專利名稱：蟛蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的藥物用途的制作方法
螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的藥物用途技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的藥物用途，特別涉及其在制備治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷型疾病(慢性肝炎或是自身免疫性肝炎)的 藥物中的應(yīng)用。背景技術(shù)：
T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷型疾病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。病毒性肝炎是一種 自限性的自愈性疾病，病程包括三個(gè)步驟感染一清除一自愈，故急性病 毒性肝炎只需給予適當(dāng)?shù)膶?duì)癥治療，免疫反應(yīng)有助于清除病毒。然而，當(dāng) 病程反復(fù)停留在感染一清除的過程，病程延長(zhǎng)至數(shù)年甚至數(shù)十年，這就是 臨床上的慢性肝炎。病毒感染僅是致病因素，但不是主要機(jī)制。乙肝病毒 不能直接造成肝細(xì)胞病變，丙肝病毒雖可以造成肝損傷，但也不是主要的，體對(duì)感染的免疫反應(yīng)。我國是肝病高發(fā)地區(qū)，慢性病毒性肝炎的治療主要 采用抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善肝功能和抗肝纖維化等綜合治療。免疫調(diào)節(jié) 主要有免疫增強(qiáng)劑如左旋咪唑、胸腺肽ct等；免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激 素、秋水仙堿等；重組細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-12等。自 身免疫性肝炎與病毒性肝炎的致病因素雖不同，但肝損傷的過程很類似， 臨床治療主要用免疫抑制劑糖皮質(zhì)激素、抗代謝藥物等。在慢性病毒性 肝炎和自身免疫性肝炎的治療中，抑制抗原-抗體反應(yīng)所引起的組織損害和 炎癥反應(yīng)最常用的免疫抑制藥物有糖皮質(zhì)激素(如強(qiáng)的松)、抗代謝藥物(如 硫唑噪呤)、烷化劑(如環(huán)磷酰胺)。糖皮質(zhì)激素在體內(nèi)的作用廣泛而復(fù)雜，在生理劑量下主要影響物質(zhì)代 謝，在應(yīng)激狀態(tài)下通過允許作用使機(jī)體適應(yīng)環(huán)境的強(qiáng)烈刺激。在藥理劑量 下還具有強(qiáng)大的抗炎、抗免疫和抗休克等藥理作用。對(duì)于免疫反應(yīng)，糖皮質(zhì)激素有多方面的抑制作用，對(duì)自身免疫性疾病能發(fā)揮一定的近期療效。糖皮質(zhì)激素對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制主要是通過以下幾條途徑(1)誘導(dǎo)淋巴細(xì) 胞DNA降解；(2)影響淋巴細(xì)胞的代謝，抑制淋巴細(xì)胞中的DNA、 RNA 和蛋白質(zhì)的生物合成；(3)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡；(4)抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-KB 的活性。因此，糖皮質(zhì)激素的作用是全身性、多靶點(diǎn)的，不良反應(yīng)也是廣 泛的、嚴(yán)重的，累及多個(gè)器官，特別是免疫抑制會(huì)誘發(fā)或加重感染，停藥 后有反跳現(xiàn)象?？勾x藥物硫唑噪呤，通過干擾噪呤代謝的所有環(huán)節(jié)，抑制嘌呤核苷 酸的合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞DNA、 RNA及蛋白質(zhì)的生物合成，發(fā)揮抑制T、 B母細(xì)胞及NK細(xì)胞的效應(yīng)(T細(xì)胞較B細(xì)胞更為敏感)。此類藥物能同時(shí) 抑制細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。主要的不良反應(yīng)是骨髓抑制，肝功能損害。