專利名稱：含哌可酸的抗糖尿病組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含哌可酸的組合物以及含有該組合物的藥物組合物、食品、補品、飼料。
背景技術：
近年來，伴隨著日本國的飲食生活的歐美化和高熱量化、車輛社會的發(fā)達等引起的運動不足、以及高齡化現(xiàn)象，糖尿病患者急劇增加。2002年日本厚生勞動省進行的糖尿病實際情況調(diào)查中，指出“嚴重疑為糖尿病的人”約有740萬人，再加上“不能排除糖尿病的可能性的人”的話，高達約1620萬人。該現(xiàn)狀在生活習慣病的對策方面已成為重大的社會、醫(yī)療問題(非專利文獻1)。
作為糖尿病的治療劑，使用促進胰島素分泌的磺酰脲類制劑、抑制餐后高血糖的α-葡糖苷酶抑制劑、或者最近使用改善胰島素抵抗性的噻唑烷類制劑，然而，這些醫(yī)療用合成制劑由于需要開處方，因此不能容易地獲得，不僅如此，制劑的投入或服用有時會伴隨各種副作用(非專利文獻2、3)。因此，要求容易獲取且盡可能減少副作用的得自天然的物質(zhì)作為用于治療糖尿病的抗糖尿病劑，難消化性糊精及其它天然提取物受到矚目(非專利文獻4、專利文獻1、2)。但是，這些物質(zhì)幾乎都是通過抑制糖的吸收來抑制血糖上升的，因此，不僅無法直接改善體質(zhì)，而且有時會引起下痢或便秘等給消化器官帶來不良影響。因此，期望副作用更少、直接作用于病情改善的抗糖尿病劑。
報道指出動脈硬化是由糖尿病(高血糖、胰島素抵抗性)、高血脂癥或內(nèi)臟脂肪的蓄積等被稱為代謝綜合癥的生活習慣病引起的，已知動脈硬化的發(fā)展會引發(fā)心肌梗塞或腦梗塞。這兩種疾病導致的死亡占日本人死亡原因的31.0％，比癌癥導致的死亡比例28.5％更高，迫切希望開發(fā)出能夠預防、改善動脈硬化的抗動脈硬化劑。例如，已知米糠中所包含的三萜烯醇、作為各種植物甾醇的阿魏酸酯的總稱的γ-orizanol是通過降低血中脂質(zhì)來顯示出抗動脈硬化作用的(專利文獻3)。另外，由于桉樹屬植物的提取物顯示出抗肥胖作用，從而可以預測起到抗動脈硬化作用(專利文獻4)。
已知哌可酸是在哺乳類的體內(nèi)由賴氨酸生物合成的氨基酸的一種，在被廣泛食用的各種植物特別是菜豆屬(phaseolus sp)中也大量含有哌可酸(非專利文獻5、6、7)。另外，其代謝途徑與賴氨酸代謝基本上相同，最終在TCA循環(huán)中代謝至CO2(非專利文獻8)。如上所述，哌可酸是內(nèi)因性的物質(zhì)，其被廣泛食用，并且其代謝途徑也與賴氨酸代謝相似，因此可以認為具有非常高的安全性。
另一方面，報道指出哌可酸的L型異構(gòu)體在人體中被腎臟再吸收、其血中濃度得以維持(非專利文獻5)。然而，并不清楚哌可酸是否作為內(nèi)因性調(diào)節(jié)因子具體參與到生物體組織中，而且，完全沒有發(fā)現(xiàn)哌可酸對糖尿病有效果的認識。進一步，從食品中攝取得到的哌可酸的量即便高估也只有每日15mg/kg體重，因此可容易第推測出與本發(fā)明相比在量上明顯少。
日本特開2002-316938號公報[專利文獻2]日本特開2001-181194號公報[專利文獻3]日本特開昭60-248611號公報[專利文獻4]日本特開2001-270833號公報[非專利文獻1]糖尿病實際情況調(diào)查報告書。