專利名稱：：6,9-二取代的嘌呤衍生物及其在皮膚治療中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明提供了通過給予含有6,9-二取代的嘌呤衍生物的組合物，在體外和體內對抗哺乳動物細胞老化的不良影響，尤其是人皮膚細胞老化，并治療哺乳動物過度增殖和相關皮膚病的方法和組合物。
背景技術：
：細胞老化或細胞衰老是正常非轉化細胞的一般屬性，表現(xiàn)為形態(tài)學變化，并伴有老化相關的增殖潛力或能力的損失，包括細胞不能對外源性生長因子作出應答。已提出了許多理論來解釋細胞衰老現(xiàn)象。實驗證據(jù)提示，老化相關的增殖潛力或能力的損失可能是遺傳程序的原因(參見例如，Smith等，Mech.Age.Dev.13，387(1980);和Kirkwood等，Theor.Biol.53，481(1975))。該證據(jù)包括體外人成纖維細胞的細胞融合試驗，證明靜止細胞的衰老表型比增殖表型明顯(參見例如，Pereira-Smith等，SomaticCellGenet.8，731(1982);和Norwood等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1，223(1974))，并且在與年輕細胞融合之前，衰老細胞中需要進行蛋白質合成以抑制異質雙核體中年輕核內的DNA合成(參見例如，Burmer等，Exp.CellRes.145，708(1983);和Drescher-Lincoln等，Exp.CellRes.153，208(1984))。并且，將衰老成纖維細胞mRNA顯微注射到年輕成纖維細胞內可抑制年輕細胞合成DNA的能力(參見例如，Lumpkin等，Science232，393(1986))和年輕細胞進入細胞周期的S期(Lumpkin等，Exp.CellRes.160，544(1985))。而且，在體外衰老成纖維細胞中特殊類型的mRNA發(fā)生擴增(參見例如，Wellinger等，J.CellBiol.，34，203(1986);Flemming等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，4099(1988);West等，Exp.CellRes.184，138(1989);和Giordano,Exp.CellRes.185，399(1989))。還提出，衰老人成纖維細胞中存在改變的遺傳程序，包括在轉錄水平c-fos表達的阻抑(參見例如，Seshadri等，Science247，205(1990))。因此，年輕和衰老細胞之間存在基因型以及表型上的差異。近年來，認為6-取代的氨基嘌呤具有重要的生物化學意義。一些這種類型的化合物能夠促進植物生長，屬于稱為"細胞分裂素"的生長調節(jié)劑類型(Letham，Ann.Rev.Plant.Physiol.18，349(1967))。在基于植物組織培養(yǎng)物中誘導細胞分裂的生物試驗中，活性最高的細胞分裂素類化合物是天然來源的細胞分裂素反式玉米素(6-((E)-4-羥基-3-甲基丁-2-烯基氨基)嘌呤，Letham，Planta74，228(1967))。與玉米素緊密相關的細胞分裂素表現(xiàn)為可溶性RNA中的堿基(Skoog等，Science154，1354(1966))。在酵母、植物和動物的絲氨酸和酪氨酸RNA中，細胞分裂素與反密碼子相鄰。哺乳動物細胞培養(yǎng)物的生長受到某些具有細胞分裂素活性的N^取代的腺苷的抑制(Grace等，Proc.Am.Assoc.CancerRes.8，23(1967))。對于主干部分、葉切削和葡萄發(fā)育，已報道6-芐基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(BPA)能夠激發(fā)比細胞分裂素6-芐基氨基嘌呤(BA)更高程度的生長。在組織培養(yǎng)物生物試驗和一些園藝植物中，BPA也顯示了更高活性(Werbrouck等，Physiol.Plant98，291(1996))。此外，某些6-(取代的氨基)嘌呤(包括激動素和玉米素)已顯示具有顯著的抗-老化和其他性質，適用于治療哺乳動物細胞，包括人皮膚和/或人皮膚細胞。局部施用這些組合物能夠改善皮膚美容外觀；這些組合物也可用于治療皮膚及相關疾病或病癥。重要的是，這些6-(取代的氨基)嘌呤在特定用量下不會顯著提高經(jīng)治療的哺乳動物細胞的生長速率和總的增殖能力。參見例如，美國專利5,371,089(1994年12月6日)和5,602,139(1997年2月11日)(皮膚美容外觀的改善)；美國專利5,614,407(1997年3月25日)(延緩或延遲培養(yǎng)物中伴隨哺乳動物細胞老化正常發(fā)生的形態(tài)學改變);和美國專利5,021,422(1991年6月4日)和5,164,394(1992年11月17日)(某些過度增殖皮膚病的治療)。所有上述專利的內容被納入本文作為參考。Rattan和Clark在培養(yǎng)的人成纖維細胞中也證明了6-(取代的氨基)嘌呤對人皮膚的抗老化作用(Biochem.Biophys.Res.Commun.201，665-672(1994))，激動素(N6-糠基-腺嘌呤)的存在能延遲與細胞連續(xù)傳代有關的許多形態(tài)學和生物化學特征的發(fā)生并且降低其程度。這種6-(取代的氨基)嘌呤能在老化細胞中有效地維持正常細胞功能，提供了它們在保持老化皮膚活力中的應用的基礎。最近，由GeraldWeinstein博士在歐文(Irvine)加利福尼亞大學進行的臨床研究(CosmeticDermatology15，29-32(2003))表明，濃度0.005-0.10%的外用激動素產(chǎn)品(Kinerase⑥)能夠改善輕度到中度光致?lián)p傷面部皮膚的狀況。治療12和24周后，醫(yī)師和患者都發(fā)現(xiàn)，皮膚質地、斑點狀色素過度沉著和細紋狀況與原本相比得到顯著改善。治療還能改善皮膚屏障功能，經(jīng)表皮的水分損失減少。防止、逆轉或減緩細胞老化過程是生物科學領域持久而難以實現(xiàn)的目標，可導致許多重要且實用的結果。防止人皮膚或其他器官的細胞老化與保持結構和功能完整性有關，也與美容完整性有關。如果可以處理培養(yǎng)細胞使其保留年輕細胞的特征，那么這些培養(yǎng)細胞產(chǎn)生有價值的產(chǎn)物的能力也有所提高。雖然6-(取代的氨基)嘌呤，尤其是激動素和玉米素，具有顯著的抗老化和其他性質，需要提供額外的生長調節(jié)性、分化和/或抗-衰老化合物。尤其希望與目前使用的6-(取代的氨基)嘌呤相比，該化合物的選擇性和效力更高(g卩，毒性較小和/或更有效)。本發(fā)明提供了這種改良的抗老化合物。本發(fā)明涉及6,9-二取代的嘌呤衍生物及其藥學上可接受的鹽，所述6,9-二取代的嘌呤衍生物通式如下式中R6是糠基、甲氧基取代的糠基、苯基、甲氧基取代的苯基或甲氧基取代的芐基；R9是2-四氫吡喃基或2-四氫呋喃基。甲氧基取代的糠基包括例如，3-甲氧基糠基、4-甲氧基糠基和5-甲氧基糠基。甲氧基取代的苯基包括例發(fā)明概述7如，2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2,3-二甲氧基苯基、2,4-二甲氧基苯基、2，5-二甲氧基苯基、3,4-二甲氧基苯基、3,5-二甲氧基苯基、2,3,4-三甲氧基苯基和2,3,5-三甲氧基苯基。甲氧基取代的芐基包括例如，2-甲氧基芐基、3-甲氧基芐基、4-甲氧基芐基、2,3-二甲氧基芐基、2,4-二甲氧基芐基、2,5-二甲氧基芐基、3,4-二甲氧基芐基，3,5-二甲氧基芐基、2,3,4-三甲氧基芐基和2,3,5-三甲氧基芐基。優(yōu)選的6，9-二取代的嘌呤衍生物是6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(也稱為N6-糠基-9-(2-四氫吡喃基)腺嘌呤或吡喃基激動素)，通式如下這些6,9-二取代的嘌呤衍生物具有抗衰老、抗炎和/或免疫抑制特性。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物可用作美容組合物，可用于抑制哺乳動物表皮細胞(例如角質形成細胞或成纖維細胞)的老化和衰老，改善其美容外觀，和/或改善哺乳動物表皮細胞(例如角質形成細胞或成纖維細胞)老化的不良影響。它們尤其適合用作能夠抑制人表皮細胞和/或人皮膚的老化和衰老、和/或改善其美容外觀的美容組合物。因此，本發(fā)明提供了一種改善哺乳動物細胞老化不良影響的方法，所述方法包括對哺乳動物的細胞施用有效量的6,9-二取代的嘌呤衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述6,9-二取代的嘌呤衍生物通式如下式中，R6是糠基、甲氧基取代的糠基、苯基、甲氧基取代的苯基或甲氧基取代的芐基；R9是2-四氫吡喃基或2-四氫呋喃基。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物也適用于治療某些皮膚病，包括過度增殖性皮膚病。含有這些6,9-二取代的嘌呤衍生物的組合物(例如)可用于治療皮膚疾病，如狼瘡、變應性濕疹、毒性濕疹、特應性皮炎、魚鱗病、乳頭瘤、鮑恩病、脂溢性角化病、光化性角化病、基底細胞和鱗狀細胞癌等。因此，本發(fā)明還提供了用于治療哺乳動物細胞的皮膚病的方法，所述方法包括對需要這種治療的哺乳動物細胞施用有效量的6,9-二取代的嘌呤衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中所述6,9-二取代的嘌呤衍生物通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>式中，R6是糠基、甲氧基取代的糠基、苯基、甲氧基取代的苯基或甲氧基取代的芐基；R9是2-四氫吡喃基或2-四氫呋喃基。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物也可用于治療炎癥相關疾病。所述炎癥相關疾病包括例如，炎癥，病損(例如，加速其治愈)，疼痛和其他炎癥導致的免疫應答(例如，提供緩解作用)，和/或治療炎性皮膚病(例如，特應性皮炎、扁平苔蘚、過度色素沉著、單純皰疹損傷等)。因此，本發(fā)明也提供了治療哺乳動物細胞的炎性疾病的方法，所述方法包括對需要這種治療的哺乳動物細胞施用有效量的6,9-二取代的嘌呤衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中所述6,9-二取代的嘌呤衍生物通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>式中，R6是糠基、甲氧基取代的糠基、苯基、甲氧基取代的苯基或甲氧基取代的芐基；R9是2-四氫吡喃基或2-四氫呋喃基。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物可以上述通式的游離化合物或其藥學上可接受的鹽的形式用于組合物中。藥學上可接受的鹽可用(例如)堿金屬、銨或胺形成。所述衍生物或它們的鹽可以是外消旋混合物或光學活性異構體的形式；它們也可以是酸加成鹽的形式。
