專利名稱：一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用材料制造的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鈦基種植體表面RGD交聯(lián)的膠 原、納米羥基磷灰石雜化涂層的制備方法，該涂層能夠?qū)崿F(xiàn)硬組織與永久性植入材料之間 快速骨整合，亦有利于種植材料的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
牙種植術(shù)是在骨結(jié)合理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，即種植體直接與骨組織形成化學(xué) 鍵合的能力，這種鍵合使得材料與組織產(chǎn)生牢固的骨性結(jié)合(Bone-binding)，而不是被纖 維組織所隔離，也就是在種植體與骨組織發(fā)生骨整合。研究表明骨整合是影響種植成功的 關(guān)鍵因素，排除外科操作技術(shù)和患者個(gè)體差異(種植部位骨量及其骨質(zhì)的情況等)這兩種因 素的影響，種植體表面形貌和化學(xué)性質(zhì)對(duì)于種植體骨整合性能具有決定性的影響。人們發(fā)現(xiàn)具有羥基磷灰石(HA)涂層的種植體和骨組織生物固定的速度快且長(zhǎng)期 的成功率顯著高于沒有HA涂層的種植體。這是由于HA可誘導(dǎo)骨基質(zhì)的異位晶體生長(zhǎng)，形 成化學(xué)性連接；HA微量溶解的Ca2+局部調(diào)控分化成骨細(xì)胞促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化；HA特異性 的吸附胞外基質(zhì)蛋白和骨基質(zhì)蛋白，加快分化性成骨細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)；HA的粗糙表面還 可增加纖維蛋白的附著。但是，臨床上和骨組織具有良好結(jié)合的HA涂層和鈦金屬種植體本 體的剝離，是這種具有HA涂層的鈦種植體面臨的一個(gè)很嚴(yán)重的問題。近年來，很多學(xué)者致力于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)胞膜受體之間相互作用的機(jī)制研 究，從而發(fā)現(xiàn)了很多調(diào)控細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的活性分子。RGD (Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨 酸-天冬氨酸)是各種細(xì)胞外基質(zhì)中最常見的基本結(jié)構(gòu)，也是廣泛存在于細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)中的 基本單位。RGD基團(tuán)能促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制破骨細(xì)胞之間、破骨細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏 附，阻止破骨細(xì)胞的增殖、遷移和分化，從而促進(jìn)成骨。研究者還發(fā)現(xiàn)，人工合成的RGD短肽 也具有同樣的功能。于是，人們?cè)囍裄GD短肽引入到種植體表面。物理吸附法是最簡(jiǎn)單 的一種，就是直接將種植體浸泡在RGD短肽溶液中。這種方法確實(shí)也有一定的作用，促進(jìn)了 種植體周圍骨的形成。但是物理吸附引入的RGD分布不均、厚薄不一、效率低下、穩(wěn)定性差、 重復(fù)性差以及結(jié)合力小容易在種植體植入過程中被擦掉。接著，有學(xué)者把目光轉(zhuǎn)向了用化 學(xué)偶聯(lián)的方法來引入RGD。就是用特殊的方法將種植體表面活化，使之產(chǎn)生能與RGD多肽 共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)，如-OH、-COOH和-NH2等?；瘜W(xué)偶聯(lián)法使RGD能與材料結(jié)合牢固、穩(wěn) 定、可重復(fù)性好。然而，化學(xué)交聯(lián)容易改變RGD起作用的最佳構(gòu)象，損害了 RGD的活性?？?見尋找一種合適的方法，將RGD短肽均勻、穩(wěn)定、牢固的結(jié)合到種植體表面而同時(shí)又不改變 種植體本來的表面形貌是很有必要的。層層自組裝技術(shù)是一種有效的表面改性方法。它的原理是利用靜電作用力，在固 體支持物表面依次組裝帶相反電荷的聚電解質(zhì)，最后得到從分子尺度到亞微米尺度的多層 復(fù)合膜(PEM)。