日本厚生勞動省、2002 “Acta anaesthesiologica Scandinavica”47；221-225(2003)[非專利文獻3]“Diabetes”52；2249-2259(2003)[非專利文獻4]“Journal of nutritional food”6；89-98(2003)[非專利文獻5]“Clinica Chimica Acta”287；145-156(1999)[非專利文獻6]“Journal of Chromatography A”708；131-141(1995)[非專利文獻7]“Journal of agricultural and foodchemistry”34；282-284(1986)[非專利文獻8]“Biochimica et Biophysica Acta”675；411-415(1981)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供一種組合物，其含有作為生物體內(nèi)內(nèi)因性物質(zhì)的被廣泛食用的成分。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了哌可酸的投入可以改善正常大鼠以及肥胖模型、糖尿病病理模型大鼠的耐糖能力、胰島素抵抗性，減少血中中性脂肪和內(nèi)臟脂肪的蓄積，基于這樣的見解，完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物以每日的投入量為20mg/kg體重～2000mg/kg體重的量含有哌可酸。
本發(fā)明還提供一種組合物，其用于抑制血糖值上升或降低血糖值、增進胰島素感受性或改善胰島素抵抗性、抑制血中脂質(zhì)的上升或降低血中脂質(zhì)、抑制內(nèi)臟脂肪蓄積或減少已蓄積的內(nèi)臟脂肪、或者預防、減輕或治療糖尿病、動脈硬化、肥胖或高血壓，其中，所述組合物含有哌可酸。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其含有上述組合物。
本發(fā)明還提供一種食品，其含有上述組合物。
本發(fā)明還提供一種補品，其含有上述組合物。
本發(fā)明還提供一種飼料，其含有上述組合物。
本發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種組合物，其毒性低、直接且有效地預防、減輕或治療上述糖尿病等病患或病情。


圖1是表示在試驗1中進行的糖負荷試驗的結(jié)果的圖。(A)表示糖負荷后的血糖值變化及其濃度曲線下面積、(B)表示糖負荷后的血中胰島素濃度變化。圖中所示的P值表示相比于對照組的危險率。
圖2是表示在試驗2中進行的糖負荷試驗的結(jié)果的圖。(A)表示糖負荷后的血糖值變化及其濃度曲線下面積、(B)表示糖負荷后的血中胰島素濃度變化。*和#分別表示對應的組間危險率存在顯著性差異，P＜0.05、P＜0.01。
圖3A是表示在試驗3中進行的糖負荷試驗的結(jié)果的圖。(A)表示試驗食物供給后第2周的糖負荷后的血糖值和血中胰島素濃度變化、它們的濃度曲線下面積。*和#分別表示與對照組相比危險率存在顯著性差異，P＜0.05、P＜0.01。另外，圖中所示的P值表示相比于對照組的危險率。
圖3B是表示在試驗3中進行的糖負荷試驗的結(jié)果的圖。(B)表示第8周的糖負荷后的血糖值和血中胰島素濃度變化、它們的濃度曲線下面積。*和#分別表示與對照組相比危險率存在顯著性差異，P＜0.05、P＜0.01。另外，圖中所示的P值表示相比于對照組的危險率。
圖4是表示在試驗3的第9周進行的胰島素抵抗性試驗的結(jié)果的圖。在0分投入0.5U/kg體重的胰島素，研究胰島素引起的血糖降低作用是否被增強。*表示與對照組相比危險率存在顯著性差異，P＜0.05。
圖5是表示試驗3的尸體剖檢時的各種器官重量的結(jié)果。給出每100g體重的重量。另外，這些重量只是體右側(cè)的重量。#表示與對照組相比危險率存在顯著性差異，P＜0.01。