發(fā)明內容本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物具有以下通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>式中，Re是糠基、甲氧基取代的糠基、苯基、甲氧基取代的苯基或甲氧基取代的芐基；R9是2-四氫吡喃基或2-四氫呋喃基。甲氧基取代的糠基包括例如，3-甲氧基糠基、4-甲氧基糠基和5-甲氧基糠基.甲氧基取代的苯基包括例如、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2,3-二甲氧基苯基、2,4-二甲氧基苯基、2,5-二甲氧基苯基、3,4-二甲氧基苯基、3,5-二甲氧基苯基、2,3,4-三甲氧基苯基和2，3,5-三甲氧基苯基。甲氧基取代的芐基包括例如、2-甲氧基芐基、3-甲氧基芐基、4-甲氧基芐基、2,3-二甲氧基芐基、2,4-二甲氧基芐基、2,5-二甲氧基芐基、3,4-二甲氧基芐基、3,5-二甲氧基芐基、2,3,4-三甲氧基芐基和2,3,5-三甲氧基芐基。優(yōu)選的6,9-二取代的嘌呤衍生物是6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤。這些6,9-二取代的嘌呤衍生物與哺乳動物細胞(包括人細胞)接觸時具有抗衰老、抗炎和/或免疫抑制特性。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物可用作美容組合物，用于抑制哺乳動物表皮細胞(例如角質形成細胞或成纖維細胞)的老化和衰老和/或改善其美容外觀。它們尤其適合用作能夠抑制人表皮細胞和/或人皮膚的老化和衰老和/或改善其美容外觀的美容組合物。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物也可用于治療某些皮膚疾病或病癥，包括(但不限于)過度增殖性皮膚病。含有這些6,9-二取代的嘌呤衍生物的組合物可用于治療(例如)狼瘡、變應性濕疹、毒性濕疹、特應性皮炎、魚鱗病、乳頭瘤、鮑恩病、脂溢性角化病、光化性角化病、基底和鱗狀細胞癌、痤瘡、紅斑等。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物也可用于治療炎癥，加速病損的治愈，提供疼痛及炎癥導致的其他免疫應答的緩解作用，和/或治療炎性皮膚疾病或病癥(例如，特應性皮炎、扁平苔蘚、過度色素沉著、單純皰疹損傷、紅斑等)。本發(fā)明6，9-二取代的嘌呤衍生物可以上述通式的游離混合物或其藥學上可接受的鹽形式用于組合物中；可使用單獨的6,9-二取代的嘌呤衍生物或其混合物。藥學上可接受的鹽可用(例如)堿金屬、銨或胺形成。所述衍生物或它們的鹽可以是外消旋混合物或光學活性異構體的形式；它們也可以是酸加成鹽的形式。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物通常包含在適合應用于感興趣細胞(例如，人皮膚)的載體組合物中，含量與指定應用相適應。這些組合物包括例如美容和藥物組合物。通常，這種組合物包含約0.005-20%的活性齊1」，優(yōu)選約0.05-10%，更優(yōu)選約0.1-2%。組合物，尤其是美容和藥物組合物，可以溶液、乳膏、氣溶膠、乳狀洗劑、洗齊U、凝膠、膏藥、泥敷劑、香波、唇膏、軟膏、糊劑、泡沫、酊劑、噴霧劑等形式。組合物的形式不是關鍵，只要其適合指定應用。適用于本文所述化合物的給予的美容和藥學載體或運載體包括本領域技術人員已知適合特定給藥模式的載體。此外，化合物可配制成組合物中的單一藥物活性成分，或者可與其他活性成分組合?；钚曰衔镌谳d體中的含量足以產(chǎn)生治療和/或美容學上有用的效果，而不會對治療個體造成嚴重毒副作用。有效濃度可通過采用體外和體內系統(tǒng)測試化合物憑經(jīng)驗確定，包括組織培養(yǎng)物和無毛小鼠或其他合適的動物模型。治療和/或美容學上有用的效果包括但不限于延遲、減緩、防止、逆轉、減輕和以其他有益的方式改變與哺乳動物細胞(尤其是人細胞，甚至更具體是人皮膚細胞)老化有關的疾病狀態(tài)或不良美容反應。這些美容作用可包括例如，改善已經(jīng)老化或接觸日光/風造成損傷的人皮膚的外觀，首先防止(或減緩)未受損皮膚發(fā)生這種損傷，和/或防止(或減緩)已經(jīng)受損皮膚中再次發(fā)生這種損傷。這種治療效果可包括例如，改善已存在疾病狀態(tài)導致的損傷的人皮膚的狀況，防止(或減緩)這種疾病狀態(tài)的發(fā)生，和/或防止(或減緩)這種疾病狀態(tài)的再次復發(fā)。組合物中活性化合物的濃度將取決于活性化合物的吸收、滅活和排泄率，劑量方案和給藥量，以及本領域技術人員已知的其他因素。一般，治療和/或美容有效劑量應將濃度至少約0.005%,優(yōu)選至少約0.05，更優(yōu)選至少約0.1%的活性化合物遞送至所治療的組織?；钚猿煞挚梢淮涡越o予，或者可分成多個較小的劑量在一定的時間間隔分批給予。應理解，精確劑量和治療持續(xù)時間視待治療的組織而定，可采用已知的測試方案憑經(jīng)驗確定或者通過體內和體外試驗數(shù)據(jù)外推得到。應注意，濃度和劑量值也可因治療個體的老化而變化。還應理解，對于任意特定的對象，具體的劑量方案應隨時間根據(jù)個體需要、以及給予組合物或監(jiān)控組合物給予人員的專業(yè)判斷進行調整，本文所述濃度范圍僅僅是示例性的，并不旨在限制所述組合物的范圍和實踐。為治療皮膚，化合物可配制成局部應用或外用于皮膚的美容或藥物組合物的形式，其中，6,9-二取代的嘌呤衍生物與藥學或美容學上可接受的載體混合。該組合物可以是凝膠、乳膏、洗劑、固體、溶液、混懸劑、氣溶膠等形式。配制局部應用的用于治療人皮膚的組合物，在乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、溶液、本領域已知無毒且皮膚病學上可接受的固體基質或運載體中，6,9-二取代的嘌呤衍生物的有效濃度范圍約0.005-20%，優(yōu)選約0.05-10%和更優(yōu)選約0.1-2%。用于人皮膚的組合物中溶解、懸浮、分散或以其他方式混合的6,9-二取代的嘌呤衍生物濃度或重量分數(shù)，使得6,9-二取代的嘌呤衍生物以有效濃度，通常至少約0.005%,優(yōu)選至少約0.05%，優(yōu)選至少約0.1%，遞送至皮膚活細胞(例如，成纖維細胞)，從而減輕、逆轉或延遲老化不良影響。應將上限調節(jié)成不會使得細胞分裂速率或總的細胞增殖能力顯著增加，具體是使治療細胞或組織不會顯示任何典型的癌癥或癌前改變的征兆或任何其他美容學上不希望的改變，如損傷的形成。雖然上限最高可達約20%，通常優(yōu)選較低的上限(如10%，2%，或者甚至是1%)，因為在該水平下抗老化作用明顯，并且引起所不希望的細胞分裂速率或細胞總的增殖能力升高的風險最小。通常，相對于揮發(fā)性運載體(例如乙醇，可造成皮膚干燥)，更優(yōu)選有助于水合皮膚的軟化或潤滑運載體。用于制備應用于人體皮膚組合物的合適的基質或運載體的例子是凡士林、凡士林加揮發(fā)性硅酮、羊毛脂、冷霜(USP)和親水軟膏(USP)。可制備局部應用的包含有效量的一種或多種6，9-二取代的嘌呤衍生物的組合物，例如乳化、懸浮、或以其他方式與合適的軟膏或乳膏基質混合。合適的運載體的選擇在較大程度上由6,9-二取代的嘌呤衍生物的給藥途徑?jīng)Q定。所述方法包括局部給藥。適合于局部施用的藥學和皮膚病學上可接受的運載體包括適用于洗劑、乳膏、溶液、混懸劑、凝膠、固體等的那些物質。通常，運載體是有機溶劑或水性乳劑，6,9-二取代的嘌呤衍生物能夠分散、懸浮或溶解在其中。運載體可包括例如，藥學上可接受的軟化劑、皮膚吸收促進劑、UV保護劑、抗氧化劑、緩沖劑、著色劑、芳香劑、乳化劑、填充劑、增稠劑、溶劑等。這些劑型的更詳細列表和描述如下所述(不是排他性的)。(l)洗劑。洗劑含有有效濃度的一種或多種6,9-二取代的嘌呤衍生物。有效濃度優(yōu)選能夠將濃度約0.05-10%的6,9-二取代的嘌呤衍生物遞送至皮膚活細胞，尤其是真皮中的成纖維細胞。洗劑還可包含約1-50%，優(yōu)選約3-15%的軟化劑和平衡水，合適的緩沖劑，C2或C3醇，或水或緩沖劑和醇的混合物?？墒褂帽绢I域技術人員已知的適用于人體皮膚的任何軟化劑。這些軟化劑包括但不限于(a)烴油和蠟，包括(但不限于)礦物油、凡士林、石蠟、純地蠟、地蠟、微晶蠟、聚乙烯和全氫鯊烯。(b)硅酮油，包括(但不限于)二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、水溶性和醇溶性硅酮-乙二醇共聚物。(c)甘油三酯脂肪和油，包括從植物、動物和海洋來源獲得的那些。例子包括(但不限于)蓖麻油、紅花油、棉花籽油、玉米油、橄欖油、魚肝油、杏仁油、鱷梨油、棕櫚油、芝麻油和大豆油。(d)乙酰甘油酯，包括(但不限于)乙?；视鸵货?。(e)乙氧基化甘油酯，包括(但不限于)乙氧基化單硬脂酸甘油酯。(f)具有10-20個碳原子的脂肪酸垸基酯。本文可使用的有脂肪酸甲酯、脂肪酸異丙酯和脂肪酸丁酯。例子包括(但不限于)月桂酸己酯、月桂酸異己基酯、棕櫚酸異己基酯、棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、油酸異癸酯、硬脂酸十六烷基酯、硬脂酸癸酯、異硬脂酸異丙酯、己二酸二異丙酯、己二酸二異己基酯、己二酸二己基癸基酯、癸二酸二異丙酯、乳酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯和乳酸鯨蠟酯。(g)具有10-20個碳原子的脂肪酸烯酯。例子包括(但不限于)肉豆蔻酸油酯、硬脂酸油酯和油酸油酯。(h)具有9-22個碳原子的脂肪酸。合適的例子包括(但不限于)壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、異硬脂酸、羥基硬脂酸、油酸、亞油酸、蓖麻油酸、花生四烯酸、山酸和芥酸。(i)具有10-22碳原子的脂肪醇，包括(但不限于)月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇、十六醇、硬脂醇、異硬脂醇、羥基硬脂醇、油醇、蓖麻油醇、山醇、芥醇和2_辛基十二烷基醇。(j)脂肪醇醚，包括(但不限于)10-20個碳原子的乙氧基化脂肪醇，例如(但不限于)連接l-50個環(huán)氧乙垸基團或l-50個環(huán)氧丙烷基團或它們的混合物的月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇、異硬脂醇、油醇和膽固醇。(k)醚-酯，包括(但不限于)乙氧基化脂肪醇的脂肪酸酯。(l)羊毛脂及其衍生物，包括(但不限于)羊毛脂、羊毛脂油、羊毛脂蠟、羊毛脂醇、羊毛脂脂肪酸、羊毛脂酸異丙酯、乙氧基化羊毛脂、乙氧基化羊毛脂醇、乙氧基化膽固醇、丙氧基化羊毛脂醇、乙酰化羊毛脂、乙?；蛎肌⒀蛎紒営退狨?、羊毛脂醇蓖麻油酸酯、羊毛脂醇蓖麻油酸酯的乙酸酯、乙氧基化醇-酯的乙酸酯、羊毛脂的氫解、乙氧基化氫化羊毛脂、乙氧基化山梨糖醇羊毛脂以及液體和半固體羊毛脂吸收基質。(m)多羥基醇和聚醚衍生物，包括(但不限于)丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇(M,W.2000-4000)、聚氧乙烯聚丙二醇、聚氧丙烯聚乙二醇、甘油、乙氧基化甘油、丙氧基化甘油、山梨糖醇、乙氧基化山梨糖醇、羥丙基山梨糖醇、聚乙二醇(M.W.200-6000)、甲氧基聚乙二醇350、550、750、2000、5000、聚[環(huán)氧乙垸]均聚物(M.W.100,000-5,000,000)、聚烷二醇和衍生物、己二醇(2-甲基-2，4-戊二醇)、1,3-丁二醇、1，2，6,-己三醇、乙基己二醇USP(2-乙基-l,3-己二醇)、<:15《18鄰位二醇和三羥甲基丙烷的聚氧丙烯衍生物。(n)多羥基醇酯，包括(但不限于)單脂肪酸乙二醇酯和二脂肪酸乙二醇酯、單脂肪酸二乙二醇和二脂肪酸二乙二醇酯、聚乙二醇(M.W.200-6000)、單-和二-脂肪酯、單脂肪酸丙二醇酯和二脂肪酸丙二醇酯、聚丙二醇2000單油酸酯、聚丙二醇2000單硬脂酸酯、乙氧基化丙二醇單硬脂酸酯、單脂肪酸甘油酯和二脂肪酸甘油酯、聚脂肪酸多聚甘油酯、乙氧基化單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸141，3-丁二醇酯、二硬脂酸1,3-丁二醇酯、聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯、去水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯去水山梨糖醇脂肪酸酯。