專利名稱：：含穿心蓮內(nèi)酯衍生物的藥物組合物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以下述通式化合物為活性成分的藥物組合物及其制備方法，具體為乳劑及其制備，及此藥用組合物在制藥中的用途。1896年Boorsma從穿心蓮中首次分離出一種無色結(jié)晶物，1911年經(jīng)Gorter結(jié)構(gòu)鑒定為二萜內(nèi)酯類化合物，被命名為androgrAPholide，中文名稱穿心蓮內(nèi)酯，又稱穿心蓮乙素，是穿心蓮的主要化學(xué)成分之一。穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎、解熱、抗病毒、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抑制NF-icB、抗腫瘤等藥理活性。但穿心蓮內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)決定穿心蓮內(nèi)酯化學(xué)性質(zhì)較不穩(wěn)定和相對活潑的特點韓光.穿心蓮的超分子提取和穿心蓮內(nèi)酯衍生物的合成及活性研究.遼寧中醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文.2005(6)。如穿心蓮內(nèi)酯在堿性條件下不穩(wěn)定，且隨著堿性的增加其不穩(wěn)定性增強(qiáng)；其最穩(wěn)定的pH值為35，但在該酸性條件下溶解性較差。該特點使得將穿心蓮內(nèi)酯直接開發(fā)為新藥具有一定的缺陷性。故近年來許學(xué)學(xué)者皆致力于穿心蓮內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)改造，以期改善該化合物自身的缺陷。如我國藥物化學(xué)工作者對穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，而成功開發(fā)的穿心蓮內(nèi)酯衍生物穿琥寧注射液(脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯單鉀鹽滅菌水溶液)、炎琥寧注射液(脫水穿心蓮內(nèi)酯-3,19-二琥珀酸半酯單鉀鈉鹽水物)、蓮必治注射液(穿心蓮內(nèi)酯與亞硫酸氫鈉作用而制得的單體化合物滅菌水溶液)、喜炎平注射液(穿心蓮總內(nèi)酯磺酸鹽)治療上呼吸道感染、肺炎等皆取得顯著的臨床療效。但上述幾個衍生物卻存在著穩(wěn)定性差、質(zhì)量難控、不良反應(yīng)發(fā)生率高、配伍禁忌多等問題。其中尤以過敏性不良反應(yīng)發(fā)生率較高的問題較為嚴(yán)重張立華.穿琥寧的不良反應(yīng)分析及措施.中國新醫(yī)藥.2004(3):67—69;李杰，陳敏.炎琥寧致急性呼吸窘迫癥1例.江蘇藥學(xué)與臨床研究.2004(增刊)朱磊.喜炎平注射液和青霉素、頭孢拉定在兩種輸液
背景技術(shù)：
：中配伍前后微粒的變化.遼寧藥物與臨床.2002(4):199—200。究其原因我們認(rèn)為上述穿心蓮內(nèi)酯衍生物在形成衍生物的過程'中產(chǎn)生許多中間體，使其衍生物的成份復(fù)雜多變，從而其制成注射劑后穩(wěn)定性差，有效成份的含量測定困難，質(zhì)量難控。且由于衍生物及其中間體復(fù)雜多變而導(dǎo)致過敏性不良反應(yīng)發(fā)生率高，并使其在與抗生素配伍過程中出現(xiàn)沉淀等。國內(nèi)上市的穿心蓮內(nèi)酯衍生物的上述問題嚴(yán)重妨礙該類藥物的臨床應(yīng)用。而國外的許多學(xué)者亦以穿心蓮內(nèi)酯為原料衍生出大量的化合物，其中以印度科學(xué)家NanduriS為代表。該課題組近年來合成了上百種穿心蓮內(nèi)酯衍生物，并對其進(jìn)行抗腫瘤、調(diào)節(jié)代謝、調(diào)節(jié)免疫等活性篩選PCT公開號WO01S5710，獲得許多有價值的化合物，但卻未發(fā)現(xiàn)對該類化合物進(jìn)行深入的藥劑學(xué)研究報告。一氧化氮參與機(jī)體許多生理和病理過程，參與巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒和免疫調(diào)節(jié)、松馳血管平滑肌、抑制血小板聚集和傳遞神經(jīng)信息等。一氧化氮生成過量或不足在許多疾病的發(fā)生中皆起著重要作用。其中一氧化氮生成過量可見于骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、全身炎性反應(yīng)綜合征、膿毒血癥、感染性休克、腦梗塞、高血壓、心肌梗塞、充血性心力衰竭、腎小球腎炎、肝硬化、炎癥性腸病、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征、血管性頭痛、哮喘、腫瘤余躍.一氧化氮與疾病.北京；科學(xué)出版社。故開發(fā)可以抑制一氧化氮生成過量的新藥具有重要的臨床意義。國內(nèi)外的學(xué)者們雖然獲得大量穿心蓮內(nèi)酯衍生物，但卻未發(fā)現(xiàn)對該類化合物進(jìn)行深入的藥劑學(xué)研究報告。由于下述通式化合物(I)的水溶性極差，為了解決其注射給藥問題，我們發(fā)明以通式化合物(I)為活性成份的乳劑組合物。其中Ri、R2選自乙?；?、羥基、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈烷酰基、鏈烯?；?、芳?；?，雜芳?；騌i和R2被異亞丙基取代，Rs選自氫或鹵素。通式化合物(I)在大豆油等長鏈油中溶解度很小，不能達(dá)到臨床應(yīng)用要求；通式化合物(I)在中鏈油中有較好的溶解度，但由于中鏈油(MCT)不含人體必需的a-亞麻酸和亞油
