以按通常的方式完成，例如在-78℃將苯駢二氮雜
硫酮在四氫呋喃和甲醇中形成的溶液與氨反應，或在一種惰性溶劑如四氫呋喃，甲苯或二氧六環(huán)中，在一種Lewis酸如TiCl4或SnCl4存在的條件下，將對應的酰胺與R2-NH2進行反應。所用的苯駢二氮雜
硫酮類化合物Ⅱ可以由相應的酰胺和五硫化磷或2，4-雙-(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二膦乙烷-2，4-二硫化物(Lawessen試劑)，于50-100℃在四氫呋喃，甲苯，吡啶或二氧六環(huán)中進行反應來制備。
化合物Ⅰ和它們的鹽類具有有用的抗病毒活性，特別是抗反錄病毒的活性，尤其是抗HIV的活性，這后一種病毒與愛滋病的發(fā)展有關，還和有關的疾病如ARC(愛滋病有關的綜合癥)等有關。這些化合物也通過抑制重要的HIV病毒功能如TAT(轉活轉錄)活性而能抑制HIV復制。
可按下面的實驗來試驗化合物Ⅰ抑制HIV-細胞病的效果和減少與病毒抗原結合的細胞數(shù)目的效果在補充了10%的胎兒小牛血清和0.1毫克/毫升慶大霉素的RMPI-1640培養(yǎng)液中(Gibco實驗室)，使高效價的病毒原株(HIV-1 NIT毒株)在CD+4CR10細胞中生長。將所收集的培養(yǎng)液過濾并將病毒析離物濃縮100倍，儲存于-80℃。把在同一種培養(yǎng)液中繁殖的CD+4CEM細胞，在感染倍數(shù)(MOI)等于1的條件下于37℃用稀釋的毒株孵育60分鐘。把細胞用磷酸鹽緩沖的食鹽水洗滌，重新懸浮于培養(yǎng)液中，并使其濃度為2×105細胞/毫升，加入不同量的試驗化合物在二甲亞砜中的溶液;感染4天后用臺盼藍分離法計數(shù)存活的細胞數(shù)目(參見Proc.Natl.Acad.Sci.83，1986，1911)。同時，把等分的細胞用丙酮固定并用取自愛滋病人的抗體染色，接著第二次用熒光素結合的山羊抗人體免疫球蛋白(Cappel)染色。這樣，經熒光抗體染色的細胞即可用熒光顯微鏡計數(shù)，實驗結果表示為總的計數(shù)過的細胞中染色細胞的百分數(shù)(J.Med.Virol.19，1986，325)。
實驗結果可用ID50(μM)來表示，它是指能把免疫熒光呈陽性的細胞數(shù)目減少50%所需的試驗化合物的濃度，對于實例1中制得的產物(化合物A)，此值為0.5至1μM，對于實例2中制得的產物(化合物B)，此值為1μM。
為進行細胞毒性試驗，可將CEM細胞用相似濃度的式Ⅰ化合物處理，并通過計數(shù)存活細胞的數(shù)目來測量化合物的毒性。
附
圖1和附圖2描繪了化合物A的抗HIV活性，圖1是顯示用化合物A處理過的被HlV-1感染過的CEM細胞的存活率。圖1也顯示當細胞用增加量的化合物A處理后，導致用HlV抗體感色后呈免疫熒光陽性的細胞的百分數(shù)降低。圖2提供了化合物A與AZT、ddC在抗HIV活性方面的比較數(shù)據(jù)，是分別用細胞存活率，P24抗原和病毒的RNA量測定的。
試驗化合物A和B的抗HlV-TAT活性的實驗方法可按下列步驟進行(a)把分泌鹼性磷酸脂酶(SeAp)的基團表達和病毒活性轉移者TAT的基因表達都置于HIV促進劑LTR的控制下，后者可響應HlV活性轉移者TAT的作用;
(b)用含有上述(a)中基因構成的原生質體轉染培養(yǎng)的哺乳動物細胞，并引起轉活因子TAT和SeAP的細胞增殖;
(c)加入被試驗的藥物，這里是化合物A和B，并通過測量SeAP酶活性來測定增殖的SeAP的量，藉助SeAP增殖被抑制的情況來和藥物的抗TAT抑制活性相關連。在這一分析方法中，SeAP增殖的抑制和抗TAT的活性正性相關，即藥物抑制SeAP增殖的能力愈大，它的抗TAT活性也愈大。