(O)蠟酯，包括(但不限于)蜂蠟、鯨蠟、肉豆蔻酸肉豆蔻酯和硬脂酸硬脂酰酯和蜂蠟衍生物，包括但不限于聚氧乙烯山梨糖醇蜂蠟，它是蜂蠟與形成醚-酯混合物的各種環(huán)氧乙垸含量的乙氧基化山梨糖醇的反應產(chǎn)物。(p)植物蠟，包括(但不限于)巴西棕櫚蠟(camauba)和小燭樹蠟。(q)磷脂，包括(但不限于)卵磷脂及其衍生物。(r)固醇，包括(但不限于)膽固醇和膽固醇脂肪酸酯。(S)酰胺，包括(但不限于)脂肪酸酰胺，乙氧基化脂肪酸酰胺和固體脂肪酸垸醇酰胺。洗劑可還包含約1-10%，更優(yōu)選約2-5%的乳化劑。乳化劑可以是非離子型、陰離子型或陽離子型。令人滿意的非離子乳化劑的例子包括(但不限于)具有10-20個碳原子的脂肪醇，與2-20摩爾環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷縮合的具有10-20個碳原子的脂肪醇，與2-20摩爾環(huán)氧乙垸縮合的垸基鏈中含有6-12個碳原子的垸基酚，單脂肪酸環(huán)氧乙烷酯和二脂肪酸環(huán)氧乙垸酯，單脂肪酸乙二醇酯和二脂肪酸乙二醇酯，其中脂肪酸部分含有10-20個碳原子，二乙二醇，分子量200-6000的聚乙二醇，分子量200-3000的丙二醇，甘油，山梨糖醇，去水山梨糖醇，聚氧乙烯山梨糖醇，聚氧乙烯去水山梨糖醇和親水蠟酯。合適的陰離子乳化劑包括(但不限于)脂肪酸皂，如鈉、鉀和三乙醇胺皂，其中脂肪酸部分含有10-20個碳原子。其他合適的陰離子乳化劑包括(但不限于)堿金屬、銨或取代的銨烷基硫酸酯，垸基芳基磺酸酯和烷基乙氧基醚磺酸酯，垸基部分具有10-30個碳原子。垸基乙氧基醚磺酸酯含有l(wèi)-50個環(huán)氧乙垸單元。令人滿意的陽離子乳化劑包括季銨、嗎啉鑰(morpholinium)和吡啶鑰化合物。某些前述軟化劑也具有乳化性質。配制含有這類軟化劑的洗劑時，無需使用額外的乳化劑，雖然組合物中也可包含乳化劑。洗劑的平衡通常用水、或C2或C3醇、或水和醇的混合物。可簡單地將所有成分混合在一起來配制洗劑。優(yōu)選地，將6,9-二取代的嘌呤衍生物溶解、懸浮或以其他方式均勻分散在混合物中。這種洗劑可包含其他常規(guī)成分。一種添加劑是占組合物水平約1-10%的增稠劑。合適的增稠劑的例子包括但不限于交聯(lián)的聚羧乙烯聚合物、乙基纖維素、聚乙二醇、黃芪樹膠、梧桐膠(gumkaraya)、黃原膠和膨潤土(bentonire)、羥乙基纖維素和羥丙基纖維素。適合以洗劑形式的施用于人面部皮膚的一種優(yōu)選的組合物的例子，在基質中含有約0.5-10%的本發(fā)明的6,9-二取代的嘌呤衍生物(優(yōu)選吡喃基激動素)，通過將10份單硬脂酸甘油酯、IO份鯨蠟醇、30份鯨蠟、10份吐溫20(單硬脂酸去水山梨糖醇酯的聚氧亞烷基衍生物)、10份司盤20(單月桂酸去水山梨糖醇酯)、12.5份甘油和IOO份水混合在一起進行制備。(2)乳膏。配制含有有效濃度的一種或多種6，9-二取代的嘌呤衍生物的乳膏。有效濃度通常是能將6,9-二取代的嘌呤衍生物有效遞送至治療組織的量，約0.5-10%遞送至皮膚活細胞，尤其是真皮中的成纖維細胞。乳膏也可包含約5-50%，優(yōu)選約10-25%的軟化劑，其余是水或其他合適的無毒性載體，如等滲緩沖液。上文洗劑部分中描述的軟化劑也可用于乳膏組合物中。乳膏也可包含合適的乳化劑，如上所述。乳化劑在組合物中的含量約為3-50%，優(yōu)選約5-20%。(3)溶液和混懸液。配制含有有效量的一種或多種6,9-二取代的嘌呤衍生物的溶液，通常含量能夠將約0.5-10%的6,9-二取代的嘌呤衍生物有效遞送至皮膚活細胞，尤其是真皮中的成纖維細胞；用水、合適的有機溶劑或其他合適的溶劑或緩沖液平衡。適合用作溶劑或溶劑體系的一部分的合適的有機材料包括丙二醇、聚乙二醇(M.W.200-600)、聚丙二醇(M.W.425-2025)、甘油、山梨糖醇酯、1,2,6-己三醇、乙醇、異丙醇、酒石酸二乙酯、丁二醇以及它們的混合物。這些溶劑系統(tǒng)也可包含水。配制成溶液或混懸液形式的這些組合物可應用于皮膚，或者可配制成氣溶膠并以噴霧劑的形式應用于皮膚。氣溶膠組合物還包含約25-80%，優(yōu)選約30-50%的合適的推進齊1」。推進劑的例子包括氯化、氟化、和氯氟化的低分子量烴。氧化亞氮，二氧化碳，丁垸和丙烷也可用作推進劑氣體。在本領域所理解的用量并在適合排出容器內容物的壓力下使用這些推進劑。(4)凝膠?？珊唵蔚貙⒑线m的增稠劑與前述溶液或混懸液組合物混合來配制凝膠組合物。合適的增稠劑的例子已在上文洗劑部分中描述。凝膠組合物含有有效量的一種或多種6,9-二取代的嘌呤衍生物，通常含量能夠將0.05-10%的6,9-二取代的嘌呤衍生物有效遞送至皮膚活細胞，尤其是真皮中的成纖維細胞；約5-75%，優(yōu)選約10-50%如上所述的有機溶劑；約0.5-20%，優(yōu)選約1-10%的增稠劑；用水或其他水性載體平衡。(5)固體。可將固體形式的組合物配制成指定應用于唇部或身體其他部分的棒型組合物。這種組合物包含有效量的一種或多種6,9-二取代的嘌呤衍生物。通常含量能夠將0.05-10%的6,9-二取代的嘌呤衍生物遞送至皮膚活細胞，尤其是真皮中的成纖維細胞。固體也可包含約50-98%，優(yōu)選約60-90%的前述軟化劑。該組合物可還包含約1-20%，優(yōu)選約5-15%合適的增稠劑，希望或需要的話，還可包含乳化劑和水或緩沖劑。固體形式的組合物中可適當?shù)夭捎蒙衔南磩┎糠种忻枋龅脑龀韯?。局部應用或其他應用的所述組合物類型中的任一種也可釆用其他成分，如防腐劑，包括對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸乙酯，香料，染料等，本領域己知能為應用于皮膚的組合物提供所需的穩(wěn)定性、芳香性或顏色，或者其他所需性質，如避免太陽光化射線。除6,9-二取代的嘌呤衍生物外，組合物還可包含其他改善老化不良反應的活性成分，如類視黃醇、激動素、和/或玉米素，但不應包含諸如生長素等能加強或誘導細胞分裂誘導性的成分。優(yōu)選的組合物僅包含一種或多種6,9-二取代的噤呤衍生物作為老化不良反應改善性成分。用于人皮膚的組合物優(yōu)選每天一次，或者需要時為實現(xiàn)所需結果，每天多次應用于需要治療的皮膚區(qū)域。應理解，明確的治療方案取決于待治療的個體，可根據(jù)配方、尤其是所治療個體的老化憑經(jīng)驗確定。任何方案都是可以接受的，只要能夠實現(xiàn)所需的老化改善作用而不導致顯著有害或持久的不良副作用。對人皮膚進行治療的方法通過以下方式實施對皮膚施用適用于人體皮膚治療的上述本發(fā)明組合物，優(yōu)選每天進行，持續(xù)一段時間，時間長度不確定，通常只要在患者需要改善皮膚老化不良影響的時候。要求對皮膚每天施用一次組合物，持續(xù)至少約l個月，最多至少約l年，取決于患者老化、需要施用組合物的皮膚狀況，以及組合物中6，9-二取代的嘌呤衍生物的濃度，然后有益效果(例如延遲皮膚基底細胞層的成纖維細胞中的老化相關的形態(tài)學改變)開始在皮膚表面顯現(xiàn)。如果終止施用6,9-二取代的嘌呤衍生物，一段時間后上述方法改善的老化作用再次繼續(xù)。對于人皮膚成纖維細胞(或其他活細胞，如角質形成細胞)，該方法通過對皮膚外表面施用配制成適用于皮膚外表面的生理學上可接受的乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、溶液、香水、固體、或其他合適的形式的組合物來實施，其中，所述組合物包含一種或多種6,9-二取代的嘌呤衍生物，其濃度能有效改善真皮中活細胞(例如成纖維細胞)的老化不良影響，使得經(jīng)處理皮膚比未處理皮膚更慢老化，和/或從外觀上變得比處理之前更年輕，表現(xiàn)為皺紋和/或松垂或其他老化的美容指示現(xiàn)象減少。所述濃度通常約為0.05-10%(優(yōu)選約0.1-2%)。準確濃度可憑經(jīng)驗，根據(jù)載體或遞送運載體以及組合物呈現(xiàn)給皮膚表面的形式而定。本發(fā)明還涉及治療上文所述細胞衰老和疾病狀態(tài)以及改善哺乳動物細胞，尤其是人細胞(更具體是人皮膚細胞)的老化不良影響的方法。一種或多種本發(fā)明的6,9-二取代的嘌呤衍生物可以上文所述組合物的形式并以上文所述有效量預防性或治療性地給予。如本文所用，改善哺乳動物細胞的老化不良影響表示在體外或體內減緩、逆轉和/或延遲正常哺乳動物細胞中隨老化正常發(fā)生的形態(tài)學改變。老化不良影響也包括基因表達和蛋白質生物合成中的老化相關改變。改善作用在這里指在不會顯著提高經(jīng)處理細胞生長速率或總的增殖能力的情況下實現(xiàn)。改善細胞老化不良影響，包括對體外和/或體內細胞的效果，可以檢測為隨細胞老化正常發(fā)生的老化相關形態(tài)學和表型改變發(fā)生的延遲和逆轉作用。這些改變包括組織培養(yǎng)細胞中檢測的改變，例如較老的細胞不能響應外源性生長因子和/或在老細胞中發(fā)現(xiàn)較高水平的自身熒光。隨著細胞的老化，它們表現(xiàn)為老化依賴性的增殖潛力損失。培養(yǎng)的老化成纖維細胞顯示許多老化相關性特征，包括扁平且不規(guī)則的形態(tài)，異常大的尺寸，稀疏生長，每單位面積培養(yǎng)基質細胞產(chǎn)率低，相當頻率的多核細胞，難以胰酶消化，不能生長至融合，和/或培養(yǎng)基中高的碎片產(chǎn)生率。與老細胞相比，年輕細胞顯示對生長因子較高的響應且DNA和蛋白質合成速率較高。組織培養(yǎng)物中的年輕哺乳動物(包括人)成纖維細胞健康且干凈；具有規(guī)則、長形、薄的紡錘狀形態(tài)；以陣列形式緊密填充，在培養(yǎng)基質上形成融合；不會相互重疊生長；很少發(fā)生單核以外的情況;培養(yǎng)基中產(chǎn)生碎片較少。老化相關性體內變化包括哺乳動物組織的變化，例如18皮膚發(fā)生褶皺、線條、松垂、變色、斑點、皮革樣、和/或與皮膚美容狀況有關的變黃，或其數(shù)量或深度增加，以及組織結構和功能完整性方面的相關變化。本發(fā)明組合物能有效改善皮膚整體外觀和狀態(tài)，包括老化相關性改變和不與老化緊密相關的變化(例如，痤瘡、紅斑、發(fā)紅等)。出于本發(fā)明的目的，這些不與老化緊密相關的改變或者甚至是與老化無關的改變包括在老化相關性改變的范圍內。本發(fā)明的方法可與其他治療或美容方法(尤其是與人皮膚的治療相關的那些方法)聯(lián)合使用。因此，本發(fā)明方法可與例如激光或其他基于光的治療或裝置聯(lián)合使用。如本文所用，正常細胞(例如成纖維細胞)總的增殖能力是細胞有限增殖能力的衡量，表示該細胞的培養(yǎng)物在培養(yǎng)物生長停止之前能夠經(jīng)歷的細胞數(shù)量倍增的總數(shù)，根據(jù)獲取細胞的供者年齡而定。從胚胎組織獲取的細胞比從成人組織獲取的細胞具有更大的增殖能力。如本文所用，生長速率或增殖速率是細胞分裂速率的衡量。本領域技術人員所理解的一個量度單位是倍增時間的倒數(shù)。在正常細胞培養(yǎng)物的生存期間的最后階段，培養(yǎng)物生長很快停止，在僅僅幾個倍增時間內從接近年輕細胞的正常值降至零。如本文所用，顯著改變生長速率或總的增殖能力表示使細胞分裂速率或細胞倍增數(shù)量改變超出細胞和組織間正常變化范圍的程度。具體說，生長速率或總的增殖能力的改變不會使經(jīng)處理的細胞永生化或經(jīng)歷惡性轉化。體內處理細胞的情況下，經(jīng)處理的組織不會顯著改變尺寸，厚度或變成致癌或癌細胞。評價生長速率和總的增殖能力的方法是本領域技術人員已知的。可使用任何方法，包括本文所舉例的那些，來評價生長速率或總的增殖能力的改變。本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物通?？