本發(fā)明涉及一種干預(yù)口腔鱗狀細胞癌細胞生長的藥物，具體地說是以中草藥漏蘆為原料，經(jīng)乙酸乙酯提取，即漏蘆乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract，EA)。本發(fā)明還涉及該藥物的制備方法。

背景技術(shù)：

祁州漏蘆(Rhaponticum uniflorum，DC.)多年生草本，根直伸，莖直立，不分枝，簇生或單生，灰白色，被棉毛。生于山地草原、草甸草原、石質(zhì)山坡。分布黑龍江、吉林、遼寧、河北、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、青海、山西、河南、四川、山東等地。

《本草綱目》上描述其功效：“漏蘆，下乳汁、消熱毒、排膿、止血、生肌、殺蟲，故東垣以為手、足陽明藥，而古方治癰疽發(fā)背，以漏蘆湯為首稱也。龐安?！秱摗分伟b疽及預(yù)解時行痘疹熱，用漏蘆葉，云無則以山梔子代之，亦取其寒能解熱，蓋不知其能入陽明之故也”。漏蘆為較常用中藥，早有“久服輕身益氣，耳目聰明，不毛延年”的記載。漏蘆既以其苦寒通利之性，清泄陽明經(jīng)之熱，又因其益氣活血、強健脾胃之功能，故久服可延年益壽。但多年來臨床中多取其清熱解毒、消癰腫、下乳汁之功效，對其抗腫瘤的作用研究較少。

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，占頭頸部惡性腫瘤的40％。世界范圍內(nèi)每年有接近540,000例新發(fā)病例，盡管近年來口腔癌治療的技術(shù)不斷提高，但5年生存率不足50％(1)。在發(fā)展中國家，口腔癌成為主要致死性疾病之一。目前，對于口腔癌主要采用手術(shù)治療，放射治療，化學(xué)藥物治療為主的綜合序列治療，但治療效果往往不佳。理想的抗癌藥物應(yīng)具備低毒、安全、有效、價廉等條件。中藥是我國醫(yī)學(xué)瑰寶，現(xiàn)代藥理研究表明許多傳統(tǒng)中藥具有抗腫瘤作用，且具有優(yōu)效、低毒、低副作用的優(yōu)點。目前，中藥已成為腫瘤預(yù)防和治療新的研究熱點。尋找新型低毒高效的治療藥物對口腔癌綜合治療具有重要意義。

漏蘆始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。味苦、咸，性寒，入胃，大腸經(jīng)，具有清熱解毒、消癰排膿、通乳功效。研究表明，漏蘆揮發(fā)油有醇類，酮類，烷烴類，烯類，萜類，酚類等化合物.其中主要為萜類化合物，萜類化合物是存在于植物界的具有多方面生物活性的有意義的一類化合物，是某些中藥的有效成分.如上述揮發(fā)油中都含有的石竹烯、欖香烯等活性有效成分分別具有鎮(zhèn)痙、抗病毒、驅(qū)蟲等作用(2)。近年來，一些研究表明，漏蘆具有抗氧化、提高免疫、抗炎及抗衰老、抗腫瘤等作用(3-6)。其抗腫瘤作用機制可能通過誘導(dǎo)細胞凋亡、逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株對化療藥的敏感性、抑制腫瘤細胞增殖等作用。相關(guān)研究表明，漏蘆提取物大劑量時可發(fā)揮直接抑瘤抗癌作用。在小劑量時可發(fā)揮突出的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，有助于讓已耐藥的細胞株對化療藥重獲敏感；可有效逆轉(zhuǎn)對人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR的耐藥性，因而在臨床上有廣闊的應(yīng)用前景(7-8)。漏蘆復(fù)方制劑可有效治療原發(fā)性肝癌(9)。在荷瘤動物試驗中，漏蘆及其復(fù)方制劑具有明顯的抑制腫瘤作用，其作用可能與其增高機體免疫機能和抗氧化能力有關(guān)(10-11)。但目前漏蘆對口腔癌作用等方面的研究尚未見報道。