發(fā)明內(nèi)容酸，而必須有長鏈油(LCT)來補(bǔ)充，這就使中鏈油(MCT)單獨使用不好唐云.脂肪乳劑與多不飽和脂肪酸的代謝.國外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊，i994(6):322-324，因此本發(fā)明采用中鏈油和長鏈油的混合油作為油相載體；本發(fā)明對長鏈油和中鏈油的比例進(jìn)行了篩選，確定了長鏈油和中鏈油的最佳比例，既能使通式化合物(I)溶解度達(dá)到臨床治療有效量，又能制成質(zhì)量穩(wěn)定并符合臨床用藥安全的乳劑。通過對上述通式化合物(I)為活性成份的乳劑組合物的藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，該乳劑組合物不但解決注射給藥問題，還取得以下意想不到的效果上述通式化合物(I)的體內(nèi)藥理活性與劑型關(guān)系密切，即簡單地將該通式化合物(I)混懸后口服，動物體內(nèi)抗炎活性較差甚至無活性，而將其制成乳劑后，不但解決注射給藥問題，而且無論口服給藥還是注射給藥，其動物體內(nèi)抗炎活性皆得到顯著性提高。具體技術(shù)方案如下-一種通式化合物(I)的藥物組合物，含治療有效量的通式化合物(I)及藥學(xué)上所說口服或靜脈給藥乳劑制劑的輔料。較優(yōu)選的藥物組合物，所述為口服乳或靜脈乳劑，其組成為治療有效量的通式化合物(I)、藥學(xué)上可作為載體的油、乳化劑和水；其配比為每lOOtnl乳劑含通式化合物(I)0.013.0g、油520g、乳化劑0.55g，油酸0.02-0.2g,等滲調(diào)節(jié)劑2.03.Og，余量為水。上面所述的藥物組合物，其特征在于，所述油為藥學(xué)上作為載體的油，由中鏈油與長鏈油以中鏈油比長鏈油重量比為h0.25的比例組成。更優(yōu)選的乳劑組合物配比是每100ml乳劑組合物含通式化合物(I)0.1lg、中鏈油215g、長鏈油310g、乳化劑0.83.0g，油酸0.02-0.2g，等滲調(diào)節(jié)劑2.03.Og，余量為水。再優(yōu)選的乳劑組合物配比是每100ml乳劑組合物含通式化合物(I)0.1lg、中鏈油28g、長鏈油38g、乳化劑1.22.4g，油酸0.02-0.lg，等滲調(diào)節(jié)劑2.03.Og，余量為水。本發(fā)明所述通式化合物(I)具體亦可如下列通式(II):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中X選自氫或鹵素。其中特別有用的化合物包括3，19一異亞丙基一14一乙酰穿心蓮內(nèi)酯、7—氯一3，19—異亞丙基一14一乙酰穿心蓮內(nèi)酯。本發(fā)明所述通式化合物(I)具體亦可如下列通式(m):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中Ri、R2選自乙?；?、羥基、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈烷酰基、鏈烯?；?、芳?；?，雜芳?；琑3選自氫或鹵素。其中特別有用的化合物包括3，14，19一三乙酰穿心蓮內(nèi)酯、14，19一二乙酰穿心蓮內(nèi)酯、14—乙酰穿心蓮內(nèi)酯、7—氯一3，14，19—三乙酰穿心蓮內(nèi)酯。本發(fā)明所述的通式化合物(I)中的具體代表性化合物是由穿心蓮內(nèi)酯經(jīng)化學(xué)合成獲得，并經(jīng)過純化獲得，含量不低于95%。所述的油是指生物可接受的物質(zhì)，一般指植物油、動物油、合成油或其混合物。長鏈油為植物油或動物油或兩者混合物，所述植物油為大豆油、玉米油、花生油、橄欖油、蓖麻油、棕櫚油、椰子油、菜籽油、芝麻油、棉子油中的一種或它們的混合物，所述動物油為魚油、鯨蠟油或它們的混合物。中鏈油即辛癸酸甘油酯，是半合成的天然功能性油脂，碳鏈長度(VC1C。本發(fā)明所述的乳化劑可以是磷脂類或泊洛沙姆類(如poloxamer188)中的一種或幾種。本發(fā)明所述的乳化劑優(yōu)選大豆磷脂、蛋黃磷脂、氫化磷脂等中的一種或幾中。本發(fā)明所述通式化合物(I)乳劑組合物的等滲調(diào)節(jié)劑為甘油等常規(guī)輔料。前述各項藥物組合物的制備方法為將通式化合物(I)與油混合，加熱至6080'C，攪拌，使溶解為澄明溶液，加入油酸和乳化劑，攪拌，使溶解為澄明溶液，得油相；將等滲劑溶于水中形成水相，加熱至60-8(TC;在高速攪拌下將油相加到水相中形成初乳，所得初乳加水定容后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)乳化，即得。優(yōu)化的制備方法為將含有治療有效量通式化合物(1)、大豆磷脂和/或蛋黃磷脂、中鏈油與長鏈油混合，加熱至708(TC，加入油酸，使溶解為澄明溶液，得油相將甘油溶于水中形成水相，加熱至70-80°C;把含有通式化合物(I)的油相加到水相中用高速攪拌形成初乳，所得初乳加水定容后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后滅菌。含有所述通式化合物(I)的乳劑組合物體外可顯著抑制一氧化氮生成；并且對多種腫瘤細(xì)胞皆具有細(xì)胞毒活性。本發(fā)明提供了上述通式化合物(I)乳劑組合物在制備治療一氧化氮生成過量疾病藥物中的應(yīng)用。其中所述一氧化氮生成過量疾病包括骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、全身炎性反應(yīng)綜合征、膿毒血癥、感染性休克、腦梗塞、高血壓、心肌梗塞、充血性心力衰竭、腎小球腎炎、肝硬化、炎癥性腸病、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征、血管性頭痛、哮喘、腫瘤。本發(fā)明提供的通式化合物(I)乳劑組合物用作治療一氧化氮生成過量疾病的用法用量每人每日0.003-6mg/kg，口服或靜脈注射。下述具體實施方式目的在于進(jìn)一步解釋說明本發(fā)明，并不局限于此。具體實施例方式穿心蓮內(nèi)酯(純度大于98%):購自四川廣漢本草植化有限公司；其余化學(xué)試劑均為市售品(分析純)精制大豆卵磷脂(供注射用)購自上海太偉藥業(yè)有限公司；魚油、精制蛋黃卵磷脂(供注射用)購自上海東尚實業(yè)有限公司；大豆油茶油、玉米油(供注射用)購自鐵嶺北亞藥用油有限公司。