專利名稱:6H-[1]苯并吡喃并[4,3-b]喹啉及其作為雌激素藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及6H-[1]苯并吡喃并[4,3-b]喹啉化合物,它們作為雌激素藥物的用途以及它們的制備方法。
背景技術(shù):
雌激素在哺乳動(dòng)物組織中的多效性作用已被很好地證明,現(xiàn)在了解到雌激素可影響許多器官系統(tǒng)(參見Mendelsohn and Karas,NewEngland Journal of Medicine 3401801-1811(1999),Epperson,et al.,Psychosomatic Medicine 61676-697(1999),Crandall,Journal ofWomens Health & Gender Based Medicine 81155-1166(1999),Monkand Brodaty,Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 111-10(2000),Hurn and Macrae,Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism20631-652(2000),Calvin,Maturitas 34195-210(2000),F(xiàn)inking,etal.,Zeitschrift fur Kardiologie 89442-453(2000),Brincat,Maturitas35107-117(2000),Al-Azzawi,Postgraduate Medical Journal 77292-304(2001))。雌激素可以幾種方式對(duì)組織發(fā)揮作用,最具特征性的作用機(jī)制為其與雌激素受體相互作用導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的改變。雌激素受體為配體活化的轉(zhuǎn)錄因子,屬于細(xì)胞核激素受體超家族。該家族中的其它成員包括黃體酮、雄激素、糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素受體。在與配體結(jié)合后,這些受體發(fā)生二聚化,并可通過直接與DNA上的特定序列(稱為反應(yīng)元件)結(jié)合或通過與其它轉(zhuǎn)錄因子(如AP1)相互作用再直接與特定的DNA序列結(jié)合來活化基因轉(zhuǎn)錄(參見Moggsand Orphanides,EMBO Reports 2775-781(2001),Hall,et al.,Journalof Biological Chemistry 27636869-36872(2001),McDonnell,Principles of Molecular Regulation 351-361(2000))?!拜o調(diào)節(jié)”蛋白類也可與配體結(jié)合受體相互作用,進(jìn)一步調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性(參見McKenna,et al.,Endocrine Reviews 20321-344(1999))。據(jù)顯示,雌激素受體還可以配體依賴型和非依賴型方式抑制NFκB-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄(參見Quaedackers,et al.,Endocrinology 1421156-1166(2001),Bhat,et al.,Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 67233-240(1998),Pelzer,et al.,Biochemical & Biophysical ResearchCommunications 2861153-7(2001))。
雌激素受體還可被磷酸化作用活化。磷酸化作用由生長(zhǎng)因子如EGF介導(dǎo),在沒有配體存在時(shí)引起基因轉(zhuǎn)錄變化(參見Moggs andOrphanides,EMBO Reports 2775-781(2001),Hall,et al.,Journal ofBiological Chemistry 27636869-36872(2001))。
一種不太具特征性的雌激素影響細(xì)胞的方式為通過所謂的膜受體。這種受體的存在是有爭(zhēng)論的,但已很好地證明雌激素可從細(xì)胞中引起非??焖俚姆腔蚪M應(yīng)答(non-genomic responses)。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)這些作用的細(xì)胞實(shí)體尚未被確定分離,但是有證據(jù)顯示其至少與雌激素受體的細(xì)胞核形式相關(guān)(參見Levin,Journal of Applied Physiology911860-1867(2001),Levin,Trends in Endocrinology & Metabolism10374-377(1999))。
目前已發(fā)現(xiàn)兩種雌激素受體。第一種雌激素受體約于15年前被克隆,現(xiàn)在被稱為ERα(參見Green,et al.,Nature 320134-9(1986))。第二種雌激素受體是最近才發(fā)現(xiàn)的,被稱作ERβ(參見Kuiper,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 935925-5930(1996))。早先對(duì)ERβ的研究集中在定義其對(duì)許多種配體的親和力方面,的確發(fā)現(xiàn)與ERα的一些不同之處。已經(jīng)在嚙鼠動(dòng)物中清楚繪制了ERβ的組織分布圖,其與ERα的并不一致。組織如小鼠和大鼠的子宮主要表達(dá)ERα,而其它組織如小鼠和大鼠的肺主要表達(dá)ERβ(參見Couse,et al.,Endocrinology 1384613-4621(1997),Kuiper,et al.,Endocrinology138863-870(1997))。即使在同樣的器官中,ERα和ERβ的分布也可被區(qū)分。例如,在大鼠卵巢中,ERβ在顆粒細(xì)胞中高度表達(dá),ERα則限于在鞘和基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)(參見Sar and Welsch,Endocrinology 140963-971(1999),F(xiàn)itzpatrick,et al.,Endocrinology1402581-2591(1999))。但是,有兩種受體共表達(dá)的例子,在體外研究中有證據(jù)表明ERα和ERβ可形成異二聚體(參見Cowley,et al.,Journal of Biological Chemistry 27219858-19862(1997))。
已描述過許多可擬或阻滯17β-雌二醇活性的化合物。與17β-雌二醇,即最有效的內(nèi)源性雌激素,具有大致相同的生物效應(yīng)的化合物被稱為“雌激素受體激動(dòng)劑”。那些與17β-雌二醇聯(lián)用時(shí)阻滯其功效的化合物被叫做“雌激素受體拮抗劑”。實(shí)際上,在雌激素受體激動(dòng)劑和雌激素受體拮抗劑活性之間具有連續(xù)區(qū)(continuum),的確,一些化合物在一些組織中表現(xiàn)為雌激素受體激動(dòng)劑,而在另一些組織中則表現(xiàn)為雌激素受體拮抗劑。這些具有混合活性的化合物被稱為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMS),為治療上有用的藥物(如EVISTA)(參見McDonnell,Journal of the Society for GynecologicInvestigation 7S10-S15(2000),Goldstein,et al.,Human ReproductionUpdate 6212-224(2000))。同樣的化合物可具有細(xì)胞特異性作用的確切原因尚未被闡明,但是可能與受體構(gòu)象和/或輔調(diào)節(jié)蛋白的環(huán)境的差別有關(guān)。
大家已經(jīng)知道當(dāng)與配體結(jié)合時(shí),雌激素受體采用不同的構(gòu)象。但是,這些變化的結(jié)果和微妙之處最近才被揭示。ERα和ERβ的三維結(jié)構(gòu)已通過與各種配體共結(jié)晶得以解析,其清楚地顯示出在雌激素受體拮抗劑存在下螺旋12的復(fù)位,其在空間上阻礙受體-輔調(diào)節(jié)蛋白相互作用所需的蛋白序列(參見Pike,et al.,Embo 184608-4618(1999),Shiau,et al.,Cell 95927-937(1998))。此外,已用噬菌體展示技術(shù)來鑒別在不同配體存在下與雌激素受體相互作用的肽(參見Paige,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 963999-4004(1999))。例如,鑒定了一種肽,該肽在ERα與全雌激素受體激動(dòng)劑和與二乙基己烯雌酚的結(jié)合之間有所不同。不同的肽在氯米酚與ERα和ERβ的結(jié)合之間也顯示出不同。這些資料表明每個(gè)配體都可能使受體處于可能具有不同生物活性的獨(dú)特的和不可預(yù)知的構(gòu)象。