研究表明，抑制細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上皮細胞后促進EMT相關(guān)因子表達(12)。當(dāng)大鼠胚胎肝細胞發(fā)生EMT時，能夠促進Akt以及Bcl-xL的活化，進而抑制TGF-β誘導(dǎo)的凋亡，這些細胞具有肝前體細胞以及一些肝細胞瘤的性質(zhì)。據(jù)此推測，EMT的細胞活化了抗凋亡的信號通路(AKT和PI3K)或者分泌了抗凋亡的因子。多種不同的哺乳動物上皮細胞(EpH-4、NMuMG和KIM-2)在經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)生EMT之后，對紫外線照射誘導(dǎo)的凋亡具有明顯的耐受性(13)。

本研究發(fā)現(xiàn)漏蘆EA抑制SCC15細胞增殖，且隨時間增加抑制作用增強；可顯著誘導(dǎo)SCC15細胞凋亡，并且具有時間和濃度依賴性；漏蘆EA抑制SCC15細胞侵襲及遷移；并具有逆轉(zhuǎn)口腔癌細胞SCC15上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。漏蘆EA導(dǎo)致促凋亡相關(guān)的p-p38和p-JNK表達顯著增高，使促增殖相關(guān)的p-ERK表達降低。漏蘆EA影響EMT進程，從而抑制口腔癌生長、侵襲及遷移。

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現(xiàn)有技術(shù)背景缺陷：口腔癌主要采用手術(shù)治療，放射治療，化學(xué)藥物治療為主的綜合序列治療，但治療效果往往不佳?，F(xiàn)代藥理研究表明許多傳統(tǒng)中藥具有抗腫瘤作用，且具有優(yōu)效、低毒、低副作用的優(yōu)點。人們開始逐步重視于傳統(tǒng)中藥的開發(fā)，尋找新型低毒高效的治療藥物對口腔癌綜合治療具有重要意義。本實驗所用提取溶劑為脂溶性溶劑乙酸乙酯，較常規(guī)的水提物更能夠較充分的溶解漏蘆中的有效物質(zhì)。本發(fā)明為臨床治療口腔癌新藥的研發(fā)提供依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是根據(jù)漏蘆抗氧化，調(diào)高免疫，抗腫瘤等直接或間接的抗腫瘤作用，來檢測漏蘆乙酸乙酯提取物是否具有抗口腔癌作用，以期為口腔癌的臨床藥物治療提供新的支持。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。

具體包括以下步驟：

(1)漏蘆乙酸乙酯提取物的制備

漏蘆樣品粉碎成粗粉，取粗粉500克，用80％乙醇濕潤后，再用3倍量80％乙醇回流提取兩次，合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味，用等體積乙酸乙酯萃取2次(上層液體)，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至干，得乙酸乙酯萃取物(EA)。

(2)漏蘆EA對SCC15細胞增殖的影響

將12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml不同濃度的漏蘆EA作用于SCC15細胞后，SCC15細胞增殖受到不同程度的抑制。隨著藥物濃度的升高，SCC15細胞增殖抑制率亦隨著升高。漏蘆EA作用SCC15細胞24h,48h,72h的IC50分別為112.62±0.21μg/ml,87.71±0.49μg/ml和65.19±0.46μg/ml，提示漏蘆EA對SCC15細胞增殖具有抑制作用，且隨時間增加抑制作用增強。

(3)漏蘆EA對SCC15細胞的凋亡的影響

將12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml不同濃度的漏蘆EA分別作用于SCC15細胞24h,48h，采用FITC/PI雙染色法，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示，同時間內(nèi)，隨著藥物濃度增加，細胞凋亡率顯著增加；相同濃度下，48h比24h凋亡率增加明顯。說明漏蘆EA可顯著誘導(dǎo)SCC15細胞凋亡，并且具有時間和濃度依賴性。