制備例l3,19-異亞丙基-14-乙酰穿心蓮內(nèi)酯(簡稱AP5)的制備將5g穿心蓮內(nèi)酯(簡稱AP)、20mL2，2-二甲氧基丙烷及催化量的對甲苯磺酸溶于100mL丙酮中，加熱回流過夜，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層依次用飽和NaHC03和飽和食鹽水洗，無水Na2S04干燥，濃縮，經(jīng)硅膠柱層析得3,19-異亞丙基穿心蓮內(nèi)酯(簡稱AP2)，為白色固體。lgAP2溶于10mLAcA加熱回流2小時，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層依次用水、飽和NaHC03和飽和食鹽水洗，無水Na2SC^干燥。經(jīng)硅膠柱層析得AP5白色固體。分子式為C25H3606。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>化合物確認(rèn)數(shù)據(jù)如下IRvSCcm—1):3435,2932,1740,1642,1383,1227,1096,1024,897,603,466.&(400MHz,CDCI3):S7.03(td,J=6.91,1.49Hz,1H,H-12),5.93(d,J=6.00Hz,1H,H-14),4.90(bs,1H，H-17a),4.56(dd，J=11.68,4.26Hz,1H,H-15a),4.54(bs,1H,H-17b)，4.25(dd,11.26,1.86Hz,1H，H-15b)，3.96(4/=11.60Hz,1H,H-19a)，3.50(dd,/=8.50,3.90Hz,1H,H-3),3.18(d,/=11.56Hz,1H,H-19b),2.51~2.39(m,3H),2.13(s,3H),2.05~1.97(m,2H)，1.871.68(m,4H),1.41(s,3H),1.36(s,3H)，1.33~1.22(m,3H),1.20(s,3H,CH3-8),0.94(s,3H,CH3-20),13C-NMR(100MHz,CDC13):5107.5，169.0,150.7,147.1,123.8,108.8,99.2,76.1,71.6,67.8,63.9,55.9,52.2,38.4,37.9,37.6,34.5,27.0,26.1,25.4,25.3,24.9,23.1,20.7,16丄MS(ESI)(%):433([M+H]+，100%)制備例23,14,19-三乙酰穿心蓮內(nèi)酯(簡稱APIO)的制備lg穿心蓮內(nèi)酯溶于lOmLAc20，加熱回流2小時，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層依次用水、飽和NaHC03和飽和食鹽水洗，無水MgS04干燥。經(jīng)硅膠柱層析得APIO白色固體。分子式為C26H3608?；衔锎_認(rèn)數(shù)據(jù)如下:IRv給"cm"):3454,3080,2954,1731,1683,1375,1250,1191,1075,1026,895,606.^(400函z,CDC13):S7.00(td,J=6.84,1.48Hz,1&H-12),5.92(d,/=5.96Hz,IH,H-14),4.90(bs,IH,H-17a),4.60(dd，J=11.68，4.26Hz,IH,H-15a),4.55(dd,J=11.24，6.08Hz，IH,H-15b),4.53(bs,IH,H-17b)，4.36(d，J=11.80Hz,IH,H-19a),4.25(dd,J=11.24，1.80Hz,IH,H-3),4.12(d,■/=11.80Hz,IH,H-19b),2.522.37(m,3H),2.12(s,3H),2.05(s,6H),2.0CM.96(m,IH),1.90-1.86(m，2H),1.801.77(m，2H),1.731.66(m,IH),1.571.47(m，1H),1.371.31(m,2H),1.03(s,3H:CH3-8)，0.76(s,3H,CH3-20)13C-NMR(100MHz,CDC13):S170.8，170.4,170.3,168.9，150.0，146.5,124.0,108.8,79.6,71.5,67.7,64.6,55.8,55.2,41.2,38.9,37.8,37.0,25.1,24.6,24.2,22.6,21.1,21.0,20.6,14.4MS(ESI)j/z(°/。)499([M+Na]+,100%),477([M+H]+，13%)制備例314,19-二乙酰穿心蓮內(nèi)酯(簡稱AP12)和14-乙酰穿心蓮內(nèi)酯(簡稱AP13)的制備5g穿心蓮內(nèi)酯加入30mL乙酸攪拌加熱至8(TC，反應(yīng)過夜。反應(yīng)混合物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層依次用水和飽和食鹽水洗，無水MgS04干燥。經(jīng)硅膠柱層析得AP12和AP13。AP13為白色固體。分子式為C22H32Q6。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>化合物確認(rèn)數(shù)據(jù)如下-IRvl穀(cm"):3436,2927,1738,1641,1384,1233,1077,1024,723,621&(400MHz,Acetone):S6.88(td,J=6.92,1.68Hz,1H,H-12),6.03(d,J=6.04Hz,1H,H-14),4.87((!，■/=1.20Hz,1H,H-17a),4.59(d,J=1.08Hz,1H,H-17b)，4.59~4.57(m,1H,OH-19),4.58(dd,J=10.94,5.94Hz,1H,H-15a)，4.26(dd,J=11.00,1.76Hz，1H,H-15b),4.11(d,</=10.88Hz,1H,H-19a),3.70(d，■/=6.88Hz,1H,OH-3),3.44~3.40(m，1H,H-3),3.303.25(m,1H,H-19b),2.62~2.38(m,3H),2.08(s,3H，Ac-14),2.06~1.96(m,2H),1.86-4.74(m,4H)，1.40~1.25(m，3H)，1.20(s,3H，CH3-8):0.70(s,3H,CH3-20)MS(ESI)m/z(%):415([M+Na]+,100%)，393([M+H]+，56%)制備例47-氯-3,19-異亞丙基-14-乙酰穿心蓮內(nèi)酯(簡稱AP20)的制備取AP5510mg，溶于20raL1:1二氯甲烷與水的混合溶液中，加入CeC].7H201.32g，緩慢滴加12%NaOCl2.2mL，室溫反應(yīng)1小時后加入5mL10%郵03攪拌30min停止反應(yīng)，反應(yīng)混合物用二氯甲烷萃取，有機(jī)層依次用水、飽和NaHC03和飽和食鹽水洗，無水MgS04干燥。