如上所述,雌激素會(huì)影響一整套(panoply)生物學(xué)過程。此外,當(dāng)描述性別差異(如發(fā)病頻率、對(duì)刺激的應(yīng)答等)時(shí),其解釋有可能涉及男性和女性之間雌激素水平的差異。知道了這些化合物的重要性,就了解了對(duì)新型雌激素藥物的需要。本發(fā)明涉及這些以及其它重要的目標(biāo)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了可用作雌激素藥物的6H-[1]苯并吡喃并[4,3-b]喹啉化合物。在某些實(shí)施方案中,所述化合物具有式I結(jié)構(gòu) 其中A和A′各自獨(dú)立為OH、H或OR;每個(gè)R獨(dú)立選自C1-C6烷基、烯基、芐基、酰基、芳酰基、-C(=O)-OR′、磺?;土柞;渲忻總€(gè)R′獨(dú)立選自C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基或C3-C10環(huán)烷基,各自任選被1-3個(gè)選自C1-C6烷基或鹵素的取代基取代;R1和R2獨(dú)立選自H、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6全鹵代烷基、CF3、C2-C7烯基和C1-C6烷氧基;
R3、R4、R5和R6各自獨(dú)立選自H、鹵素、CF3、C1-C6全鹵代烷基、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、CN、-CHO、?;⒈交⒎蓟碗s芳基;其中R3、R4、R5和R6的烷基或烯基部分各自可任選被最多3個(gè)獨(dú)立選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、OH、CN、三氟烷基、三氟烷氧基、NO2或苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3、R4、R5和R6的炔基部分各自可任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、-CHO、酰基、三氟烷基、三烷基甲硅烷基或苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3、R4、R5和R6的苯基、芳基或雜芳基部分各自可任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、烷基、烷氧基、全氟烷基或全氟烷氧基;每個(gè)R10獨(dú)立選自鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、-OH、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、-NO2、氨基、C1-C6烷基氨基、二-(C1-C6)烷基氨基、巰基(thiol)和C1-C6烷硫基;和n為0、1、2或3;條件是A和A′中至少一個(gè)不為H;如果n為0,則R3不為鹵素;和R3、R4和R5中至少一個(gè)為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、酰基、苯基、芳基或雜芳基;或其N-氧化物或其藥學(xué)可接受鹽或其前藥。
本發(fā)明化合物為雌激素受體調(diào)節(jié)劑,可用于治療或抑制至少部分由雌激素缺乏或過量而介導(dǎo)的或可通過使用雌激素藥物而被治療或抑制的癥狀、病癥或疾病狀態(tài)。因此,在一些方面,本發(fā)明涉及本發(fā)明化合物在治療或預(yù)防如骨質(zhì)疏松癥、炎性腸病、Crohn′s病、潰瘍性直腸炎、結(jié)腸炎、雌激素依賴性癌癥、高膽固醇血癥、高脂血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、老年性癡呆、Alzheimer′s病、焦慮癥、神經(jīng)退化性疾病、不育癥或關(guān)節(jié)炎的疾病中的用途。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了6H-[1]苯并吡喃并[4,3-b]喹啉化合物,包含所述化合物的組合物和所述化合物作為雌激素藥物的用途。本發(fā)明化合物可有效治療和預(yù)防預(yù)雌激素受體特別是ERβ相關(guān)的疾病。在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明的雌激素化合物具有下面的式I結(jié)構(gòu) 其中A和A′各自獨(dú)立為OH、H或OR;每個(gè)R獨(dú)立選自C1-C6烷基、烯基、芐基、酰基、芳?;?C(=O)-OR′、磺?;土柞;?,其中每個(gè)R′獨(dú)立選自C1-6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基或C3-C10環(huán)烷基、各自任選被1-3個(gè)選自C1-C6烷基或鹵素的取代基取代;R1和R2獨(dú)立選自H、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6全鹵代烷基、CF3、C2-C7烯基和C1-C6烷氧基;R3、R4、R5和R6各自獨(dú)立選自H、鹵素、CF3、C1-C6全鹵代烷基、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、CN、-CHO、?;?、苯基、芳基和雜芳基;
其中R3、R4、R5和R6的烷基或烯基部分各自可任選被最多3個(gè)獨(dú)立選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、OH、CN、三氟烷基、三氟烷氧基、NO2或苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3、R4、R5和R6的炔基部分各自可任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、-CHO、酰基、三氟烷基、三烷基甲硅烷基或苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3、R4、R5和R6的苯基、芳基或雜芳基部分各自可任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、烷基、烷氧基、全氟烷基或全氟烷氧基;每個(gè)R10獨(dú)立選自鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、-OH、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、-NO2、氨基、C1-C6烷基氨基、二-(C1-C6)烷基氨基、巰基和C1-C6烷硫基;和n為0、1、2或3;條件是A和A′中至少一個(gè)不為H;如果n為0,則R3不為鹵素;和R3、R4和R5中至少一個(gè)為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、?;?、苯基、芳基或雜芳基;或其N-氧化物或其藥學(xué)可接受鹽或其前藥。
在一些實(shí)施方案中,A和A′各自為OH。在另一些實(shí)施方案中,A和A′之一為OH,A和A′中的另外一個(gè)為OR。在另一些實(shí)施方案中,A和A′之一為OH,A和A′中的另外一個(gè)為O-C1-C6烷基。在另一些實(shí)施方案中,A和A′各自為OR。在再另外的實(shí)施方案中,A和A′各自為-O-C1-C6烷基。在再另外的實(shí)施方案中,A和A′之一為H,A和A′中的另外一個(gè)為OH或OR。在另外的實(shí)施方案中,A和A′之一為H,A和A′中的另外一個(gè)為OH或O-C1-C6烷基。
在一些實(shí)施方案中,R3和R5各自獨(dú)立為H、鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO、?;蛉缜八龅娜芜x取代的苯基。在一些這樣的實(shí)施方案中,R3不為H。
在一些實(shí)施方案中,R3為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO或任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代的苯基鹵素、-O-C1-C6烷基(即C1-C6烷氧基)、全氟烷基和CN;且R5為H、鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO或任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代的苯基鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基和CN。在一些這樣的實(shí)施方案中,R3的苯基任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代F、Cl、Br、CN、OCH3和CF3。