圖6是表示試驗4中在供給哌可酸的第5周測定的斷食時血中甘油三酯、血中總膽固醇和血中游離脂肪酸的圖。
圖7是表示試驗4中在供給哌可酸的第5周摘取的肝臟中的總脂質(zhì)、甘油三酯、總膽固醇的圖。圖中所示的P值表示相比于對照組的危險率。
具體實施例方式
作為可以在本發(fā)明中使用的哌可酸，可以列舉出L型哌可酸、D型哌可酸、以及哌可酸衍生物。
在本發(fā)明中使用的哌可酸衍生物是指哌可酸甜菜堿本身或者生理學上可接受的成為哌可酸、哌可酸甜菜堿的來源的化合物。
生理學上可接受的成為哌可酸、哌可酸甜菜堿的來源的化合物包含以下化合物。
包含哌可酸、哌可酸甜菜堿作為構(gòu)成要素的肽；(丙氨酰-哌可酸、γ-谷氨酰-哌可酸等包含哌可酸、哌可酸甜菜堿的低聚肽)哌可酸烷基酯或烯基酯或芳烷基酯；哌可酰胺；哌可酸烷基酰胺或烯基酰胺或芳烷基酰胺；
哌可酸二烷基酰胺；N-?；?哌可酸；N-?；?哌可酸烷基酯；N-?；?哌可酰胺；N-?；?哌可酸烷基酰胺；N-酰基-哌可酸二烷基酰胺；哌可酸甜菜堿烷基酯或烯基酯或芳烷基酯；哌可酸甜菜堿酰胺；哌可酸甜菜堿烷基酰胺或烯基酰胺或芳烷基酰胺；哌可酸甜菜堿二烷基酰胺。
其中，烷基的碳原子數(shù)為1～22、烯基的碳原子數(shù)為2～22、芳烷基的碳原子數(shù)為7～22、?；奶荚訑?shù)為碳原子數(shù)1～22。具有二烷基的情況下，各個烷基的碳原子數(shù)可以相同也可以不同。
在本發(fā)明中使用的哌可酸可以是游離體、鹽、以及溶劑化物的任一形式。作為鹽，例如，相對于式中的羧基可以列舉出銨鹽、與鈉、鉀等堿金屬的鹽、與鈣、鎂等堿土類金屬的鹽、鋁鹽、鋅鹽、與三乙胺、乙醇胺等有機胺的鹽，相對于堿性基團可以列舉出與鹽酸、硫酸、磷酸等無機酸的鹽、與醋酸、檸檬酸、安息香酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸等有機羧酸的鹽、與甲烷磺酸、對甲苯磺酸等有機磺酸的鹽。作為溶劑化物，可以列舉出水合物、醇合物等。另外，哌可酸可以是L體、D體、DL體、以及L體與D體的任意比例的混合物的任意一種。哌可酸可以并用上述物質(zhì)的兩種以上，這是不言而喻的。
另外，本發(fā)明組合物中的哌可酸的含量是每日投入量為20mg/kg體重～2000mg/kg體重、優(yōu)選為50mg/kg體重～1000mg/kg體重的量。當每日投入量少于20mg/kg體重時，不能充分顯示出所期望的作用，當每日投入量多于2000mg/kg體重時，從表現(xiàn)出毒性這一觀點來看存在問題。
本發(fā)明的組合物所優(yōu)選的投入方法(攝取方法)是經(jīng)口攝取，另外，還優(yōu)選數(shù)日間連續(xù)攝取。
本發(fā)明的組合物可以用于抑制血糖值上升或降低血糖值、增進胰島素感受性或改善胰島素抵抗性、抑制血中脂質(zhì)的上升或降低血中脂質(zhì)、抑制內(nèi)臟脂肪蓄積或減少已蓄積的內(nèi)臟脂肪、或者用于預防、減輕或治療糖尿病、動脈硬化、肥胖或高血壓。特別是可以優(yōu)選用于預防、減輕或治療動脈硬化以及動脈硬化癥、肥胖、高血壓、以及糖尿病性并發(fā)癥。另外，尤其在II型糖尿病中抑制餐后的血糖上升或改善胰島素抵抗性等方面發(fā)揮優(yōu)異的效果。另外，還可以降低內(nèi)臟脂肪和血中脂質(zhì)。
本發(fā)明的組合物，除了藥物組合物形式之外，還可以采用標注了用于預防、減輕或治療上述疾患或病情的食品、健康食品、補品、營養(yǎng)組合物或飼料等形式。