(4)漏蘆EA對凋亡相關(guān)磷酸化蛋白p38、JNK及ERK1/2作用

采用Western blot檢測漏蘆EA處理后SCC15細胞中MAPK信號通路中凋亡相關(guān)指標磷酸化p38(p-p38),磷酸化JNK(p-JNK),磷酸化ERK1/2(p-ERK)的變化。50μg/ml漏蘆EA處理口腔癌細胞SCC15 48h后，與促凋亡相關(guān)的p-p38和p-JNK表達顯著增高，而與促增殖相關(guān)的p-ERK表達降低。結(jié)果表明，漏蘆EA具有促進細胞凋亡的作用。

(5)漏蘆EA對SCC15細胞侵襲及遷移的影響

采用Transwell侵襲實驗和劃痕實驗檢測漏蘆EA對SCC15細胞的侵襲及遷移的影響。侵襲實驗中，12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml三種不同濃度的漏蘆EA能不同程度抑制SCC15細胞的侵襲能力，與對照組相比，漏蘆EA組細胞隨著藥物濃度增加侵襲能力逐漸下降。劃痕實驗結(jié)果顯示：12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml三種不同濃度的漏蘆EA處理SCC15細胞24h，48h，可不同程度降低SCC15細胞的體外愈合能力，隨著藥物濃度的增加抑制遷移作用越明顯。

(6)漏蘆EA對SCC15細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

50μg/ml漏蘆EA處理口腔癌細胞SCC15 48h，Q-PCR和Western blot對EMT相關(guān)指標E-cadherin，Snail,Vimentin的mRNA及蛋白的表達進行檢測。結(jié)果顯示，E-cadherin表達增高，Snail,Vimentin表達降低。說明漏蘆EA具有逆轉(zhuǎn)口腔癌細胞SCC15上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。

附圖說明

圖1.漏蘆EA對SCC15細胞增殖的影響；

圖2.漏蘆EA對SCC15細胞遷移的影響；

圖3.漏蘆EA對SCC15細胞侵襲的影響；

圖4.漏蘆EA對SCC15細胞EMT相關(guān)分子表達影響

圖5.漏蘆EA對SCC15細胞凋亡的影響；

圖6.漏蘆EA對SCC15細胞MAPK凋亡相關(guān)蛋白的表達影響；

具體實施方式

(1)CCK-8法：

采用CCK-8法檢測細胞增殖。實驗設(shè)置實驗組，漏蘆EA濃度分別為12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml；對照組，與實驗組同濃度的DMSO。取對數(shù)生長期細胞，用含0.25％EDTA胰酶消化，離心，棄上清。用含有10％血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2.5×10⁴個/ml。每孔接種200μl細胞懸液入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組4個復(fù)孔。貼壁過夜后，吸棄上清，按組加入含有不同濃度漏蘆EA的培養(yǎng)液(血清含量為10％)，并設(shè)溶劑對照組繼續(xù)培養(yǎng)不同時間(24h、48h、72h)。每孔加190μl培養(yǎng)基和10μl CCK8試劑，置于37℃、5％CO₂飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)2.5h后終止培養(yǎng)。在酶標儀上測定各孔吸光度(A值)，選擇450nm波長，記錄結(jié)果，并按以下公式計算增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(A_實驗組-A_空白組)/(A_對照組-A_空白組)×100％。實驗重復(fù)3次。

(2)細胞劃痕實驗：

將對數(shù)生長期SCC15細胞按每孔5×10⁵個接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞生長至融合后，用200ul黃色槍頭垂直劃痕。實驗組分別加含不同漏蘆EA濃度(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)的無血清培養(yǎng)基，對照組加入同等濃度DMSO，放入37℃、5％CO₂飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)，按24h、48h顯微鏡下取樣，拍照。每組取三個部位拍照并測量劃痕兩側(cè)細胞間相對距離，距離變化除以2為細胞相對遷移距離，計算細胞相對遷移率：相對遷移率(％)＝相對遷移距離/0h劃痕邊緣距劃痕中線距離，重復(fù)三次并進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗重復(fù)3次。