經(jīng)硅膠柱層析得AP20。AP20為白色固體。分子式為C25H3505C1。IRvgg(cm—、3438,2924,2854,1738,1638,1461,1383,1228,1098,1020,832,676&(400MHz,CDC13):S7.18(td,</=6.38,1.16Hz,1H,H-12),5.98~5.97(m,1H,H-17a),5.93((!，/=6.04Hz,1H,H-14),4.58(dd,J=11.28,6.08Hz，1H,H-15a),4.26(dd,J=11.28,1.68Hz,1H,H-15b),4.15-4.04(m,2H，H-17b,H-7)，3.98((!,</=11.44Hz,1H,H-19a),3.52~3.49(m,1H,H-3),3.24(d,J=11.48Hz,1H,H-19b),2.59~2.56(m,2H),2.44(bs,1H),2.17~2.11(m，1H),2.13(s，3H,Ac-14):2.0CM.71(m，4H),1.46~1.38(m，1H),1.42(s,3H),1.38(s,3H),1.28~1.22(m,1H),1.22(s,3H,CH3-8),0.95(s,3H,CH3-20)MS(ESI)//z(%):469([M+H]+,33%),467([M+H]+,100%)制備例57-氯-3,14,19-三乙酰穿心蓮內(nèi)酯(AP23)的制備取APIO600mg，溶于30mL1:1二氯甲烷與水的混合溶液中，加入CeCl7H201.41g，緩慢滴加12%NaOCl2.4mL，室溫反應(yīng)1小時后加入8mL10%^^03攪拌30min停止反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，有機(jī)層依次用水、飽和NaHC03和飽和食鹽水洗，無水MgS04干燥。柱層析得AP23。AP23為白色固體。分子式為C26H3508C1。化合物確認(rèn)數(shù)據(jù)如下IRv^Ccm-1):3445,2926,2855,1736,1640,1460,1382,1237,1039,854,677,442^(400MHz,CDC13):S7.13(td,J=6.92,1.40Hz,1H,H-12),6.00-599(m,1H,H-17a),5.92(d,/=5.92Hz,1H,H-14),4.62-4.56(m,2H),4.41(d,/=11.88Hz,1H),4.2611.32,1.88Hz,1H),4.22(d,J=11.92Hz,1H),4.08(d,./=11.36Hz,1H),4.00(d,./=11.48Hz,1H),2.61~2.58(m,2H),2.46(bs,1H),2.12(s,3H),2.07(s,3H),2.05(s,3H),1.901.85(m,1H),1.78~1.69(m,2H),1.54~U9(m,3H),1.06(d,J=11.16Hz,1H),1.03(s,3H,CH3-8),0.85(s,3H,CH3-20)MS(ESI)ot/z(%):513([M+H〗+,33%),511([M+H]+,100%)制備例6空白乳的制備將蛋黃卵磷脂1.2g、加入到中鏈油6g和大豆油4g的混合油中，加入油酸0.04g，加熱至6080°C，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.25g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-80°C;把油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后,分裝后12rC滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑176nm。實施例1:AP5乳劑的制備將AP50.05g、大豆卵磷脂0.5g、加入到茶油3g和中鏈油2g的混合油中，加入油酸O.02g，加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.0g溶于60ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后,分裝后121'C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑416nm。實施例2:AP10乳劑的制備將AP103.0g、蛋黃卵磷脂5.0g、加入到精制芝麻油5g和中鏈油20g的混合油中，加入油酸0.2g,加熱至6080°C，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油3.0g溶于60ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP10的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100inl后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后12:TC滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的O色乳液，平均粒徑758咖。實施例3:AP12乳劑的制備將AP121.0g、蛋黃卵磷脂3.0g、在氮氣保護(hù)條件下加入到魚油10g和中鏈油15g的混合油中，加入油酸0.2g，加熱至6080。C,攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油3.0g溶于70ml水中形成水相，加熱至60-80°C;把含有AP12的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后12rC滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑371nm。