在藥物組合物形式的情況下，可以混合藥學上可接受的載體或稀釋劑，例如羧甲基纖維素、乙基纖維素等纖維素衍生物，馬鈴薯淀粉、玉米淀粉等淀粉類，乳糖、蔗糖等糖類，花生油、玉米油、芝麻油等植物性油，聚乙二醇、藻酸、明膠、滑石等，可以制成片劑、散劑、丸劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑等口服劑，皮下注射劑、靜脈內(nèi)注射劑、肌肉內(nèi)注射劑、硬膜外腔注射劑、蛛網(wǎng)膜下腔注射劑等注射劑，經(jīng)鼻給藥制劑、經(jīng)皮制劑、軟膏劑等外用劑，直腸栓劑、陰道栓劑等栓劑，點滴劑等的劑型。
本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)口或非經(jīng)口地投入，例如可以經(jīng)腸投入、經(jīng)靜脈投入。
在食品形式的情況下，還可以使用適當?shù)奶砑觿?，利用通常的方法調(diào)制。作為這樣的添加劑，可以列舉出調(diào)整改良味道的果汁、糊精、環(huán)狀低聚糖、糖類(果糖、葡萄糖、糖漿、蔗糖)、酸味料、香料、粉末茶、油脂，改善質(zhì)地的乳化劑、膠原、全脂奶粉、增稠多糖類、瓊脂(凝膠飲料的情況)等通常用作健康食品成分的物質(zhì)。
本發(fā)明的食品還可以通過進一步配合氨基酸、維生素、蛋殼鈣、泛酸鈣、其它礦物質(zhì)類、蜂王漿、蜂膠、蜂蜜、食物纖維、傘菌類、殼多糖、脫乙酰殼多糖、辣椒堿、多酚、類胡蘿卜素、脂肪酸、粘多糖、輔酶、抗氧化物質(zhì)等來制成健康食品。
在補品形式的情況下，可以混合乳化劑、色素、香料等，可采用片劑、膠囊狀、液狀等劑型。
本發(fā)明的組合物可以制成豬、牛、羊、狗、貓、小鼠、大鼠、猴子等哺乳動物或者雞、雉、鴕鳥等鳥類的飼料，例如，還可以按照該技術領域中眾所周知的方法，制成飲料用的固體或液體的添加劑。
本發(fā)明的組合物的制品形式?jīng)]有特別限制，只要是通常被使用的能夠攝取氨基酸的形式，就可以是任意形式。作為這樣的形式，如果是經(jīng)口攝取，則可以列舉出使用了適當賦形劑的粉末、顆粒、片劑、液體(飲料、凝膠飲料)、糖果(巧克力等)、或上述1種或2種氨基酸的簡單的混合物。另外，如果是靜脈給藥，則可以列舉出含有上述1種或2種氨基酸的輸液、水溶液、用于使用時調(diào)制的氨基酸粉末。
以下，舉出實施例具體說明本發(fā)明。在此使用的分析方法是糖負荷試驗和胰島素抵抗性試驗，這些是用于判斷糖尿病或胰島素抵抗性的通常使用的方法，從藥理學和生物學的觀點出發(fā)是恰當?shù)姆椒?。此次全部的結(jié)果均以平均值±標準誤差來表示。另外，在統(tǒng)計分析中，對于各個測定項目，使用Tukey-Kramer的多重鑒定來進行全部試驗組間的平均值的鑒定。
實施例下面，根據(jù)試驗例對本發(fā)明進行更詳細的說明。
試驗例1(對正常大鼠供給4周的哌可酸時的糖負荷后血糖變化的確認)(1)試驗的概要以正常大鼠為對象，研究通過對其供給4周哌可酸，是否能夠抑糖負荷后的血糖上升。
(b)使用9周齡的SD系雄性大鼠，開始進行實驗。
(c)將24只正常大鼠分成3個組(各組8只)以使斷食時血糖和體重一樣，分別向各組供給4周添加了0％、0.2％或0.4％D，L型哌可酸的飼料。然后斷食17小時，按照2g/kg體重的量經(jīng)口投入10％葡萄糖溶液。測定投入后0、15、30、60以及120分鐘的血糖值和血中胰島素濃度。