烷化劑環(huán)磷酰胺，通過殺傷增殖期的淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞較T細(xì)胞更為 敏感)，亦影響某些靜止細(xì)胞，從而抑制初次和再次的體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)。 主要的不良反應(yīng)是骨髓抑制，腸胃道反應(yīng)、易感染及中毒性肝炎等。香豆素類化合物是廣泛存在于蕓香科、傘形科、菊科、豆科、瑞香科、 茄科等植物的一類內(nèi)酯，具有抗心律失常、降壓、平喘、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、 抗HIV、抗癌、抗骨質(zhì)疏松等生物活性。螺蜞菊內(nèi)酯屬香豆素類化合物， 在植物中分布較局限，具有明顯科屬分布特征在菊科植物墨旱蓮(Eclipta prostrata L.)和金盞蠔蜞菊(Wedelia calenulaceae )中發(fā)現(xiàn)，螺蜞菊內(nèi)酯在 植物中含量相對(duì)較高，活性及作用機(jī)制特殊，結(jié)構(gòu)具有特征性，理化性質(zhì) 明確、藥理活性肯定。蟛蜞菊內(nèi)酯與上述的免疫抑制劑相比，具有特異的免疫抑制作用，其 特異性作用于T淋巴細(xì)胞僅對(duì)被激活進(jìn)入細(xì)胞周期的T細(xì)胞抑制,對(duì)外 周G(j期T細(xì)胞無抑制作用。因此，具有更高的選擇性，不會(huì)引起骨髓抑 制等不良反應(yīng)，對(duì)免疫抑制帶來的感染及腫瘤風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)較降低。目前，螺蜞菊內(nèi)酯已實(shí)現(xiàn)了系列衍生物的全合成，為后續(xù)的藥物研究 提供可能。CN1566116公開了一種制備蟛蜞菊內(nèi)酯的方法及其應(yīng)用。但對(duì) 于在制備治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷型疾病(慢性肝炎或是自身免疫性肝 炎)的藥物中的應(yīng)用未見報(bào)道。4本發(fā)明提供了蟛蜞菊內(nèi)酯及其衍生物在制備治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損 傷型疾病(慢性肝炎或是自身免疫性肝炎)的藥物中的應(yīng)用。切相關(guān)。傳統(tǒng)的CCl4、 D-半乳糖氨誘導(dǎo)模型的肝損傷機(jī)制是脂質(zhì)過氧化， 因而不能很好地反映這一病理特點(diǎn)。應(yīng)用刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)小鼠肝損 傷是最近十年發(fā)展起來的由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的肝損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，靜脈注射 ConA，首先活化肝臟內(nèi)的T細(xì)胞，并刺激CD4+ T細(xì)胞分泌一 系列的細(xì)胞 因子，繼而進(jìn)一步活化肝臟庫普弗細(xì)胞并導(dǎo)致更多的細(xì)胞因子的分泌，加 劇肝損傷。這一實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶攸c(diǎn)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，肝臟特異的，是肝細(xì) 胞損害研究的理想模型，常用于慢性肝炎和自身免疫性肝病的藥物篩選。 本發(fā)明以此損傷模型觀察了墨旱蓮及其活性成分蟮蜞菊內(nèi)酯的保肝作用。本發(fā)明的目的以螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物制備免疫抑制類的藥物，其 特點(diǎn)是通過選擇性抑制進(jìn)入細(xì)胞周期的T淋巴細(xì)胞的增殖，使T細(xì)胞介導(dǎo) 的過度炎癥反應(yīng)得以控制，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)靶細(xì)胞的損傷。螺蜞菊內(nèi)酯的 免疫抑制作用是選擇性的，更具有安全性，不會(huì)引起上述幾類藥物的不良 反應(yīng)。本發(fā)明尋找到了一個(gè)高活性的先導(dǎo)化合物一螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物， 可用于新藥物的開發(fā)。