本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種熟三七及其制備方法。

背景技術(shù)：

三七，別名：假人參、人參三七、田三七、山漆、三七參，拉丁學(xué)名：Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen，為五加科人參屬多年生草本植物，根狀莖短，肉質(zhì)根圓柱形，分布于云南、廣西、江西、四川等地。三七主要富含皂苷、黃酮、蛋白氨基酸及非蛋白氨基酸、多糖、蛋白、甾醇、無(wú)機(jī)物、揮發(fā)油和油脂等成分。三七的主要有效成分為三七皂苷，迄今為止，已從三七不同部位分離得到60余種單體皂苷成分，這些單體皂苷成分大多數(shù)為達(dá)瑪烷的20(S)-原人參二醇型[20(S)-protopanaxadio1]和20(S)-原人參三醇型[20(S)-peotopanaxatrio1]，但未發(fā)現(xiàn)含有齊墩果酸型皂苷。這與同屬植物人參和西洋參有著顯著區(qū)別。

根據(jù)炮制方法的不同，三七飲片分生三七、熟三七。生三七經(jīng)高溫炮制后其固有皂苷的糖苷鍵發(fā)生裂解反應(yīng)、側(cè)鏈脫水反應(yīng)以及C-20的構(gòu)型改變而生成新的皂苷，即三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁、人參皂苷Rb₁ 3種單體皂苷的含量逐漸降低，新生成的人參皂苷20(S)-Rh₁、人參皂苷20(R)-Rh₁、人參皂苷Rd、人參皂苷Rk₃、人參皂苷Rh₄、人參皂苷20(S)-Rg₃、人參皂苷20(R)-Rg₃、人參皂苷Rk₁、人參皂苷Rg₅的含量逐步增加。此消彼長(zhǎng)的程度受三七的含水量以及炮制溫度、和時(shí)間相關(guān)，轉(zhuǎn)化生成的低 極性皂苷的百分含量在零至100％之間變化，這造就了從生三七至完全成熟的眾多不同成熟度的熟三七產(chǎn)品，這些成熟度不同的熟三七因?yàn)槲镔|(zhì)基礎(chǔ)不同而具有不同的功效。三七自古就有“生消熟補(bǔ)”之說(shuō)，生三七具有散淤止血，消腫定痛功效，主要用于咯血，吐血，便血，崩漏，外傷出血，胸腹刺疼，跌撲腫痛。熟三七長(zhǎng)于滋補(bǔ)，三七經(jīng)過(guò)炮制可以緩和三七的止血特性，增強(qiáng)三七補(bǔ)血、補(bǔ)氣的療效，具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤，提高機(jī)體免疫的功能，成熟度越高補(bǔ)益作用越強(qiáng)。

在影響熟三七成熟度的眾多因素中，三七的含水量以及炮制的溫度和時(shí)間是決定熟三七成熟度的三大關(guān)鍵因素，直接決定著熟三七中皂苷種類(lèi)和含量的變化。隨著加水量增加、溫度升高和時(shí)間延長(zhǎng)，生三七中的固有皂苷如三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁、人參皂苷Rb₁將被持續(xù)裂解轉(zhuǎn)化而逐漸降低，從生三七重量百分含量5％以上逐步降至接近零的極低水平，而裂解轉(zhuǎn)化生成的低極性皂苷人參皂苷20(S)-Rh₁、人參皂苷20(R)-Rh₁、人參皂苷Rd、人參皂苷Rk₃、人參皂苷Rh₄、人參皂苷20(S)-Rg₃、人參皂苷20(R)-Rg₃、人參皂苷Rk₁、人參皂苷Rg₅則逐步增多，從生三七中幾乎為零的極低值持續(xù)增長(zhǎng)到熟三七重量的5％以上。由此可見(jiàn)不同的加水量、蒸制溫度和時(shí)間組合制備的熟三七是內(nèi)在質(zhì)量不同的產(chǎn)品，精確控制蒸煮工藝的技術(shù)參數(shù)是獲得具有特定低極性皂苷種類(lèi)和含量的熟三七的必要條件。低極性人參皂苷Rg₃已經(jīng)作為1類(lèi)新藥批準(zhǔn)上市，該產(chǎn)品適用于腫瘤的治療，具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。而人參皂苷Rh₁、人參皂苷Rh₄，人參皂苷Rk₃，人參皂苷Rg₃，人參皂苷Rg₅，人參皂苷Rk₁等亦已 被證明具有提高人體免疫功能和抗腫瘤活性，這些低極性皂苷的種類(lèi)和含量的不同決定了熟三七療效的差異。