(d)供給添加了0.2％和0.4％D，L型哌可酸的飼料的組，能夠抑制糖負荷后的血糖上升。特別是在0.4％添加組中，降低了血糖顯著上升的30分鐘以及60分鐘的血糖。然而，血中胰島素濃度在任一個組的任一時間中都沒有改變。(參考圖1)(e)從上述結(jié)果可以確認哌可酸在不影響血中胰島素濃度的前提下抑制血糖值的上升。可以認為這是胰島素感受性被增進的結(jié)果。因此，正如本發(fā)明所言，可以認為供給哌可酸具有抑制糖負荷后的血糖上升和改善胰島素抵抗性的效果。
(2)試驗的詳細內(nèi)容(a)各組的組成示于下述表1。
表1


(b)飼料調(diào)制向市售飼料(Oriental Yeast公司CRF-1)中少量連續(xù)混合D，L型哌可酸(Aldrich公司)，再使用萬能混合攪拌機(Dalton公司制造)混合5分鐘。
(c)動物飼養(yǎng)從日本CHARLES RIVER購入24只(3個試驗區(qū)×8只)7周齡的SD系雄性大鼠，在12小時的明暗循環(huán)(7:00-19:00)、室溫25℃的動物飼養(yǎng)室中分開飼養(yǎng)。2周的馴化后，以體重和斷食時血糖為基礎分成3個組，供給4周上述飼料。在此期間的星期一、星期三、星期五，測定體重和攝食量，并追加飼料。經(jīng)過4周后，進行糖負荷試驗。
(d)糖負荷試驗在前一日的17點開始斷食，在當日的10點按照2g/kg體重的量經(jīng)口投入10％葡萄糖溶液。在投入后的0、15、30、60以及120分鐘進行采血，測定血糖值和血中胰島素濃度。血糖值是使用動物用生化自動分析裝置(Fuji Photo Film Co.Ltd.制造，F(xiàn)uji DriChem 5500)在采血后立即測定的。另外，血中胰島素濃度是以離心機(日立公司制造，himac CF15D)離心所采集的血液，取出血漿，使用胰島素測定試劑盒(森永生化研究所)來進行測定的。結(jié)果示于圖1。(A)表示血糖值變化和其濃度曲線下面積、(B)表示血中胰島素濃度變化。
試驗例2(對肥胖鼠供給了4周哌可酸時的糖負荷后血糖變化的確認)(1)試驗的概要(a)報道指出通過高脂肪食物負荷而制作的肥胖模型大鼠表現(xiàn)出胰島素抵抗性，并顯示出高胰島素血癥。于是，以該肥胖模型大鼠為對象，研究了通過對其供給4周D，L型哌可酸，是否能夠抑制糖負荷后的血糖和血中胰島素濃度的上升。
(b)使用6周齡的SD系雄性大鼠開始實驗。
(c)將48只大鼠分成2個組以使其斷食時血糖和體重一樣，供給3周通常食物或高脂肪食物(模型制造期)。然后，再以斷食時血糖和斷食時血中胰島素濃度、體重為基礎，進一步分成3個組(共計6個組)，供給4周在通常食物或高脂肪食物中添加了0％、0.2％、0.4％D，L型哌可酸的飼料(試驗期)。供給4周后斷食17個小時，按照2g/kg體重的量經(jīng)口投入10％葡萄糖溶液。測定投入后0、15、30、60以及120分鐘的血糖值和血中胰島素濃度。
(d)相比于通常飲食組，高脂肪飲食組可以確認糖負荷后的血糖上升延遲和血中胰島素濃度變高，這與公知的事實、報告一致。但是，在高脂肪食物中添加了D，L型哌可酸的組中，糖負荷后的血糖上升基本上沒有被抑制，不過，血中胰島素濃度降低到與通常飲食組相同的程度。(參考圖2)(e)總結(jié)以上結(jié)果，哌可酸在高脂肪食物負荷肥胖模型大鼠中，基本上沒有抑制血糖上升的效果，但可以顯著地降低血中胰島素濃度。這被認為是由于哌可酸在肥胖模型大鼠中改善了胰島素抵抗性的結(jié)果。
(2)實驗的詳細內(nèi)容(a)各組的組成示于下述表2。
表2


(b)試驗日程

(c)飼料調(diào)制通常食物和高脂肪食物的組成示于下述表3。向這些飼料中混合0.2或0.4％的D，L型哌可酸(Aldrich公司)，制作通常飲食或高脂肪飲食+哌可酸飼料。
表3