實施例4:AP13乳劑的制備將AP130.lg、蛋黃卵磷脂0.8g、在氮氣保護(hù)條件下加入到中鏈油2g和玉米油3g的混合油中，加入油酸0.02g，加熱至6080。C，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.0g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP13的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后,分裝后121'C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑274mn。實施例5:AP20乳劑的制備將AP201.0g、蛋黃卵磷脂2.4g、加入到中鏈油8g和玉米油8g的混合油中，加入油酸0.lg，加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油3.0g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-80'C;把含有AP20的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后12rC滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑258nm。實施例6:AP23乳劑的制備將AP230.lg、大豆卵磷脂1.2g、加入到中鏈油2g和大豆油3g的混合油中，加入油酸0.02g,加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.Og溶于80ml水中形成水相，加熱至fi0-8(TC;把含有AP23的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121。C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑197mn。實施例7:AP5乳劑的制備將AP50.5g、蛋黃卵磷脂2.4g、加入到中鏈油15g和大豆油3g的混合油中，加入油酸0.06g，加熱至6080'C，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121'C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑384nra。實施例8:AP5乳劑的制備將AP50.lg、蛋黃卵磷脂1.2g、加入到中鏈油2g和大豆油10g的混合油中，加入油酸0.04g，加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ral后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121匸滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑316nra。實施例9:AP5乳劑的制備將AP50.3g、蛋黃卵磷脂1.4g、加入到中鏈油3g和大豆油8g的混合油中，加入油酸0.04g，加熱至6080'C，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.25g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-80°C;把含有AP5的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后,分裝后121°0滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑216nin。實施例10:AP5乳劑的制備將AP50.5g、蛋黃卵磷脂1.6g、加入到中鏈油6g和大豆油4g的混合油中，加入油酸0.04g,加熱至6080°C，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-80°C;把含有AP5的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121'C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑316nm。實施例11:AP10乳劑的制備將AP100.2g、蛋黃卵磷脂1.6g、加入到中鏈油2g和大豆油8g的混合油中，加入油酸0.04g，加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.25g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后,分裝后12rC滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑164nm。實施例12:AP10乳劑的制備將APIO0.3g、蛋黃卵磷脂1.6g、加入到中鏈油3g和大豆油9g的混合油中，加入油酸0.05g，加熱至6080'C，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.5g溶于80ml水中形成水相，加熱至60-80'C;把含有AP10的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121'C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑176nm。實施例13:AP5乳劑的制備將AP53.Og、蛋黃卵磷脂2.4g、加入到精制芝麻油5g和中鏈油15g的混合油中，加入油酸0.2g，加熱至6080'C，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油3.Og溶于60ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP5的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后12rC滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑468mn。