三七的傳統(tǒng)炮制方法為凈制、烘烤或晾曬、潤(rùn)切制或粉碎，制成生三七、生三七片和生三七粉?，F(xiàn)有技術(shù)中的熟三七也是通過(guò)蒸制得到，例如中國(guó)專(zhuān)利CN200910113914.8公開(kāi)了一種三七加工方法及其產(chǎn)品，其特征在于取三七的根及根莖，先加工成生三七、或潤(rùn)透的三七；或生三七片、潤(rùn)透的三七片；或三七粉；再置流通蒸汽鍋內(nèi)高溫106～125℃、高壓0.03～0.14MPa蒸制1～15小時(shí)，至內(nèi)外呈棕褐色，取出，干燥，即得。采用該工藝制備的熟三七，其中三七總皂苷從基本未轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)化完全均有可能，即在其不同工藝條件范圍內(nèi)炮制成的成熟度不同的熟三七，其內(nèi)在質(zhì)量具有本質(zhì)的差異，而且從該專(zhuān)利的說(shuō)明書(shū)附圖的HPLC色譜圖中根本看不到轉(zhuǎn)化生成的低極性皂苷人參皂苷20(S)-Rh₁、人參皂苷20(R)-Rh₁、人參皂苷Rd、人參皂苷Rk₃、人參皂苷Rh₄、人參皂苷20(S)-Rg₃、人參皂苷20(R)-Rg₃、人參皂苷Rk₁、人參皂苷Rg₅的色譜峰。而申請(qǐng)?zhí)枮?01510023537.4的發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種熟三七及其制備方法和用途，該熟三七基于重量百分比，含有三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁、人參皂苷Rb₁三者的總量不得少于5.0％，其中三七皂苷R₁的含量不得少于0.4％，人參皂苷Rg₁的含量不得少于2.0％，人參皂苷Rb₁的含量不得少于1.5％；含有人參皂苷Rh₄、人參皂苷20(S)-Rg₃、人參皂苷20(R)-Rg₃三者的總量不得少于0.5％，其中人參皂苷Rh₄含量不得少于0.3％，人參皂苷20(S)-Rg₃含量不少于0.06％，人參皂苷20(R)-Rg₃含量不少于0.03％。該專(zhuān)利公開(kāi)的是一種轉(zhuǎn)化程度非常低的熟三七。中華人民共和國(guó)藥典2015版一部規(guī)定生三七中三七皂苷 R₁、人參皂苷Rg₁、人參皂苷Rb₁的總含量不得少于5.0％，即按照該發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)的制備工藝制備的熟三七仍然符合生三七的藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中的三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁、人參皂苷Rb₁基本未轉(zhuǎn)化，而轉(zhuǎn)化生成的低極性皂苷含量非常低，其皂苷成分的組成比例與本專(zhuān)利完全不一致，說(shuō)明上述專(zhuān)利與本專(zhuān)利無(wú)關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種熟三七，尤其是提供一種消補(bǔ)基本平衡的具有特定皂苷組成的熟三七。

本發(fā)明的目的之一是提供一種熟三七的新炮制工藝。

本發(fā)明提供的熟三七，具有以下技術(shù)特征：即基于其重量百分比計(jì)，該熟三七含有總皂苷為6.0-12.0％，其中轉(zhuǎn)化生成的9種低級(jí)性皂苷的含量之和占熟三七總皂苷的40-90％，優(yōu)選50-80％。三七固有皂苷包括三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁、人參皂苷Rb₁，三者總含量小于5.0％，各單體皂苷含量依次小于0.01-0.5％、0.2-2.0％和0.3-3.0％；轉(zhuǎn)化生成的九個(gè)低極性皂苷人參皂苷20(S)-Rh₁、人參皂苷20(R)-Rh₁、人參皂苷Rd、人參皂苷Rk₃、人參皂苷Rh₄、人參皂苷20(S)-Rg₃、人參皂苷20(R)-Rg₃、人參皂苷Rk₁、人參皂苷Rg₅的含量依次為0.3-1.5％、0.1-1.0％、0.05-1.0％、0.2-1.5％、0.5-3.0％、0.1-1.0％、0.05-0.5％、0.1-1.0％、0.5-3.0％。