(d)動物飼養(yǎng)從日本CHARLES RIVER購入48只(6個試驗區(qū)×8只)5周齡的SD系雄性大鼠，在12小時的明暗循環(huán)(7:00-19:00)、室溫25℃的動物飼養(yǎng)室中分開飼養(yǎng)。1周的馴化后，以體重和斷食時血糖為基礎分成2個組，一方供給通常食物，另一方供給高脂肪食物(模型制作期)。在經(jīng)過了3周的時點，進一步將各組分成3個組(共計6個組)以使其體重、斷食時血糖和血中胰島素濃度一樣，供給4周在通常食物或高脂肪食物中添加了0％、0.2％、0.4％的D，L型哌可酸的飼料(試驗期)。從模型制作期到試驗期結(jié)束為止的整個期間的星期一、星期三、星期五，測定體重和攝食量，并追加飼料。在試驗結(jié)束的時點，進行糖負荷試驗。
(d)糖負荷試驗在前一日的17點開始斷食，在當日的10點按照2g/kg體重的量經(jīng)口投入10％葡萄糖溶液。在投入后的0、15、30、60以及120分鐘進行采血，測定血糖值和血中胰島素濃度。血糖值是使用動物用生化自動分析裝置(Fuji Photo Film Co.Ltd.制造，F(xiàn)uji DriChem 5500)在采血后立即測定的。另外，血中胰島素濃度是以離心機(日立公司制造，himac CF15D)離心分離所采集的血液，取出血漿，使用胰島素測定試劑盒(森永生化研究所)來進行測定的。結(jié)果示于圖2。(A)表示血糖值變化和其濃度曲線下面積、(B)表示血中胰島素濃度變化和其濃度曲線下面積。
試驗例3(哌可酸對II型糖尿病模型小鼠的病情變化的效果)(1)試驗的概要(a)以II型糖尿病模型小鼠為對象，研究了D，L型哌可酸帶來的病情的改善效果。
(b)使用II型糖尿病模型的KK-Ay雄性小鼠，開始實驗。
(c)以體重、糖負荷時的血糖值和血中胰島素濃度變化為基礎，將24只KK-Ay小鼠分成3個組，向各組供給10周添加了0、0.4或0.8％D，L型哌可酸的飼料。從試驗開始起第2周和第8周測定糖負荷后的血糖值、血中胰島素濃度。另外，在第9周進行胰島素耐性試驗，在第10周進行尸體剖檢，測定副睪丸脂肪和腎周圍脂肪重量。
(d)與未添加的組相比，添加了0.4％的D，L型哌可酸的組在第二周的糖負荷試驗中血糖上升得到了抑制，但在第8周沒有發(fā)現(xiàn)強的抑制血糖上升的作用。然而，添加了0.8％的D，L型哌可酸的組直到第8周還能確認其抑制糖負荷后的血糖上升的效果。
(參考圖3)另外，在第9周進行的胰島素抵抗性試驗中，添加了0.8％的D，L型哌可酸的組相比于未添加組，促進了投入胰島素后的血糖降低。(參考圖4)可確認尸體剖檢中所采集的副睪丸脂肪和腎周圍脂肪的重量通過添加0.8％的D，L型哌可酸而降低了。(參考圖5)(e)哌可酸(特別是添加0.8％)在糖負荷試驗和胰島素抵抗性試驗中顯示出改善糖尿病病情的結(jié)果，因而啟示了其對II型糖尿病的預防、治療有效果。另外，作為內(nèi)臟脂肪的副睪丸脂肪和腎周圍脂肪的蓄積是肥胖的原因，同時也是引起動脈硬化的危險因子之一，因此，可減少其重量的哌可酸被認為也具有抗肥胖和抗動脈硬化的效果。
(2)實驗的詳細內(nèi)容(a)各組的組成示于下表4。
表4

(b)飼料調(diào)制向市售飼料(Oriental Yeast公司CRF-1)中少量連續(xù)混合D，L型哌可酸(Aldrich公司)，再使用萬能混合攪拌機(DALTON公司制造)混合5分鐘。