具體地說，有關下面報告的實驗結果，是按下述試驗方法測定其抗HIV-TAT活性的
在轉染24小時以后，往COS細胞的培養(yǎng)液中分別加入1，10，25和50μM待試驗的具有式Ⅰ結構的化合物，這些COS細胞是用兩種原生質體轉染的，其中一種含有報道基因，它能在HlV-LTR控制下為SeAP編碼，另一種含有HlV-TAT基因，它也在HlV-LTR控制之下，培養(yǎng)液的鹼性磷酸酯酶活性在加入試驗化合物48小時后，用對硝基苯基磷酸酯為底物，通過比色法進行測定。藥物的抗TAT活性，是通過在HlV-LTR控制下SeAP基因表達的抑制百分數(shù)，相對于在RSV-LTR控制下的SeAP基因表達的抑制百分數(shù)來衡量的，RSV-LTR對TAT沒有響應。每種被試驗的化合物A和B，經過三次獨立的分析測定，其抗HlV-TAT活性的平均值按上述抑制百分數(shù)計算均優(yōu)于60%。
這些實驗結果表明化合物A和B是HlV-TAT控制的基因表達的專一性抑制劑，而沒有非專一性的細胞毒性效應。
化合物A和B作為TAT抑制劑的專一性可用一個平行試驗來證實，在其中把SeAP的基因表達置于骨髓瘤病毒(RSV)-LTR的控制之下，它對TAT沒有響應;這一試驗消除了化合物A和B具有一般細胞毒性或抑制SeAP活性的可能性。
被試驗的化合物的抗HIV-TAT活性，可通過細胞培養(yǎng)液的上清液中堿性磷酸酯酶的量來決定，在其中SeAP的基因表達是在HIV-LTR促進劑的控制之下;被試驗化合物的專一性抑制活性可按下式計算100〔(1-A/B)-(1-C/D)〕其中A和B分別表示在有和沒有試驗化合物存在時被HIV-LTR/SeAP增長的堿性磷酸酯酶的活性，C和D分別表示在有和沒有試驗化合物存在時被RSV-LTR/SeAP增長的堿性磷酸酯酶的活性。試驗化合物的濃度范圍從1至50μM，提供的結果是至少三次實驗的平均值。試驗化合物是在細胞被用原生質體轉染24小時以后才加入的，這時SeAP專有的mRNA和蛋白質已經存在并且蛋白質是很穩(wěn)定的。因此，用這一分析程序不可能觀測到100%的抑制。圖3報告了對化合物A進行測定的結果。
也曾用能在HIV-LTR控制下在組成上表達SeAP基因的細胞株來試驗化合物A的抗HIV-TAT活性。細胞株193C，191F，199F是衍生自CHO細胞(中國倉鼠卵巢的細胞株)每一株都是無性系源的，并且在細胞染色體中整合有HlV-LTR/SeAP和HlV-LTR/TAT的序列。一天之后細胞被嗜斑(約30%點)，然后往培養(yǎng)液中加入所需濃度的化合物A在DMSO中的溶液(濃度為0.05%)。一天之后洗滌細胞并補加化合物A;在第二次加入試驗化合物的兩天之后測定SeAP的活性。圖4給出的細胞毒性測量的結果表明，化合物A有意義地抑制在HlV-LTR促進劑控制下的SeAP表達(由圖中頂端的幾條線可證實)，同時對細胞沒有細胞毒性效應(由圖中下端的虛線證實)。
對于感染了HlV的人類患者，和有癥狀或無癥狀的HlV感染患者，具有式Ⅰ結構的化合物或其鹽類的抗病毒有效用藥量為每天0.1至10毫克/公斤體重，最好是0.3至5毫克/公斤體重，更好是大約1至3毫克/公斤體重。這一劑量可通過在一天的不同時間間隔一次或分數(shù)次給藥;非腸道給藥或口服均可，但最好是每天口服一次。
