一種可注射植入劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可注射植入劑及其制備方法。該植入劑是：在pH為7.0～7.5的磷酸氯化鈉生理溶液中混合有羊膜微粒。其制備方法是：通過消毒處理、脫細(xì)胞處理、改性處理、制備羊膜微粒的步驟完成，即，將羊膜微粒作為組分A和磷酸氯化鈉生理溶液作為組分B，按照質(zhì)量體積比20:1～100:1震蕩混勻，經(jīng)高速微射流設(shè)備制備成濃度為20～100mg/mL羊膜微粒懸液，羊膜微粒的粒徑為50～200μm。本發(fā)明保留了人羊膜的天然三維立體結(jié)構(gòu)以及大量的天然活性成分，降低了美容注射產(chǎn)品在臨床使用后因原料來源而引起的免疫排斥反應(yīng)，適用于注射至皮下真皮層深層至皮下淺層以修復(fù)中度至重度皺紋或褶皺，具有良好的美容修復(fù)效果。
【專利說明】一種可注射植入劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)美容整形【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來源于羊膜生物材料的能夠促 進(jìn)自體膠原再生的可注射植入劑及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] -個世紀(jì)以來，軟組織充填劑被廣泛應(yīng)用于美容外科手術(shù)以改善面部輪廓、修正 皺紋、填平凹陷瘢痕和填充體積(如唇部）等，現(xiàn)今對于軟組織填充劑的需求越來越大。
[0003] 理想的軟組織填充劑，應(yīng)該具有便宜易得、良好的生物惰性、生物相容性和穩(wěn)定 性、無毒性、無致癌性、無感染性、無急性或慢性炎癥反應(yīng)、易于注射和取出、能夠維持長期 甚至永久的外觀修復(fù)效果且恢復(fù)時間短。但至今為止，仍沒有如此理想的注射式填充劑問 世。
[0004] 目前國內(nèi)外常用的各類可注射軟組織充填材料有以下幾種，包括：
[0005] ( 1)合成高分子材料，如整形用膠原和聚甲基丙烯甲酯（PMMA)皮下植入物系統(tǒng)，是 以牛膠原溶液為載體，將PMMA圓形光滑微球懸浮于其中，同時含有一定量的利多卡因麻醉 齊U ;其主要缺點是，由于PMMA不可降解，長期存留于人體，存在材料移位，誘發(fā)長期慢性炎 癥的使用風(fēng)險，對注射部位及注射方法要求很高。
[0006] (2)牛膠原蛋白，Zyderm采用牛源性I型膠原蛋白為原料，未經(jīng)交聯(lián)，濃度為 35mg/mL,作用效果較短，一般可維持4個月；Zyplast，也是采用牛源性I型膠原蛋白為原 料，但經(jīng)過戊二醛交聯(lián)，濃度為35mg/mL，其使用效果可維持約6個月；醫(yī)用膠原充填劑（商 品名：膚美達(dá)）是3. 5%牛膠原蛋白及0.3%鹽酸利多卡因的生理鹽水懸浮液，預(yù)填充在玻璃 注射器（含注射針）內(nèi)。以上牛膠原蛋白植入劑的缺點是：在注射前30天需進(jìn)行皮試以防 止患者出現(xiàn)過敏現(xiàn)象，美容修復(fù)效果持續(xù)時間較為短暫，常需要多次反復(fù)注射，注射后可能 的并發(fā)癥有引起出血斑、肉芽瘤、急性過敏、延遲性過敏反應(yīng)和全身不適反應(yīng)等。
[0007] (3)豬膠原蛋白，如雙美膠原蛋白植入劑，其原料是由豬皮純化而成的I型膠原蛋 白經(jīng)過濾除菌及無菌操作方式分散于磷酸生理食鹽緩沖溶液中并充填于無菌注射針筒中 制成。其產(chǎn)品未經(jīng)過交聯(lián)處理，在體內(nèi)降解周期約為4?6個月。該產(chǎn)品的缺點為豬源性 膠原，可能會引起排斥反應(yīng)，一般動物源性膠原均需進(jìn)行過敏皮試，有同類動物膠原植入劑 產(chǎn)品引起出血斑，肉芽瘤等并發(fā)癥報道。
[0008] (4)人膠原蛋白，是從人成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)得到的細(xì)胞外基質(zhì)獲得的膠原植入 產(chǎn)品，如Dermalogen和Cosmoderm是可注射的同種異體皮膠原纖維和膠原組織基質(zhì)懸液； 這些材料均由膠原和彈力纖維、葡聚糖組成。該類材料優(yōu)點為來源于人，免疫排斥反應(yīng)低， 不需要進(jìn)行皮試測試，但制備周期較長，生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，設(shè)備要求較高，產(chǎn)品成本較高。
[0009] (5)人脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒，是將人尸體皮經(jīng)過去除表皮、脫細(xì)胞、冷凍干燥、粉碎 后形成的材料，如Cymetre是微粒化可注射的異體脫細(xì)胞真皮，平均粒徑約123 μ m，未經(jīng) 過交聯(lián)處理，文獻(xiàn)報道唇部修復(fù)效果可維持1年以上。該材料的主要缺點是最終形式為微 粒，未制備成均勻的懸浮液，醫(yī)生使用時需術(shù)前進(jìn)行準(zhǔn)備工作，即利用三通連接閥將微粒及 注射劑或麻醉劑混合，增加了手術(shù)準(zhǔn)備時間，且混勻為手工操作，難以保證混懸液的均勻程 度。
[0010] (6)透明質(zhì)酸類，包括Restylane瑞藍(lán)等，其透明質(zhì)酸原料來源于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)， 經(jīng)過沉淀、過濾、干燥等純化過程，并經(jīng)1，4- 丁二醇二縮水甘油醚部分交聯(lián)，再經(jīng)過加熱、 滅菌得到的透明質(zhì)酸植入劑，其主要成分由經(jīng)修飾（部分化學(xué)交聯(lián)）的透明質(zhì)酸、鈉離子、 氯離子、磷酸鹽緩沖體系以及注射用水組成，透明質(zhì)酸濃度為20±3mg/mL，100000粒子/ mL，平均粒徑約為250 μ m，溶于pH7的磷酸緩沖鹽溶液中。透明質(zhì)酸材料作為充填植入劑， 也有一定缺點，如少量患者出現(xiàn)不良反應(yīng)如腫脹、紅斑或皮膚硬化等；吸水性較強，有隆唇 后水腫的不良反應(yīng)報道；無麻醉劑，疼痛感較強。
[0011] (7)透明質(zhì)酸和纖維素類，該類產(chǎn)品主要是用透明質(zhì)酸和纖維素進(jìn)行交聯(lián)處理得 到的混合成分的填充劑，如逸美，是由羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸和平衡鹽溶液組成的無 菌凝膠狀溶液，封裝在預(yù)灌封玻璃注射器（無注射針）中。該類產(chǎn)品成分較為復(fù)雜，生產(chǎn)工 藝中控制交聯(lián)度難度較大，故造成該產(chǎn)品降解周期較短，4?6個月后基本完全降解。
[0012] 以上各種類型的美容植入產(chǎn)品均存在一定缺陷，且目前國家對于美容植入劑類產(chǎn) 品要求非常嚴(yán)格，如：要明確控制交聯(lián)程度、粒徑分布范圍、分子量大小、降解周期等，需滿 足的技術(shù)條件很1?。
[0013] 中國專利CN200510044005. 5公開了一種可注射軟組織生物填充材料的制備方 法，其采用新宰殺小豬皮為原料，經(jīng)過去皮下組織、脫脂、堿處理、剖層、酶處理、戊二醛交 聯(lián)、漂白處理以及微?；庸?，最后經(jīng)包裝及鈷60滅菌而成。該專利制備微粒的方法只是 將皮片通過物理方法切制為邊長為300?500 μ m的微粒，但微粒直徑過大，無法采用直徑 較小的針頭注射；且最終只是將微粒進(jìn)行簡單包裝，無法直接注射使用。