(c)動物飼養(yǎng)從日本Clea(株)購入24只5周齡的KK-Ay雄性小鼠，在12小時的明暗循環(huán)(7:00-19:00)、室溫25℃的動物飼養(yǎng)室中分開飼養(yǎng)。測定糖負荷時的血糖值和血中胰島素濃度，以這些值為基礎，將KK-Ay小鼠分成3個組。2周的馴化后，供給10周上述飼料。在第2周和第8周實施糖負荷試驗，測定糖負荷后的血糖值、血中胰島素濃度。在第9周進行胰島素抵抗性試驗，研究了在各組中的胰島素耐性。另外，在第10周進行尸體剖檢，測定副睪丸脂肪和腎周圍脂肪重量，確認了哌可酸對內(nèi)臟脂肪重量的效果。
(d)糖負荷試驗在前一日的20點開始斷食，在當日的10點按照1g/kg體重的量經(jīng)口投入10％葡萄糖溶液。在投入后的0、30、60、120、180以及240分鐘進行采血，測定血糖值和血中胰島素濃度。血糖值是使用動物用生化自動分析裝置(Fuji PhotoFilm Co.Ltd.制造，F(xiàn)uji DriChem 5500)在采血后立即測定的。另外，血中胰島素濃度是以離心機(日立公司制，himac CF15D)離心分離所采集的血液，取出血漿，使用胰島素測定試劑盒(森永生化研究所)來進行測定的。結(jié)果示于圖3。(A)表示第2周的血糖值、血中胰島素濃度變化和其濃度曲線下面積、(B)表示第8周的血糖值、血中胰島素濃度變化和其濃度曲線下面積。
(e)胰島素抵抗性試驗從前一日的18點開始斷食，在當天的10點按照0.5U/kg體重的量皮下投入胰島素(Insulin)。在投入后的0、30、60、120以及180分鐘進行采血，使用動物用生化自動分析裝置(Fuji Photo Film Co.Ltd.制造，F(xiàn)uji Dri Chem 5500)測定血糖值。結(jié)果示于圖4。
(f)尸體剖檢從前一日的18點開始斷食，從當天的10點開始進行尸體剖檢。取出副睪丸脂肪和腎周圍脂肪，測定其濕重。結(jié)果示于圖5。
試驗例4(哌可酸對II型糖尿病模型小鼠的血中和肝臟中的脂質(zhì)濃度的效果)(1)試驗的概要(a)以II型糖尿病模型小鼠為對象，研究了D，L型哌可酸對血中脂質(zhì)和肝臟中脂質(zhì)帶來的影響。
(b)使用6周齡的KK-Ay雄性小鼠開始實驗。
(c)將16只KK-Ay雄性小鼠以體重為基礎分成2個組，向各組供給5周添加了0、1.6％的D，L型哌可酸的飼料。在第5周斷食，進行采血和肝臟的采集，測定斷食時血中甘油三酯、斷食時血中總膽固醇、斷食時血中游離脂肪酸、肝臟中總脂質(zhì)、肝臟中甘油三酯、肝臟中總膽固醇。
(d)添加了1.6％的D，L型哌可酸的組相比于對照組，血中甘油三酯以及血中游離脂肪酸、肝臟中總脂質(zhì)、肝臟中甘油三酯以平均值計減少了約20％左右(參考圖6、7)。關于肝臟中的總脂質(zhì)，可以確認其與哌可酸添加量顯著相關。
(e)在該試驗中，哌可酸可以減少已知為胰島素抵抗性誘發(fā)因子的肝臟中的脂質(zhì)和血中游離脂肪酸，因此，哌可酸具有胰島素感受性的增進效果的可能性高。另外，向飼料中添加哌可酸，也減少了作為動脈硬化的危險因子的血中甘油三酯，因此，若結(jié)合考慮前述試驗的抑制內(nèi)臟脂肪蓄積，可以認為向飼料中添加哌可酸對預防、治療動脈硬化方面具有復合效果。另外，由于動脈硬化是高血壓的主要原因之一，因而啟示了哌可酸在預防、治療高血壓方面也有效果。
(2)實驗的詳細內(nèi)容(a)各組的組成示于下表5。
表5

(b)飼料調(diào)制向市售飼料(Oriental Yeast公司CRF-1)中少量連續(xù)混合D，L型哌可酸(Aldrich公司)，再使用萬能混合攪拌機(DALTON公司制造)混合5分鐘。