在一些實(shí)施方案中,R3為鹵素、C2-C7炔基或-CN。在另一些實(shí)施方案中,R3和R5各自獨(dú)立為鹵素、C2-C7炔基或-CN。
在一些實(shí)施方案中,R1和R2之一為鹵素。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中,R1和R2之一為氟。在另一些實(shí)施方案中,R1和R2之一為鹵素,R1和R2中的另外一個(gè)為H。在另一些實(shí)施方案中,R1和R2之一為氟,R1和R2中的另外一個(gè)為H。在另一些實(shí)施方案中,R1和R2各自獨(dú)立為鹵素。在另一些實(shí)施方案中,R1和R2各自為氟。在另一些實(shí)施方案中,R1和R2各自為H。
在一些實(shí)施方案中,R4為H、鹵素或-CN,優(yōu)選為H。
在一些實(shí)施方案中,R3為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO或任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代的苯基鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基和CN;R5為H、鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO或任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代的苯基鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基和CN;且R1和R2之一為鹵素;且R4為H、鹵素或-CN。
在一些實(shí)施方案中,優(yōu)選其中A和A′各自為OH,R1、R2、R4、R5和R6為氫,且R3為鹵素,或R3為OH,或R3為C2-C7烯基,或R3為CN,或R3為C2-C7炔基,或R3為C1-C6烷基,或R3為任選取代的苯基,優(yōu)選其中所述苯基的取代基為鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基或CN的那些化合物。
在每個(gè)上述實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中,n為1。
在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明化合物或其藥學(xué)可接受鹽、螯合物、絡(luò)合物或前藥的組合物。
應(yīng)了解,本發(fā)明的化合物可以本文提到的結(jié)構(gòu)式描述的游離堿形式或以其鹽和/或其水合物形式,特別是以其藥學(xué)可接受鹽形式存在。藥學(xué)可接受鹽為本領(lǐng)域中已知的,水合物也是如此,本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員會(huì)發(fā)現(xiàn)很方便用領(lǐng)域中公認(rèn)的技術(shù)來制備這樣的鹽。當(dāng)本發(fā)明化合物包含堿性部分時(shí),可從有機(jī)和無機(jī)酸形成藥學(xué)可接受鹽,如乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、丙二酸、扁桃酸、蘋果酸、鄰苯二甲酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、樟腦磺酸和類似的已知可接受酸。當(dāng)本發(fā)明化合物包含酸性部分時(shí),也可從有機(jī)和無機(jī)堿形成鹽,如堿金屬鹽(如鈉、鋰或鉀)、堿土金屬鹽、銨鹽、包含1-6個(gè)碳原子的烷基銨鹽或在每個(gè)烷基中包含1-6個(gè)碳原子的二烷基銨鹽,和在每個(gè)烷基中包含1-6個(gè)碳原子的三烷基銨鹽。示例性的鹽還包括酸加成鹽如HCl、H2SO4、HBr、HI、HNO3、H3PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、H3PO3、NaH2PO3、Na2HPO4、H2SO4、NaHSO4,羧酸如乙酸、丙二酸、癸酸、月桂酸、二氯乙酸、三氯乙酸等,以及其它藥學(xué)可耐受的鹽。水合物包括半水合物、一水合物、二水合物等。除非本文另有修改,游離堿結(jié)構(gòu)式的使用包括其鹽和/或水合物。
本發(fā)明還包括本文公開的化合物的N-氧化物衍生物。這些N-氧化物可由制備類似化合物的方法制備。如,可用過酸、過氧化氫、堿金屬過氧化物或烷基過氧化物來氧化所述化合物。有效的N-氧化物衍生物為其中喹啉環(huán)上的氮原子形成N-氧化物基團(tuán)的化合物。
本發(fā)明還包括前藥衍生物。“前藥衍生物”或“前藥”是指在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的本發(fā)明化合物的非衍生形式的本發(fā)明化合物的衍生物。
除非另有說明,本文所用術(shù)語“烷基”,無論是單獨(dú)使用還是作為其它基團(tuán)的一部分,是指包括但不限于包含1-12個(gè)碳原子優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的直鏈和支鏈脂肪族烴鏈。例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基等都包含在術(shù)語“烷基”中。
在本文的定義中所用的碳原子的數(shù)目是指所述部分的碳主鏈或碳支鏈,但并不包括所述部分的取代基的碳原子,如烷氧基取代基等。
本文所用術(shù)語“烯基”,無論單獨(dú)使用還是作為其它基團(tuán)的一部分,是指脂肪族烴鏈,其包括但不限于具有2-8個(gè)碳原子如2-7個(gè)碳原子的直鏈和支鏈并包含至少一個(gè)雙鍵。優(yōu)選地,烯基部分具有1或2個(gè)雙鍵。如乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基等都包含在術(shù)語“烯基”內(nèi)。這樣的烯基部分可以E或Z構(gòu)象存在,本發(fā)明的化合物包含兩種構(gòu)象。
本文所用術(shù)語“炔基”,無論單獨(dú)使用還是作為其它基團(tuán)的一部分,是指脂肪族烴鏈,其包括但不限于具有2-8個(gè)碳原子如2-7個(gè)碳原子的直鏈和支鏈并包含至少一個(gè)三鍵。優(yōu)選地,炔基部分具有1或2個(gè)三鍵。如,乙炔基、丙炔基等都包含在術(shù)語“炔基”內(nèi)。
術(shù)語“酰基”是指烷基羰基部分,如其中烷基如本文所定義。術(shù)語“芐基”具有其常規(guī)意義為苯基甲基。術(shù)語“芳?;笔侵竿ㄟ^羰基連接的芳基部分,如苯甲?;?。
提到變量R1、R2R3、R4、R5、R6、A和A′時(shí)本文所描述的烷基、烯基、炔基、芳基、環(huán)烷基、雜芳基、芳?;Ⅴ;捅交扇芜x被一個(gè)或多個(gè)取代基取代,優(yōu)選被最多3個(gè)取代基取代。所述取代基為獨(dú)立選擇的,包括硝基、氰基、鹵素、羥基、羧基、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳基氧基、雜芳基氧基、烷基烷氧基、烷氧基烷氧基、全氟烷基、全氟烷氧基、芳基烷基、烷基芳基、羥基烷基、烷氧基烷基、烷硫基、S(O)s-芳基(其中s=0-2)、S(O)s-雜芳基(其中s=0-2)或-C(=O)-OR′,其中R′如前所述。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中,優(yōu)選的取代基包括鹵素、OH、CN、三氟烷基、三氟烷氧基、全氟烷基、全氟烷氧基、芳基烷基、烷基芳基、NO2和苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的如前所述的R10基團(tuán)取代。
例如,當(dāng)烷基或烯基部分被取代時(shí),它們通常被單-、二-、三-或全取代。鹵素取代基的實(shí)例包括1-溴乙烯基、1-氟乙烯基、1,2-二氟乙烯基、2,2-二氟乙烯基、1,2,2-三氟乙烯基、1,2-二溴乙烷、1,2-氟乙烷、1-氟-2-溴乙烷、CF2CF3、CF2CF2CF3等。
術(shù)語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。
示例性的環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、金剛烷基等。在一些實(shí)施方案中,所述環(huán)烷基具有3-10個(gè)碳原子。優(yōu)選的環(huán)烷基具有3-7個(gè)碳原子。本文所用的環(huán)烷基還包括不飽和環(huán)烷基,即環(huán)烯基。示例性的不飽和環(huán)烷基包括環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基等。