[0014] 中國專利CN95106720. 6公開了一種采用人胎盤為原料制備顆粒性膠原的方法， 其是先對胎盤進(jìn)行輻照滅活病毒，清洗、粉碎后采用有機試劑提取胎盤中的膠原，最后經(jīng) 濃縮透析并加入利多卡因而得到的可注射膠原溶液。該專利使用原料與本專利相近，但工 藝中使用大量有機試劑提取膠原，易存在有機試劑殘留。
[0015] 中國專利CN201010117490. 5公開了一種制備注射用的透明質(zhì)酸凝膠微粒的方 法。該專利所用原料為透明質(zhì)酸干粉，將其用堿性溶液溶解后加入交聯(lián)劑交聯(lián)，制備得到透 明質(zhì)酸凝膠后再采用透析方法去除交聯(lián)劑。該方法可能無法徹底去除凝膠中的交聯(lián)劑等試 劑殘留，另外清洗效率較低，需要透析4?5天。
[0016] 中國專利CN200810007484. 7公開了一種采用人發(fā)角蛋白制備軟組織填充材料的 方法，該專利利用人發(fā)中段作為原料，經(jīng)過清洗、漂白、研磨加工、凍干、包裝、鈷60輻照處 理，將人發(fā)制備成粉體勻漿及液體人發(fā)角蛋白顆粒。該專利僅采用物理碾磨方法制備粒徑 60?80 μ m的人發(fā)角蛋白顆粒勻漿，根據(jù)發(fā)明人實驗經(jīng)驗，將不溶于水的不同固體物質(zhì)進(jìn) 行物理碾磨而沒有篩分、均質(zhì)化等后續(xù)步驟，得到的粒徑分布范圍通常在100?1000 μ m， 很難得到較小粒徑范圍。
[0017] 中國專利CN02156797. 2公開了一種注射性膠原蛋白的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng) 用，該專利通過提取動物組織中的膠原蛋白纖維來制備注射性膠原蛋白，在制備過程中會 完全破壞動物組織原有結(jié)構(gòu)及其他成分，損失了天然組織中具有生物活性或生物功能的天 然成分，只能起到單純的膠原蛋白填充作用。
[0018] 由上可見，目前已上市的各種美容植入產(chǎn)品及國內(nèi)同類專利公開的美容植入劑制 備方法均存在一定缺點，尤其是同類膠原植入劑產(chǎn)品除了包含膠原基質(zhì)外，并未包含生物 活性因子，因此其作用僅僅是填充，當(dāng)這些填充材料被機體分解吸收后，美容修復(fù)效果會減 弱或消失，因而該類植入劑產(chǎn)品的美容效果是暫時性的。
[0019] 羊膜，從細(xì)胞滋養(yǎng)層衍化而來，是胚胎雙層膜的內(nèi)層，由上皮細(xì)胞層，基底膜和無 血管基質(zhì)組成。羊膜中包含了多種膠原蛋白成分及活性因子，包括：
[0020] (1)膠原：羊膜內(nèi)含有較多的I、III、IV、V以及VII型膠原，與上皮基底層（由IV 型膠原、VII型膠原和層粘連蛋白等組成）成分相近，也包含了皮膚組成的主要成分I、III 型膠原。羊膜中含量較多的膠原為I、III、IV型膠原，占羊膜中所有膠原的90%以上。
[0021] (2)層粘連蛋白（LN):廣泛分布于基底膜的透明層，緊貼細(xì)胞基底部，與IV型膠原 結(jié)合形成基底膜的骨架，影響細(xì)胞的粘附、運動，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化。
[0022] (3)表皮生長因子（EGF):可通過DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成而促進(jìn)細(xì)胞增殖與皮膚 上皮細(xì)胞上皮化。
[0023] (4)角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF):研究表明可促進(jìn)人皮膚上皮細(xì)胞DNA合成，促進(jìn)細(xì) 胞增生。
[0024] (5)堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF):具有促進(jìn)基質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖、移行和分 化，促進(jìn)傷口愈合的作用，能有效地刺激動物及人的上皮組織細(xì)胞的增殖。
[0025] (6)肝細(xì)胞生長因子（HGF):能刺激各種靶細(xì)胞的生長，包括肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi) 皮細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞和造血細(xì)胞。
[0026] (7)金屬蛋白酶組織抑制因子（--ΜΡ):可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生及膠原合成，致細(xì)胞 外基質(zhì)沉積并抑制其降解。
[0027] (8)其它蛋白酶抑制因子：α 1-抗胰蛋白酶、α 2-巨球蛋白、α 2-抗糜蛋白酶等， 可抑制相應(yīng)的蛋白酶而發(fā)揮抗炎作用。
[0028] 正是羊膜中含有以上較多的能夠抑制血管生成、抗炎癥的活性因子（Hao，Y. et， al.，Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea, 2000. 19 (3):p.348-52 ；BK,N. ,et al., Analysis of human amniotic membrane components as proteinase inhibitors for development of therapeutic agent of recalcitrant keratitis.Trophoblast Res，1999(13) :p. 459-466.)，因此羊膜能夠起到促進(jìn)眼表上皮化、減輕炎性反應(yīng)、抑制纖維 組織增生和新生血管形成的作用，從而在臨床上廣泛應(yīng)用于眼表各類疾病修復(fù)、皮膚燒創(chuàng) 傷修復(fù)等方面。
[0029] 目前尚無采用羊膜為原料制備可注射充填材料的產(chǎn)品，亦無專利及文獻(xiàn)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 針對上述各種植入劑的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種可以抑制炎癥、抑制瘢痕 生成、促進(jìn)自體膠原合成的長期有效的美容植入劑及其制備方法，該方法保留了羊膜的天 然三維立體結(jié)構(gòu)以及大量的天然活性成分，降低了美容注射產(chǎn)品在臨床使用后因原料來源 而引起的免疫排斥反應(yīng)。
[0031] 本發(fā)明制備的可注射用羊膜微粒填充劑，是在pH為7. 0?7. 5的磷酸氯化鈉生理 溶液中混合有羊膜微粒；該可注射植入劑的微粒直徑為50?200 μ m，濃度為30?lOOmg/ mL〇
[0032] 所述磷酸氯化鈉生理溶液，是以注射用水為溶劑，含有終濃度為3?8g/L的氯化 鈉溶液，〇. 2?0. 4g/L的磷酸二氫鈉溶液和1. 2?2. Og/L的磷酸氫二鈉溶液；
[0033] 所述羊膜微粒和磷酸氯化鈉生理溶液按照質(zhì)量體積比20:1?100:1混勻。
[0034] 本發(fā)明之可注射用羊膜微粒填充劑的制備方法，是以羊膜為原料，經(jīng)過脫細(xì)胞、交 聯(lián)改性、勻漿和灌裝，制備而成，包括羊膜的消毒處理，脫細(xì)胞處理，改性處理，羊膜微粒的 制備以及羊膜微粒植入劑的制備，具體步驟如下：
[0035] 步驟一、消毒處理：在無菌條件下，將羊膜浸泡在磷酸鹽緩沖液（PBS)中清洗至無 血色、污物，再用純化水清洗1?5次，然后用體積濃度為1?3%的雙氧水溶液、體積濃度 為60?90%的乙醇水溶液、體積濃度為0. 1?2%的過氧乙酸水溶液中的一種或者幾種，依 次對羊膜進(jìn)行消毒處理5?60分鐘；