赏ㄟ^相應的6-氯-9-取代的嘌呤與合適的胺反應來制備6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤可用于制備本發(fā)明優(yōu)選的6，9-二取代的嘌呤衍生物，它可采用對甲苯磺酸，由6-氯嘌呤和3,4-二氫吡喃，根據(jù)文獻(Robins等，J.Am.Chem.Soc.83，2574(1961))制得。以未取代的或甲氧基取代的芐胺、苯基胺和糠基胺(非市售)(否則從西格瑪阿爾德里奇(SigmaAldrich)或熒光化學(Fluorochem)購得)作原料，可以在合適的金屬催化劑的存在下，由相應的醛制得。6-氯-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤可采用對甲苯磺酸，從6-氯嘌呤和3，4-二氫呋喃合成。包括下面的實施例僅僅是為了闡述的目的，不是為了限制本發(fā)明的范圍。除非另有說明，所有濃度、比率等都基于重量。本文引用的所有參考文獻的內容被納入本文作為參考。實施例l:本實施例闡述了6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的制備。將6-氯嘌呤(60克，388毫摩爾)和對甲苯磺酸一水合物(l克)在乙酸乙酯(750毫升)中的混合液在5(TC劇烈攪拌。在30分鐘的時間內逐滴加入3,4-二氫吡喃(40毫升，438毫摩爾)，維持反應溫度55-60°C(Robins等，1961)。將該溶液再攪拌1小時，其間冷卻至室溫。加入濃氨水(35毫升)，溶液攪拌5分鐘。隨后用2X200毫升水對該均勻的深綠色溶液進行提取。將黃色乙酸乙酯提取物在硫酸鈉上干燥過夜，然后在-20。C冷卻。產(chǎn)生的黃色固體再在五氧化二磷上37'C真空干燥。產(chǎn)率66.9克(72.2%).MS(ES):[M+H]+=239(100)。實施例2:本實施例也闡述了6-氯-9-(2-四氫呋喃基)-嘌呤的制備。將6-氯嘌呤(50克，323毫摩爾)和對甲苯磺酸(2.5克，14.5毫摩爾)在乙酸乙酯(200毫升)中的混合物在室溫下劇烈攪拌。30分鐘的時間內逐滴加入2,3-二氫呋喃(37.5克，535毫摩爾)。將該溶液再攪拌1小時，其間6-氯嘌呤完全溶解(Lewis等，J.Org.Chem.;26;1961;3837)。隨后，加入摩爾比1:1的氨水(150毫升)和水的混合液。然后用2X100毫升水對該均勻的暗黃色溶液進行提取。將黃色乙酸乙酯提取物在硫酸鈉上干燥過夜。然后，溶液過濾并蒸發(fā)。真空蒸發(fā)后，粗品黃色油在五氧化二磷上37'C真空干燥。黃色粗品由石油醚重結晶。產(chǎn)率80%，黃色固體。熔點92-95°C。TLC(甲苯:乙酸乙酯，1:2(v:v)，單點。HPLC純度>97%.1H-NMR(400MHz，DMSO):2.05七重峰(1H，J=6.8Hz);2.22七重峰(1H，J=6.8Hz);2.48m(2H);3.95q(lH，J=7.4Hz);4.20qq(lH，20Ja=7.4Hz，Jb=l,9Hz);6.40m(lH);8.78s(lH);8.80s(lH)。MS(ES):[M+H]+=225(100)。實施例3:本實施例闡述了6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的制備。向糠基胺(IOO克，91毫升，1030毫摩爾)中加入30.3克6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(126.9毫摩爾)。充分混合后固體完全溶解。將均勻溶液在卯。C加熱60分鐘，然后室溫下冷卻。無色結晶鹽酸糠基胺立即沉積并過濾。剩余的濾液真空蒸發(fā)。將異辛垸(600毫升)加入黃色油中，充分震搖，室溫下靜置。產(chǎn)品在約1小時內緩慢結晶。過濾白色固體沉淀，用乙醚(50毫升)洗滌，空氣干燥過夜以去除溶劑。粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率24.4克(81.52毫摩爾，64.2%)。熔點峰值在144-145°C，無降解。TLC(氯仿:甲醇(95:5(v:v))):單點(Rf=0.35)。TLC(氯仿)單點(RfH).34)。HPLC純度99+%。元素分析％(預期值/實測值)C=60.19/60.14，H=5.72/5.70，N=23.40/23.30。實施例4:本實施例闡述了6-糠基氨基-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤的制備。向用100毫升正丙醇配制的糠基胺(1456毫克，15毫摩爾)中加入6-氯-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤(2247毫克，10毫摩爾)和三乙胺(3.6毫升，25毫摩爾)。充分混合后固體完全溶解。將均勻溶液在10(TC加熱3小時，然后在室溫下冷卻。真空蒸發(fā)后，所得材料用水(100毫升)處理，用乙酸乙酯(100毫升)提取。將乙酸乙酯提取物蒸發(fā)，殘余物用50毫升乙醚洗滌。白色粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率85%，白色固體。熔點128-129。C。TLC(CHCl3:甲醇，8:2(v:v)，單點。HPLC純度>99%.^-NMR(400MHz，DMSO):2.02七重峰(1H，J=6.8Hz);2.22七重峰(1H，J=6.8Hz);2.42m(2H);3.91q(lH，J=7.4Hz);4.14q(lH，J=7.4Hz);4.70bs(2H);6.23dd(lH，Ja=3.2Hz，Jb=0.9Hz);6.26m(lH);6.36t(lH，J=2.4Hz);7.53m(lH);8.19bs(lH);8.24s(lH);8.27s(lH)。MS(ES):[M+H]+=286(100)。實施例5:本實施例闡述了6-(4-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的制備。將10毫摩爾6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(由1546毫克6-氯嘌呤制備)、12毫摩爾4-甲氧基芐胺和5毫升三乙胺的混合物在正丙醇中回流3小時。正丙醇真空蒸發(fā)后，所得材料用水處理并用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯相在硫酸鈉上干燥，過濾，蒸發(fā)，殘余物用30毫升乙醚洗滌。過濾固體殘余物，粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率80%，白色固體。熔點137-138°C。TLC(CHCl3:甲醇(8:2(v:v))):單點。HPLC純度>98%.^-NMR(400MHz，DMSO):1.55m(2H);L68m(1H);1.93m(2H);2.26qq(Ja=11.0Hz，Jb=4.3Hz);3.64qq(lH，Ja=11.0Hz，Jb=4.3Hz);3.70s(3H);4.00d(lH，J=11.0Hz);4.65s(2H);5.63dd(lH，Ja=11.0Hz，Jb=2.2Hz);6.85d(2H，J=8.8Hz);7.28d(2H，J=8.8Hz);8.23s(1H);8.29bs(lH);8.34s(lH)。MS(ES):[M+H]+=340(100)。實施例6:本實施例闡述了6-(2-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的制備。將由1546毫克6-氯嘌呤制備的6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(2387毫克，IO毫摩爾)、2-甲氧基芐胺(1470毫克，12毫摩爾)和5毫升三乙胺(35毫摩爾)的混合物在正丙醇中回流3小時。充分混合后固體完全溶解。正丙醇真空蒸發(fā)后，所得材料用水(100毫升)洗滌，用乙酸乙酯(100毫升)提取。蒸發(fā)乙酸乙酯提取物，殘余物用50毫升石油醚洗滌。白色粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率90%，白色固體。熔點106-108°C。TLC(CHCl3:甲醇，(8:2(v:v)，單點。HPLC純度>98%。！H-NMR(400MHz，DMSO):1.56m(2H);1.71m(lH);1.94m(2H);2.27qq(lH，Ja=12.3Hz，Jb=3.8Hz);3.67m(lH);3.83s(3H);4.20m(lH);4.71bs(2H);5.64dd(lH，Ja=11.3Hz，Jb=1.9Hz);6.83tt(lH，Ja=7.4Hz，Jb=0.9Hz);6.97dd(lH，Ja=8.2Hz，Jb=0.7Hz);7.14d(lH，J=7.3Hz);7.20tt(lH，Ja=7.8Hz，Jb=1.7Hz);8.09s(lH);8.21s(lH);8.36s(lH)。MS(ES):[M+H]+=340(100)。實施例7:本實施例闡述了6-(4-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤的制備。將10毫摩爾6-氯-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤(由1546毫克6-氯嘌呤制備)、12毫摩爾4-甲氧基節(jié)胺和5毫升三乙胺在正丙醇中回流3小時。真空蒸發(fā)正丙醇后，所得材料用水處理并用乙酸乙酯提取。蒸發(fā)乙酸乙酯相，殘余物用30毫升乙醚洗滌。過濾固體殘余物，粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率80%，白色固體。熔點182-183。C。TLC(CHCl3:甲醇(8:2(v:v)):單點。HPLC純度:>98%.iHNMR(400MHz，DMSO):2.02六重峰(1H，J=7,4Hz);2.21六重峰(1H，J=7.4Hz);2.44m(2H);3.72s(3H);3.卯q(1H，J=7.4Hz);4.15q(J=7.4Hz);4.67s(H);6.28m(lH);6.86d(2H，J=8.7Hz);7.31d(2H，J=8.7Hz);8.1bs(lH);8.19s(lH);8.29s(lH)。MS(ES):[M+H]+=326(100)。22實施例8:本實施例闡述了6-(2-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤的制備。將2247毫克(10毫摩爾)6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(由1546毫克6-氯嘌呤制備)、2-甲氧基芐胺(1470毫克，12毫摩爾)和5毫升三乙胺(35毫摩爾)在正丙醇中回流3小時。充分混合后固體完全溶解。真空蒸發(fā)正丙醇后，所得材料用水(100毫升)處理并用乙酸乙酯(100毫升)提取，蒸發(fā)乙酸乙酯提取物，殘余物用50毫升己烷洗滌。白色粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率90%，白色固體。熔點97-99°C。TLC(CHCl3:甲醇，8:2(v:v)，單點。HPLC純度>98%。^-NMR(400MHz，DMSO):2.02m(lH);2.21七重峰(1H，J=6.8Hz);2.43m(2H);3.83s(3H);3.91q(lH，J=7.4Hz);4.14q(lH，J=7.4Hz);4.68bs(2H);6.26m(lH);6.83tt(lH，Ja=7.4Hz，Jb=0.9Hz);6.98dd(lH，Ja=8.2Hz，Jb=0.7Hz);7.12d(lH，J=7.3Hz);7.20tt(lH，Ja=7.8Hz，Jb=1.7Hz);8.05bs(lH);8.18s(lH);8.27s(lH)。