本發(fā)明所采用的技術(shù)路線為1、 中藥墨旱蓮的保肝作用a.降酶作用(ALT); b.病理改善(HE切 片)；c.抗凋亡(TUNNEL切片)d.糾正肝內(nèi)CD/與CDs+細(xì)胞的失衡；通過測(cè)定小鼠血清樣品谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量，來分析墨旱蓮提 取物對(duì)小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響。通過顯微圖像分析儀觀察肝臟組織中 被染色的凋亡細(xì)胞的數(shù)量，以評(píng)價(jià)肝臟組織病理學(xué)變化。用流式細(xì)胞4義分 析CD4+T細(xì)胞CD8+ T細(xì)胞的百分率，來分析比較T細(xì)胞亞群的相對(duì)比例。2、 活性跟蹤分離得到螺蜞菊內(nèi)酯證實(shí)上述藥理作用是螺蜞菊內(nèi)酯所 起的作用；通過MTT法觀察墨旱蓮各分離部位對(duì)ConA刺激的T細(xì)胞增殖的影 響，進(jìn)而確定墨旱蓮的保肝作用是螺蜞菊內(nèi)酯所起的。3、 螺蜞菊內(nèi)酯的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)碌蜞菊內(nèi)酯的性狀，波譜分析和結(jié)構(gòu)鑒定等；觀察螺蜞菊內(nèi)酯的性狀、熔點(diǎn)、熒光性質(zhì)、顯色特征等。通過IR譜、 t3C-NMR譜、^-NMR譜、'H-13C HMBC譜和iH-13C HMQC譜分析，確 定了蟛蜞菊內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，如圖1所示。4、 蟛蜞菊內(nèi)酯的生物活性高選擇性地抑制ConA刺激的T淋巴細(xì)胞 的增殖、對(duì)外周正常淋巴細(xì)胞無抑制作用、無細(xì)胞毒性。用3H-TdR法測(cè)定螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)單個(gè)核淋巴細(xì)胞的增殖以及ConA刺 激的T淋巴細(xì)胞增殖的影響；觀察螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16、小鼠 成纖維細(xì)胞L929的影響，以確定場(chǎng)蜞菊內(nèi)酯無細(xì)胞毒性。以生藥提取、 全合成兩種不同來源蠔蜞菊內(nèi)酯重復(fù)對(duì)ConA刺激的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增 殖作用的抑制實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了天然產(chǎn)物與合成產(chǎn)物具有生物等效性。本發(fā)明所公開的螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的藥物用途，尤其是其在制備 治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷型疾病的藥物中的應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)中藥墨旱蓮的滋腎補(bǔ)肝、保肝護(hù)肝用藥歷史悠久、療效肯定；實(shí) 驗(yàn)證實(shí)螺蜞菊內(nèi)酯是中藥保肝護(hù)肝作用的活性成分；以活性成分螺蜞菊內(nèi) 酯及其衍生物制備新藥，其優(yōu)點(diǎn)為去粗取精，藥物成分清晰、作用明確、 安全有效、質(zhì)量可控、可減少不良反應(yīng)，符合國家中藥現(xiàn)代化戰(zhàn)略的要求； (2 )螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物用在制備治療慢性肝炎和自身免疫性肝炎 的藥物，作用機(jī)制特別僅作用于被激活的T細(xì)胞，對(duì)外周單個(gè)核淋巴細(xì) 胞無抑制作用，選擇性高，副作用??；(3) 蟛蜞菊內(nèi)酯屬小分子化合物，活性強(qiáng)、作用機(jī)制獨(dú)特、生物利用 度高，是性能優(yōu)良的先導(dǎo)化合物，進(jìn)一步明確藥物的構(gòu)-效關(guān)系，可開發(fā)出 免疫抑制新藥，其活性^(汙生物結(jié)構(gòu)如圖7;其中，R產(chǎn)OH, OCH3， OCOCH3 中的任意一種基團(tuán)，R2=OH, OCH3, OCOCH3中的任意一種基團(tuán)，R3=OH, OCH3, OCOCH3中的任意一種基團(tuán)，R4OH， OCH3， OCOCH3中的任意 一種基團(tuán)。(4) 已完成系列合成，可經(jīng)衍生化對(duì)螺蜞菊內(nèi)酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，無須 過分依賴植物來源，適合通過合成途徑大規(guī)模生產(chǎn)。