[0036] 本步驟通過對羊膜進(jìn)行消毒處理，可降低羊膜的微生物負(fù)載，同時滅活多種可能 存在的病毒，保證羊膜在后續(xù)處理時的安全性，避免羊膜上攜帶的微生物污染。
[0037] 步驟二、脫細(xì)胞處理：將步驟一消毒處理后的羊膜先用純化水清洗1?3次，再用 0· 1?lmg/mL的乙二酸四乙胺（EDTA)水溶液、0· 01?0· lmol/L氫氧化鈉水溶液、1?5mol/ L氯化鈉水溶液、0. 1?lmg/mL的胰酶水溶液中的一種或者幾種，依次對羊膜進(jìn)行震蕩處理 5?120分鐘，振蕩頻率為50?80rpm，最后采用純化水或PBS清洗3?10次；
[0038] 本步驟通過溫和的化學(xué)及物理方法去除羊膜中的細(xì)胞成分，降低羊膜的免疫原 性，并同時最大程度保留了羊膜的膠原及活性因子，為制備保留羊膜生物活性的植入劑提 供原料。
[0039] 步驟三、改性處理：將步驟二得到的羊膜用物理或化學(xué)方法進(jìn)行改性處理，根據(jù)最 終產(chǎn)品降解性能的要求，可選擇不同處理強度的改性方法。改性所用的化學(xué)試劑或物理方 法包括但不限于：〇. 1?〇. 5mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC. HCL)的pH為5?6的水溶液在2?40°C下處理6?48小時，0. 1?lmg/mL的核黃素水溶 液在室溫下處理4?24小時，室溫下3000?10000 μ W/cm2紫外線照射4?16小時，體積 濃度為〇. 1?1%戊二醛水溶液在室溫下處理6?12小時，0. 5?1. 5mg/mL的核糖水溶液 在2?40 °C下處理3?14天；
[0040] 本步驟中不同的改性處理方法，可為最終制備不同降解時間的羊膜微粒植入劑提 供選擇，適用于面部不同部位的修復(fù)，本發(fā)明人經(jīng)過實驗驗證，降解時間短的羊膜微粒植入 劑可用于真皮層淺層區(qū)域以修復(fù)淺表細(xì)紋，例如眼角四周等區(qū)域，降解時間長的羊膜微粒 植入劑可用于真皮層深層部位以修復(fù)較深皺紋，例如鼻唇溝等區(qū)域。另外，通過改性處理可 將羊膜中保留的活性成分尤其是各種因子固定于羊膜中，減少因后續(xù)清洗、干燥、粉碎工藝 造成的損失。
[0041] 步驟四、羊膜微粒的制備：將步驟三改性處理后的羊膜用純化水或PBS震蕩清洗 3?10次，然后進(jìn)行室溫風(fēng)干或真空冷凍干燥處理，最后于2?8°C下將羊膜經(jīng)超高速低溫 離心粉碎機粉碎成100?1000 μ m大小的顆粒。
[0042] 本步驟先對羊膜進(jìn)行干燥處理再制備成顆粒，有利于羊膜粉碎，另外，步驟三及步 驟四采用先交聯(lián)后勻漿的方法，方便改性后清洗，能夠徹底去除試劑殘留。
[0043] 步驟五、羊膜微粒植入劑的制備：將步驟四制備的羊膜微粒作為組分A，將pH為 7. 0?7. 5的磷酸氯化鈉生理溶液作為組分B，將組分A和組分B按照質(zhì)量體積比20:1? 100:1 (g/L)震蕩混勻，經(jīng)高速微射流設(shè)備循環(huán)3?8次。隨后，先將羊膜微粒懸液經(jīng)無菌 真空灌裝，再經(jīng)10?30kGy伽馬射線輻照滅菌或者先將羊膜微粒懸液經(jīng)10?30kGy伽馬 射線輻照滅菌，并進(jìn)行無菌真空灌裝，即制得可臨床使用的羊膜微粒植入劑：濃度為20? 100mg/mL羊膜微粒懸液，羊膜微粒的粒徑為50?200 μ m。
[0044] 所述組分B之磷酸氯化鈉生理溶液的組成為：以注射用水為溶劑，含有終濃度為 3?8g/L的氯化鈉溶液，0. 2?0. 4g/L的磷酸二氫鈉溶液和1. 2?2. Og/L的磷酸氫二鈉 溶液。在組分B之磷酸氯化鈉生理溶液中也可添加終濃度為0. 001?0. 01mg/mL的細(xì)胞生 長因子、0. 3?2mg/mL的利多卡因、1?10mg/mL的透明質(zhì)酸等中的任一種或者幾種。
[0045] 該步驟5采用的高速微射流設(shè)備，高速微射流設(shè)備的工作壓力為5000?15000Pa， 出口噴嘴直徑為0. 1?0. 25mm.。通過高速微射流設(shè)備的流體運動產(chǎn)生的剪切力來進(jìn)一步 粉碎步驟四制備得到的羊膜微粒，得到粒徑為50?200 μ m的羊膜微粒。本發(fā)明人通過巨 噬細(xì)胞吞噬實驗驗證，直徑小的羊膜微粒（10?40 μ m)植入體內(nèi)后，容易被巨噬細(xì)胞吞噬， 無法達(dá)到修復(fù)效果；通常臨床為了控制準(zhǔn)確注射至真皮層需要修復(fù)的部位，使用的針頭為 27?30g，粒徑過大容易堵塞注射美容針頭。
[0046] 本發(fā)明之植入劑的制備裝置，采用中空半橢球形裝置固定羊膜，即該裝置為中空 半橢球形殼體，殼體上均勻分布有若干小孔。由于天然羊膜呈橢球形包裹胎兒，從分娩后的 胎盤分離得到的羊膜往往無法完全在平面鋪展，本發(fā)明采用有孔的半橢球形裝置固定、處 理、清洗羊膜，能夠?qū)⒀蚰て秸馗采w于半球形的表面裝置，裝置表面具有多個小孔以利于 液體透過(參見附圖1)。使用該裝置時，將羊膜從半橢球形裝置外表面頂端鋪展至底部，并 用夾具或醫(yī)用縫合線將羊膜和裝置固定在一起，可以將裝置完全浸沒于液體、或采用噴淋、 流水等方式對羊膜進(jìn)行處理，相比于非鋪展式的處理方法，避免了因羊膜繞纏、折疊造成的 清洗效率下降，還可以將裝置放于干燥環(huán)境直接對羊膜進(jìn)行風(fēng)干或真空干燥處理，該裝置 材質(zhì)為不銹鋼等不易被水、乙醇、酸堿、鹽等試劑腐蝕的材料。相比于羊膜平鋪于無孔不銹 鋼操作臺，該裝置可有效提高風(fēng)干或凍干效率，有效避免在處理、清洗過程中羊膜破損、纏 繞，大大提高清洗、處理效率。本發(fā)明人通過實驗驗證，若不使用該裝置，羊膜之間纏繞導(dǎo)致 每一次清洗后，需手工將羊膜纏繞處解開甚至出現(xiàn)破損，影響規(guī)?；幚淼男剩依p繞 部位不利于液體滲透和清洗，會造成批次間和批次內(nèi)檢測結(jié)果不穩(wěn)定。實驗證明，未采用本 發(fā)明裝置固定清洗羊膜，因振蕩會造成70%的情況下羊膜纏繞，每次清洗結(jié)束后手工解開 纏繞的羊膜需耗時5?10分鐘，多次處理會對羊膜造成破壞，完整度僅為30?40% ;而采 用羊膜固定裝置，則能100%避免羊膜纏繞，羊膜完整度在90%以上。
[0047] 本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑，以去異體細(xì)胞成分的羊膜為主要原料，具有羊膜 特有的天然膠原及各類因子，例如IV型膠原、bFGF，EGF，HGF，KGF等；植入劑呈均漿狀態(tài)； 微粒直徑為50?200 μ m，濃度為30?100mg/mL。該植入劑適用于注射至皮下真皮層深層 至皮下淺層，以修復(fù)中度至重度皺紋或褶皺，具有極好的美容修復(fù)效果。本發(fā)明通過大鼠皮 下植入實驗，證實了羊膜微粒植入劑可在大鼠皮下至少維持52周的效果。
[0048] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果是：
[0049] (1)采用本發(fā)明制備技術(shù)，可保留大部分人羊膜中的I型膠原、III型膠原、IV型 膠原等膠原天然成分以及HGF、EGF、bFGF、TIMP、KGF等天然活性因子，有效保留羊膜本身抑 制炎癥、抑制瘢痕生成的能力（圖2,圖3)。
[0050] (2)與純膠原植入劑、透明質(zhì)酸植入劑、合成微球PMMA相比，本發(fā)明制備的羊膜微 粒植入劑，可在一定程度上維持羊膜的細(xì)胞外基質(zhì)天然三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖4)，在材料降解前 可有效維持植入部位的空隙，并提供自體組織細(xì)胞生成的三維空間，可使注射羊膜微粒植 入劑的部位維持較好的立體修復(fù)效果。