實施例14:AP12乳劑的制備將AP123.Og、大豆磷脂2.Og、加入到精制大豆油5g和中鏈油15g的混合油中，加入油酸0.2g，加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油3.Og溶于60ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP12的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121。C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑438nm。實施例15:AP13乳劑的制備將AP133.Og、蛋黃卵磷脂2.6g、加入到精制芝麻油5g和中鏈油15g的混合油中，加入油酸0.2g,加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油3.Og溶于60ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP13的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力lOOMpa的條件下乳化后,分裝后121'C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑458nm。實施例16:AP20乳劑的制備將AP203.Og、蛋黃卵磷脂2.2g、加入到精制芝麻油5g和中鏈油15g的混合油中，加入油酸0.2g，加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油3.Og溶于60ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP20的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后,分裝后121'C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑418nm。實施例17:AP10乳劑的制備將AP100.Olg、大豆卵磷脂0.5g、加入到茶油3g和中鏈油2g的混合油中，加入油酸0.02、，加熱至608(TC，攪拌使溶解為澄明溶液，得油相；將甘油2.Og溶于60ml水中形成水相，加熱至60-8(TC;把含有AP10的油相加到水相中用高速攪拌乳化成初乳，所得初乳加水定容至100ml后，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在壓力100Mpa的條件下乳化后，分裝后121'C滅菌15分鐘，即得。所得乳劑為均勻的白色乳液，平均粒徑420nm。對比例1:AP5在大豆油中的溶解度將AP50.02g加入到5g玉米油中，加熱至608(TC，攪拌3小時，AP5不能完全溶于玉米油，無法制得油相。對比例2:AP10在大豆油中的溶解度將AP100.05g加入到20g大豆油中，加熱至608(TC，攪拌攪拌3小時，AP10不能完全溶于玉米油，無法制得油相。試驗例1:藥物對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)的抑制活性實驗1、藥品及儀器脂多糖(lip叩o]ysaccharide，1PS)、MTT購自Sigma公司;小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中科院細(xì)胞庫(ATCC);RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清購自Gibco公司；其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純；全自動酶標(biāo)儀(美國，Biotek集團(tuán)生產(chǎn))；恒溫C02培養(yǎng)箱(美國，Thermo公司生產(chǎn))。AP5、APIO、AP12、AP13、AP20樣品:按制備例1、2、3、4制備，并以DMSO溶解用于體外細(xì)胞實驗。2、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng):小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)于含10%熱滅活(56°C，30min)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素鈉、100嗎/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37°C、4>(C02)=5%的恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長。3、NO釋放量的測定由于NO極不穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)很快代謝成亞硝酸基(NCf)，故采用Griess法測定樣品中N02的濃度作為衡量NO水平的指標(biāo)。Griess試劑A:w(N-萘乙二胺鹽酸鹽)=0.1%溶于水中；Griess試劑B:w(對氨基苯磺酰胺)=1%溶于4>(H3P04)=5%中，使用前等體積混合試劑A和B。用RPMI1640培養(yǎng)基將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7稀釋至5X105cells/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200nL細(xì)胞懸浮液。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh后，每孔加入LPS(1ng/mL)和不同濃度(0.l-200pmol/L)的測試樣品0.4&，同時設(shè)LPS組(不加入被測試樣品)和空白對照組(DMSO)，每個樣品4個重復(fù)。