圖1.螺蜞菊內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖2.墨旱蓮提取物對(duì)ConA誘導(dǎo)肝損傷小鼠的血清ALT活性的影響 圖3.肝臟組織HE病理觀察 圖4.肝臟組織凋亡病理觀察圖5.墨旱蓮提取物對(duì)肝組織內(nèi)CD4+、 CD8+T細(xì)胞亞型分布的影響圖6.墨旱蓮抑制ConA刺激的T細(xì)胞增殖活性成分跟蹤圖7.螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖8.螺蜞菊內(nèi)酯抑制ConA刺激的T細(xì)胞增殖作用圖9.螺蜞菊內(nèi)酯抑制ConA刺激的T細(xì)胞增殖作用(重復(fù)驗(yàn)證)圖10.螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)外周淋巴細(xì)胞增殖作用的影響圖11.天然產(chǎn)物與合成產(chǎn)物的螺蜞菊內(nèi)酯的活性對(duì)照具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。1、 原材料昆明種小鼠，20 g,清潔級(jí)。BALB/c小鼠6 8周齡，清潔級(jí)。黑色素 瘤細(xì)胞B16、小鼠成纖維細(xì)胞L929。聯(lián)苯雙酯滴丸；刀豆蛋白A(ConA); RPMI 1640;四曱基偶氮唑 MTT(Fluka); ALT試劑盒；淋巴細(xì)胞分離液(密度為1.077 ), CD3-PI抗 體；CD4-FITC抗體；CD8-Cys抗體；96孔培養(yǎng)板；色譜柱用硅膠(100~ 200目)，RPMI 1640營養(yǎng)液；DMSO (AR);氮-脫氧胸腺嘧。定核苦(3H-TdR); 刀豆蛋白A(ConA); 96孔培養(yǎng)板；藥材墨旱蓮；其余試劑均為國產(chǎn)分析 純。2、 試驗(yàn)步驟 (1)藥物制備藥材墨旱蓮以80%乙醇回流提取三次，每次2h,減壓濃縮干燥制備 浸膏，將總浸膏懸于水中，以石油醚反復(fù)萃取，脫脂后的水溶液減壓濃縮 千燥，得極性部位提取物，-5°。冰箱保存。實(shí)驗(yàn)用藥以蒸餾水配制成給藥所需濃度藥液。(2) 血清樣品、肝組織樣品制備昆明種小鼠，雌雄兼用，6 8周齡，體重約20g。隨機(jī)分為五組(見 表l),分別為陰性對(duì)照組、墨旱蓮對(duì)照組、ConA模型組、陽性對(duì)照DDB 組以及墨旱蓮提取物組，每組IO只小鼠，每天定時(shí)灌胃給藥一次，對(duì)照組、 ConA組給NS溶液(約0.2mL )，藥物組劑量以生藥重量計(jì)算，配制所需 濃度的提取物溶液給藥(約0.2mL),不禁水、不禁食，連續(xù)給藥7天。肝 損傷劑為ConA溶于NS溶液，以15mg/kg劑量(約0.2mL )于末次給藥 后2h腹腔注射，誘導(dǎo)肝損傷后禁食、不禁水，16h后眼眶采血，全血放置 0.5h，待凝固后2000r/min離心10min,取上層清液，制備血清樣品，樣品 -20。C凍存待測(cè)，忌反復(fù)凍融。小鼠斷頸處死后，取一半肝臟組織以10% 福爾馬林(4%曱醛)固定，待做病理學(xué)分析。在陰性對(duì)照組、ConA模型 組和高劑量組中分別隨機(jī)選取小鼠5只、7只、7只，取另一半肝臟組織置 于PBS液暫存，待做肝組織中T細(xì)胞亞型定量分析。(3) 墨旱蓮提取物對(duì)小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響取小鼠血清樣本按試劑盒說明書要求操作，測(cè)定小鼠血清樣品谷丙轉(zhuǎn) 氨酶(ALT)的含量以全自動(dòng)生化儀分析，測(cè)定方法為速率法，酶反應(yīng) 的啟動(dòng)方式為底物啟動(dòng)，結(jié)果計(jì)算方法為ALT(U/L)二F x AA/min。表1.