MS(ES):[M+H]+=326(100)。實施例9:本實施例闡述了6-(3-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的制備。將10毫摩爾6-氯-9-(2-四氫吡喃基)-嘌呤、12毫摩爾3-甲氧基芐胺和5毫升三乙胺的混合物在正丙醇中回流3小時。真空蒸發(fā)正丙醇后，所得材料用水處理并用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯相在硫酸鈉上干燥，過濾，然后蒸發(fā)。當油狀殘余物用30毫升正己烷處理時，形成白色粉末狀產(chǎn)物。粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率70%，白色固體。熔點134-135°C。TLC(CHC13:CH30H(85:15(v:v)):單點。HPLC純度:>99%.^NMR(400MHz,DMSO):1.56m(2H);1.70m(1H)，1.94m(2H);2.30qq(lH，Ja=11.0，Jb=4.3Hz);3.67tt(lH，Ja=11.0Hz，Jb=4.3Hz);3.83s(3H);4.00d(lH，J=llHz);4.71s(2H);5.64dd(lH，Ja=11.0Hz，Jb=4.3Hz);6.83t(lH，J=7.7Hz);6.97d(lH，J=7.7Hz);7.14d(J=7.7Hz);7.20tt(lH，Ja=7.7Hz，Jb=1.5Hz);8.09bs(lH);8.21s(lH);8.36s(lH)。MS(ES):[M+H]+=340,)。實施例10:本實施例闡述了6-(4-甲氧基苯基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的制備。將2387毫克(10毫摩爾)6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(由1546毫克6-氯嘌呤制備)、4-甲氧基苯基胺(1803毫克，15毫摩爾)和5毫升二異丙胺(35毫摩爾)在正丙醇(100毫升)中回流5小時。充分混合后固體完全溶解。真空蒸發(fā)正丙醇后，所得材料用水(50毫升)處理并用乙酸乙酯(50毫升)提取。蒸發(fā)乙酸乙酯提取物，殘余物用50毫升石油醚洗滌。產(chǎn)率90%，白色固體。熔點150-151。C。TLC(乙酸乙酯:甲苯，3:l(v:v)，單點。HPLC純度:>98%。'H-NMR(400顧z，DMSO):1.59m(2H);1.73m(lH);1.97m(2H);2.31qq(lH，Ja=12.3Hz，Jb=3.8Hz);3.69m(lH);4.02m(lH);5扁d(lH，Ja=11.3Hz，Jb=1.9Hz);6.91d(lH，J=9.0Hz);7.78d(lH，J=9.0Hz);8.34s(lH);8.47s(lH);9.72s(lH)。MS(ES):[M+H]+=326(100)。實施例11:本實施例闡述了6-(3-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤的制備。將10毫摩爾6-氯-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤(由1546亳克6-氯嘌呤制備)、12毫摩爾3-甲氧基芐胺和5毫升三乙胺的混合物在正丙醇中回流3小時。真空蒸發(fā)正丙醇后，所得材料用水處理并用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯相在硫酸鈉上干燥，過濾并蒸發(fā)。然后，殘余物用30毫升正己垸洗滌。過濾白色固體，粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。幾小時后，得到純的透明結晶。產(chǎn)率80%，白色固體。熔點87-88°C。TLC(CHCl3:甲醇(8:2(v:v)):單點。HPLC純度:>98%。iHNMR(400MHz，DMSO):2.02六重峰(1H，J=7.4Hz);2.22六重峰(1H，J=7.4Hz);2.45m(2H);3.84s(3H);3.91q(1H，J=7.4Hz);4.14q(IH，J=7.4Hz);4.68s(2H);6.26m(1H);6.83t(lH，J=7.7Hz);6細(1H，J=7.7Hz);7.11d(lH，J=7.7Hz);7.20t(lH，J=7.7Hz);8.06bs(lH);8.17s(lH);8.27s(lH)。MS(ES):[M+H]+=326(100)。實施例12:本實施例闡述了6-(2，5-二甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的制備。將2387毫克(IO毫摩爾)6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤、2,5-二甲氧基芐胺(2006毫克，12毫摩爾)和5毫升三乙胺(35毫摩爾)在正丙醇中回流3小時。充分混合后固體完全溶解。真空蒸發(fā)正丙醇后，所得材料用水(IOO毫升)處理并用乙酸乙酯(100毫升)提取。蒸發(fā)乙酸乙酯提取物，殘余物用50毫升乙醚洗滌。過濾白色固體并真空干燥。產(chǎn)率95%,白色固體。熔點150-152。C。TLC(乙酸乙酯:己烷，l:2(v:v)，單點。HPLC純度>98%.iH-NMR(400MHz，DMSO):1.56m(2H);1.70m(IH);1.94m(2H);2.27qq(lH，Ja=12.3Hz，Jb=3.8Hz);3.60s(3H);3.70s(3H);3.66m(lH);3.78s(3H);楊m(lH);4.68bs(2H);5.64dd(lH，Ja=11.2Hz，Jb=2.0Hz);6.75m(2H);6,89dd(lH，Ja=9.2Hz，Jb=1.9Hz);8.10bs(lH);8.21s(lH);8.36s(lH)。MS(ES):[M+H]+=370(100)。實施例13:本實施例闡述了6-(2,5-二甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤的制備。將2247毫克(10毫摩爾)6-氯-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤(由1546毫克6-氯嘌呤制備)、2,5-二甲氧基芐胺(2006毫克，12毫摩爾)和5毫升三乙胺(35毫摩爾)的混合物在正丙醇中回流3小時。充分混合后固體完全溶解。真空蒸發(fā)正丙醇后，所得材料用水(100毫升)處理并用乙酸乙酯(100毫升)提取。蒸發(fā)乙酸乙酯提取物，殘余物用50毫升乙醚洗滌。白色產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率90%，白色固體。熔點103-104°C。TLC(乙酸乙酯:己烷，1:2(v:v)，單點。HPLC純度:>98%.'H國NMR(400MHz，DMSO):2.02m(lH);2.21七重峰(1H，J=6.8Hz);2.43m(2H);3.60s(3H);3.78s(3H);3.91q(lH，J=7.4Hz);4.14q(lH，J=7.4Hz);4,65bs(2H);6.26m(lH);6.74m(2H);6細(1H，J=8.8Hz);8.10bs(lH);8.18s(lH);8.28s(lH)。MS(ES):[M+H〗+=356(100)。實施例14:本實施例闡述了6-(2,3，4-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的制備。將2387毫克(IO毫摩爾)6-氯-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤、2，3,4-三甲氧基芐胺鹽酸鹽(2799毫克，12毫摩爾)和8毫升三乙胺(57毫摩爾)的混合物在正丁醇(45毫升)中回流3小時。充分混合后固體完全溶解。真空蒸發(fā)正丁醇后，所得材料用水(50毫升)處理并用乙酸乙酯(50毫升)提取。蒸發(fā)乙酸乙酯提取物，殘余物用30毫升乙醚洗滌。過濾白色固體并在甲醇中重結晶。產(chǎn)率90%，白色固體。熔點142-143°C。TLC(乙酸乙酯:己烷，1:2(v:v)，單點。HPLC純度〉98%.iH-NMR(400MHz，DMSO):1.57m(2H);1.72m(lH);1.95m(2H);2.27qq(lH，Ja=12.3Hz，Jb=3.8Hz);3.67m(lH);3.73s(3H);3.75s(3H);3.84s(3H);4.00m(lH);4.66bs(2H);5.63dd(lH，Ja=11.3Hz，Jb=1.9Hz);6,69d(lH，J=8.7Hz);6.91d(lH，J=8.7Hz);8.04bs(lH);8,20s(lH);8.34s(lH)。MS(ES):[M+H]+=400(100)。實施例15:本實施例闡述了6-(2)3,4-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤的制備。將2247毫克(10毫摩爾)6-氯-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤(由1546毫克6-氯嘌呤制備)、2,3，4-三甲氧基芐胺鹽酸鹽(2799毫克，12毫摩爾)和8毫升三乙胺(57毫摩爾)的混合物在正丁醇中回流3小時。充分混合后固體完全溶解。真空蒸發(fā)正丁醇后，所得材料用水(50毫升)處理并用乙酸乙酯(50毫升)提取。蒸發(fā)乙酸乙酯提取物，殘余物用50毫升己烷洗滌。白色粗產(chǎn)物在甲醇中重結晶。產(chǎn)率90%,白色固體。熔點140-141°C。TLC(乙酸乙酯:己烷，1:2(v:v)，單點。HPLC純度>98%。^-NMR(400MHz，DMSO):2.02七重峰(1H，J=6.8Hz);2.22七重峰(1H，J=6.8Hz);2.44m(2H);3.73s(3H);3.75s(3H);3.84s(3H);3.91q(lH，J=7.4Hz);4.13q(lH，J=7.4Hz);4.65bs(2H);6.26m(lH);6.70d(lH，J:8.6Hz);6.90d(lH，J=8.6Hz);8.03bs(lH);8.19s(lH);8.26s(lH)。MS(ES):[M+H]+=386(100)。實施例16:6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤對培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞的作用的一些短時初步研究。最初的研究涉及將6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(40-400pM)加入培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞中。處理6小時后，細胞對培養(yǎng)瓶表面的貼附百分率不受影響。在本實施例報道的其余實驗中，在細胞接種的同時將6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤直接加入培養(yǎng)基中。測定較寬的濃度范圍(從0.01到500pM)，用于確定處理3天后6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤對培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞的存活率的影響。l-200pM的濃度下，可見輕微刺激細胞生長和存活。