[0051] (3 )本發(fā)明通過溫和的物理化學(xué)方法去除了羊膜的細(xì)胞及可溶性蛋白等免疫排斥 成分，有效保留多種天然成分及細(xì)胞外基質(zhì)天然結(jié)構(gòu)，并采用先交聯(lián)后勻漿的方法，方便改 性后清洗，能夠徹底去除試劑殘留，使羊膜微粒植入劑具有良好的細(xì)胞相容性和組織相容 性，將本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時未顯示有細(xì)胞毒性，且較完 整的羊膜細(xì)胞外基質(zhì)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞貼附于羊膜微粒進(jìn)行增殖生長（圖5,圖6);大鼠 皮下植入實驗結(jié)果表明，植入部位未出現(xiàn)任何紅腫，潰爛，血腫，組織學(xué)染色切片結(jié)果表明 1、4、8、24、52周的組織炎癥反應(yīng)均較輕，植入材料周圍及內(nèi)部浸潤的炎癥細(xì)胞數(shù)量均較少 (圖 9)。
[0052] (4)本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑，在植入體內(nèi)后可有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠 原，通過在體外模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行羊膜微粒植入劑與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，對成纖維細(xì)胞 合成膠原的能力進(jìn)行驗證，結(jié)果表明羊膜微粒植入劑可有效刺激人成纖維細(xì)胞提高膠原合 成的能力（圖7)，說明了本發(fā)明制備方法能夠保留羊膜的成纖維細(xì)胞生長因子，可有效促進(jìn) 成纖維細(xì)胞的增殖。
[0053] (5)本發(fā)明制備方法具有較高的質(zhì)量可控性，可通過控制產(chǎn)品制備過程中產(chǎn)品的 改性程度、濃度、平均粒徑及粒徑分布范圍等參數(shù)從而控制產(chǎn)品的動力粘度、降解速率等參 數(shù)，實現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。按照本發(fā)明制備得到的多批產(chǎn)品各項理化參數(shù)如微粒濃度、動 力粘度、體外降解時間均較為穩(wěn)定(表1 )，并可將90%羊膜微粒粒徑控制在50?200 μ m之 間，避免出現(xiàn)粒徑分布過大導(dǎo)致注射時堵塞針頭或粒徑分布過小導(dǎo)致有效性不穩(wěn)定等問題 (圖 8)。
[0054] (6)本發(fā)明根據(jù)羊膜天然的橢球形特點，在清洗、處理羊膜過程中，將羊膜固定在 半橢球形裝置上，可有效避免羊膜在處理過程中破損，纏繞，大大提高生產(chǎn)效率。
[0055] (7)本發(fā)明制備方法可有效控制產(chǎn)品濃度、粘度、降解速率等參數(shù)，能夠保證制備 的羊膜微粒植入劑植入體內(nèi)后可快速成型，具有長期良好的填充效果，其持久性至少在12 個月以上，羊膜微粒植入劑雖在逐步降解，但未發(fā)生移位、擴(kuò)散等現(xiàn)象（圖9)。
[0056] (8)本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑，生物安全性良好，與采用動物來源膠原或通過 基因重組發(fā)酵獲取的重組膠原制備的膠原植入劑相比，同源性大大提高，可避免注射動物 膠原或重組膠原所必須進(jìn)行的皮試實驗，節(jié)省患者就診時間及費用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0057] 圖1是本發(fā)明的中空半橢球形固定羊膜的裝置示意圖 圖2是實施例制備的羊膜微粒植入劑中膠原組分的免疫組化染色結(jié)果之圖片 圖3是本實施例制備的羊膜微粒植入劑的多種膠原及活性因子定量檢測結(jié)果之圖片 圖4是本實施例制備的羊膜微粒植入劑凍干后掃描電鏡結(jié)果 圖5是人成纖維細(xì)胞與羊膜微粒植入劑進(jìn)行共培養(yǎng)5天后在普通光學(xué)顯微鏡下的觀察 圖片 圖6是人成纖維細(xì)胞與羊膜微粒植入劑進(jìn)行共培養(yǎng)5天后的組織學(xué)切片圖片 圖7是本實施例制備的羊膜微粒植入劑在體外與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)3、5、7天后， 取共培養(yǎng)體系中的所有人成纖維細(xì)胞，提取其中的mRNA后采用RT-PCR方法檢測I型膠原 mRNA表達(dá)量的檢測結(jié)果之圖片 圖8是本實施例制備的羊膜微粒植入劑的粒徑分布檢測結(jié)果之圖片 圖9是本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑植入大鼠皮下組織后進(jìn)行組織學(xué)檢測以及羊膜 微粒植入劑的降解研究結(jié)果圖片 圖10是本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑植入大鼠皮下組織后不同時間點進(jìn)行外觀效果 觀察的圖片 圖11是本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑植入大鼠皮下組織后不同時間點的組織學(xué)切片 效果觀察的圖片

【具體實施方式】
[0058] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0059] 本發(fā)明實施例采用人羊膜是產(chǎn)婦簽署知情同意書后，經(jīng)剖腹產(chǎn)從廢棄胎盤剝離獲 得，并浸泡于PBS冰浴保存，24小時之內(nèi)運輸至實驗室；高速微射流設(shè)備是美國BEE廠家生 產(chǎn)的Nano DeBEE. 45型號；高速低溫離心粉碎機是上海福里茨儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)定制 的。
[0060] 圖1顯示了本發(fā)明之固定羊膜裝置的形狀和結(jié)構(gòu)
[0061] 該裝置為中空半橢球形殼體1，殼體上均勻地分布著諸多小孔2,小孔直徑為 0. 5cm，相鄰小孔間距為2cm。使用時，在清洗、處理羊膜過程中，將羊膜固定在該半橢球形殼 體上，可有效避免羊膜在處理過程中破損，纏繞，大大提高生產(chǎn)效率。
[0062] 下面列舉九個制備可注射植入劑方法的實施例：
[0063] 實施例1、
[0064] 步驟一、消毒處理：在無菌條件下，將羊膜浸泡在PBS中清洗至無血色、污物，再用 純化水清洗1次，然后用體積濃度為75%的乙醇水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理30分鐘；
[0065] 步驟二、脫細(xì)胞處理：將步驟一消毒處理后的羊膜先用純化水清洗3次，再用 0. 05mol/L氫氧化鈉水溶液對羊膜進(jìn)行震蕩處理30分鐘，振蕩頻率為50rpm，最后采用純化 水清洗3次；
[0066] 步驟三、改性處理：將步驟二得到的羊膜用0. lmol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳二亞胺鹽酸鹽的pH為5的水溶液在2°C下處理6小時；
[0067] 步驟四、羊膜微粒的制備：將步驟三改性處理后的羊膜用純化水震蕩清洗3次，然 后真空冷凍干燥，最后于2°C下將羊膜經(jīng)超高速低溫離心粉碎機粉碎成粒徑約200 μ m的微 粒；