墨旱蓮提取物對(duì)ConA誘導(dǎo)肝損傷小鼠的血清ALT活性的影響(7± s)GroupConA (mg/kg)DDB,五c/— extracts (g/kg)a (U/L)Control41.2±10.3￡c/z》to cont2041.3±12.3ConA15698.3 ±234.7**DDB150.15427.4 ±137.6+1520273.5 ± 125.8++"=10, **尸<0.01Cont， +尸<0.05，尸< 0.01 w ConA結(jié)果表明(見圖2): ConA組的血清ALT活性急劇升高，表明小鼠肝 細(xì)胞損傷已發(fā)生，陽性對(duì)照藥DDB能顯著降低血清ALT活性，提示肝損8傷模型復(fù)制成功；墨旱蓮對(duì)照組的ALT與空白對(duì)照組無顯著差異，但墨旱 蓮藥物組可顯著降低ConA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷小鼠的血清ALT值，提示墨 旱蓮粗提物的降酶作用是針對(duì)ConA誘導(dǎo)的損傷，且降酶作用優(yōu)于陽性對(duì) 照藥DDB，提示墨旱蓮粗提物能改善肝細(xì)胞的功能而具有保肝活性。 (4)墨旱蓮提取物保肝作用的肝臟組織病理學(xué)觀察肝臟組織制作病理切片，以HE染色，顯微圖像分析儀觀察肝臟組織 病理學(xué)變化觀察結(jié)果(圖3)顯示與對(duì)照組相比，ConA誘導(dǎo)的肝損傷模 型組可觀察到肝細(xì)胞明顯的腫脹以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，用藥組可觀察到損傷 有所改善。制常規(guī)病理石蠟切片，按原位雜交凋亡4全測(cè)(TUNNEL)試劑盒說明 的步驟進(jìn)行標(biāo)記染色，顯微圖像分析儀觀察肝細(xì)胞凋亡的病理學(xué)變化。結(jié) 果(圖4)顯示與對(duì)照組相比，ConA誘導(dǎo)的肝損傷模型組有大量成片的 肝細(xì)胞凋亡，凋亡的細(xì)胞體積縮小，核質(zhì)濃縮，但胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，藥 物組與對(duì)照組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，散布在肝組織中，肝細(xì)胞損傷 程度有明顯改善。 (5 )肝臟組織中T細(xì)胞亞群的標(biāo)記及顯微觀察表2.墨旱蓮提取物對(duì)ConA誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟組織中T細(xì)胞亞型分布的影響(7± s)Group nConA(mg/kg) 五c/一 (g/kg) CD3+ CD4+ CD8+20.11±4.83 8.07±2.03 10.48±3.731516.01±5.85 9.14±3.81 5.45±2.19*15 20 19.22±5.05 7.77±2.68 9.16±3.24+尸<0.05 raCont，尸<0.05 ra ConA肝臟組織勻漿，篩網(wǎng)過濾，PBS溶液洗滌，離心獲取細(xì)胞，以密度為 1.077 (g/cm3)的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液離心分離單個(gè)核細(xì)胞，PBS溶液漂 洗，1500r/min離心5min，獲得小鼠肝臟組織中的單個(gè)核細(xì)胞。以流式細(xì) 胞儀分析，收集10000個(gè)單個(gè)核細(xì)胞于采集窗內(nèi)，以此群細(xì)胞開窗分析，Control 5 ConA 7五c/^f3 7用CellGuest軟件分析CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞CD8+T細(xì)胞的百分率，分 析比較T細(xì)胞亞群的相對(duì)比例(見表2)。用FACS檢測(cè)中標(biāo)記好的T細(xì)胞 以CD4+ T細(xì)胞CD8+T細(xì)胞占CD3+ T細(xì)胞的相對(duì)百分率分析墨旱蓮提 取物對(duì)T細(xì)胞亞型分布的影響，結(jié)果顯示(見圖5 ):模型組的CD4+T/CD8+T 細(xì)胞的相對(duì)比例出現(xiàn)倒置，而藥物組能糾正CD4+ZCD8+比例的倒置，使T 細(xì)胞亞型的分布恢復(fù)到正常比例。(6 ) MTT法跟蹤拮抗ConA刺激T淋巴細(xì)胞增殖的活性部位BALB/c小鼠，雄性，6 8周齡，體重約20g。取小鼠脾細(xì)胞，制備單 個(gè)脾細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，洗滌，獲得單個(gè)核細(xì)胞懸液。以RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 x 1(^個(gè)/mL。懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 含1 x 105個(gè)細(xì)胞，以RPMI 1640培養(yǎng)液為陰性對(duì)照組，終濃度為5jig/mL的 ConA為陽性對(duì)照，設(shè)置終濃度分別為160pg/mL、 80嗎/mL、 40)ig/mL、 20|iig/mL、 10|Lig/mL的提取物和5嗎/mL的ConA藥物組，以RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋至200^iL體積，各設(shè)三個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于5。/。C02培養(yǎng)箱 中37。C培養(yǎng)72h,培養(yǎng)結(jié)束前4h染色，MTT法觀察墨旱蓮各分離部位對(duì) T細(xì)胞增殖的影響。具體流程見圖6所示。每一分離部位抑制T細(xì)胞增殖活性定義ConA組為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組的 抑制作用P>0.01為(-)，實(shí)^^組最有效濃度的抑制作用PO.01為(+ ), 若能拮抗ConA作用的50%為(+ + ),完全拮抗ConA作用為(+ + + )。 結(jié)果如下，獲得了墨旱蓮抑制ConA刺激的T細(xì)胞增殖的單體化合物(螺 蜞菊內(nèi)酯，結(jié)構(gòu)鑒定步驟7)。其中，具體的實(shí)驗(yàn)流程見圖6。 (7)蟛蜞菊內(nèi)酯的理化性質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定理化性質(zhì)等化合物為灰白色粉末，溶于氯仿。mp315 319。C。紫外燈下呈藍(lán)色熒 光斑點(diǎn)，碘熏顯墨綠色。樣品進(jìn)行波譜分析IR譜、"C-NMR譜、^-NMR 譜、^-"C HMBC語和1H-13C HMQC譜。波譜凄t據(jù)如下IR(KBr)cm—卜3300, 1715, 1640， 1620, 1445， 1415， 1320, 1205, 1155, 1070。^隱NMR(500MHz DMSO-d6) 5: 3.82 (3H, s, 7-OCH3-H), 6.47 ( 1H, s, 8-H)， 6.63 (1H， s, 6-H), 7.19 ( 1H, s， 13-H)， 7.26 ( 1H， s， IO-H)。13C-NMR (125MHz DMS0隱d6) 5 : 55.8 ( C-OCH3 )， 93.2 ( C-6 ), 96.7 (C-4), 98.1 (C國8), 98.9 (C-13)， 101.7 (C陽2 )， 104.5 (C隱IO)， 113.8 (C陽M)， 144.3 (C-12), 145.4 (C畫ll), 148.9 (C-15)， 154.9 (C-5)， 155.3 (C誦3)， 157.8 (C-9), 159.0 (C畫l)， 162.3 (C-7)。HMBC、 HMQC信號(hào)及歸屬見表3。表3.蟛蜞菊內(nèi)酯的HMQC譜及HMBC (DMSO-d6)譜Sh惶HMQC( S c)HMBC( S c)6.63(H-6)93.2(C-6)96.7 (C-4)98.1 (C-8)154.9 (C-5)162.3(C-7)3.82(H-OCH3)55.8 (C-OCH3)162.3(C-7)6.47(H-8)98,1(C-8)93.2(C-6)96.7 (C-4)157.8 (C-9)162.3(C-7)7.26(H-10)104.5 (C-10)113.8(C-14)144.3(C-12)145.4(C-11)148.9(C-15)7.19(H-13)98.9 (C-13)113.8(C-14)144.3(C-12)145.4(C-11)148.9(C-15)根據(jù)IR譜、"C國NMR譜、DEPTi普、iH-NMR譜、^-"C HMBC譜和 iH屮C HMQC譜鑒定化合物為螺蜞菊內(nèi)酉旨(Wedelolactone)，結(jié)構(gòu)(見圖1 )， 在天然產(chǎn)物分類中屬香豆素類化合物。