在37'C、CCV恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后吸取培養(yǎng)液上清100HL至酶標(biāo)板中，加入等體積的Griess試劑，室溫反應(yīng)10min后測定540nm處的吸光值。用濃度分別為1、5、10、50Wnol/L的Na冊2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)NaN02標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中N02—的濃度以及對NO釋放的抑制率，抑制率計算公式為LPS-[NO2—]LPS+樣品NO釋放抑制率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>[NO2—]LPS-[NO2—]空白4、結(jié)果測得抑制率后，計算各樣品的IC，詳見表l。表1各乳劑對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>一氧化氮生成過量可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，下面以炎癥性疾病的經(jīng)典模型抗炎與腫瘤的經(jīng)典模型體外細(xì)胞毒活性為例說明。試驗例2:AP5與APIO對巴豆油致小鼠耳腫脹的抑制作用研究1、試藥AP5、AP10:按制備例l、2制備。AP5乳劑、AP10乳劑按實施例9、12制備。空白乳劑按制備例6制備。注射用炎琥寧批號20050406，吉林馬應(yīng)龍制藥有限公司生產(chǎn)。地塞米松批號0601146，鄭州羚銳制藥有限公司生產(chǎn)。羧甲基纖維素鈉(簡稱CMC):批號F20041221，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。2%巴豆油杭州中山化學(xué)有限公司生產(chǎn)。2、實驗動物昆明種小鼠，昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。3、實驗方法190只小鼠(19-22g)，雄性，隨機(jī)分為19組，分組情況詳見下表。AP5、AP10CMC混懸灌胃組皆先用1%羧甲基纖維素鈉溶液混懸后給小鼠連續(xù)灌胃三天，空白CMC組灌胃同等劑量的1%羧甲基纖維素鈉溶液、空白乳劑灌胃組灌胃同等劑量空白乳劑三天。AP5、AP10乳劑組、炎琥寧組、地塞米松組、空白乳劑靜注組均尾靜脈給藥1次。給藥結(jié)束后30min，每只小鼠左耳均勻涂抹巴豆油20微升，右耳不涂作為對照。4h后，脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用8mm打孔器沖下耳片，稱重，計算求得平均耳片重，計算抑制率。腫脹度(mg)-左耳耳片重(mg)—右耳耳片重(mg)模型組平均耳片重一給藥組平均耳片重抑制率(％)=-X100%模型組平均耳片重4、實驗結(jié)果研究結(jié)果AP5與AP10混懸后灌胃無明顯改善巴豆油致小鼠耳腫脹作用，炎琥寧60mg/kg亦未顯示出明顯的抗炎作用，而各乳劑組無論口服還是注射皆表現(xiàn)出顯著的抑制作用，其作用強(qiáng)度與地塞米松相當(dāng)，高劑量組甚至優(yōu)+地塞米松。詳見表2。試驗例3:MTT法測定各乳劑體外抗腫癟活性丄、藥品及儀器-MTT購自Sigma公司；各種腫瘤細(xì)胞株均購自中科院細(xì)胞庫(ATCC);RPMI1640及DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清購自Gibco公司；其他常用生化試劑均為國產(chǎn)分析純；全自動酶標(biāo)儀(美國，Biotek);恒溫C02培養(yǎng)箱(美國，Thermo)。AP5、APIO、AP12、AP13、AP20樣品按制備例l、2、3、4制備，并以DMSO溶解用于體外細(xì)胞實驗。2、腫瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株A549、人胃癌細(xì)胞株SGC7901、人肝癌細(xì)胞株S腿C-7721、用含10%熱滅活(56°C，30min)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素鈉、100pg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435s、人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3用含10%熱滅活胎牛血清、丄OOU/mL青霉素鈉、100嗎/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37°C、0(C02)=5%的恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長。3、試驗方法各腫瘤細(xì)胞株按照1X105cells/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200pL細(xì)胞懸浮液。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每孔加入不同濃度(0.1-200jimol/L)的測試樣品0.4pL，并以0.4nL的DMSO作為空白對照組，每個組3個重復(fù)孔。加入藥物處理48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液8pL，置于0)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去上清，吸干殘留液體，加入DMSO150pL，在搖床上振搖IOmin使生成的甲瓚結(jié)晶充分溶解后，設(shè)定630nm為參比波長，在570nm下測定吸光值。按照以下公式計算細(xì)胞增殖抑制率。樣品抑制率(％)=100X(1--)5白4、結(jié)果測得抑制率后，計算各樣品的ICs。。詳見表3。