用6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤處理細胞不會造成毒性或其他副作用。也評價了6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(0-400^iM)處理對年輕的人成纖維細胞的短時生長的影響。未處理樣品和用40、80和200^1)^6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤處理樣品中細胞生長類似。在約400pM的處理水平下，可見細胞生長稍微降低。進行類似的實驗以確定在6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤-處理細胞和未處理細胞中的凋亡程度和P-半乳糖苷酶染色程度。在用各種劑量的6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤處理的人成纖維細胞中未發(fā)現(xiàn)誘導凋亡或過早衰老。也檢査了6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤對衰老細胞的作用。將相同數(shù)量的衰老細胞接種到單獨的培養(yǎng)瓶中，然后用各種濃度的6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(0-400nM)進行處理。處理7天和14天后，胰酶消化并使細胞重新懸浮后，用庫爾德計數(shù)儀測定細胞數(shù)量。7天后未觀察到任何副作用。處理14天后，發(fā)現(xiàn)200或更高濃度的6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤對衰老細胞的存活具有輕微副作用。較低濃度下，未觀察到任何副作用，雖然6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤-處理的衰老細胞的細胞數(shù)量稍微增加。生存期間大于95%的后續(xù)傳代衰老細胞也用各種濃度的6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(0-200pM)進行處理以評價老化相關性變化。3天后檢査肌動蛋白染色分布圖。用6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤處理通常能改變肌動蛋白染色分布圖，從高度聚合的分布圖變成聚合度較低的細絲分布圖。聚合度較低且擴散的肌動蛋白染色分布圖通常與人成纖維細胞的年輕特征有關。因此，6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤似乎能夠逆轉衰老細胞肌動蛋白組織結構中的一些老化相關性改變。衰老的人皮膚成纖維細胞也用6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(0-40(^iM)進行處理，評價對老化相關性改變的逆轉作用。處理7天和30天后細胞狀況存在顯著性差異。處理30天后，處理細胞通?？瓷先ジ贻p，變得更薄且以陣列形式排列。即使在較高的濃度下(200和400pM)，與未處理細胞相比，6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤處理的細胞較小且細胞內碎片較少?；谏鲜鲅芯浚坪跄贻p和衰老的人皮膚成纖維細胞能夠很好地耐受6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤，在將衰老細胞的肌動蛋白分布圖和形態(tài)逆轉至相對較年輕的特征方面具有陽性結果。對額外的生長或細胞分裂無顯著誘導作用。實施例17:使用鈣黃綠素AM的微量滴定分析和一系列不同組織發(fā)生和物種來源的細胞系，測定一些本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物的體外細胞毒活性；也檢測了激動素作為對照。因為只有代謝活性細胞能夠裂解鈣黃綠素AM(鈣黃綠素的四乙酰氧基甲基酯)，鈣黃綠素的細胞內濃度對應于培養(yǎng)物中活細胞的數(shù)量。采用以下細胞系人骨肉瘤細胞(HOS);乳腺癌細胞MCF-7;人骨髓白血病細胞K-562;和小鼠成纖維細胞NIH3T3。將細胞維持在Nunc/康寧(Coming)80cm2塑料組織培養(yǎng)瓶中，在細胞培養(yǎng)液(含有5g/1葡萄糖，2mM谷27胺酰胺，100U/ml青霉素，100ng/ml鏈霉素，10%胎牛血清和碳酸氫鈉的DMEM)中進行培養(yǎng)。制備細胞懸液并根據(jù)具體的細胞類型和預期的細胞密度進行稀釋(基于細胞生長特征，每孔2.500-30.000個細胞)，由移液管(80pl)加入96/孔微量滴定板中。接種后為穩(wěn)定起見，在37t:、5%(302中預孵育24小時。將四倍稀釋的指定測試濃度在零時間以20nl的等分試樣加入微量滴定板各孔中。測定化合物通常以6種四倍稀釋物進行評價。本研究中使用的最高濃度為166.7pM。所有樣品三復？L。細胞與測試混合物在37°C、5%(302環(huán)境和100%濕度下孵育72小時。孵育結束時，加入鈣黃綠素AM至最終濃度1^g/ml，孵育1小時。用LabsystemFIA熒光掃描計數(shù)儀(UK)測定熒光強度(FI)。用以下方程計算細胞存活率(Gl5o):GI50=(FI制4化合柳孔/平均FI對照孔)/(平均FI對照孔-平均FI空白)X100%。由所得劑量響應曲線計算GIs。值，即導致50%細胞死亡的藥物濃度。獲得以下結果:化合物測試細胞系的Gl5。值Oimo1/1)HOSK-562MCF7NIH國3T3激動素>166.7164.1>166.7155.16-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤>166.7>166.7>166.7>166.76-(3,5-二甲氧基芐基氨萄-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤>166,7一>166.7>166.76-(4-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤>166.7>166.7>166.7>166.76-(2，3-二甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤>166.7->166.7>166.76-(3-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤>166.7->166.7>166.76-(4-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤>166.7->166.7>166.7本發(fā)明6，9-二取代的嘌呤衍生物在最高達166.7pM的濃度下對細胞幾乎沒有或沒有毒性，因此適用于美容應用。實施例18:通過96-孔優(yōu)化的標準MTT試驗測定一些本發(fā)明6,9-二取代的嘌吟衍生物對人二倍體成纖維細胞的體外細胞毒活性。該試驗基于活細胞線粒體的MTT代謝轉化產(chǎn)物的分光光度測量。中間代的人包皮成纖維細胞(細胞系BJ)維持在75cir^塑料組織培養(yǎng)瓶中并在細胞培養(yǎng)液(含有5g/l葡萄糖，2mM谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100pg/ml鏈霉素，10%胎牛血清和碳酸氫鈉的DMEM沖進行培養(yǎng)。每孔約5,000個細胞接種到96孔板中。24小時后，用含有測試化合物的細胞培養(yǎng)液更換細胞培養(yǎng)液。以六種2倍稀釋物評價測試化合物。本研究采用的最高濃度通常是200^M。對于在培養(yǎng)液中溶解度有限的化合物，可調節(jié)最高濃度。以五復孔測定每種測試化合物。細胞與測試化合物在37°C、5%C02環(huán)境和100%濕度下孵育72小時。孵育結束時，用含有MTT(0.5mg/ml)的細胞培養(yǎng)液更換培養(yǎng)基，細胞再孵育3小時。形成的甲膘用DMSO溶解，在570nm處測定吸光度。由下式計算測試化合物抑制細胞MTT還原活性的能力IC=(A接觸化合物的孔一平均A空白)/(平均A對照孔-平均A空白)X100%。由所得劑量響應曲線計算IC1()，即導致MTT還原活性降低10%的藥物濃度。得到以下結果:化合物測試的最大濃度(l^mol/l)ICioOmol/1)6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤200>2006-糠基氨基-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤200>2006-(4-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤100>腦6-(4-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤畫>訓6-(3-甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤100>1006-(2,4-二甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤25>256-(3,5-二甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤200>2006-(3,4-二甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤200>2006-(3,4-二甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫呋喃基)嘌呤200>2006-(2，3,4-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃萄嘌呤37.5>37.56-(2,3,4-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤200>2006-(2,4,5-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤200>2006-(2，4,5-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤200>2006-(2,4,6-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤50>506-(3，4，5-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤100>訓6-(3,4,5-三甲氧基芐基氨基)-9-(2-四氫吡喃萄嘌呤200>200測試的本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物顯示在廣泛的濃度范圍內對線粒29體活性和細胞活力無有害作用，因而適用于美容應用。實施例19:測定一些本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物對衰老的抑制作用；也評價了激動素作為對照。對人二倍體成纖維細胞(各種代數(shù)水平的HCA細胞:第25代-稱為HCA25;第45代-稱為HCA45;和第80代-稱為HCA80)進行染色，測定e-半乳糖苷酶活性。去除細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)液，細胞在PBS中洗滌兩次，然后在2-3毫升含2y。甲醛和0.2M戊二醛的PBS固定液中固定。細胞在室溫下孵育5分鐘，然后用PBS洗滌兩次。