(8 ) 3H-TdR法測(cè)定壞蜞菊內(nèi)酯對(duì)ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖作用的影 響無菌取BALB/c小鼠脾臟，制備濃度為1 x 1(^個(gè)/mL的單個(gè)核細(xì)胞懸 液，以RPMI 1640培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，5jig/mL的ConA為陽性對(duì)照，設(shè) 置終濃度分別含10pg/mL、 5pg/mL、 2.5|ig/mL的螺蜞菊內(nèi)酯藥物組，各設(shè) 三個(gè)復(fù)孔，與單個(gè)核細(xì)胞共同孵育，3H-TdR法測(cè)定cpm值，觀察螺蜞菊 內(nèi)酯對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖作用的影響。結(jié)果(見圖8)顯示螺蜞菊內(nèi)酯對(duì) ConA刺激的T細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，在10|iig/mL時(shí)幾乎完全拮 抗了 ConA的作用。經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(見圖9)，場(chǎng)蜞菊內(nèi)酯的抑制ConA 刺激的T細(xì)胞增殖活性結(jié)果肯定。 (9)蟛蜞菊內(nèi)酯細(xì)胞對(duì)外周淋巴細(xì)胞增殖的影響無菌取BALB/c小鼠脾臟，制備濃度為1 x 1(^個(gè)/mL的單個(gè)核細(xì)胞懸 液，將20iug/mL、 10)Lig/mL、 5嗎/mL、 2.5|ug/mL的螺蜞菊內(nèi)酯與細(xì)胞共同 孵育，3H-TdR法測(cè)定cpm值，觀察正常情況下，螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖作用的影響。結(jié)果表明(見圖10): cpm值在各實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著，即螺蜞菊 內(nèi)酯對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖無抑制作用。對(duì)外周淋巴細(xì)胞的增殖無顯著影響。 螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制具有選擇性僅對(duì)受抗原物質(zhì)刺激而 活化、增殖的T細(xì)胞有抑制作用，即對(duì)過度表達(dá)的T細(xì)胞起調(diào)控作用，而 對(duì)定居于脾臟的各種成熟淋巴細(xì)胞無抑制作用，不會(huì)造成機(jī)體的免疫低下。 (10 )蟛蜞菊內(nèi)酯細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置RPMI 1640對(duì)照組，觀察實(shí)驗(yàn)濃度的DMSO對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16 的影響，排除溶媒對(duì)細(xì)胞的毒性作用后，觀察蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)黑色素瘤細(xì)胞 B16的影響。以另一細(xì); 包系的細(xì)^^小鼠成纖維細(xì)月包L929重復(fù)試驗(yàn)，確i正 螺蜞菊內(nèi)酯無細(xì)胞毒性。MTT法觀察相應(yīng)濃度的DMSO溶酶、2.5嗎/mL、 5jug/mL、 10嗎/mL 濃度的場(chǎng)蜞菊內(nèi)酯對(duì)黑色素瘤細(xì)月包B16細(xì)胞24h、 48h、 72h時(shí)細(xì)胞存活率 的影響。MTT法觀察2.5fig/mL、 5|ug/mL、 10|ug/mL、 20|iig/mL、 50pg/mL、 100i!g/mL濃度的螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)L929細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果為:溶酶 DMSO對(duì)兩種細(xì)胞的存活率均無影響。實(shí)驗(yàn)濃度下的螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)黑色素 瘤細(xì)胞B16和小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞的存活率無顯著影響，未觀察到 螺蜞菊內(nèi)酯的細(xì)胞毒作用。