[0068] 步驟五、羊膜微粒植入劑的制備：將3. 5g步驟四制備的羊膜微粒作為組分A，用 100mL注射用水配制pH為7. 2的磷酸氯化鈉生理溶液作為組分B (所述組分B之磷酸氯化 鈉生理溶液的組成為：以注射用水為溶劑，含有終濃度為5. 5g/L的氯化鈉溶液，0. 312g/L 的磷酸二氫鈉溶液和1. 6g/L的磷酸氫二鈉溶液)，將組分A和組分B按照質(zhì)量體積比35:1 (g/L)快速震蕩混勻，經(jīng)高速微射流設(shè)備循環(huán)6次，工作壓力在15000Pa，出口噴嘴直徑為 0. 1mm，將其制備成濃度為35mg/mL的羊膜微粒懸液，羊膜微粒的粒徑約60?100 μ m。最后 將羊膜微粒懸液經(jīng)無菌真空灌裝，再經(jīng)25kGy伽馬射線輻照滅菌，即制備得到可臨床使用 的羊膜微粒植入劑。
[0069] 本實例制備得到的羊膜微粒植入劑細(xì)胞相容性良好，與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)5天 后采用光學(xué)顯微鏡及組織學(xué)切片進(jìn)行觀察及檢測的結(jié)果如圖5、圖6所示，結(jié)果表明羊膜微 粒植入劑能夠支持成纖維細(xì)胞貼服，生長。另外，本實例制備得到的羊膜微粒植入劑濃度及 改性程度均較低，故降解速率較快，采用〇. 2mg/mL的蛋白酶K進(jìn)行體外降解，降解時間約為 24小時，大鼠皮下植入結(jié)果顯示4?6個月后羊膜微粒植入劑基本降解。該方法制備的羊 膜微粒植入劑可用于眼角周圍細(xì)紋的修復(fù)。
[0070] 實施例2、
[0071] 步驟一、消毒處理：在無菌條件下，將羊膜浸泡在PBS中清洗至無血色、污物，再 用純化水清洗5次，然后用體積濃度為75%乙醇水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理15分鐘，再用 0. 1%過氧乙酸對羊膜進(jìn)行消毒處理15分鐘；
[0072] 步驟二、脫細(xì)胞處理：將步驟一消毒處理后的羊膜先用純化水清洗1次，再用 0. Olmol/L氫氧化鈉水溶液對羊膜進(jìn)行震蕩處理10分鐘，振蕩頻率為80rpm，然后用3mol/ L氯化鈉水溶液進(jìn)行震蕩處理100分鐘,最后采用純化水清洗10次；
[0073] 步驟三、改性處理：將步驟二得到的羊膜用0. 5mg/mL核糖水溶液在2°C下處理3 天；
[0074] 步驟四、羊膜微粒的制備：將步驟三改性處理后的羊膜用純化水震蕩清洗10次， 然后室溫風(fēng)干，最后于8°C下將羊膜經(jīng)超高速低溫離心粉碎機粉碎成粒徑約500 μ m大小的 顆粒；
[0075] 步驟五、羊膜微粒植入劑的制備：將5g步驟四制備的羊膜微粒作為組分A，用 100mL注射用水配制pH為7. 0的磷酸氯化鈉生理溶液，再添加50mg利多卡因和200mg透 明質(zhì)酸，與上述磷酸氯化鈉生理溶液混合后作為組分B，將組分A和組分B質(zhì)量體積比50:1 (g/L)快速震蕩混勻，經(jīng)高速微射流設(shè)備循環(huán)5次，工作壓力在8000Pa，出口噴嘴直徑為 0. 25mm，將其制備成濃度為50mg/mL的羊膜微粒懸液，羊膜微粒的粒徑約150?200 μ m。最 后將羊膜微粒懸液經(jīng)無菌真空灌裝，再經(jīng)15kGy伽馬射線輻照滅菌即制備得到可臨床使用 的羊膜微粒植入劑。所述磷酸氯化鈉生理溶液的組成為：以注射用水為溶劑，含有終濃度分 別為4. Og/L的氯化鈉溶液，0. 2g/L的磷酸二氫鈉溶液和1. Og/L的磷酸氫二鈉溶液。
[0076] 本實施例制備得到的羊膜微粒植入劑粒徑較大，同時添加了利多卡因作為局部麻 醉劑，添加了透明質(zhì)酸以改善羊膜微粒植入劑粘度。另外本實例制備得到的羊膜微粒植入 劑濃度及改性程度均較高，故降解速率較慢，采用〇. 2mg/mL的蛋白酶K進(jìn)行體外降解，降解 時間約為72小時，大鼠皮下植入組織學(xué)檢測以及羊膜微粒植入劑的降解研究結(jié)果如圖9所 示，顯示52周后羊膜微粒植入劑仍有大量材料未被降解吸收，預(yù)計注射后18?24個月后 羊膜微粒植入劑會基本降解。該方法制備的羊膜微粒植入劑可用于鼻唇溝等較深皺紋的修 復(fù)。
[0077] 實施例3、
[0078] 步驟一、消毒處理：在無菌條件下，將羊膜浸泡在PBS中清洗至無血色、污物，再用 純化水清洗3次，然后用體積濃度為75%乙醇水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理10分鐘；再用體 積濃度為1%的雙氧水溶液對羊膜消毒10分鐘；
[0079] 步驟二、脫細(xì)胞處理：先用純化水將消毒后的羊膜清洗2次，再lmg/mL的EDTA水 溶液對羊膜進(jìn)行震蕩處理60分鐘，0. lmg/mL的胰酶水溶液振蕩處理10分鐘，振蕩頻率均為 60rpm，最后采用純化水清洗6次；
[0080] 步驟三、改性處理：將步驟二得到的羊膜用體積濃度為1%的戊二醛水溶液在室溫 下處理6小時；
[0081] 步驟四、羊膜微粒的制備：將步驟三改性處理后的羊膜用純化水震蕩清洗6次，然 后室溫風(fēng)干，最后于4°C下將羊膜經(jīng)超高速低溫離心粉碎機粉碎成粒徑約280 μ m大小的顆 粒；
[0082] 步驟五、羊膜微粒植入劑的制備：將3. 5g步驟四制備的羊膜微粒作為組分A，用 100mL注射用水配制pH為7. 5的磷酸氯化鈉生理溶液作為組分B (所述組分B之磷酸氯化 鈉生理溶液的組成為：以注射用水為溶劑，含有終濃度分別為8g/L的氯化鈉溶液，0. 4g/L 的磷酸二氫鈉溶液和2. Og/L的磷酸氫二鈉溶液)，將組分A和組分B按照質(zhì)量體積比35:1 (g/L)快速震蕩混勻，經(jīng)高速微射流設(shè)備循環(huán)6次，工作壓力在12000Pa，出口噴嘴直徑為 0. 2mm，將其制備成濃度為35mg/mL的羊膜微粒懸液，羊膜微粒的粒徑約80?120 μ m。最后 將羊膜微粒懸液先經(jīng)25kGy伽馬射線輻照滅菌，再經(jīng)無菌真空灌裝即制備得到可臨床使 用的羊膜微粒植入劑。
[0083] 將本實例制備得到的三批羊膜微粒植入劑進(jìn)行體外降解時間、羊膜微粒濃度、平 均粒徑及動力粘度檢測，結(jié)果如表1所示，各批次間檢測結(jié)果差異不大，表明本發(fā)明方法可 以有效保證及控制制備的羊膜微粒植入劑質(zhì)量的穩(wěn)定性。
[0084] 實施例4、
[0085] 步驟一、消毒處理：在無菌條件下，將羊膜浸泡在PBS中清洗至無血色、污物，再用 純化水清洗3次，然后用體積濃度為3%的雙氧水溶液對羊膜進(jìn)行消毒60分鐘，再用體積濃 度為90%的乙醇水溶液對羊膜進(jìn)行消毒60分鐘，再用體積濃度為2%的過氧乙酸水溶液對 羊膜進(jìn)行消毒處理60分鐘；
[0086] 步驟二、脫細(xì)胞處理：將步驟一消毒處理后的羊膜先用純化水清洗3次，再用lmg/ mL的EDTA水溶液震蕩處理120分鐘，再用0. lmol/L氫氧化鈉水溶液震蕩處理120分鐘，再 用5mol/L氯化鈉水溶液振蕩處理120分鐘，最后再用lmg/mL的胰酶水溶液對羊膜進(jìn)行震 蕩處理120分鐘，振蕩頻率均為80rpm。最后采用PBS清洗10次；
[0087] 步驟三、改性處理：將步驟二得到的羊膜用0. lmg/mL的核黃素水溶液在室溫下處 理4小時；
[0088] 步驟四、羊膜微粒的制備：將步驟三改性處理后的羊膜用PBS震蕩清洗3次，然后 真空冷凍干燥，最后于6°C下將羊膜經(jīng)超高速低溫離心粉碎機粉碎成粒徑約300 μ m大小的 顆粒；