本發(fā)明提供的熟三七的制備方法如下：

1)清洗：取三七干品，用水進(jìn)行預(yù)洗，洗去附著在三七表面的泥土，加三七干品重量0.5～2倍量的飲用水浸泡至水吸干，再用飲用水對(duì)三七進(jìn)行 精洗，徹底洗除三七表面的泥土和雜質(zhì)，得潤(rùn)三七；或取三七鮮品，用飲用水徹底清洗除去三七表面的泥土和雜質(zhì)，得潤(rùn)三七；

2)預(yù)處理：取潤(rùn)三七，干燥，粉碎，得生三七粉，加入生三七粉重量0.5-2倍重量的飲用水，浸潤(rùn)至透心，得潤(rùn)三七粉；或取潤(rùn)三七，切制成1-3毫米的片，得潤(rùn)三七片；

3)蒸制：取潤(rùn)三七、潤(rùn)三七片或潤(rùn)三七粉，平鋪于料盤(pán)中，厚度為1-5厘米，置壓力鍋中，于116-125℃蒸制1-4小時(shí)；

4)干燥：于50-105℃干燥2-24小時(shí)，得熟三七、熟三七片或熟三七粉；

5)粉碎：粉碎，得熟三七粉；或粉碎，氣流粉碎，得熟三七超細(xì)粉。

步驟1)中所述的三七干品或鮮三七原料為五加科人參屬植物三七的主根、支根、根莖中的一種或幾種，優(yōu)選三七根莖；步驟3)中潤(rùn)三七、潤(rùn)三七片或潤(rùn)三七粉的蒸制條件優(yōu)選為溫度118-122℃，時(shí)間2-3小時(shí)；步驟4)所述的干燥方法為常壓干燥或真空干燥。

本發(fā)明通過(guò)加水量、炮制溫度和時(shí)間的精確控制獲得了一種深度炮制的熟三七，其富含生三七中幾乎不存在的具有提高免疫功能和抗腫瘤作用的低極性皂苷活性成分。

附圖說(shuō)明

圖1為混合對(duì)照品的HPLC色譜圖，其中1：三七皂苷R₁，2：人參皂苷Rg₁，3：人參皂苷Rb₁，4：人參皂苷20(S)-Rh₁，5：人參皂苷20(R)-Rh₁，6：人參皂苷Rd，7：人參皂苷Rk₃，8：人參皂苷Rh₄，9：人參皂苷 20(S)-Rg₃，10：人參皂苷20(R)-Rg₃，11：人參皂苷Rk₁，12：人參皂苷Rg₅。

圖2為實(shí)施例1制備的熟三七的HPLC色譜圖，其中1：三七皂苷R₁，2：人參皂苷Rg₁，3：人參皂苷Rb₁，4：人參皂苷20(S)-Rh₁，5：人參皂苷20(R)-Rh₁，6：人參皂苷Rd，7：人參皂苷Rk₃，8：人參皂苷Rh₄，9：人參皂苷20(S)-Rg₃，10：人參皂苷20(R)-Rg₃，11：人參皂苷Rk₁，12：人參皂苷Rg₅。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖給出本發(fā)明較佳實(shí)施例，以詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1熟三七粉的制備

取生三七根莖(剪口)干品5kg，用飲用水清洗干凈，加5kg飲用水浸泡至透心，用飲用水徹底清洗除去泥土雜質(zhì)，切成1毫米的片，置壓力鍋中于118℃蒸制3小時(shí)，50℃減壓干燥24小時(shí)，粉碎成細(xì)粉，即得熟三七粉4.56kg。HPLC法測(cè)定熟三七粉中的皂苷含量，結(jié)果三七皂苷R₁ 0.38％，人參皂苷Rg₁ 1.78％，人參皂苷Rb₁ 2.53％，人參皂苷20(S)-Rh₁0.63％，人參皂苷20(R)-Rh₁ 0.34％，人參皂苷Rd 0.56％，人參皂苷Rk₃ 0.51％，人參皂苷Rh₄ 1.58％，人參皂苷20(S)-Rg₃ 0.44％，人參皂苷20(R)-Rg₃ 0.24％，人參皂苷Rk₁0.26％，人參皂苷Rg₅ 1.11％。