芳基為具有至少一個(gè)不包含雜(即非碳)環(huán)原子的芳香性環(huán)的部分。術(shù)語“芳基”包括單-和多環(huán)芳香性環(huán)系,如包含6-15個(gè)碳原子的芳香性環(huán)系,如苯基、萘基等。芳基可具有與芳香性環(huán)稠合的完全或部分飽和環(huán)。因此,示例性的芳基包括苯基、萘基、芘基、5,6,7,8-四氫萘-1-基等。
術(shù)語雜芳基是指包含至少一個(gè)選自O(shè)、N和S的非碳環(huán)原子(如1-3個(gè)雜原子)且具有如5-14個(gè)環(huán)原子的芳香環(huán)系。示例性的雜芳基包括吡咯基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噻吩基(thiophenyl)、呋喃基、唑基、噻唑基、噻吩基(thienyl)、吡喃基、噻喃基、苯并呋喃基、吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、吲唑基、吡啶并吡咯基等。
在一些實(shí)施方案中,A或A′的-C(=O)-OR′部分的R′基團(tuán)為C1-C6烷基。在一些實(shí)施方案中,R′為C1-4烷基。在一些實(shí)施方案中,該-C(=O)-OR′部分為叔丁氧基羰基(BOC)。
關(guān)于提供本發(fā)明覆蓋的化合物或物質(zhì),其中所用術(shù)語“提供”是指直接給予這樣的化合物或物質(zhì)或給予可在體內(nèi)形成有效量的所述化合物或物質(zhì)的前藥、衍生物或類似物。
根據(jù)在下面描述的標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)試驗(yàn)程序得到的結(jié)果,本發(fā)明化合物為雌激素受體調(diào)節(jié)劑,可有效用于治療或抑制至少部分由雌激素缺乏或過量介導(dǎo)的或可通過使用雌激素藥物而被治療或抑制的癥狀、病癥或疾病狀態(tài)。本發(fā)明化合物可特別有效用于治療內(nèi)源性雌激素產(chǎn)生水平大大降低的圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)期或絕經(jīng)后患者。絕經(jīng)期通常被定義為最后的自然月經(jīng)周期,以卵巢功能停止為特征,導(dǎo)致血流中循環(huán)雌激素的實(shí)質(zhì)減少。本文所用絕經(jīng)(期)還包括由外科手術(shù)、化療或?qū)е侣殉补δ苓^早降低或停止的疾病引起的雌激素生成減少的病癥。
因此,本發(fā)明化合物可有效用于治療或抑制骨質(zhì)疏松癥和抑制骨脫礦質(zhì)作用,其可能由個(gè)體的新骨組織形成和舊組織再吸收不均衡而導(dǎo)致骨的凈流失引起。這樣的骨缺失在一定范圍的人群中發(fā)生,特別是絕經(jīng)后女性、卵巢雙側(cè)切除的女性、正在接受或接受過長(zhǎng)期皮質(zhì)類固醇療法的患者、性腺發(fā)育不全的患者和患Cushing′s綜合征的患者。也可用這些化合物滿足患有骨折、骨結(jié)構(gòu)缺陷和接受與骨相關(guān)的手術(shù)和/或假體植入的個(gè)體對(duì)骨包括牙齒和口腔骨替代的特別需要。除了上述問題外,這些化合物可用于治療或抑制骨關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、低鈣血癥、高鈣血癥、Paget′s病、骨軟化癥、骨鈣質(zhì)缺乏、多發(fā)性骨髓瘤和對(duì)骨組織具有有害作用的其它形式的癌癥。
本發(fā)明化合物還可有效用于治療或抑制繼關(guān)節(jié)鏡或手術(shù)操作而發(fā)生的關(guān)節(jié)損傷。
本發(fā)明化合物還可有效用于治療或抑制良性或惡性異常組織增生包括前列腺肥大、子宮平滑肌瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位(endometriosis)、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜息肉、良性乳房疾病、子宮腺肌病(adenomyosis)、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、CNS癌如神經(jīng)膠質(zhì)瘤或成星形細(xì)胞瘤(astioblastomia)。
本發(fā)明化合物具有心血管保護(hù)作用,它們可有效用于降低膽固醇、甘油三酯、Lp(a)脂蛋白和低密度脂蛋白(LDL)水平;抑制或治療高膽固醇血癥;高脂血癥;心血管疾??;動(dòng)脈粥樣硬化;外周血管疾??;再狹窄和血管痙攣;并可抑制引起免疫介導(dǎo)的血管損傷的由細(xì)胞事件導(dǎo)致的血管壁損傷。這些心血管保護(hù)特性,在用雌激素治療絕經(jīng)后患者來抑制骨質(zhì)疏松癥時(shí),和對(duì)適于用雌激素療法的男性具有重要的意義。
本發(fā)明化合物還是抗氧化劑,因此可有效用于治療和抑制自由基誘導(dǎo)的疾病狀態(tài)。其中抗氧化療法肯定有療效的特定情況有癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥、Alzheimer′s病、骨病、衰老、炎性疾病、外周血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病、呼吸性窘迫、肺氣腫、哮喘、胸膜炎、眼葡萄膜炎、膿毒癥、出血性休克、預(yù)防再灌注損傷(prevention of reperfusion injury)、病毒性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎、肺結(jié)核、銀屑病、全身性紅斑狼瘡、成人呼吸性窘迫綜合征、中樞神經(jīng)系統(tǒng)外傷和中風(fēng)。
本發(fā)明化合物還可有效用于提供認(rèn)知增強(qiáng),并用于治療或抑制老年性癡呆、Alzheimer′s病、認(rèn)知減退、神經(jīng)退化性疾病,提供神經(jīng)保護(hù)或認(rèn)知增強(qiáng)。
本發(fā)明化合物還可有效用于治療或抑制炎性腸病、潰瘍性直腸炎、Crohn′s病和結(jié)腸炎;絕經(jīng)相關(guān)性病癥如血管舒縮癥(vasomotorsymptoms)包括熱潮紅、陰道或外陰萎縮、萎縮性陰道炎、陰道干燥、瘙癢癥、性交困難、排尿困難、尿頻、尿失禁、泌尿道感染、肌痛、關(guān)節(jié)痛、失眠、易激癥(irritability)等;男性型禿發(fā);皮膚萎縮;痤瘡;II型糖尿病;功能障礙性子宮出血;和不育癥。
本發(fā)明化合物可有效用于其中閉經(jīng)為有利的疾病狀態(tài),如白血病、子宮內(nèi)膜切除、慢性腎病或肝病或血凝固疾病或病癥。
本發(fā)明化合物可被用作避孕藥,特別是與黃體酮聯(lián)用時(shí)。
當(dāng)用于治療或抑制特定的疾病狀態(tài)或癥狀時(shí),應(yīng)了解有效劑量可根據(jù)所用的特定化合物、給藥方式、所治療的病癥及其嚴(yán)重程度以及與所治療個(gè)體相關(guān)的各種物理因素而有所不同。本發(fā)明化合物的有效給藥口服劑量為約0.1mg/天-1,000mg/天。優(yōu)選地,給藥劑量可為約10mg/天-600mg/天,更優(yōu)選為約50mg/天-600mg/天,單次劑量或兩次或多次分份劑量。計(jì)劃日劑量根據(jù)給藥方式可有所不同。
所述劑量可以任何有利于使活性化合物進(jìn)入受者血流的方式給藥,包括口服、經(jīng)由埋植劑、胃腸外(包括靜脈、腹膜內(nèi)和皮下注射)、直腸、鼻內(nèi)、陰道和經(jīng)皮給藥。
包含本發(fā)明活性化合物的口服制劑可包括任何常規(guī)口服形式,包括片劑、膠囊劑、含劑(buccal forms)、含片(troches)、錠劑和口服液體、混懸液和或溶液。膠囊劑可包含活性化合物與惰性填充劑和/或稀釋劑如藥學(xué)可接受淀粉(如玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、糖、人工甜味劑、粉狀纖維素如晶狀和微晶纖維素、面粉、明膠、樹膠(gums)等。有效的片劑制劑可由常規(guī)壓片、濕法制?;蚋煞ㄖ屏V苽洌墒褂盟帉W(xué)可接受稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、表面修飾劑(surface modifying agents)(包括表面活性劑)、懸浮劑或穩(wěn)定劑,包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石粉、月桂基硫酸鈉、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈣、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、海藻酸、金合歡膠、黃原膠、檸檬酸鈉、硅酸鹽復(fù)合物、碳酸鈣、甘氨酸、糊精、蔗糖、山梨醇、磷酸二鈣、硫酸鈣、乳糖、高嶺土、甘露醇、氯化鈉、滑石粉、干淀粉和糖粉。優(yōu)選的表面修飾劑包括非離子和陰離子表面修飾劑。表面修飾劑的代表性實(shí)例包括但不限于帕洛沙姆188、苯扎氯銨、硬脂酸鈣、十六醇十八醇混合物(cetostearlalcohol)、聚乙二醇單鯨蠟基醚乳化蠟(cetomacrogol emulsifyingwax)、山梨坦酯、膠體二氧化硅、磷酸鹽(phosphates)、十二烷基硫酸鈉、硅酸鎂鋁和三乙醇胺。本文的口服制劑可使用標(biāo)準(zhǔn)延遲或時(shí)間釋放制劑(time release formulations)以改變活性化合物的吸收。所述口服制劑還可包括根據(jù)需要將活性成分在包含合適的穩(wěn)定劑或乳化劑的水或果汁中給藥。