[0089] 步驟五、羊膜微粒植入劑的制備：將2g步驟四制備的羊膜微粒作為組分A，用 100mL注射用水配制pH為7. 5的磷酸氯化鈉生理溶液，再添加30mg的利多卡因與上述磷酸 氯化鈉生理溶液混合后作為組分B，將組分A和組分B質(zhì)量體積比20:1 (g/L)快速震蕩混 勻，經(jīng)高速微射流設(shè)備循環(huán)8次，工作壓力為15000Pa，出口噴嘴直徑為0. 1mm制備成濃度為 20mg/mL羊膜微粒懸液，羊膜微粒的粒徑約為50?200 μ m。最后將羊膜微粒懸液經(jīng)15kGy 伽馬射線輻照滅菌，再經(jīng)無菌真空灌裝即制備得到可臨床使用的羊膜微粒植入劑。所述磷 酸氯化鈉生理溶液的組成為：以注射用水為溶劑，含有終濃度分別為8g/L的氯化鈉溶液， 0. 4g/L的磷酸二氫鈉溶液和2. Og/L的磷酸氫二鈉溶液。
[0090] 本實例制備得到的羊膜微粒植入劑作用效果與實施例1基本一致，可用于眼角周 圍細(xì)紋的修復(fù)。
[0091] 本實例制備得到的羊膜微粒植入劑進(jìn)行粒徑檢測的結(jié)果如圖8所示，從粒徑檢測 結(jié)果可以看到粒徑大小約有90%以上均在50?200 μ m范圍內(nèi)，表明羊膜微粒植入劑可有 效控制廣品粒徑。
[0092] 實施例5、
[0093] 步驟一、消毒處理：在無菌條件下，將羊膜浸泡在PBS中清洗至無血色、污物，再用 純化水清洗3次，然后用體積濃度為1%的雙氧水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理5分鐘，再用體 積濃度為60%的乙醇水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理5分鐘，再用體積濃度為0. 1%的過氧乙酸 水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理5分鐘；
[0094] 步驟二、脫細(xì)胞處理：將步驟一消毒處理后的羊膜先用純化水清洗3次，再用 0. lmg/mL的EDTA水溶液震蕩處理5分鐘，再用0. Olmol/L氫氧化鈉水溶液震蕩處理5分 鐘，再用lmol/L氯化鈉水溶液振蕩處理5分鐘，最后用0. lmg/mL的胰酶水溶液對羊膜進(jìn)行 震蕩處理5分鐘，振蕩頻率為50rpm。最后采用純化水或PBS清洗3次；
[0095] 步驟三、改性處理：將步驟二得到的羊膜在室溫下采用3000 μ W/cm2紫外線照射4 小時；
[0096] 步驟四、羊膜微粒的制備：將步驟三改性處理后的羊膜用PBS震蕩清洗10次，然 后室溫風(fēng)干，最后于5°C下將羊膜經(jīng)超高速低溫離心粉碎機粉碎成粒徑約600 μ m大小的顆 粒；
[0097] 步驟五、羊膜微粒植入劑的制備：將10g步驟四制備的羊膜微粒作為組分A，用 100mL注射用水配制pH為7. 2的磷酸氯化鈉生理溶液，再添加 lmg的bFGF與上述磷酸氯 化鈉生理溶液混合后作為組分B，將組分A和組分B質(zhì)量體積比100:1 (g/L)快速震蕩混 勻，經(jīng)高速微射流設(shè)備循環(huán)3次，工作壓力為5000Pa，出口噴嘴直徑為0. 25mm，制備成濃度 為100mg/mL羊膜微粒懸液，羊膜微粒的粒徑為150?180 μ m。最后將羊膜微粒懸液經(jīng)無菌 真空灌裝，再經(jīng)10kGy伽馬射線輻照滅菌即制備得到可臨床使用的羊膜微粒植入劑。所述 磷酸氯化鈉生理溶液的組成為：以注射用水為溶劑，含有終濃度為5. 5g/L的氯化鈉溶液， 0. 312g/L的磷酸二氫鈉溶液和1. 6g/L的磷酸氫二鈉溶液。
[0098] 本實例制備得到的羊膜微粒植入劑作用效果與實施例2基本一致，可用于鼻唇溝 等較深皺紋的修復(fù)。
[0099] 本實例制備得到的羊膜微粒植入劑進(jìn)行膠原免疫組化檢測及膠原、因子含量的定 量檢測，結(jié)果如圖2及圖3所示，從檢測結(jié)果可以看出，本實例制備得到羊膜微粒植入劑保 留了羊膜中天然的膠原及各類因子成分。
[0100] 實施例6、
[0101] 步驟一、消毒處理：在無菌條件下，將羊膜浸泡在PBS中清洗至無血色、污物，再用 純化水清洗2次，然后用體積濃度為2%的雙氧水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理30分鐘，再用體 積濃度為75%的乙醇水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理30分鐘，最后用體積濃度為1%的過氧乙 酸水溶液對羊膜進(jìn)行消毒處理30分鐘；
[0102] 步驟二、脫細(xì)胞處理：將步驟一消毒處理后的羊膜先用純化水清洗2次，再用 0. 5mg/mL的EDTA水溶液處理60分鐘，再用0. 05mol/L氫氧化鈉水溶液處理60分鐘，再用 3mol/L氯化鈉水溶液處理60分鐘，最后用0. 5mg/mL的胰酶水溶液處理60分鐘，振蕩頻率 為65rpm。最后采用PBS清洗7次；
[0103] 步驟三、改性處理：將步驟二得到的羊膜用0. 5mol/L的EDC. HCL的pH為6的水溶 液中，在40°C下處理48小時；
[0104] 步驟四、羊膜微粒的制備：將步驟三改性處理后的羊膜用PBS震蕩清洗7次，然后 真空冷凍干燥，最后于：TC下將羊膜經(jīng)超高速低溫離心粉碎機粉碎成500 μ m大小的顆粒。
[0105] 步驟五、羊膜微粒植入劑的制備：將5g步驟四制備的羊膜微粒作為組分A，用 100mL注射用水配制pH為7. 3的磷酸氯化鈉生理溶液，再添加 lg透明質(zhì)酸與上述磷酸氯化 鈉生理溶液混合后作為組分B，將組分A和組分B質(zhì)量體積比50:1 (g/L)快速震蕩混勻， 經(jīng)高速微射流設(shè)備循環(huán)5次，工作壓力為lOOOOPa，出口噴嘴直徑為0. 15_，制備成濃度為 50mg/mL羊膜微粒懸液，羊膜微粒的粒徑為120?170 μ m。最后將羊膜微粒懸液先經(jīng)10kGy 伽馬射線輻照滅菌，再經(jīng)無菌真空灌裝，即制備得到可臨床使用的羊膜微粒植入劑。所述 磷酸氯化鈉生理溶液的組成為：以注射用水為溶劑，含有終濃度為5. 8g/L的氯化鈉溶液， 0. 356g/L的磷酸二氫鈉溶液和1. 4g/L的磷酸氫二鈉溶液。
[0106] 本實例制備得到的羊膜微粒植入劑作用效果與實施例2基本一致，可用于鼻唇溝 等較深皺紋的修復(fù)。
[0107] 本實例制備得到的羊膜微粒植入劑，將其凍干后進(jìn)行掃描電鏡檢測，檢測結(jié)果如 圖4所示，從檢測結(jié)果可以看出，羊膜微粒仍保留了羊膜細(xì)胞外基質(zhì)良好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
[0108] 實施例7、
[0109] 本實施例與實施例1基本相同，不同僅在于：所述步驟三中的"1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽"改為" lmg/mL的核黃素水溶液在室溫下處理24小時，室溫 下10000 μ W/cm2紫外線照射16小時"。所述步驟五中：在組分B中添加100mg利多卡因、 100mg透明質(zhì)酸。
[0110] 將本實例制備得到的羊膜微粒植入劑與人成纖維細(xì)胞體外共培養(yǎng)，對共培養(yǎng)一段 時間后的人成纖維細(xì)胞提取其中的mRNA，采用RT-PCR方法檢測I型膠原mRNA表達(dá)量，檢測 結(jié)果如圖7所示，從圖中可以看出本實例制備的羊膜微粒植入劑，可有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞 生長增殖。
[0111] 實施例8、
[0112] 本實施例與實施例1基本相同，不同僅在于：所述步驟三中的"1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽"改為"體積濃度為〇. 1%戊二醛水溶液在室溫下處理12小 時"。所述步驟五中：在組分B中添加0· lmg bFGF、500mg透明質(zhì)酸、200mg利多卡因。
[0113] 實施例9、
[0114] 本實施例與實施例1基本相同，不同僅在于：所述步驟三中的"1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽"改為" 1. 5mg/mL的核糖水溶液在40°C下處理14天"。