隨后，細胞在2-3毫升由鐵氰化鉀(5mM)、亞鐵氰化鉀(5mM)、MgCl2(2mM)、乂^&1(5-溴-4-氯-3-吲哚基-e-D-吡喃半乳糖苷)(lmg/ml)、檸檬酸/磷酸鹽緩沖液(pH6.0)構成的溶液中，在37"C(不含C02)孵育1-16小時。每一代將測試化合物(約50^M)加入培養(yǎng)液中。孵育結束后，觀察細胞樣品以檢測藍色細胞的存在，表明X-gal已裂解(陽性衰老細胞)。在該實驗中，只有衰老細胞由于e-半乳糖苷酶對底物的作用被染成藍色。結果如下所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>6,9-二取代的嘌呤衍生物在80代之后保持較低的衰老細胞水平方面通常比激動素更有效。實施例20:測定一些本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物的抗炎活性；也評價了激動素作為對照。大鼠C6神經(jīng)膠質瘤(ATCCNo.CCL107)在含有Ham'sF10/MEM(最低必需培養(yǎng)基)(1:1v/v)，2mML-谷胺酰胺，1。/。(v/v)最低必需培養(yǎng)基維生素(100X)，1。/。(v/v)最低必需培養(yǎng)基非必需氨基酸(100X)，100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素和30nM亞硒酸鈉的無血清化學限定的培養(yǎng)液中單層培養(yǎng)。在37"C濕潤環(huán)境下進行孵育。在細胞密度2.5Xl()S個細胞/平方厘米的對數(shù)生長期進行測定。加入5mM(-)-異丙基腎上腺素誘導胞內cAMP合成;在加入(-)-異丙基腎上腺素的同一時間加入各種量的測試化合物。在37。C孵育30分鐘后，除去培養(yǎng)液，用安瑪西亞(Amersham)的cAMP-酶免疫分析試劑盒測定細胞cAMP含量。根據(jù)復孔的劑量-響應曲線測定15()值。得到以下結果:<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>6,9-二取代的嘌呤衍生物具有抗炎活性。激動素在測試方案中無活性。實施例21:用常規(guī)接受的方法和過程進行一系列6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的安全性相關測試。這些試驗的結果總結在這里。艾姆斯氏試驗(AmesTest):該試驗根據(jù)標準方案和過程，采用DMSO作為溶劑，2.5、5.0、15、50、500、1500和5000嗎/板劑量水平的6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤進行(Ames等，MutationResearch,31，347-364(1975);Maron等，MutationResearch,113，173-215(1983))。采用鼠傷寒沙門菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型TA98和TA100，在含有或不含Aroclor誘導的大鼠肝S9的情況下，在測試水平下未觀察到6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的陽性誘變反應。體外染色體畸變篩選試驗在染色體畸變篩選試驗中采用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，在含和不含Acroclor-誘導的S9活化體系的情況下評價誘裂潛力，對6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤進行測試。使用DMSO作為溶劑，劑量范圍從0.272到272ng/ml。在6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤處理樣品中結構和數(shù)目畸變的細胞百分率并沒有顯著超過溶劑對照樣品?；谠撛囼?，認為6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤不會誘導CHO細胞染色體的結構和數(shù)目畸變。絨毛膜尿囊膜血管試驗采用Bagley等，《毒物學替代方法》(AlternativeMethodsinToxicology),第6巻，"體外毒物學進展"(ProgressinInVitroToxicology),131-138(1988)所述的方法，評價6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤對眼睛剌激的可能性。白來亨雞蛋的絨毛膜尿囊膜孵育14天后，加入40pl測試化合物(和三種用蒸餾水配制的較低濃度)，然后再孵育約30分鐘，此時檢查絨毛膜尿囊膜的血管出血、毛細管充血和/或幻影血管(ghostvessds)的存在。RCso值(在50%處理雞蛋中產(chǎn)生陽性反應的濃度計算值)為105%。在試驗條件下，認為RCsJ直低于1%有刺激性，而11(:5()值高于3%無刺激性。因此，基于該試驗，發(fā)現(xiàn)測試化合物無刺激性。表皮MTT活力試驗采用MatTek公司的EpiDermTM系統(tǒng)(包括正常人源性表皮角質形成細胞(NHEK)，經(jīng)培養(yǎng)形成多層結構的、高度分化的人表皮模型)，測定發(fā)現(xiàn)6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤無刺激性。急性口服毒性對雌性Wistar大鼠口服給予2000mg/kg6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤，然后在給藥后1/2、1、2、3和4小時，隨后是每天一次，持續(xù)14天，觀察毒性和藥理學作用；試驗后所有動物用二氧化碳人道處死并檢査總的病理學狀態(tài)。所有動物在整個口服給藥期間存活；試驗過程中的重量變化正常；并且尸體剖檢結構正常。人反復創(chuàng)傷貼片試驗將含有約0.1%6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃萄嘌呤的測試凝膠(約0.2ml)置于2平方厘米的封閉貼片上，放置到每個對象的背部，保留24小時。該過程每周一、周三、周五重復進行直到在系統(tǒng)區(qū)域完成9次施用(誘導過程)。每次施用前對該區(qū)域進行觀察。去除第9個貼片后約10-14天，對新的背部區(qū)域施用一挑戰(zhàn)貼片(挑戰(zhàn)過程)，隨后在24和72小時檢査反應性。皮膚反應是基于六點標尺(0=無反應跡象；+=幾乎不能察覺；1=輕微；2=中度；3=顯著；和4=嚴重)。52位對象完成了誘導和挑戰(zhàn)過程(每位對象總共10次施用)。在完成試驗的對象中，僅有一位對象在挑戰(zhàn)過程中施用后為幾乎不能察覺評分(+)(僅24小時；72小時檢査時無反應跡象)；不認為這一觀察到的反應是刺激或是過敏性的證據(jù)。所有其他對象在誘導或挑戰(zhàn)過程期間不存在任何刺激跡象(即在標尺上為0)。人對象中沒有觀察到誘導的過敏性接觸皮炎或其他刺激性證據(jù)。32實施例22:采用無毛小鼠模型(已經(jīng)建立的用于研究光致老化的治療的模型)檢查本發(fā)明6,9-二取代的嘌呤衍生物作為局部皮膚抗老化處理的安全性和效力。將雌性SKH-1無毛小鼠(5周齡，20-25克，馬薩諸塞州威爾明頓的查爾斯河實驗室(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA))單獨飼養(yǎng)在頂部過濾器的籠子中使其適應5-7天。將小鼠分成處理組(11=6)，包括兩個不同的對照組(未處理對照，運載體對照)和陽性對照組(市售0.05%反式-視黃酸乳膏)。小鼠自由進水和進食。試驗組(每組6只小鼠)包括以下處理(l)未處理對照；(2)運載體對照(MillCreek洗劑)；(3)激動素(0.1%在MillCreek洗劑中)；(4)6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(0.1%在MillCreek洗劑中)；和(5)陽性對照(0.05%反式-視黃酸乳膏)。每天(周一到周五)以20毫克的劑量水平將各種處理施用于無毛小鼠背側皮膚(約2cmX2cm)，持續(xù)3周?；€(在第一次處理之前)和每周，檢査背側皮膚經(jīng)表皮的水分損失(TEWL)，皮膚含水量和皮膚彈性。用溴脫氧尿苷作為細胞增殖的免疫組化標記物，測定這些外用制劑對表皮細胞增殖的可能影響。對處理和對照皮膚進行組織學檢查，來測定這些外用制劑的皮膚影響。每天進行檢査，用已建立的評分標準評價處理部位可能的紅斑發(fā)生(刺激性)，其中0分=無反應；1分=非常輕微的發(fā)紅；2分=輕微發(fā)紅；3分=中度發(fā)紅/剌激；4分=嚴重發(fā)紅/刺激；5分=非常嚴重的發(fā)紅/刺激；和6分=壞死。皮膚含水量和皮膚彈性是用于表征皮膚保濕和抗皺作用的重要的非侵入性方法。采用DermaLab組合設備在基線和每周測量目標皮膚部位的皮膚含水量和彈性。該設備配備有雙探針，置于皮膚表面，取各自參數(shù)進行定量測量，測量結果記錄在整合的計算機上。最終施用后4小時所有動物組腹膜內注射溴脫氧尿苷(100mg/kg)。3小時后然后通過吸入二氧化碳再是頸椎錯位處死動物。切除測試部位，由每個測量部位和未處理對照部位獲取6mm鉆取活檢組織。將活檢組織置于含有4%中性緩沖福爾馬林的標記試管內，用于石蠟包埋和抗-BrdU染色。將石蠟切片切割成5nM厚度，采用BrdU免疫組化試劑盒(X1545K，得自EB有限公司33(ExalphaBiologicals，Inc.))和標準染色方法進行染色。切片在邁爾(Mayer's)蘇木精中稍稍復染，在光學顯微鏡下測定每個切片每毫米表皮中BrdU-陽性細胞的數(shù)量。每個處理部位和未處理對照皮膚取皮膚活檢組織。將活檢組織在4%中性緩沖福爾馬林中固定，在石蠟中包埋，并用蘇木精和伊紅染色。檢査染色的皮膚切片以確定對表皮、真皮和角質層組織學的影響。也用顯微鏡檢查活檢組織中的炎性細胞。皮膚刺激性測試產(chǎn)品能很好地耐受持續(xù)3周的長時間處理。僅反式-視黃酸乳膏在1-3周處理后導致顯著刺激(3分)。所有其他處理都低于1.5分，6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤處理在3周時間內評分不到1分。皮膚含水量陽性對照顯示皮膚傳導性顯著降低，因而表明皮膚含水量降低。相反，測試化合物和單獨的運載體導致皮膚含水量逐漸升高。第3周時，所有測試化合物的平均含水量大于運載體和未處理對照組。通常，6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤是檢査的化合物中處理導致皮膚含水量升高最高的物質之一。皮膚彈性所有測試組在3周的試驗過程中都沒有觀察到處理組皮膚彈性的顯著變化。因此，處理組的皮膚與未處理組和單獨運載體處理組相當。溴脫氧尿苷(BrdU)染色測量表皮溴脫氧尿苷染色以確定測試化合物對表皮細胞增殖的影響。與未處理或運載體對照相比，測試化合物中不存在表皮BrdU染色的統(tǒng)計學差異，或測試化合物中BrdU染色的任何差異。陽性對照處理組織無表皮BrdU染色，但真皮中的一些局部區(qū)域存在染色，可能與類視黃醇誘導的炎癥有關。3周處理后試驗完成時獲取組織活檢樣品。組織學評價顯示所有測試化合物中正常"健康"的皮膚狀況。相反，陽性對照顯示表皮厚度顯著增加和真皮中的炎性變化。光學顯微鏡測定H&E染色活檢組織的皮膚房室厚度。將處理3周后測定的表皮、真皮和角質層厚度與運載體和未處理對照進行比較。相反，陽性對照的表皮和真皮厚度升高。這些結果提供了用于改善美容狀況和保留老化皮膚活力而沒有刺激性的6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤的安全性和效力的證據(jù)。