在一些情況下,可能需要將化合物通過氣霧劑形式直接給藥至呼吸道。
本發(fā)明化合物還可胃腸外給藥或腹膜內(nèi)給藥。這些游離堿形式的活性化合物或其藥學(xué)可接受鹽的溶液劑或混懸劑可在適當(dāng)混有表面活性劑如羥丙基纖維素的水中制備。分散液也可在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其在油中的混合物中制備。在普通貯存和使用條件下,這些制劑包含防止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。
適于注射用途的藥用形式包括無菌水溶液或分散液和可臨時(shí)制備為無菌注射液或分散液的無菌粉末。在所有情況下,所述形式都必須為無菌的并必須有使其容易注射的足夠的流動(dòng)性。其在生產(chǎn)和貯存條件下必須是穩(wěn)定的并必須能防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。所述載體可為溶劑,或包含如水、乙醇多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)、其合適的混合物和植物油的分散介質(zhì)。
為了本公開的目的,經(jīng)皮給藥被理解為包括所有通過皮膚表面和身體通道內(nèi)層(inner linings)包括上皮和粘膜組織給藥的方式。該給藥方式可用本發(fā)明化合物、其N-氧化物、其前藥或其藥學(xué)可接受鹽以洗液、乳膏、泡沫、貼劑、混懸劑、溶液劑和栓劑(直腸和陰道)形式進(jìn)行。
經(jīng)皮給藥可通過使用包含活性藥物和載體的透皮貼劑來完成,所述載體對(duì)活性化合物為惰性的,對(duì)皮膚無毒并可使全身吸收的藥物通過皮膚進(jìn)入血流。所述載體可為任何形式,如乳膏和軟膏、糊劑、凝膠和封存裝置(occlusive devices)。所述乳膏和軟膏可為水包油或油包水型粘稠液體或半固體乳液。由可吸收的粉末分散于石油或親水性石油包含活性成分構(gòu)成的包含活性成分的糊劑也是合適的。可使用多種封存裝置以將所述活性藥物釋放入血流,如包有包含活性成分與載體或無載體的儲(chǔ)庫或包含活性成分的基質(zhì)的半透性膜。其它封存裝置為文獻(xiàn)中已知的。
可由傳統(tǒng)材料來制備栓劑,所述材料包括可可脂、甘油和用來改變栓劑的熔點(diǎn)的可添加或不添加的蠟。也可用水溶性栓劑基質(zhì),如各種分子量的聚乙二醇。
本發(fā)明化合物的合成本發(fā)明化合物由有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中已知的方法制備。在本發(fā)明化合物的制備中,所用的試劑可購買得到或可由文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。
在下面的方案1-4中描述了本發(fā)明代表性實(shí)施例的合成。方案1-4中的合成方法A-M在下面的實(shí)施例中描述。
方案1
方案2 方案3
方案4 實(shí)施例本發(fā)明代表性化合物的合成通用方法Aldrich Sure SealTM溶劑,無水不需進(jìn)一步純化,可用于本文描述的反應(yīng),可得自Aldrich Chemical Company(St.Louis,MO)。所有的反應(yīng)在氮?dú)庀逻M(jìn)行。色譜法采230-400目的硅膠(Merck Grade 60,Aldrich Chemical Company)。薄層色譜用得自EM Science的硅膠60F254進(jìn)行。1H和19F NMR光譜用Bruker AM-400或Bruker DPX-300儀器(Bruker,Billerica,MA)在氘化溶劑如CDCl3、DMSO-d6或丙酮-d6中進(jìn)行?;瘜W(xué)位移(δ)以距四甲基硅烷(TMS)低場(chǎng)處距離的百萬分之一(ppm)表示。熔點(diǎn)在Thomas-Hoover儀器上測(cè)定,未經(jīng)校正。紅外(IR)光譜用Perkin-Elmer衍射光柵或Perkin-Elmer 784分光光度計(jì)(Perkin-Elmer,Shelton,CT)記錄。質(zhì)譜用Kratos MS 50或Finnigan8230質(zhì)譜儀記錄?;衔锩ǔJ褂肂eilstein AutonomTM方案。
實(shí)施例13-(3-甲氧基-苯氧基)-丙酸(1)方法A向3-溴丙酸(14.70g,118mmol)在水(100mL)中的混合物中緩慢加入NaHCO3(8.40g,100mmol),所得混合物攪拌5分鐘。向該溶液中加入70-mL3-甲氧基苯酚(14.70g,96mmol)的NaOH(4.67g,119mmol)水溶液,所得混合物在100℃下加熱3小時(shí)。冷至室溫后,將反應(yīng)混合物用1N HCl酸化,用Et2O萃取。用NaHCO3(3x)水溶液洗滌Et2O層。水層再次用1N HCl酸化,用Et2O萃取。用水、鹽水洗滌Et2O層,干燥(Na2SO4),過濾,濃縮,得到棕色固體粗品,將其重結(jié)晶(Et2O/-20℃),得到黃色固狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量17.0g(23%)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ2.85(t,J=6.3Hz,2H),3.79(s,3H),4.24(t,J=6.3Hz,2H),6.50(m,3H),7.18(t,J=8.2Hz,1H),11.45(br,1H);MS(ESI)m/z 195([M-H]-);元素分析計(jì)算值C10H12O4C61.22,H6.16.實(shí)測(cè)值C61.24,H6.12。
實(shí)施例27-甲氧基-色原烷-4-酮(2)方法B在0℃向包含3-(3-甲氧基-苯氧基)-丙酸(1)(7.00g,35.6mmol)的反應(yīng)器中緩慢加入三氟甲磺酸(15mL)。將反應(yīng)混合物攪拌3小時(shí),同時(shí)使其升至室溫。冷至0℃后,用碎冰猝滅反應(yīng)混合物,然后用Et2O(2×300mL)萃取。用水(2x)、NaHCO3水溶液、水、鹽水洗滌有機(jī)層,然后干燥(Na2SO4),過濾,濃縮,得到油狀粗品,將其用硅膠色譜法純化,得到黃色固狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量4.26g(67%).1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ2.76(t,J=6.3Hz,2H),3.84(s,3H),4.52(t,J=6.3Hz,2H),6.41(d,J=2.3Hz,1H),6.58(dd,J=8.8,2.3Hz,1H),7.84(d,J=8.8Hz,1H);MS(ESI)m/z 179([M+H]+)。
實(shí)施例33,9-二甲氧基-6H-色原烯并(CHROMENO)[4,3-b]喹啉-7-醇(3)方法C將2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(1.839g,11.00mmol)和7-甲氧基-色原烷-4-酮(2)(1.960g,11.00mmol)的在Ph2O(10mL)中的混合物在170℃下加熱1小時(shí),在200℃下加熱7小時(shí)。冷至室溫后,加入己烷。過濾收集形成的黃色沉淀物,用己烷和Et2O充分洗滌,真空干燥。產(chǎn)量2.171g(64%)。mp 298℃(dec.);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ3.82(s,3H),3.84(s,3H),5.17(s,2H),6.64(d,J=2.4Hz,1H),6.79(dd,J=8.7,2.4Hz,1H),7.31(dd,J=9.0,2.9Hz,1H),7.50(d,J=2.8Hz,1H),7.74(d,J=9.0Hz,1H),7.99(d,J=8.7Hz,1H),11.56(s,1H);MS(ESI)m/z 308([M-H]-),310([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C18H15NO4310.1074([M+H]+),實(shí)測(cè)值310.1068。