[0115] 以下針對上述實施例，結(jié)合實驗數(shù)據(jù)、圖片資料等進(jìn)行分析：
[0116] 圖2是實施例制備的羊膜微粒植入劑中膠原組分的免疫組化染色結(jié)果之圖片
[0117]
[0118] 圖中，1為I型膠原，2為III型膠原，3為IV型膠原，4為陰性對照。
[0119] 圖片顯示：羊膜微粒植入劑中的I型膠原、III型膠原含量較多，IV型膠原含量 稍少但也具有明顯的陽性表達(dá)。
[0120] 圖3是本實施例制備的羊膜微粒植入劑的多種膠原及活性因子定量檢測結(jié)果之 圖片
[0121]
[0122] 圖中，I型膠原、III型膠原含量較多，IV型膠原含量稍少，與膠原組分定性結(jié)果 相符。另外，各活性因子中肝細(xì)胞生長因子（HGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF)以及(成纖維細(xì) 胞生長因子)bFGF含量較多。結(jié)果表明本實施例制備的羊膜微粒植入劑可有效保留多種活 性因子。
[0123] 圖4是本實施例制備的羊膜微粒植入劑凍干后掃描電鏡結(jié)果
[0124] 圖中可見：凍干后的羊膜微粒呈較疏松的纖維形態(tài)，顯示羊膜微粒植入劑中的羊 膜微粒仍保留了羊膜細(xì)胞外基質(zhì)良好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
[0125] 圖5是人成纖維細(xì)胞與羊膜微粒植入劑進(jìn)行共培養(yǎng)5天后在普通光學(xué)顯微鏡下的 觀察圖片
[0126]
[0127] 圖中，成纖維細(xì)胞與羊膜微粒植入劑貼附良好，且成纖維細(xì)胞能正常增殖生長，結(jié) 果表明本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑具有良好的細(xì)胞相容性。
[0128] 圖6是人成纖維細(xì)胞與羊膜微粒植入劑進(jìn)行共培養(yǎng)5天后的組織學(xué)切片圖片
[0129]
[0130] 結(jié)果顯示：羊膜微粒植入劑表層及部分羊膜微粒內(nèi)部均貼附了連續(xù)的成纖維細(xì)胞 層，說明本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑具有極好的細(xì)胞相容性，并且也說明了羊膜微粒植 入劑保留了較好的羊膜細(xì)胞外基質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可促使細(xì)胞長入。
[0131] 圖7是實施例制備的羊膜微粒植入劑在體外與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)3、5、7天后， 取共培養(yǎng)體系中的所有人成纖維細(xì)胞，提取其中的mRNA后采用RT-PCR方法檢測I型膠原 mRNA表達(dá)量的檢測結(jié)果之圖片
[0132]
[0133] 從圖中可以看出：7天后，共培養(yǎng)條件下的人成纖維細(xì)胞的I型膠原mRNA表達(dá)量比 單獨培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞的表達(dá)量要多出60%左右，說明本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑，可有 效保留羊膜中的成纖維細(xì)胞生長因子等活性成分，可起到促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長增殖的作用。
[0134] 表1是按照本發(fā)明制備的多批羊膜微粒植入劑的體外降解、羊膜微粒濃度、平均 粒徑以及動力粘度的檢測結(jié)果
[0135]
[0136] 產(chǎn)品批次代號體夕卜降解時間（min) 羊膜微粒濃度（mg/mL) 平均粒徑（μ m) 云力力粘度（mPa · s) 1 丨4358 丨35· 04 丨98· 23 丨9341 2 14403 |35. 19 |99· 84 19580 3 丨4278 丨35· 74 丨98· 91 丨9803
[0137] 說明本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑可有效控制產(chǎn)品以上質(zhì)量參數(shù)的穩(wěn)定性。
[0138] 圖8是實施例制備的羊膜微粒植入劑的粒徑分布檢測結(jié)果之圖片
[0139] 說明本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑可有效控制產(chǎn)品粒徑分布范圍。
[0140] 圖9是本發(fā)明制備的羊膜微粒植入劑植入大鼠皮下組織后進(jìn)行組織學(xué)檢測以及 羊膜微粒植入劑的降解研究結(jié)果圖片
[0141]
[0142]
[0143] 圖中，Α為1周取材外觀圖片，Β為1周取材組織學(xué)染色切片圖片，C為4周取材外 觀圖片，D為4周取材組織學(xué)染色切片圖片，E為8周取材外觀圖片，F(xiàn)為8周取材組織學(xué)染 色切片圖片，G為24周取材外觀圖片，Η為24周取材組織學(xué)染色切片圖片，I為52周取材 外觀圖片，J為52周取材組織學(xué)染色切片圖片。結(jié)果顯示：羊膜微粒植入劑具有良好的組 織相容性、良好的長期填充效果，不會發(fā)生移位、擴(kuò)散等現(xiàn)象。
[0144] 實驗報告(摘錄）
[0145] 1、羊膜微粒植入劑介紹
[0146] 羊膜（Amniotic membrane AM)為光滑、無血管、無神經(jīng)、無淋巴的透明薄膜，厚約 0. 02?0. 50mm，是一種理想的組織工程修復(fù)材料，已用于多種組織缺損的治療和修復(fù)。
[0147] 本實驗制做的羊膜微粒植入劑，是將羊膜通過本專利工藝，制備為可注射式微粒 植入劑。在制備過程中可有效去除羊膜中的異體細(xì)胞成分，并最大程度保留羊膜天然膠原 及各類因子，生物相容性好，沒有明顯的免疫誘導(dǎo)活性，具有良好的誘導(dǎo)膠原生成的能力， 是一種理想的美容注射填充材料。
[0148] 2、皮膚皺紋整形修復(fù)介紹
[0149] 2.1皺紋生成機理
[0150] 皮膚產(chǎn)生皺紋的原因有多種，主要分為內(nèi)源性及外源性原因，內(nèi)源性主要是隨著 年齡的增長，皮膚的老化，膠原蛋白及彈性蛋白的合成及降解的平衡被打破，造成膠原蛋白 和彈性蛋白含量的降低，真皮層厚度減小，膠原纖維立體結(jié)構(gòu)被破壞，真皮層中成纖維細(xì)胞 衰老及消失而造成皺紋產(chǎn)生；外源性原因主要是環(huán)境中的紫外線等各種輻射引起皮膚中基 質(zhì)金屬蛋白酶增多，從而導(dǎo)致皮膚中膠原蛋白的含量降低，另外皮膚健康狀態(tài)與尼古丁、重 復(fù)性肌肉運動、飲食、睡眠姿勢以及整體健康程度均有較大關(guān)系。
[0151] 2. 2羊膜微粒植入劑作用機理
[0152] 羊膜微粒植入劑的注射部位為真皮深層，注射后主要作用為真皮補充具有人源性 膠原、多糖細(xì)胞外基質(zhì)，包括羊膜中富含的I、III型膠原蛋白等，并且羊膜微粒植入劑富 含的多種因子如bFGF等可有效促進(jìn)注射部位的真皮層中的成纖維細(xì)胞增殖，從而大大促 進(jìn)真皮層中的膠原合成，含有的多種抗炎癥因子如TIMP等，可有效降低細(xì)胞外基質(zhì)中的金 屬基質(zhì)蛋白酶活性，抑制其對真皮層中的細(xì)胞外基質(zhì)的降解速率；另外由于注射時會針頭 造成輕微損傷，亦可同時刺激機體在創(chuàng)傷愈合的過程中對注射部位的真皮組織進(jìn)行重塑作 用。