實(shí)施例2熟三七片的制備

取生三七主根干品5kg，用飲用水清洗干凈，加2.5kg飲用水浸泡至透心，用飲用水徹底清洗除去泥土雜質(zhì)，切成3毫米的厚片，置壓力鍋中于溫度116℃，蒸制4小時(shí)，105℃常壓干燥8小時(shí)，即得熟三七片4.42kg。 HPLC法測(cè)定熟三七粉中的皂苷含量，結(jié)果三七皂苷R₁0.29％，人參皂苷Rg₁ 1.40％，人參皂苷Rb₁ 1.94％，人參皂苷20(S)-Rh₁ 0.61％，人參皂苷20(R)-Rh₁ 0.33％，人參皂苷Rd 0.46％，人參皂苷Rk₃ 0.50％，人參皂苷Rh₄ 1.57％，人參皂苷20(S)-Rg₃ 0.42％，人參皂苷20(R)-Rg₃ 0.22％，人參皂苷Rk₁ 0.25％，人參皂苷Rg₅1.16％。

實(shí)施例3熟三七的制備

取鮮三七主根5kg，清洗干凈，置壓力鍋中于溫度121℃，蒸制2小時(shí)，100℃常壓干燥12小時(shí)，即得熟三七4.67kg。HPLC法測(cè)定熟三七粉中的皂苷含量，結(jié)果三七皂苷R₁0.21％，人參皂苷Rg₁ 0.78％，人參皂苷Rb₁ 2.18％，人參皂苷20(S)-Rh₁ 0.71％，人參皂苷20(R)-Rh₁ 0.12％，人參皂苷Rd 0.06％，人參皂苷Rk₃ 0.39％，人參皂苷Rh₄ 1.61％，人參皂苷20(S)-Rg₃ 0.17％，人參皂苷20(R)-Rg₃ 0.08％，人參皂苷Rk₁ 0.25％，人參皂苷Rg₅0.65％。

實(shí)施例4熟三七的制備

取生三七根莖干品4kg、支根干品1kg，用飲用水清洗干凈，加7.5kg飲用水浸泡至透心，用飲用水徹底清洗除去泥土雜質(zhì)，置壓力鍋中于125℃蒸制1小時(shí)，80℃減壓干燥2小時(shí)，即得熟三七4.49kg。HPLC法測(cè)定熟三七粉中的皂苷含量，結(jié)果三七皂苷R₁ 0.47％，人參皂苷Rg₁ 1.93％，人參皂苷Rb₁ 2.84％，人參皂苷20(S)-Rh₁ 0.44％，人參皂苷20(R)-Rh₁0.23％，人參皂苷Rd 0.53％，人參皂苷Rk₃ 0.41％，人參皂苷Rh₄ 0.68％，人參皂苷 20(S)-Rg₃ 0.37％，人參皂苷20(R)-Rg₃ 0.23％，人參皂苷Rk₁ 0.19％，人參皂苷Rg₅ 0.96％。

實(shí)施例5熟三七片的制備

取生支根干品5kg，用飲用水清洗干凈，加5kg飲用水浸泡至透心，用飲用水徹底清洗除去泥土雜質(zhì)，切成2毫米的厚片，置壓力鍋中于溫度120℃，蒸制2.5小時(shí)，70℃減壓干燥16小時(shí)，即得熟三七片4.38kg。HPLC法測(cè)定熟三七粉中的皂苷含量，結(jié)果三七皂苷R₁0.15％，人參皂苷Rg₁ 0.55％，人參皂苷Rb₁ 1.61％，人參皂苷20(S)-Rh₁ 0.73％，人參皂苷20(R)-Rh₁ 0.41％，人參皂苷Rd 0.49％，人參皂苷Rk₃ 0.70％，人參皂苷Rh₄ 2.71％，人參皂苷20(S)-Rg₃ 0.72％，人參皂苷20(R)-Rg₃ 0.38％，人參皂苷Rk₁ 0.52％，人參皂苷Rg₅1.72％。

對(duì)比實(shí)施例1干三七制備熟三七

按照發(fā)明專(zhuān)利CN 200710066195.X熟三七和熟三七標(biāo)準(zhǔn)提取物和其應(yīng)用實(shí)施例1的方法，取干燥的三七主根5kg，破碎為小粒，置于高壓滅菌鍋內(nèi)120℃蒸制12小時(shí)，55℃干燥，粉碎，過(guò)120目，即得。HPLC法測(cè)定熟三七粉中的皂苷含量，結(jié)果三七皂苷R₁ 0.04％，人參皂苷Rg₁ 0.12％，人參皂苷Rb₁ 0.37％，人參皂苷20(S)-Rh₁ 0.52％，人參皂苷20(R)-Rh₁0.32％，人參皂苷Rd 0.21％，人參皂苷Rk₃ 1.28％，人參皂苷Rh₄ 2.87％，人參皂苷20(S)-Rg₃ 0.24％，人參皂苷20(R)-Rg₃ 0.12％，人參皂苷Rk₁ 0.57％，人參皂苷Rg₅ 3.54％。