它具有操作簡(jiǎn)單，制備條件溫和，方便可控，能連續(xù)生產(chǎn)等特點(diǎn)，而且無論固 體支持物形貌如何，最后均能得到物理化學(xué)性質(zhì)均一的聚電復(fù)合膜。這種聚電復(fù)合膜在干 燥環(huán)境中具有很高的穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)具有電荷性質(zhì)的聚電解質(zhì)和納米無機(jī)粒子等都可以利用LbL技術(shù)被引入到支持物表面。但是，聚電解質(zhì)復(fù)合膜在生理?xiàng)l件下并不是很穩(wěn)定(4 7天完全降解)。生物世界 是很奇妙的，很多生物大分子內(nèi)都有二硫鍵(-S-S-)的存在，依賴二硫鍵來維持生物大分 子(特別是蛋白質(zhì))的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。研究表明，二硫鍵可在谷胱甘肽的作用被打斷而還 原成巰基(-SH)，而巰基很容易被氧化成二硫鍵。這些反應(yīng)條件很溫和，對(duì)生物大分子的活 性損傷小。這給了我們很大的啟示，故本實(shí)驗(yàn)本發(fā)明公開一種LbL技術(shù)制備的含有RGD的 膠原/納米羥基磷灰石雜化涂層的制備方法，并在引入RGD的同時(shí)引入巰基，通過巰基與二 硫鍵的相互轉(zhuǎn)化來交聯(lián)雜化涂層，從而使雜化涂層更穩(wěn)定同時(shí)盡量不破壞雜化涂層中RGD 本來的生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法。該涂層通過鈦基 種植體表面多肽鏈段(RGD)交聯(lián)，能夠?qū)崿F(xiàn)硬組織與永久性植入材料之間快速骨整合，亦有 利于種植材料的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，本發(fā)明的制備方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)制備RGD接枝的聚電解質(zhì)合成GRGDSPC(S-S)CPSDGRG多肽鏈段(由SciLight Biotechnology, LLC公司合成)，該多肽鏈段為水溶性多肽。首先將多肽鏈段和聚電解 質(zhì)溶解在水溶液中，配置成混合溶液，然后加入碳化二亞胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl ami-nopropyl) carbodiimide，EDC]/N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)催 化體系，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，實(shí)現(xiàn)聚電解質(zhì)的改性，然后將所得到的產(chǎn)物純凈水中透析1周， 在透析液中直接加入木蘇糖或者谷胱甘肽溶解，常溫下保持不少于4小時(shí)，然后純凈水中 透析1周，最后凍干，得到RGD接枝的聚電解質(zhì)。該電解質(zhì)是一種修飾了 GRGDSPC的多肽鏈 段，并具有自由活潑巰基的聚電解質(zhì)。其中
所述聚電解質(zhì)選用透明質(zhì)酸、堿溶明膠、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、硫酸軟骨素中的一種， 得到的產(chǎn)物是RGD接枝的聚陰電解質(zhì)。聚陰電解質(zhì)的分子量為100-5000000D。(2)配置聚電解質(zhì)溶液將步驟(1)獲得的任一種RGD接枝的聚陰電解質(zhì)配置成溶 液，作為聚陰離子電解質(zhì)溶液；將I型膠原(豬源、牛源或鼠源)配置成溶液，然后將羥基磷 灰石納米粒子分散于膠原溶液中，作為聚陽(yáng)電解質(zhì)溶液；
(3)制備RGD交聯(lián)的聚電解質(zhì)涂層利用靜電自組裝技術(shù)，首先在鈦基種植體表面沉積 聚陽(yáng)電解質(zhì)，再沉積聚陰電解質(zhì)層，即將鈦基種植體浸入步驟(2)中的聚陽(yáng)電解質(zhì)溶液， 沉積一定時(shí)間后，充分水洗，然后浸入到步驟(2)配置的任一種RGD接枝的聚陰電解質(zhì)溶 液，沉積一定時(shí)間后，充分水洗；以上操作記為一次沉積循環(huán)，根據(jù)需要重復(fù)以上循環(huán)操作， 最后得到需要的聚電解質(zhì)復(fù)合層；然后，該聚電解質(zhì)復(fù)合層在氯胺T溶液或者雙氧水溶液 中浸泡一段時(shí)間，迅速取出，充分水洗，得到RGD交聯(lián)的雜化涂層。步驟(1)中，聚電解質(zhì)的濃度為0. l-50mg/ml，其中最佳濃度為5mg/ml ；所述的多 肽鏈段的量與聚電解質(zhì)中羧基含量的摩爾比例為1 :10000-1 :1，其中最佳濃度比率為1 20-50 ；所述的EDC/NHS的用量為1 :1_20 :1，其中最佳濃度比例為10-5 1 ；EDC的用量與多 肽鏈段的用量的摩爾比例為1 :1-10 :1，其中最佳濃度比例為2-5 1 ；所用的木蘇糖或者谷 胱甘肽的濃度與EDC/NHS體系中雙硫鍵的摩爾比例為1 :1-50 :1，其中最佳摩爾濃度比例為