[0153] 3、動物實驗?zāi)Ｐ?、手術(shù)方法及評價標(biāo)準(zhǔn)
[0154] 3.1動物實驗?zāi)Ｐ?br> [0155] 本動物實驗報告采用對30只SD大鼠進(jìn)行皮下注射填充效果的動物有效性驗證， 動物性別不限，動物年齡均為成年。
[0156] 3. 2手術(shù)方法
[0157] 1 依據(jù)
[0158] 中華人名共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886. 10-2005《GBT16886. 2-2000醫(yī)療器械生物 學(xué)評價第2部分：動物保護(hù)要求》
[0159] 2受試動物
[0160] (1)動物品系：SD大鼠
[0161] (2)飼養(yǎng)條件：全價營養(yǎng)顆粒飼料喂食，自由采食，自由飲水，室溫18-26°C，每天 光照12小時，術(shù)前禁食8小時。
[0162] 3手術(shù)操作方法
[0163] (1)按照35mg/kg劑量使用1%戊巴比妥鈉靜脈注射進(jìn)行深度麻醉。
[0164] (2)待動物進(jìn)入手術(shù)麻醉期，將動物俯臥位固定在手術(shù)臺上。
[0165] (3)常規(guī)備皮，碘伏消毒手術(shù)部位。
[0166] (4)術(shù)者打開羊膜微粒植入劑產(chǎn)品，安裝好注射針頭，采用點狀注射方法，將材料 注射至大鼠胸椎兩側(cè)皮膚的皮下淺層部位。每點注射量0. 5ml。
[0167] (5)注射完畢后對注射部位進(jìn)行再次碘伏消毒。
[0168] (6)術(shù)后注意動物保暖復(fù)蘇，待蘇醒后放入籠具。
[0169] (7)寫好籠具標(biāo)簽，做好試驗記錄。
[0170] 4評價指標(biāo)
[0171] 于術(shù)后1周、2周、4周、8周、12周、16周、24周、32周、40周、52周對30只實驗大 鼠進(jìn)行處死解剖取材，每個時間點取材3只大鼠，大體觀察羊膜微粒植入劑在大鼠皮下殘 留情況，并進(jìn)行組織學(xué)切片檢測材料植入部位的組織相容性、炎癥反應(yīng)以及降解情況等。
[0172] 4、動物實驗結(jié)果
[0173] 4. 1大體取材外觀結(jié)果
[0174] 各時間點取材時注射部位大體情況如圖10所示，各時間點觀察大鼠皮下植入部 位均未出現(xiàn)紅腫、潰爛等不良反應(yīng)，皮膚外觀正常，材料生物相容性良好。羊膜微粒植入劑 在植入大鼠皮下52周后仍能從外觀看出注射材料部位的隆起效果。
[0175]
[0176] 4. 2組織學(xué)檢測結(jié)果
[0177] 各時間點取材后的材料形態(tài)，組織學(xué)切片結(jié)果如圖11所示，各時間點材料均保持 良好的填充效果，沒有發(fā)生移位、擴(kuò)散等不良現(xiàn)象。羊膜微粒植入劑在植入大鼠皮下52周 后仍能從組織學(xué)切片看到有較多材料剩余，材料內(nèi)部炎癥細(xì)胞浸潤較少，成纖維細(xì)胞逐漸 遷入材料內(nèi)部，羊膜微粒植入劑生物相容性良好。
[0178]
[0179] 上述結(jié)果說明，羊膜微粒植入劑具有良好的組織相容性、良好的長期填充效果，不 會發(fā)生移位、擴(kuò)散等現(xiàn)象。
【權(quán)利要求】
1. 一種可注射植入劑，其特征在于：是在pH為7. 0?7. 5的磷酸氯化鈉生理溶液中混 合有羊膜微粒；該可注射植入劑的微粒直徑為50?200 μ m，濃度為30?100mg/mL : 羊膜微粒和磷酸氯化鈉生理溶液，按照質(zhì)量體積比20:1?100:1混勻。
2. -種可注射植入劑的其制備方法，其特征在于：以羊膜為原料，經(jīng)過脫細(xì)胞、交聯(lián)改 性、勻漿和灌裝，制備而成，其包括羊膜的消毒處理，脫細(xì)胞處理，改性處理，羊膜微粒的制 備以及羊膜微粒植入劑的制備，具體步驟如下： 步驟一、消毒處理：在無菌條件下，將羊膜浸泡在磷酸鹽緩沖液中清洗至無血色、污物， 再用純化水清洗1?5次，然后用體積濃度為1?3%的雙氧水溶液、體積濃度為60?90% 的乙醇水溶液、體積濃度為0. 1?2%的過氧乙酸水溶液中的一種或者幾種，依次對羊膜進(jìn) 行消毒處理5?60分鐘； 步驟二、脫細(xì)胞處理：將步驟一消毒處理后的羊膜先用純化水清洗1?3次，再用 0. 1?lmg/mL的乙二酸四乙胺水溶液、0. 01?0. lmol/L氫氧化鈉水溶液、1?5mol/L氯化 鈉水溶液、〇. 1?lmg/mL的胰酶水溶液中的一種或者幾種，依次對羊膜進(jìn)行震蕩處理5? 120分鐘，振蕩頻率為50?80rpm，最后采用純化水或PBS清洗3?10次； 步驟三、改性處理：將步驟二得到的羊膜用物理或化學(xué)方法進(jìn)行改性處理，根據(jù)最終產(chǎn) 品降解性能的要求，可選擇不同處理強度的改性方法。改性所用的化學(xué)試劑或物理方法包 括但不限于：〇. 1?0. 5mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽的pH為 5?6的水溶液在2?40°C下處理6?48小時，0. 1?lmg/mL的核黃素水溶液在室溫下處 理4?24小時，室溫下3000?10000 μ W/cm2紫外線照射4?16小時，體積濃度為0. 1? 1%戊二醛水溶液在室溫下處理6?12小時，0. 5?1. 5mg/mL的核糖水溶液在2?40°C下 處理3?14天； 步驟四、羊膜微粒的制備：將步驟三改性處理后的羊膜用純化水或PBS震蕩清洗3? 10次，然后進(jìn)行室溫風(fēng)干或真空冷凍干燥處理，最后于2?8°C下將羊膜經(jīng)超高速低溫離心 粉碎機粉碎成100?1000 μ m大小的顆粒； 步驟五、羊膜微粒植入劑的制備：將步驟四制備的羊膜微粒作為組分A，將pH為7. 0? 7. 5的磷酸氯化鈉生理溶液作為組分B，將組分A和組分B按照質(zhì)量體積比20:1?100:1 (g/L)震蕩混勻，經(jīng)高速微射流設(shè)備循環(huán)3?8次。隨后，先將羊膜微粒懸液經(jīng)無菌真空灌 裝，再經(jīng)10?30kGy伽馬射線輻照滅菌或者先將羊膜微粒懸液經(jīng)10?30kGy伽馬射線輻 照滅菌，并進(jìn)行無菌真空灌裝，即制得可臨床使用的羊膜微粒植入劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述可注射植入劑的其制備方法，其特征在于：所述組分B之磷 酸氯化鈉生理溶液的組成為：以注射用水為溶劑，含有終濃度為3?8g/L的氯化鈉溶液， 0. 2?0. 4g/L的磷酸二氫鈉溶液和1. 2?2. Og/L的磷酸氫二鈉溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述可注射植入劑的其制備方法，其特征在于：在組分B中，還包括 有細(xì)胞生長因子、利多卡因、透明質(zhì)酸等中的任一種或者幾種，終濃度為0.001?O.Olmg/ mL的細(xì)胞生長因子、0. 3?2mg/mL的利多卡因、1?10mg/mL的透明質(zhì)酸等中的任一種或者 幾種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述可注射植入劑制備方法的制備裝置，其特征在于：固定羊膜采 用中空半橢球形殼體，該殼體上均勻分布有若干小孔。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述可注射植入劑制備方法的制備裝置，其特征在于：步驟五所述
【文檔編號】A61K35/54GK104055795SQ201310071109
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月6日
【發(fā)明者】劉博文, 張宏波, 冉永峰 申請人:陜西瑞盛生物科技有限公司