對(duì)比實(shí)施例2蒸制熟三七粉的制備

按照發(fā)明專(zhuān)利CN201510023537.4一種熟三七的制備方法和用途實(shí)施例2b熟三七粉的制備方法，取三七藥材5kg，凈選，洗凈，加1.75kg飲用水水潤(rùn)透，用純水蒸汽在溫度110℃下，蒸制3小時(shí)，干燥，粉碎成最細(xì)粉，即得。HPLC法測(cè)定熟三七粉中的皂苷含量，結(jié)果三七皂苷R₁ 0.63％，人參皂苷Rg₁ 3.27％，人參皂苷Rb₁ 3.49％，人參皂苷20(S)-Rh₁ 0.23％，人參皂苷20(R)-Rh₁ 0.10％，人參皂苷Rd 0.47％，人參皂苷Rk₃ 0.30％，人參皂苷Rh₄0.87％，人參皂苷20(S)-Rg₃ 0.21％，人參皂苷20(R)-Rg₃ 0.11％，人參皂苷Rk₁ 0.13％，人參皂苷Rg₅ 0.62％。

熟三七有效成分的定量分析方法，包括以下步驟：

1)供試品溶液的制備：

取熟三七粉0.6g，精密稱(chēng)定，置三角瓶中，精密加入甲醇50ml，稱(chēng)定重量，置80℃水浴上保持微沸2小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得；

2)對(duì)照品溶液的制備：

分別精密稱(chēng)取三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁、人參皂苷Rb₁、人參皂苷20(S)-Rh₁、人參皂苷20(R)-Rh₁、人參皂苷Rd、人參皂苷Rk₃、人參皂苷Rh₄、人參皂苷20(S)-Rg₃、人參皂苷20(R)-Rg₃、人參皂苷Rk₁、人參皂苷Rg₅對(duì)照品，置容量瓶中，加甲醇分別制成約含各單體皂苷3-100μg/mL的對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得；

3)色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL；流速：1.0mL/min；DAD檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm；流動(dòng)相：水(A)-乙腈(B)，按表1的條件進(jìn)行梯度洗脫：系統(tǒng)適應(yīng)性研究要求人參皂苷Rb1的理論塔板數(shù)不低于100000。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度

4)方法學(xué)研究

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的考察：

對(duì)照品溶液20μL，依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果

結(jié)果表明，各標(biāo)準(zhǔn)品在進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

(2)檢測(cè)限、定量限考察：

以峰高約為基線(xiàn)噪音3倍時(shí)的進(jìn)樣量為檢測(cè)限，以峰高約為基線(xiàn)噪音10倍時(shí)的進(jìn)樣量為定量限。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各皂苷檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)數(shù)據(jù)

(3)回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取熟三七粉末96.00mg 6份，分別置25mL容量瓶中，分別加入等同于樣品含量的各皂苷對(duì)照品，加70％甲醇水溶液至接近刻度，室溫超聲40min,冷至室溫后，70％甲醇水溶液定容，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各皂苷的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各皂苷回收率考察結(jié)果

(4)精密度試驗(yàn)

取線(xiàn)性測(cè)定項(xiàng)下的混標(biāo)、人參皂苷Rb₁標(biāo)準(zhǔn)液,依次重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果表明該分析方法精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

(5)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取熟三七粉末96.00mg 6份，分別置25mL容量瓶中，加70％甲醇水溶液至接近刻度，室溫超聲提取40min,冷至室溫后，70％甲醇水溶液定容，搖勻，提取液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算熟三七粉末中各皂苷的含量，計(jì)算RSD。結(jié)果表明：該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 熟三七提取液各皂苷含量測(cè)定重復(fù)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

(6)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的樣品(96.07mg),每個(gè)2小時(shí)測(cè)定1次，考察16小時(shí)，各皂苷的峰面積的RSD均小于3.5％，結(jié)果表明熟三七提取液中各皂苷在16小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定，見(jiàn)表7。

表7 熟三七提取液各皂苷含量測(cè)定穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

5)含量測(cè)定

取供試品溶液20μL，依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，根據(jù)對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算供試品溶液中各種皂苷的含量。

對(duì)照品和熟三七的典型HPLC色譜圖見(jiàn)圖1對(duì)照品HPLC色譜圖、圖2按照實(shí)施例1制備的熟三七的HPLC色譜圖。