45 :1。步驟(2)中聚電解質(zhì)溶液的濃度范圍為0. lmg/ml-10mg/ml，其中最佳濃度范圍為 0. 5-lmg/ml，其中聚電解質(zhì)溶液中NaCl濃度為0. 1-0. 2mol/L。步驟(2)中納米羥基磷灰石的粒徑為20ηπΓ 00ηπι。步驟(3)中聚電解質(zhì)層所用的沉積時(shí)間為5min到20min，聚電解質(zhì)復(fù)合層的沉積 循環(huán)為0. 5到50次，根據(jù)實(shí)際臨床用途確定最后的沉積循環(huán)數(shù)，其中口腔用牙種植體的表 面沉積最佳循環(huán)是4-10次，最外層為RGD修飾的聚電解質(zhì)層。步驟(3)中聚電解質(zhì)復(fù)合層 在氯胺T中的浸泡時(shí)間為5-180秒，最佳時(shí)間為30-90秒，氯胺T的濃度為0. 5-10 mM，其中 最佳濃度為2mM，在雙氧水中浸泡時(shí)間為5-60分鐘，最佳時(shí)間為10-20分鐘，雙氧水的濃度 為1-50 mM，其中最佳濃度為10-15mM。步驟(3)中所用的種植體表面為各種永久植入型種植體表面，可以選用經(jīng)氧化性 酸處理的純鈦或者鈦合金表面、非氧化型酸處理的純鈦或者鈦合金種植體表面、噴砂/酸 處理的表面、各種堿熱法得到的純鈦或者鈦合金種植體表面、電化學(xué)得到的各種表面、各種 羥基磷灰石涂層的純鈦或者鈦合金種植體表面、鈦或者羥基磷灰石噴漿表面的純鈦或者鈦 合金種植體表面、鈦噴漿/酸處理的純鈦或者鈦合金表面、離子注入的各種純鈦或者鈦合 金種植體表面、或激光處理的各種純鈦或者鈦合金種植體表面。本發(fā)明方法所構(gòu)建的RGD交聯(lián)的雜化涂層，在引入RGD的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了雜化涂層的 交聯(lián)，而且通過引入雙硫鍵，使得最后的聚電解質(zhì)復(fù)合膜的生物降解性能具有體內(nèi)響應(yīng)性， 該富含RGD的雜化涂層在適合各種體內(nèi)植入的鈦基種植體表面處理；該雜化涂層可以促進(jìn) 成骨前體細(xì)胞的黏附增殖分化，可以促進(jìn)種植體周圍成骨的早期發(fā)生，可以早日實(shí)現(xiàn)骨整
I=I ο


圖1是兩種涂層的降解曲線。
圖2是細(xì)胞在兩種涂層上的黏附和增殖能力檢測(cè)。
圖3是成骨細(xì)胞在兩組涂層上的堿性磷酸酶ALP檢測(cè)。
圖4是骨鈣素OC的檢測(cè)。
圖5是CollalmRNA在兩組涂層上的表達(dá)水平。
圖6是AKP-2mRNA在兩組涂層上的表達(dá)水平。
圖7是OsxmRNA在兩組涂層上的表達(dá)水平。
圖8是Rimx-2在兩組涂層上的表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。由于本發(fā)明可以在所有體內(nèi)永久性植 入的種植體表面進(jìn)行構(gòu)建，從而可以實(shí)現(xiàn)植入體和硬組織間的快速骨整合和遠(yuǎn)期的種植成 功率。實(shí)施例中只是以一種噴砂/酸處理表面作為說明，但是，其他體內(nèi)永久性植入種植體 表面上用本發(fā)明所構(gòu)建的這種涂層都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施例只是為了 更好說明本發(fā)明的特征，并不完全包含本專利的所保護(hù)內(nèi)容。實(shí)施例1 :RGD交聯(lián)的(膠原+羥基磷灰石)/透明質(zhì)酸雜化涂層的制備
5取一定量的透明質(zhì)酸溶解于水中，加入GRGDSPCS-SCPSDGRG溶解，最后加入EDC/NHS溶 解，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物透析1周，凍干；反應(yīng)產(chǎn)物直接溶解于水中，加入木蘇糖，反應(yīng)4小 時(shí)，透析一周，凍干，得到具有自由巰基的RGD接枝的透明質(zhì)酸鈉。將該RGD接枝的透明質(zhì)酸鈉和膠原分別溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，二者濃 度都為lmg/ml，然后將羥基磷灰石納米粒子分散于膠原溶液中，其中納米羥基磷灰石的最 終濃度為0. 