實(shí)施例47-氯-3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(4)方法C將3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉-7-醇(3)(124mg,0.400mmol)和POCl3(1mL)的混合物加熱回流1小時(shí)。冷卻后,減壓除去過量的POCl3。向固體殘留物中緩慢加入水,然后緩慢加入K2CO3水溶液,反應(yīng)混合物用EtOAc萃取。用鹽水洗滌有機(jī)層,然后干燥(Na2SO4),過濾,濃縮,得到固體粗品,將其通過硅膠短墊(a short pad of silica gel),重結(jié)晶(熱庚烷/-20℃),得到黃色粉末狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量124mg(95%);mp 190-191℃;1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ3.85(s,3H),3.97(s,3H),5.50(s,2H),6.53(d,J=2.4Hz,1H),6.71(dd,J=8.7,2.4Hz,1H),7.35(dd,J=8.9,2.8Hz,1H),7.38(d,J=3.2Hz,1H),7.98(d,J=8.8Hz,1H),8.29(d,J=8.7Hz,1H);MS(ESI)m/z 328/330([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C18H14ClNO3328.0735([M+H]+),實(shí)測(cè)值328.0728;元素分析計(jì)算值C18H14ClNO3C65.96,H4.31,N4.27.實(shí)測(cè)值C65.71,H4.17,N3.92。
實(shí)施例57-溴-3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(5)方法E.將3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉-7-醇(3)(1.025g,3.31mmol)和POBr3(1.430g,5.00mmol,1.5當(dāng)量)在DMF(15mL)中的混合物在70℃加熱30分鐘。冷至室溫后,緩慢加入水,然后緩慢加入K2CO3水溶液,反應(yīng)混合物用溫CHCl3(2x)萃取。用水(2x)和鹽水洗滌有機(jī)層,然后干燥(Na2SO4),通過硅膠短墊過濾,濃縮得到黃色固狀粗品,將其重結(jié)晶(熱EtOAc/-20℃)得到黃色針狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量1.127g(91%);mp 196-197℃;1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ3.85(s,3H),3.98(s,3H),5.48(s,2H),6.53(d,J=2.4Hz,1H),6.71(dd,J=8.7,2.5Hz,1H),7.35(dd,J=9.0,2.7Hz,1H),7.39(d,J=2.7Hz,1H),7.97(d,J=9.0Hz,1H),8.30(d,J=8.7Hz,1H);MS(ESI)m/z 372/374([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C18H14BrNO3372.0230([M+H]+),實(shí)測(cè)值372.0228;元素分析計(jì)算值C18H14BrNO3C58.08,H3.79,N3.76.實(shí)測(cè)值C57.94,H3.68,N3.73。
實(shí)施例67-氯-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(6)方法F向7-氯-3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(4)(68mg,0.21mmol)的1,2-二氯乙烷(3mL)溶液中緩慢加入BBr3(1.0M,1mL,1mmol)的CH2Cl2溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘,然后在40℃下攪拌2小時(shí)。在冰浴中冷卻后,在劇烈攪拌下非常緩慢地加入NaHCO3水溶液以猝滅反應(yīng),所得反應(yīng)混合物用EtOAc萃取。用鹽水洗滌有機(jī)層,然后干燥(Na2SO4),通過硅膠短墊過濾,濃縮得到黃色固體,將其重結(jié)晶(THF/己烷)。產(chǎn)量56mg(90%);mp 235℃(dec.);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ5.47(s,2H),6.40(s,1H),6.60(d,J=8.0Hz,1H),7.34(d,J=2.1Hz,2H),7.89(d,J=9.6Hz,1H),8.09(d,J=8.6Hz,1H),10.10(s,1H),10.35(s,1H);HRMS(ESI+)計(jì)算值C16H10ClNO3300.0422([M+H]+),實(shí)測(cè)值300.0411。
實(shí)施例77-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)方法G向7-溴-3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(5)(881mg,2.37mmol)的1,2-二氯乙烷(20mL)溶液中緩慢加入AlCl3(3.16g,23.7mmol)和EtSH(2.7mL,36mmol),將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。在冰浴中冷卻后,在劇烈攪拌下非常緩慢地加入NaHCO3水溶液以猝滅反應(yīng),所得反應(yīng)混合物用EtOAc萃取。通過Celite過濾形成沉淀物。用鹽水洗滌有機(jī)層,然后干燥(Na2SO4),過濾,濃縮,得到黃色固狀粗品,將其用硅膠色譜法純化得到橙色固狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量478mg(59%);mp 240℃(dec.);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ5.44(s,2H),6.41(d,J=2.3Hz,1H),6.59(dd,J=8.6,2.3Hz,1H),7.33(dd,J=8.7,2.6Hz,1H),7.35(s,1H),7.88(d,J=8.7Hz,1H),8.09(d,J=8.6Hz,1H),10.09(s,1H),10.35(s,1H);MS(ESI)m/z 342/344([M-H]-),344/346([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C16H10BrNO3343.9917([M+H]+),實(shí)測(cè)值343.9911。
實(shí)施例83,9-二羥基-7-乙烯基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(8)方法H將7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)(34.5mg,0.100mmol)、三丁基(乙烯基)錫(38mg,0.120mmol,1.2當(dāng)量)和Pd(PPh3)4(11.6mg,0.0100mmol,10mol%)在甲苯(1.5mL)中的混合物在氮?dú)庀禄亓?,直至消耗完所有的起始原?1-2小時(shí))。通過Celite過濾,并通過硅膠短墊純化,得到橙色粉末狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量24mg(83%);mp 160℃(dec.);1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.36(s,2H),5.47(dd,J=17.9,1.4Hz,1H),5.91(dd,J=11.6,1.4Hz,1H),6.38(d,J=2.3Hz,1H),6.58(dd,J=8.5,2.3Hz,1H),7.10(dd,J=17.7,11.6Hz,1H),7.22(d,J=2.5Hz,1H),7.26(dd,J=9.1,2.6Hz,1H),7.84(d,J=8.9Hz,1H),8.10(d,J=8.5Hz,1H),9.94(s,1H),9.95(s,1H);MS(ESI)m/z 290([M-H]-),292([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C18H13NO3292.0968([M+H]+),實(shí)測(cè)值292.0962。