這些化合物也可以和別的抗病毒藥物和/或生物應搭修飾劑一道用藥。例如，它們可以和已知的RT(逆轉錄酶)抑制劑如ddC，AZT和ddI一道用藥，也可以和其它能作用于別的HIV蛋白，如蛋白酶的抑制劑以及生物修飾劑如α，β和/或γ干擾素，白介細胞素-2和/或GM-CSF等一道用藥。對于ddC，用藥范圍在大約0.005-0.25毫克/公斤體重時，在大多數(shù)患者身上即有抑制病毒的效果?？诜盟幍某醮蝿┝糠秶^寬，例如從0.001至0.25毫克/公斤體重，可相隔2，4，6，8或12小時，一次或多次服藥。通常最好是每隔8小時按0.01毫克/公斤體重服用ddC。在聯(lián)合治療中，其它抗HIV藥物可以和本發(fā)明中的化合物同時給藥，但如果需要也可交錯給藥。兩種(或更多種)藥物可以聯(lián)合用于一種組成中，當聯(lián)合用藥時每種藥物的劑量可比單獨用藥時小一些。
對于本發(fā)明中的化合物，可以單獨以溶液的形式給藥。但最好是活性成份以藥物制劑或組合物形式給藥。這些制劑包含至少一種活性成份，還有一種或多種藥物上可接受的載體或賦形劑以及任意其它藥劑，例如蛋白酶抑制劑。這些載體包括那些適用于口服，直腸給藥，經鼻腔給藥，皮膚表面給藥，頰部用藥，舌下用藥，陰道用藥，非腸道用藥(包括皮下、肌內、靜脈內、真皮內的注射)的載體物質。
本發(fā)明的藥劑組合物實例有活性組份在水或鹽水中的溶液，膠囊如軟明膠膠囊，粉劑或片劑，每種組合物都含事先決定好數(shù)量的活性成份，也可以是粒劑，溶液，或在水溶液中的懸浮液，或油在水中的乳液，或水在油中的乳液。片劑可包括一種或多種賦形劑如乳糖，微晶纖維素，膠體二氧化硅，Croscarmellose鈉，硬脂酸鎂，硬脂酸等，著色劑和藥物上合適的載體，適合于皮膚用藥的制劑包括錠劑，其中的活性成份包含在一種調味劑，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠中;軟錠劑是把活性成份包含在一種惰性基質如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠中;漱口藥劑則把活性成份包含在合適的液體載體中。為直腸用藥的制劑是由合適的基質包括可可脂或水揚酸酯制成的栓劑。適用于陰道用藥的制劑可做成陰道栓劑，棉塞，乳膏，凝膠劑，糊劑，泡沫劑或噴霧劑;適用于非腸道給藥的制劑包括水或非水的等滲無菌注射液，其中可含有抗氧化劑，緩沖劑，制菌劑，以及使制劑與受體的血液等滲的溶質;水和非水的無菌懸浮液可包含懸浮劑和增稠劑。制劑可包裝在含有一次劑量或多次劑量的密封容器如安瓿和小瓶中，也可在冷凍干燥的條件下儲存，當需要使用時只需加入無菌的液體載體比如水，即可供注射。臨時的注射溶液和懸浮液可由前述的無菌粉劑、粒劑和片劑來制備。
實施例1把0.5克7-氯-1，3-二氫-5-(1H-吡咯-2-基)-1，4-苯駢二氮雜
-2-酮在25毫升THF(四氫呋喃)中形成的溶液在干冰/丙酮浴中冷卻，往此溶液中通入甲胺氣體并在攪拌下滴加0.29毫升TiCl4，在室溫反應5小時后，再加入另外0.2毫升TiCl4。18小時后加入小片冰并將反應混合物過濾，用THF洗滌并濃縮，產物由CH2Cl2/甲醇中結晶，再由乙醇中重結晶，得到0.25克(48%)7-氯-N-甲基-5-(1H-吡咯-2-基)-3H-1，4-苯駢二氮雜
-2-胺，熔點251℃。
實施例2a)在攪拌下往10克7-氯-1，3-二氫-5-(1H-吡咯-2-基)-1，4-苯駢二氮
-2-酮在400毫升THF中形成的溶液中加入10克P4S10，反應混合物在40℃用超聲波照射，2.5小時后往混合物中加入另外10克P4S10，繼續(xù)反應2小時。反應混合物冷卻到室溫并過濾。固體產物用CH2Cl2洗滌后，匯合的濾液真空蒸餾除去其中80%的溶劑，殘余物用飽和碳酸氫鈉溶液堿化，濾出沉淀的產物，濾液用CH2Cl2提取，然后減壓濃縮，得到的固體由THF/石油醚中重結晶，得到9.9克(產率94%)7-氯-1，3-二氫-5-(1H-吡咯-2-基)-1，4-苯駢二氮雜
-2-硫酮，熔點258-260℃分解。