5mg/ml ；種植體表面經(jīng)大顆粒噴砂、H2SO4和HCl混酸溶液處理1分鐘，大量純 凈水洗凈種植體表面，然后將該種植體浸泡于膠原羥基磷灰石溶液中l(wèi)Omin，去離子水洗去 物理吸附膠原和羥基磷灰石；然后，再浸泡于RGD交聯(lián)的透明質(zhì)酸溶液中l(wèi)Omin，去離子水 洗去物理吸附的透明質(zhì)酸鈉。重復(fù)以上操作，最后得到6個(gè)(膠原+羥基磷灰石)/透明質(zhì) 酸聚電解質(zhì)復(fù)合層。將該雜化聚電解質(zhì)復(fù)合層涂層的種植體浸泡于氯胺T中30秒鐘，立即 拿出，大量水洗，洗去氯胺T。得到RGD交聯(lián)的(膠原+羥基磷灰石)/透明質(zhì)酸雜化涂層的 種植體。實(shí)施例2 =RGD交聯(lián)的(膠原+羥基磷灰石)/堿溶明膠雜化涂層的制備 方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸換成堿溶明膠(豬源、牛源、鼠源)。實(shí)施例3 =RGD交聯(lián)的(膠原+羥基磷灰石)/聚谷氨酸雜化涂層的制備 方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸換成聚谷氨酸。實(shí)施例4 =RGD交聯(lián)的(膠原+羥基磷灰石)/聚天冬氨酸雜化涂層的制備 方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸換成聚天冬氨酸。實(shí)施例5 =RGD交聯(lián)的(膠原+羥基磷灰石)/硫酸軟骨素雜化涂層的制備 方法同實(shí)施例一，區(qū)別在于將透明質(zhì)酸換成硫酸軟骨素。 實(shí)施例6 體外降解試驗(yàn)
在PH為7. 2的PBS溶液中，分別研究(膠原+羥基磷灰石)/透明質(zhì)酸雜化涂層和RGD 交聯(lián)的(膠原+羥基磷灰石)/透明質(zhì)酸雜化涂層(制備方法見實(shí)施例一)的穩(wěn)定性，如圖1所 示，不交聯(lián)雜化聚電解質(zhì)涂層((Col+Ha) /HA) PBS溶液中六天內(nèi)降解完全，而交聯(lián)的雜化聚 電解質(zhì)涂層可以在14天內(nèi)降解完全，交聯(lián)的雜化涂層(RGD crosslinked hybrid coating) 的穩(wěn)定性得到極大的提高。實(shí)施例7 體外生物學(xué)評(píng)價(jià)
使用小鼠成骨前體細(xì)胞細(xì)胞系MC3T3-E1 (中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))來評(píng)測(cè)該涂層的體外生 物學(xué)性能。對(duì)照組為(膠原+羥基磷灰石)/透明質(zhì)酸雜化涂層鈦片組((Col+Ha) /HA)，試驗(yàn) 組為RGD交聯(lián)的(膠原+羥基磷灰石)/透明質(zhì)酸雜化涂層(制備方法見實(shí)施例一)鈦片組 (RGD crosslinked hybrid coating)。a.成骨細(xì)胞在鈦片上黏附(attachment)、增殖(proliferation)能力的檢測(cè)，參 見圖2 ；
b.成骨前體細(xì)胞在鈦片上分化能力的檢測(cè) 堿性磷酸酶活性的檢測(cè)(ALP)參見圖3 ； 細(xì)胞培養(yǎng)基中骨鈣素含量的檢測(cè)(OC)參見圖4 ； c.成骨相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)
本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法來分析成骨相關(guān)基因的表達(dá)變化。分別檢測(cè)I型 膠原(Collal mRNA)(參圖 5)，堿性磷酸酶(AKP-2 mRNA)(圖 6)，Osx mRNA (參圖 7)及Runx2 mRNA (參圖8)的表達(dá)。
1)細(xì)胞總RNA的提取
本實(shí)驗(yàn)采用能提取高質(zhì)量RNA的專用試劑盒(RNeasy Mini kit, Qiagen, German)。
該試劑盒包含以下幾部分
a.RNeasy Mini Spin Columns (pink)50
b.Collection Tubes (1. 5ml)50
c.Collection Tubes (2ml)50
d.Buffer RLT45ml
e.Buffer Rffl45ml
f.Buffer RPE(5 X)Ilml
g.RNase — Free Water10ml
h.Handbook1
為了去除總RNA中殘留的微量DNA，可以用試劑盒(RNase — free DNase Set)，包含 Buffer RDD 禾口 DNase I stock solution 兩部分。RNA提取前的準(zhǔn)備