實(shí)施例93,9-二羥基-7-[(三甲基甲硅烷基)乙炔基]-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(9)方法I將7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)(51.6mg,0.150mmol)、(三甲基甲硅烷基乙炔基)三丁基錫(70mg,0.180mmol,1.2當(dāng)量)和Pd(PPh3)4(17mg,0.015mmol,10mol%)在甲苯(2mL)中的混合物在氮?dú)庀禄亓?,直至消耗完所有的起始原?1-2小時(shí))。通過Celite過濾,并通過硅膠短墊純化,得到紅色固狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量54mg(99.6%);mp 160℃(dec.);1H-NMR(300MHz,acetone-d6)δ0.43(s,9H),5.53(s,2H),6.52(d,J=2.3Hz,1H),6.71(dd,J=8.6,2.3Hz,1H),7.42(dd,J=9.1,2.7Hz,1H),7.61(d,J=2.7Hz,1H),7.97(d,J=9.0Hz,1H),8.26(d,J=8.6Hz,1H),8.94(s,1H),9.16(s,1H);MS(ESI)m/z 360([M-H]-),362([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C21H19NO3Si 362.1207([M+H]+),實(shí)測(cè)值362.1207。
實(shí)施例103,9-二羥基-7-乙炔基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(10)方法J向3,9-二羥基-7-[(三甲基甲硅烷基)乙炔基]-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(9)(54mg,0.15mmol)的MeOH(2mL)溶液中加入K2CO3(104mg,0.75mmol,5當(dāng)量),將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘。用NH4Cl(5mL)水溶液猝滅反應(yīng)混合物。減壓除去甲醇(MeOH),用EtOAc萃取反應(yīng)混合物。用水和鹽水洗滌有機(jī)層,然后干燥(Na2SO4),過濾,濃縮,得到黃色固狀粗品,將其通過硅膠短墊純化,得到酒紅色(burgundy)粉末純產(chǎn)物。產(chǎn)量27mg(63%);mp220℃(dec.);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ5.27(s,1H),5.46(s,2H),6.41(d,J=2.1Hz,1H),6.59(dd,J=8.5,2.1Hz,1H),7.31(dd,J=9.1,2.6Hz,1H),7.41(d,J=2.5Hz,1H),7.87(d,J=9.0Hz,1H),8.09(d,J=8.5Hz,1H),10.04(s,1H),10.23(s,1H);MS(ESI)m/z 288([M-H]-),290([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C18H11NO3290.0812([M+H]+),實(shí)測(cè)值290.0808。
實(shí)施例113,9-二羥基-7-乙基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(11)方法K將3,9-二羥基-7-乙炔基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(10)(13mg,0.045mmol)和Pd/C(10wt.%)在EtOAc/THF(1.5mL)中的混合物在氫氣(1atm,氣球)下攪拌30分鐘。通過Celite過濾反應(yīng)混合物,濃縮,得到黃色固體,將其重結(jié)晶(EtOAc/己烷/-20℃)。產(chǎn)量13mg(98%)。mp 145℃(dec.);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ1.18(t,J=7.4Hz,3H),2.95(q,J=7.6Hz,2H),5.41(s,2H),6.38(d,J=2.2Hz,1H),6.56(dd,J=8.5,2.3Hz,1H),7.24(dd,J=8.3,2.4Hz,1H),7.26(s,1H),7.82(d,J=9.0Hz,1H),8.09(d,J=8.5Hz,1H),9.90(s,1H),9.93(s,1H);MS(ESI)m/z 292([M-H]-),294([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C18H15NO3294.1125([M+H]+),實(shí)測(cè)值294.1123。
實(shí)施例127-氰基-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(12)方法L將7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)(47mg,0.14mmol)、CuCN(370mg,4.13mmol)在無水DMF(2mL)中的混合物在密封管中在200℃下加熱,直至消耗完所有的起始原料(5小時(shí))。冷至室溫后,通過Celite過濾反應(yīng)混合物,用EtOAc沖洗。向?yàn)V液中加入水,用EtOAc萃取反應(yīng)混合物。用水(2x)和鹽水洗滌有機(jī)層,然后干燥(Na2SO4),過濾,濃縮,得到固體粗品,將其用硅膠色譜法純化得到棕色粉末狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量9mg(23%);1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ5.52(s,2H),6.44(d,J=2.1Hz,1H),6.63(dd,J=8.6,2.1Hz,1H),7.27(d,J=2.4Hz,1H),7.41(dd,J=9.1,2.5Hz,1H),7.98(d,J=9.1Hz,1H),8.09(d,J=8.6Hz,1H),10.19(s,1H),10.63(s,1H);MS(ESI)m/z 289([M-H]-),291([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C17H10N2O3291.0764([M+H]+),實(shí)測(cè)值291.0758。
實(shí)施例137-(4-氯苯基)-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(13)方法M將7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)(40mg,0.12mmol)和Pd(PPh3)4(7mg,0.006mmol,5mol%)在DME(3mL)中的混合物在室溫下攪拌10分鐘。向該混合物中依次加入4-氯苯基硼酸(boronic acid)(22mg,0.14mmol,1.2當(dāng)量)和Na2CO3水溶液(2Msoln,5當(dāng)量),使反應(yīng)混合物回流,直至消耗完所有的起始原料(2-3小時(shí))。冷卻后,加入NH4Cl水溶液,用EtOAc萃取反應(yīng)混合物。用水和鹽水洗滌有機(jī)層,然后干燥(Na2SO4),過濾,濃縮,得到固體粗品,將其通過硅膠短墊純化,得到紅色粉末狀純產(chǎn)物。產(chǎn)量41mg(94%);mp 215-218℃(dec.);1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.01(s,2H),6.36(d,J=2.2Hz,1H),6.60(dd,J=8.7,2.2Hz,1H),6.62(d,J=2.5Hz,1H),7.26(dd,J=9.1,2.6Hz,1H),7.41(d,J=8.4Hz,2H),7.68(d,J=8.4Hz,2H),7.90(d,J=9.0Hz,1H),8.15(d,J=8.4Hz,1H),9.82(s,1H),9.98(s,1H);MS(ESI)m/z 374/376([M-H]-),376/378([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C22H14ClNO3376.0735([M+H]+),實(shí)測(cè)值376.0728。
實(shí)施例147-(4-氰基苯基)-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(14)該化合物按照方法M采用4-氰基苯基硼酸從7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)制備。象牙色粉末;產(chǎn)率96%;mp295℃(dec.);1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.99(s,2H),6.36(d,J=2.3Hz,1H),6.53(d,J=2.7Hz,1H),6.61(dd,J=8.7,2.3Hz,1H),7.27(dd,J=9.1,2.6Hz,1H),7.62(d,J=8.5Hz,2H),7.91(d,J=9.0Hz,2H),8.09(d,J=8.3Hz,1H),8.16(d,J=8.6Hz,1H),9.86(s,1H),9.99(s,1H);MS(ESI)m/z 365([M-H]-),367([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C23H14N2O3367.1077([M+H]+),實(shí)測(cè)值367.1074。