結(jié)果表明在黑色素瘤細(xì)胞B16和小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞培養(yǎng)實(shí) 驗(yàn)中未觀察到螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞存活率的影響，在兩種不同細(xì)胞系的細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果，可以確定螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞沒有直接的毒性作用，螺 蜞菊內(nèi)酯對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用不是通過細(xì)胞毒作用實(shí)現(xiàn)的。 (11 )天然產(chǎn)物與合成樣品的活性對(duì)照參照步驟8,以生藥提取、全合成兩種不同來源螺蜞菊內(nèi)酯重復(fù)對(duì) ConA刺激的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖作用的抑制實(shí)-驗(yàn)，SH-TdR法觀察兩種 不同來源螺蜞菊內(nèi)酯對(duì)ConA刺激的T細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果(見圖11) 顯示天然的以及合成的兩種不同來源的螺蜞菊內(nèi)酯在抑制ConA誘導(dǎo)的 T細(xì)胞增殖活性的量-效關(guān)系上無顯著
權(quán)利要求
1. 蟛蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的藥物用途，其特征在于蟛蜞菊內(nèi)酯及其衍生物結(jié)構(gòu)式為id="icf0001" file="A2007101707070002C1.gif" wi="90" he="37" top= "43" left = "59" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中，R1＝OH，OCH3，OCOCH3中的任意一種基團(tuán)，R2＝OH，OCH3，OCOCH3中的任意一種基團(tuán)，R3＝OH，OCH3，OCOCH3中的任意一種基團(tuán)，R4＝OH，OCH3，OCOCH3中的任意一種基團(tuán)。
2. 根據(jù)權(quán)利1的要求所述的螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的藥物用途， 其特征在于所述的用途是在制備治療'ft性肝炎的藥物中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利1的要求所述的螺蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的藥物用途， 其特征在于所述的用途是在制備治療自身免疫性肝炎的藥物中的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明涉及蟛蜞菊內(nèi)酯及其衍生物的藥物用途，尤其是其在制備治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷型疾病(慢性肝炎或是自身免疫性肝炎)的藥物中的應(yīng)用。中藥墨旱蓮具有保肝作用；通過活性跟蹤分離得到蟛蜞菊內(nèi)酯，從而證實(shí)上述藥理作用是蟛蜞菊內(nèi)酯所起的作用；通過波譜性質(zhì)和理化性質(zhì)來確定蟛蜞菊內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)；蟛蜞菊內(nèi)酯的具有生物活性高選擇性抑制ConA刺激的T淋巴細(xì)胞的增殖、對(duì)外周正常淋巴細(xì)胞無抑制作用、無細(xì)胞毒性。蟛蜞菊內(nèi)酯是中藥保肝護(hù)肝作用的活性成分；以中藥墨旱蓮的活性成分蟛蜞菊內(nèi)酯制備新藥，其優(yōu)點(diǎn)為去粗取精，藥物成分清晰、作用明確、安全有效、質(zhì)量可控、可減少不良反應(yīng)；可大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101259124SQ20071017070
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2007年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月21日
發(fā)明者崔永耀, 徐德鋒, 徐汝明, 李寧麗, 鄧克敏, 陽 陸 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院