1.每毫升BufferRLT使用前最好加10 μ 1巰基丙醇(β — ME)
2.1體積的Buffer RPE加4體積的無水酒精配成工作液 具體操作步驟
1.收集細(xì)胞，不超過10*7個(gè)細(xì)胞。在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，將裝有鈦片的細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng) 箱中取出，倒掉培養(yǎng)基，將鈦片在PBS里沖洗2遍，并轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)板中。接著每片鈦 片表面加Buffer RLT 200 μ 1 (平行樣本3片共600 μ 1)，搖床處理數(shù)分鐘，收集到RNA-free EP管中(可-80度長(zhǎng)期保存)。2.加一體積的70%乙醇(DEPC水配)，混勻，勿離心。3.取700μ 1置于柱子中，蓋上，IOOOOrpm離心15s，倒掉流出液。4.取350 μ 1 Buffer RWl置于柱子中，IOOOOrpm離心15s，倒掉流出液。5. 10 μ 1 Dnase原液+70μ1 Buffer RDD共80 μ 1加在柱子中的硅膠膜上，室溫 靜置15min。6.取350 μ 1 Buffer RWl置于柱子中，IOOOOrpm離心15s，倒掉流出液。7.取500 μ 1 Buffer RPE置于柱子中，IOOOOrpm離心15s，倒掉流出液。8.取 500 μ 1 Buffer RPE 置于柱子中，IOOOOrpm 離心 2min，棄管。9.將柱子放置于1. 5ml RNA-free EP新管中，將30 μ 1 RNA-free水加在柱子中 的硅膠膜上，蓋上，IOOOOrpm離心Imin以洗脫RNA。剛提取的總RNA馬上置于冰上，接著行RNA純度及濃度檢測(cè)(用紫外分光光度計(jì))。 當(dāng)RNA的A260/A280介于1. 8 2. 0之間，說明提取的RNA質(zhì)量好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。2 )總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
所用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit, Code DRR037A, TAKARA,大連寶生物工程有限公司)。該試劑盒推薦一個(gè)反應(yīng)體系為10 μ 1。具體的步驟為
5 X primescript buffer2 μ 1Primescript TR Emyne Mix I0. 5 μ 1
Random 6 mer(IOOum)0. 5 μ 1
Oligo dT prime(50um)0. 5 μ 1
Total RNA500ng
+ Rnase freeH20至 10 μ 1
37° 水浴 15min 85°水浴IOS cDNA -20° 保存 3)引物的設(shè)計(jì)和合成
Realtime RT-PCR所用引物由大連寶生Takara公司設(shè)計(jì)合成，具體見表1。
表1:目的基因的上游和下游引物
3) Realtime PCR
試劑SYBR 染料法試劑盒(SYBRR Premix Ex TaqTM, Perfect Real Time, Takara, Code: DRR041A)
儀器熒光定量 PCR 儀(C1000TM Thermal Cycler, Bio-rad, USA) 本實(shí)驗(yàn)采用的是20 μ 1體系，具體加樣方法參見表2 : 表2: PCR反應(yīng)液的制備
權(quán)利要求
1.一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法，其特征在于通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)制備多肽鏈段接枝的聚電解質(zhì)先將GRGDSPC(S-S)CPSDGRG多肽鏈段和聚電解質(zhì) 溶解在水溶液中配置成混合溶液，然后加入碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺催化體系，室 溫下反應(yīng)4小時(shí)，然后將所得到的產(chǎn)物在純凈水中透析1周，在透析液中直接加入木蘇糖或 者谷胱甘肽溶解，常溫下保持4小時(shí)，然后在純凈水中透析1周，凍干，得到多肽鏈段接枝的 聚電解質(zhì)；其中所述聚電解質(zhì)選用透明質(zhì)酸、堿溶明膠、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、硫酸軟骨素中的 