表2對巴豆油致小鼠耳腫脹的抑制作用實驗分組給藥劑量(mg/kg)給藥途徑動物數(shù)(只)耳腫脹度(呢)抑制率(%)空白CMC組—灌胃1020.7±4.1—空白乳劑灌胃組—灌胃1022.7±3.5—空白乳劑靜注組—靜注1021.6±3.2——地塞米松0.5靜注1010.5±4.9A51.3炎琥寧60靜注1017.5±6.019.0AP5CMC混懸劑(高)100灌胃1017.1±2.217.4AP5CMC混懸劑(低)50灌胃1020.0±3.63.4AP10CMC混懸劑(高)100灌胃1016.9±3.918.4AP10CMC混懸劑(低)50灌胃1018.5±3.510.6AP5乳劑(高)100灌胃105.5±3.8##75.8AP5乳劑(低)50灌胃1011.2±2.5#50.7AP10乳劑(高)100灌胃105.6±3.6##75.3AP10乳劑(低)50灌胃109.9±1.3#56.4AP5乳劑(高)60靜注105.9±2.5AA72.7AP5乳劑(中)30靜注106.7土1.4AA69.0AP5乳劑(低)15靜注1011.1±2.5A48.6AP10乳劑(高)60靜注103.8±2.9厶A82.4AP丄0乳劑(中)30靜注102.7±1.3AA87.5AP10乳劑(低)15靜注109.6±2.8A55.6與空自CMC組比較*p<0.05，林p〈0.01;與空白乳劑灌胃組比較flp〈0.05，弁p〈0.01;與空白乳劑靜注組比較Ap〈0.05，AAp<0.01。表3各樣品體外抗腫瘤活性(lCs。pmoi/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權(quán)利要求1、一種以下述通式化合物(I)為活性成份的藥物組合物，其組成為每100ml組合物中含有通式化合物(I)0.01～3g、油5～25g、乳化劑0.5～5.0g、油酸0.02-0.2g，等滲調(diào)節(jié)劑2.0-3.0g，余量的水；其中R1、R2選自乙?；⒘u基、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈烷?；㈡溝；?、芳酰基，雜芳?；騌1和R2被異亞丙基取代，R3選自氫或鹵素。2、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述通式化合物(I)為下列通式(II):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中X選自氫或鹵素。3、如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述通式化合物(II)選自3，19一異亞丙基一14一乙酰穿心蓮內(nèi)酯、7—氯一3，19一異亞丙基一14一乙酰穿心蓮內(nèi)酯。4、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述通式化合物(I)為下列通式(III):CH3COO其中R,、R2選自乙?；⒘u基、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈烷?；?、鏈烯?；?、芳酰基，雜芳?；?，R3選自氫或鹵素。5、如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述通式化合物(m)選自3，14，19一三乙酰穿心蓮內(nèi)酯、14，19一二乙酰穿心蓮內(nèi)酯、14一乙酰穿心蓮內(nèi)酯、7—氯一3，14，19一三乙酰穿心蓮內(nèi)酯。6、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述油為藥學(xué)上作為載體的油，由中鏈油與長鏈油以中鏈油比長鏈油重量比為1比0.25的比例組成。7、如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述長鏈油為大豆油、玉米油、花生油、橄欖油、蓖麻油、棕櫚油、椰子油、菜籽油、芝麻油、棉子油、魚油、鯨蠟油或它們的混合物；所述中鏈油即辛癸酸甘油酯，是半合成的天然功能性油脂，碳鏈長度CVd。。8、如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，所述乳化劑為大豆磷脂、蛋黃磷脂、氫化磷脂屮的一種或者它們的混合物。9、如權(quán)利要求l所述的藥物組合物，其特征在于，每100ml組合物中含有通式化合物(I)0.llg、中鏈油215g、長鏈油310g、乳化劑0.83.0g，油酸0.02-0.2g，等滲調(diào)節(jié)劑2.03.0g，余量為水。10、如權(quán)利要求1所述藥物組合物，其特征在于，所述組合物是口服乳劑或靜脈乳劑。11、如權(quán)利要求1一10所述任一組合物的制備方法，其特征在于，將通式化合物(I)和乳化劑與油混合，加熱，攪拌，使溶解為澄明溶液，得油相；將等滲劑溶于水中形成水相；在高速攪拌下將油相加到水相中形成初乳，所得初乳加水定容后，經(jīng)髙壓均質(zhì)機(jī)乳化，得到乳劑。12、如權(quán)利要求l一ll所述任一組合物在制備治療一氧化氮生成過量疾病藥物中的應(yīng)用，其中所述一氧化氮生成過量疾病包括骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、全身炎性反應(yīng)綜合征、膿毒血癥、感染性休克、腦梗塞、高血壓、心肌梗塞、充血性心力衰竭、腎小球腎炎、肝硬化、炎癥性腸病、糖尿病、獲得性免疫缺陷綜合征、血管性頭痛、哮喘、腫瘤。全文摘要本發(fā)明涉及以下述通式化合物為活性成分的藥物組合物及其制備方法，具體為1、該通式化合物為穿心蓮內(nèi)酯衍生物；2、將該通式化合物與油、乳化劑等制成乳劑；3、該乳劑藥用組合物在制備一氧化氮生成過量疾病藥物中的用途。其中R₁、R₂選自乙酰基、羥基、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、鏈烷酰基、鏈烯?；?、芳?；?，雜芳?；騌₁和R₂被異亞丙基取代，R₃選自氫或鹵素。文檔編號A61K47/24GK101284003SQ20071001428公開日2008年10月15日申請日期2007年4月13日優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日發(fā)明者關(guān)玉昆,珂劉,滕厚雷,翟大偉,烽趙,萌邵申請人:煙臺靶點藥物研究有限公司