b)0.5克上述a)的產物在5毫升THF及200毫升甲醇中形成的溶液冷卻到-78℃，往其中通入NH3氣，然后使反應物慢慢升到室溫并攪拌12小時，蒸去溶劑得到7-氯-5-(1H-吡咯-2-基)-3H-1，4-苯駢二氮雜
-2-胺，產率40%，熔點177-179℃分解。
下列含有前面定義的化合物Ⅰ或它的鹽作為活性組分的草本制劑，可按通常已知的方法制備片劑配方成分 毫克/片活性成分 20毫克乳糖 180毫克預凝膠化淀粉 15毫克口服液配方成分 毫克/劑活性成分 20.0毫克對-羥基苯甲酸甲酯 20.0毫克蔗糖 適量調味香料 適量檸檬酸緩沖液 適量純化水加至 5毫升片劑配方成分 毫克/片活性成分 20毫克淀粉 40毫克微晶纖維素 80毫克乳糖 274毫克硬脂酸鎂 2毫克416毫克軟膠囊劑配方成分 毫克/膠囊活性成分 20毫克乙氧基化的脂肪酸 500毫克PEG4000(一種聚乙二醇) 100毫克植物油加至 1.0毫升
權利要求
1.一種制造具有式Ⅰ所示的氨基苯駢二氮雜
及其藥物上可接受的鹽類的方法
其中R1是氫，NO2，鹵素，CF3，低級烷基，OH，低級烷氧基或CN，R2是氫或CH3，它包括把具有式Ⅱ所示的苯駢二氮雜
或相應的酰胺(即氧替代了硫)與R2-NH2進行反應而制得。
2.一種如權利要求1所述的方法，其中R1是Cl。
3.一種如權利要求1或2所述的方法，用它制備了7-氯-N-甲基-5-(1H-吡咯-2-基)-3H-1，4-苯駢二氮雜
-2-胺。
4.一種制造一種藥劑的方法，該藥劑可用來治療或預防病毒感染，特別是反錄病毒感染，諸如HIV1和/或HIV2感染，或使細胞免遭這類感染;它包括把一種權利要求1，2或3中所述的具有式Ⅰ的化合物或它的鹽類，以及任何一種第二類抗病毒藥劑，特別是逆轉錄酶抑制劑如ddC，AZT，HIV蛋白酶抑制劑，α，β和/或γ干擾素，白介細胞素-2和/或GM-CSF制成草本制劑的形式。
5.一種藥劑，可用來治療或預防病毒感染，特別是反錄病毒感染，諸如HIV1和/或HIV2感染，或使細胞免遭這類感染，它含有一種權利要求1、2或3中所述的具有式Ⅰ的化合物或它的鹽類作為活性藥物組分，以及任何一種第二類抗病毒藥劑，特別是逆轉錄酶抑制劑如ddC，AZT，HIT蛋白酶抑制劑，α，β和/或γ干擾素，白介細胞素-2和/或GM-CSF。
6.把權利要求1、2或3所述的化合物用來制造一種藥劑，它可用來治療或預防病毒感染，特別是反錄病毒感染，諸如HIV1和/或HIV2感染，或使細胞免遭這類感染。
7.具有式Ⅰ所示的氨基苯駢二氮雜
及其藥物上可接受的鹽類，
其中R1是氫，NO2，鹵素，CF3，低級烷基，OH，低級烷氧基或CN，R2是氫或CH3，無論是用權利要求1中所述的方法還是一種明顯在化學上與之等價的方法所制備。
8.如權利要求7中所述的化合物，其中R1是Cl，無論是用權利要求2中所述的方法還是一種明顯在化學上與之等價的方法所制備。
9.7-氯-N-甲基-5-(1H-吡咯-2-基)-3H-1，4-苯駢二氮雜
-2-胺，無論是用權利要求3中所述的方法還是一種明顯在化學上與之等價的方法所制備。
10.上文所述的各種化合物，組合物，制造方法和用途，特別是實例中所示的。
11.具有式Ⅱ所示結構的苯駢二氮雜
硫酮，其中R1的定義如權利要求1中所述。
全文摘要
一種具有式I所示的氨基苯駢二氮雜及其藥物上可接受的鹽類，其中R
文檔編號A61K31/55GK1057462SQ9110434
公開日1992年1月1日 申請日期1991年6月17日 優(yōu)先權日1990年6月18日
發(fā)明者阿尼·羅伯特·貝里民, 詹姆斯·瓦林廷·俄雷, 明-初·舒, 司特烏·易克-凱·湯姆 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司