34實施例23:進行臨床研究以確定每天兩次持續(xù)12周，外用6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(0.10%)以改善光致?lián)p傷面部皮膚的臨床征兆和癥狀的美容效力和對象耐受性。本試驗中采用年齡40-65歲的存在輕度到中度光致?lián)p傷面部皮膚征兆的40位女性志愿者對象。34位對象完成試驗；完成試驗的對象的平均年齡約為54歲。要求對象將測試產(chǎn)品施用于整個面部皮膚，每天兩次(即早晨和臨睡前大約1小時施用)，連續(xù)12周。還要求對象除了防曬劑或溫和清潔劑及彩妝外，試驗期間面部不使用其他外用皮膚護理產(chǎn)品或藥物。測試產(chǎn)品包含以MillCreek洗劑作為運載體的0.1%6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤。第2、4、8和12周評價對象。使用開始時(基線)以及第2、4、8和12周評價經(jīng)處理的面部皮膚的皮膚老化臨床征兆(例如粗紋和細紋，粗糙度，斑駁的過度色素沉著)。對象自我評價也獲取相對基線的改善效果(皺紋、質地、斑點、顏色和總體改善效果。此外，在所有對象臉頰上獲取經(jīng)表皮的水分損失(TEWL)和皮膚含水量測定結果。經(jīng)表皮的水分損失(TEWL):TEWL表示通過角質層水分蒸發(fā)損失的量。TEWL值升高提示蒸發(fā)性水分損失(例如，出汗或蒸發(fā))或皮膚屏障損傷。TEWL值降低表示屏障功能改善或皮膚屏障的存在。TEWL測量結果用TEWL測量計(德國庫林的C&K公司(Courage&Khazaka，Kmn，Germany))獲取，該裝置包括與中央處理單元相連的探針構成(包括濕度和溫度感應器)。對于每一位對象，將探針置于兩頰中央，獲取雙重測量結果。皮膚含水量測量通過測量皮膚電學性質的變化來間接測定皮膚含水量。采用NOVADPM9003(美國馬薩諸塞州格洛斯特的諾伐科技公司(NOVATechnologies,Gloucester,MA，USA))在皮膚上獲取基于電容的電阻測量結果。該裝置在各種預先選擇的應用交流電的頻率(最高1Hz)下進行測量。以任意單位測定直接與電容相關的值；較高的值表示較高的電容，表示測試部位處含水量升高。在每位測試對象兩頰中央獲取三重測定結果。對象面部皮膚的專家評估在基線(第0天)拜訪時，研究人員采用5點標尺(0=無；1=最少；2=輕微；3=中度；和4=嚴重)評價每位對象面部的細紋、粗紋、粗糙度、斑駁的過度色素沉著及其他參數(shù)。用10點標尺(0=無；1-3=輕微;4-6=中度；和7-9=嚴重)評價皮膚光致?lián)p傷的總的嚴重程度(皺紋、粗糙度、斑駁的過度色素沉著)；將基線時嚴重性評分大于6的對象排除在試驗之外。每一次隨后的拜訪，研究人員采用6-點標尺(1=優(yōu)異改善；2=顯著改善；3=中度改善；4=輕微改善；5=無改善；和6=惡化)評價相對于基線的總體改善效果。對象的效力感知每一次隨后拜訪，要求對象完成自評問巻以評價皮膚質地、皮膚顏色、斑點(即棕色點)、細紋相對于基線的改善效果；用5-點標尺評價總體改善效果(1=改善很多；2=—些改善；3=無變化；4=一些惡化；和5=嚴重惡化)。結果得到以下測試結果，對所有對象取平均并以均值記錄?；€第2周第4周第8周第12周TEWL(g/m2/hr)13.1512.8911.70*13.089.54*相對于基線的變化/-1.98%-9.62%0.11%-27.79%皮膚含水量(任意單位)118.03125.37*141.30*158.04*165.42*相對于基線的變化/6.22%20.96%35.10%41.21%*與基線相比存在顯著性差異&《0.05)。TEWL值降低表明皮膚屏障功能的改善；TEWL值升高表明屏障性的破壞。皮膚含水量的升高間接表明濕度水平的升高。研究人員對皮膚一般狀況的評價，采用5-點標尺(0=無；1=最小；2=輕微;3=中度；和4=嚴重)獲得以下結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>*與基線相比存在顯著性差異(p《005)+如果數(shù)據(jù)僅限于基線時具有紅斑征兆的對象，在所有時間范圍內存在顯著性差異。如果數(shù)據(jù)僅限于基線時沒有紅斑征兆的對象，在任意時間范圍都沒有顯著升高，表明不會誘導可見的紅斑征兆。++高度提示(=0.056)在第2周紅斑顯著減少。上述表格中參數(shù)變化的負百分率表示相關參數(shù)的改善。專家評價人員在一個或多個時間范圍對于細紋和粗紋、粗糙度、斑駁的過度色素沉著、痤瘡和紅斑觀察到顯著改善。未發(fā)現(xiàn)皮膚刺激。研究者采用10-點標尺(0=無；1-3=輕微；4-6=中度；和7-9=嚴重)基于皮膚老化相關的美容外觀評價總體皮膚狀態(tài)基線時4.10;第2周4.05(相對于基線的變化為-1.22%);第4周3.56(相對于基線的變化為-15.23%);第8周3.20(相對于基線的變化為-24.32%);和第12周3.03(相對于基線的變化為-27.97%)。第4、8和12周存在顯著性差異(p《0.001)?？傮w皮膚狀態(tài)的負百分變化表示皮膚老化相關美容外觀的改善。研究者釆用6-點標尺(1=優(yōu)異改善；2=顯著改善；3=中度改善；4=輕微改善；5=無改善；和6=惡化)評價皮膚狀態(tài)的總體改善效果第2周4.95;第4周4.44(相對于第2周的數(shù)據(jù)變化為-10.61%);第8周4.11(相對于第2周的數(shù)據(jù)變化為-16.67%);和第12周4.12(相對于第2周的數(shù)據(jù)變化為-17.16%)。第4、378和12周存在顯著性差異(p《0.001)。總體改善效果的負百分變化表示皮膚狀態(tài)的改善。試驗期間對象采用5-點標尺(1=改善很多；2=—些改善；3=無變化；4=一些惡化；和5=嚴重惡化)對皮膚狀態(tài)的自評結果如下:_<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>*與第2周的數(shù)據(jù)相比存在顯著性差異(p《0.05)。上表中參數(shù)的負百分變化表示相關參數(shù)的改善。對象在一個或多個時間范圍報告皮膚質地、皮膚顏色、斑點、棕色點和細紋的顯著改善。此外，對象報告在第8周和第12周皮膚總體狀態(tài)和外觀的顯著改善?？傊?，專家評價和自評都表明，試驗期間對象的總體皮膚狀態(tài)得到顯著改善，老化相關的不良影響顯著降低。未觀察到皮膚刺激或其他不良影響。實施例24:本實施例比較了局部施用來自實施例23的6-糠基氨基-9-(2-四氫吡喃基)嘌呤(0.10%)的臨床數(shù)據(jù)與局部施用來自較早試驗的激動素(0.1%)產(chǎn)生的類似臨床數(shù)據(jù)。較早的激動素臨床試驗的方法類似于用于本發(fā)明化合物的實施例23中所述的方法；32位女性志愿者完成較早的激動素試驗。比較是基于第8周和第12周對試驗中評價的一些參數(shù)的數(shù)據(jù)的皮膚狀態(tài)的專家評價和自評結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>權利要求1.一種改善哺乳動物細胞老化的不良影響的方法，所述方法包括對哺乳動物細胞施用一定量的6，9-二取代的嘌呤衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述6，9-二取代的嘌呤衍生物通式如下式中R6是糠基、甲氧基取代的糠基、苯基、甲氧基取代的苯基或甲氧基取代的芐基；R9是2-四氫吡喃基或2-四氫呋喃基；所述的量能夠有效改善哺乳動物細胞老化的不良影響。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，R6是糠基或甲氧基取代的糠基，R9是2-四氫吡喃基。3.如權利要求l所述的方法，其特征在于，R6是糠基，R9是2-四氫吡喃基。4.如權利要求l所述的方法，其特征在于，用量約為0.05-10%。5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，用量約為0.05-10%。6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，用量約為0.05-10%。7.如權利要求l所述的方法，其特征在于，用量約為0.1-2%。8.如權利要求2所述的方法，其特征在于，用量約為0.1-2%。9.如權利要求3所述的方法，其特征在于，用量約為0.1-2%。10.—種治療哺乳動物皮膚病或皮膚病癥的方法，所述方法包括對需要這種治療的哺乳動物皮膚細胞施用有效量的6，9-二取代的嘌呤衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述6,9-二取代的嘌呤衍生物的通式如下式中R6是糠基、甲氧基取代的糠基、苯基、甲氧基取代的苯基或甲氧基取代的芐基；R9是2-四氫吡喃基或2-四氫呋喃基。11.一種治療哺乳動物炎癥的方法，所述方法包括對需要這種治療的哺乳動物細胞施用有效量的6,9-二取代的嘌呤衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述6,9-二取代的嘌呤衍生物的通式如下Re、NHN'NR9式中Rs是糠基、甲氧基取代的糠基、苯基、甲氧基取代的苯基或甲氧基取代的芐基；R9是2-四氫吡喃基或2-四氫呋喃基。12.—種改善哺乳動物細胞老化的不良影響的方法，所述方法包括對哺乳動物細胞施用一定量的6,9-二取代的嘌呤衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述6，9-二取代的嘌呤衍生物的通式如下所述的量能夠有效改善哺乳動物細胞老化的不良影響。13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述用量約為0.05-10%。14.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述用量約為0.1-2%。15.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是人皮膚細胞。16.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是人皮膚細胞。17.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞是人皮膚細胞。18.—種改善人皮膚老化的不良影響的方法，所述方法包括對人皮膚施用一定量的6,9-二取代的嘌呤衍生物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述6，9-二取代的嘌呤衍生物的通式如下所述的量能夠有效改善人皮膚老化的不良影響。19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述用量約為0.05-10%。20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述用量約為0.1-2%。全文摘要本發(fā)明提供了通過給予含有6，9-二取代的嘌呤衍生物的組合物，在體外和體內對抗哺乳動物細胞(尤其是人皮膚細胞和人皮膚)老化的不良影響，并治療哺乳動物過度增殖和相關皮膚病的方法和組合物。文檔編號A61K31/375GK101646435SQ200780031839公開日2010年2月10日申請日期2007年7月10日優(yōu)先權日2006年7月10日發(fā)明者F·J·馬西諾,J·多樂澤爾,L·弗勒利希,L·斯皮恰,L·祖科瓦,M·扎魯卡爾,M·斯特納德申請人:捷克共和國科學院實驗植物學學會