(c)動物飼養(yǎng)從日本Clea購入16只(2個試驗區(qū)×8只)4周齡的KK-Ay雄性小鼠，在12小時的明暗循環(huán)(7:00-19:00)、室溫25℃的動物飼養(yǎng)室中分開飼養(yǎng)。2周的馴化后，以體重為基礎分成2個組，供給5周上述飼料。在這期間的星期一、星期三、星期五測定體重和攝食量，并追加飼料。經(jīng)過5周后，斷食17小時進行采血和摘出肝臟。使用這些試樣測定斷食時血中甘油三酯、斷食時血中總膽固醇、斷食時血中游離脂肪酸、肝臟中總脂質(zhì)、肝臟中甘油三酯、肝臟中總膽固醇。
(d)血中脂質(zhì)的測定以離心機(日立公司制，himac CF15D)離心分離所采集的血液，將所得到的血漿用作試樣。血中甘油三酯和血中總膽固醇是使用動物用生化自動分析裝置(FujiPhoto Film Co.Ltd.制造，F(xiàn)uji DriChem 5500)來進行測定的。另外，血中游離脂肪酸是使用NEFA E-test Wako(和光純藥工業(yè)公司制造)測定的。結(jié)果示于圖6。
(e)肝臟中脂質(zhì)的測定在10ml氯仿/甲醇溶液(2∶1)中，將約0.5g肝臟試樣勻化，提取一晚脂質(zhì)。第二天，使用桐山漏斗除去肝臟殘渣，再次使用氯仿/甲醇溶液裝滿到10ml。向其中加入2ml的生理食鹽水，使用振蕩器(Yayoi公司制，model YS-8D)攪拌10分鐘。然后，靜置2小時以上，吸取上清液，再次以氯仿/甲醇溶液裝滿到10ml。將其中的5ml用離心蒸發(fā)器濃縮干燥并測定重量，將此作為肝臟中總脂質(zhì)。
另外，肝臟中甘油三酯和總膽固醇是如下測定的使用將40μl上述脂質(zhì)提取液干燥后重新溶解在含1％Triton X-100的異丙醇中得到的溶液，利用甘油三酯E-test Wako和游離膽固醇E-test Wako(和光純藥工業(yè)公司制造)來進行測定。結(jié)果示于圖7。
權利要求
1.一種組合物，該組合物以每日的投入量為20mg/kg體重～2000mg/kg體重的量含有哌可酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，哌可酸的每日的投入量為50mg/kg體重～1000mg/kg體重。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的組合物，其中，所述哌可酸選自L-哌可酸、D-哌可酸以及L或D-哌可酸衍生物所組成的組中。
4.一種組合物，其用于抑制血糖值上升或降低血糖值、增進胰島素感受性或改善胰島素抵抗性、抑制血中脂質(zhì)的上升或降低血中脂質(zhì)、抑制內(nèi)臟脂肪蓄積或減少蓄積了的內(nèi)臟脂肪、或者預防、減輕或治療糖尿病、動脈硬化、肥胖或高血壓，其中，所述組合物含有哌可酸。
5.一種藥物組合物，其含有權利要求1～4任一項所述的組合物。
6.一種食品，其含有權利要求1～4任一項所述的組合物。
7.一種補品，其含有權利要求1～4任一項所述的組合物。
8.一種飼料，其含有權利要求1～4任一項所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種組合物，其含有作為生物體內(nèi)內(nèi)因性物質(zhì)的被廣泛食用的成分。根據(jù)本發(fā)明提供一種組合物，該組合物以每日的投入量為20mg/kg體重～2000mg/kg體重的量含有哌可酸。本發(fā)明的組合物可以用于糖尿病的治療等。
文檔編號A61P3/10GK101045055SQ20071008698
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權日2006年3月29日
發(fā)明者高木智, 中野敬, 太田史生, 宮澤由紀, 佐藤弘之 申請人:味之素株式會社