一種，得到的產(chǎn)物是多肽鏈段接枝的聚陰電解質(zhì)，聚陰電解質(zhì)的分子量為100-5000000D ；(2)配置聚電解質(zhì)溶液將步驟(1)獲得的多肽鏈段接枝的聚陰電解質(zhì)配置成溶液，作 為聚陰離子電解質(zhì)溶液；將I型膠原配置成溶液，然后將羥基磷灰石納米粒子分散于膠原 溶液中，作為聚陽(yáng)電解質(zhì)溶液；(3)制備多肽鏈段交聯(lián)的聚電解質(zhì)涂層將鈦基種植體浸入步驟(2)中的聚陽(yáng)電解質(zhì) 溶液，沉積，充分水洗，然后浸入到步驟(2)配置的多肽鏈段接枝的聚陰電解質(zhì)溶液，沉積， 充分水洗；以上操作記為一次沉積循環(huán)，根據(jù)需要重復(fù)以上循環(huán)操作，得到聚電解質(zhì)復(fù)合 層；然后，該聚電解質(zhì)復(fù)合層在氯胺T溶液或者雙氧水溶液中浸泡，取出，充分水洗，得到多 肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法，其特征在于，步 驟(1)中，聚電解質(zhì)的濃度為0. l-50mg/ml，多肽鏈段的量與聚電解質(zhì)中羧基含量的摩爾比 為1 :10000-1 :1，碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺的用量為1 :1-20 :1，碳化二亞胺的用量 與多肽鏈段的用量的摩爾比為1 :1-10 :1，所用的木蘇糖或者谷胱甘肽的濃度與碳化二亞 胺/N-羥基琥珀酰亞胺體系中雙硫鍵的摩爾比為1 :1-50 :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法，其特征在于，步 驟(2)中聚電解質(zhì)溶液的濃度范圍為0. lmg/ml-10mg/ml，其中聚電解質(zhì)溶液中NaCl濃度為 0.1-0. 2mol/Lo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法，其特征在于，步 驟(2)中納米羥基磷灰石的粒徑為2(Tl00nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法，其特征在于，步 驟(3)中聚電解質(zhì)層所用的沉積時(shí)間為5-20min，聚電解質(zhì)復(fù)合層的沉積循環(huán)為0. 5到50次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法，其特征在于，步 驟(3)中聚電解質(zhì)復(fù)合層在氯胺T中的浸泡時(shí)間為5-180秒，氯胺T的濃度為0. 5-10 mM, 在雙氧水中浸泡時(shí)間為5-60分鐘，雙氧水的濃度為1-50 mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法，其特征在于，步 驟(3)中所用的種植體表面為永久植入型種植體表面，選用經(jīng)氧化性酸處理的純鈦或鈦合 金表面、非氧化型酸處理的純鈦或鈦合金種植體表面、噴砂/酸處理的表面、堿熱法得到的 純鈦或鈦合金種植體表面、電化學(xué)得到的表面、羥基磷灰石涂層的純鈦或鈦合金種植體表 面、鈦或羥基磷灰石噴漿表面的純鈦或鈦合金種植體表面、鈦噴漿/酸處理的純鈦或鈦合 金表面、離子注入的純鈦或鈦合金種植體表面、激光處理的純鈦或鈦合金種植體表面。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多肽鏈段交聯(lián)的雜化涂層的制備方法，通過鈦基種植體表面多肽鏈段交聯(lián)，實(shí)現(xiàn)硬組織與永久性植入材料之間快速骨整合，也有利于種植材料的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。本發(fā)明方法在引入RGD的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了雜化涂層的交聯(lián)，而且通過引入雙硫鍵，使得最后的聚電解質(zhì)復(fù)合膜的生物降解性能具有體內(nèi)響應(yīng)性。本發(fā)明所構(gòu)建的RGD交聯(lián)的雜化涂層，適合各種體內(nèi)植入的鈦基種植體表面處理，該雜化涂層可以促進(jìn)成骨前體細(xì)胞的黏附增殖分化，可以促進(jìn)種植體周圍成骨的早期發(fā)生，早日實(shí)現(xiàn)骨整合。
文檔編號(hào)A61L27/34GK102091350SQ20111003145
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者李曉東, 趙士芳, 黃穎 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)