(3)Transwell侵襲實驗：

采用24孔板Transwell小室進行，小室包被有膠原基質(zhì)的matrigel濾膜孔徑為8μm。將凍存于-80℃冰箱的BD matrigel 4℃過夜。無血清培養(yǎng)基1:5稀釋，吸取100μl均勻鋪到Transwell小室上室，放入37℃、5％CO₂飽和濕度孵箱內(nèi)過夜。在上室中加入100μl預(yù)溫?zé)o血清DMEM，室溫孵育。分別將含有12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml漏蘆EA的培養(yǎng)基分別處理培養(yǎng)24h、48h的SCC15細胞。0.25％胰蛋白酶消化，將濃度為5×10⁵個/孔的細胞接種于上層小室，每個小室100μl細胞懸液。下層小室加入10％胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液500μl，37℃孵育24h，取出小室，用棉拭子輕輕擦掉濾膜上層的細胞，將濾膜用PBS洗2次，10％福爾馬林固定15min，Gimsa染色10min，高倍鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移至濾膜下層的細胞，實驗重復(fù)3次。侵襲抑制率(％)＝(對照組穿膜細胞的數(shù)量-實驗組穿膜細胞的數(shù)量)/對照組穿膜細胞的數(shù)量×100％。

(4)FITC/PI流式細胞術(shù)

將對數(shù)生長期SCC15細胞接種于中皿，實驗組漏蘆EA終濃度分別為12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml；對照組，與實驗組同濃度的DMSO。處理SCC15細胞24h、48h。按試劑盒說明書收集細胞并染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

(5)Q-PCR

50μg/ml漏蘆EA提取物,處理SCC15細胞48h，應(yīng)用Trizol試劑分別提取各組細胞總RNA。用分光光度計測量RNA濃度和質(zhì)量。用ABI反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用一步法RT-PCR反應(yīng)試劑盒擴增用熒光定量PCR試劑盒進行PCR的擴增。采用相對定量方法進行結(jié)果分析，計算2^-△△Ct值，GAPDH作為內(nèi)參。實驗重復(fù)三次?；蛞镄蛄袨椋篏APDH-F,5’-aggtcggtgtgaacggatttg-3’；GAPDH-R,5’-tgtagaccatgtagttgaggtca-3’。Snail-F,5’-ttaccttccagcagccctac-3’；Snail-R,5’-gacagagtcccagatgagca-3’。E-cadherin-F,5’-ttgctactggaacagggaca-3’；E-cadherin-R,5’-gtattgggaggaaggtctgc-3’。Vimetin-F,5’-gaagagaactttgccgttga-3’；Vimetin-R,5’-cgaaggtgacgagccatt-3’。擴增反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃10min，變性95℃15S，退火60℃1min，共40個循環(huán)。融解曲線分析，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。采用相對定量方法進行結(jié)果分析，計算2^-△△Ct值。

(6)Western Blot

SCC15細胞處理分組如Q-PCR，分別收集各組細胞,加蛋白裂解液,混勻,冰上裂解15min,4,12000r/min離心10min,取上清液,即為細胞總蛋白,采用Bradford法測定蛋白濃度,1×SDS凝膠加樣緩沖液調(diào)蛋白濃度使各組一致,分別取含相同濃度蛋白樣品各50μg,加4×loading buffer(3：1),100℃5min，4℃5min，經(jīng)10％SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜,麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果,并確定蛋白分子量標準的位置。含5％脫脂奶粉TBST液封閉2h,加入一抗兔抗人E-cadherin(1:1000)、Snail(1:500)、Vimentin(1:200)、p-p38(1:1000)、p-JNK(1:1000)、p-ERK1/2(1:1000)多克隆抗體(1:2000)或兔抗人GAPDH(1：2000),4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入二抗辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG(1：3000),37℃孵育1h,TBST洗膜3次,用ECL顯影液檢測底物的表達,Labworks圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進行灰度掃描，分析結(jié)果。