實(shí)施例153,9-二羥基-7-(4-甲氧基苯基)-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(15)該化合物按照方法M采用4-甲氧基苯基硼酸從7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)制備。黃色粉末;產(chǎn)率84%;mp 195℃(dec.);1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.87(s,3H),5.03(s,2H),6.36(d,J=2.2Hz,1H),6.60(dd,J=8.5,2.5Hz,1H),6.73(d,J=2.6Hz,1H),7.16(d,J=8.6Hz,2H),7.24(dd,J=9.0,2.6Hz,1H),7.30(d,J=8.6Hz,2H),7.89(d,J=9.0Hz,1H),8.15(d,J=8.6Hz,1H),9.80(s,1H),9.98(s,1H);MS(ESI)m/z 370([M-H]-),372([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C23H17NO4372.1230([M+H]+),實(shí)測(cè)值372.1226。
實(shí)施例163,9-二羥基-7-[4-(三氟甲基)苯基]-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(16)該化合物按照方法M采用4-三氟甲基苯基硼酸從7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)制備。黃色粉末;產(chǎn)率95%;mp175-177℃(dec.);1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.00(s,2H),6.36(d,J=2.3Hz,1H),6.56(d,J=2.6Hz,1H),6.61(dd,J=8.6,2.2Hz,1H),7.26(dd,J=9.1,2.6Hz,1H),7.64(d,J=7.9Hz,2H),7.92(d,J=9.0Hz,1H),7.98(d,J=8.1Hz,2H),8.16(d,J=8.6Hz,1H),9.84(s,1H),10.00(s,1H);19F-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ-61.43(s);MS(ESI)m/z 408([M-H]-),410([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C23H14F3NO3410.0999([M+H]+),實(shí)測(cè)值410.0992。
實(shí)施例177-(3-氯苯基)-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(17)該化合物按照方法M采用3-氯苯基硼酸從7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)制備。橙色粉末;產(chǎn)率94%;mp 162-165℃(dec.);1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.01(s,2H),6.36(d,J=2.3Hz,1H),6.60(dd,J=8.5,2.2Hz,1H),6.61(d,J=2.6Hz,1H),7.26(dd,J=9.1,2.6Hz,1H),7.35(m,1H),7.50(d,J=1.0Hz,1H),7.64(dd,J=3.9,1.6,Hz,2H),7.90(d,J=9.1Hz,1H),8.15(d,J=8.8Hz,1H),9.86(s,1H),9.98(s,1H);MS(ESI)m/z 374/376([M-H]-),376/378([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C22H14ClNO3376.0735([M+H]+),實(shí)測(cè)值376.0721。
實(shí)施例183,9-二羥基-7-(3-甲氧基苯基)-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(18)
該化合物按照方法M采用3-甲氧基苯基硼酸從7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)制備。黃色粉末;產(chǎn)率87%;mp 155-158℃(dec.);1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.82(s,3H),4.99(d,J=14.2Hz,1H),5.04(d,J=14.2Hz,1H),6.35(d,J=2.3Hz,1H),6.60(dd,J=8.6,2.3Hz,1H),6.71(d,J=2.7Hz,1H),6.90(m,1H),6.92(d,J=1.6Hz,1H),7.12(m,1H),7.24(dd,J=9.1,2.7Hz,1H),7.52(dd,J=8.2,7.9Hz,1H),7.89(d,J=9.1Hz,1H),8.15(d,J=8.6Hz,1H),9.80(s,1H),9.96(s,1H);MS(ESI)m/z 370([M-H]-),372([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C23H17NO4372.1230([M+H]+),實(shí)測(cè)值372.1223。
實(shí)施例197-(3-氰基苯基)-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(19)該化合物按照方法M采用3-氰基苯基硼酸從7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉(7)制備。黃色粉末;產(chǎn)率74%;mp 275℃(dec.);1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.98(d,J=14.2Hz,1H),5.03(d,J=14.2Hz,1H),6.36(d,J=2.3Hz,1H),6.54(d,J=2.6Hz,1H),6.61(dd,J=8.6,2.3Hz,1H),7.27(dd,J=9.1,2.6Hz,1H),7.74(dt,J=7.8,1.4Hz,1H),7.82(t,J=7.7Hz,1H),7.92(d,J=9.1Hz,1H),7.94(d,J=1.6Hz,1H),8.05(dt,J=7.7,1.4Hz,1H),8.16(d,J=8.6Hz,1H),9.87(s,1H),10.00(s,1H);MS(ESI)m/z 365([M-H]-),367([M+H]+);HRMS(ESI+)計(jì)算值C23H14N2O3367.1066([M+H]+),實(shí)測(cè)值367.1083。
藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法雌激素活性的證明評(píng)價(jià)了本發(fā)明的代表性實(shí)例與17β-雌二醇對(duì)ERα和ERβ競(jìng)爭(zhēng)的能力。所用試驗(yàn)方法使人們可確定特定的化合物是否與雌激素受體結(jié)合(因此為“雌激素的”),是否對(duì)ERα或ERβ具有選擇性。下面的表1中顯示了代表性化合物實(shí)施例的結(jié)果,以IC50值表示。IC50被定義為降低總17β-雌二醇結(jié)合50%的化合物濃度。簡(jiǎn)要地描述了所用方法。制備表達(dá)人ERα或ERβ雌激素受體配體結(jié)合域(D、E和F)的大腸桿菌(E.coli)粗溶胞產(chǎn)物。將兩種受體和化合物在加有1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的1X Dulbecco′s磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中稀釋。采用高結(jié)合掩蔽的微孔滴定板(high binding masked microtiterplate),將100uL受體(1uG/孔)與2nM[3H]-17β-雌二醇和各種濃度的化合物結(jié)合。在室溫下5-15小時(shí)之后,用DPBS/1mM EDTA洗滌板,通過液體閃爍計(jì)數(shù)確定結(jié)合放射性。
表1本發(fā)明代表性化合物的結(jié)合親和力和受體選擇性;以IC50表示
在該藥理學(xué)試驗(yàn)方法中得到的結(jié)果證明了本發(fā)明化合物為雌激素化合物,許多化合物都對(duì)ERβ受體具有強(qiáng)優(yōu)選的親和力。本發(fā)明涵蓋對(duì)ERβ比對(duì)ERα具有高度優(yōu)選親和力至對(duì)兩種受體具有幾乎相等親和力的化合物。因此,本發(fā)明化合物的活性范圍,至少部分以其受體親和力選擇性曲線(profile)為基礎(chǔ),將有一定跨度。此外,由于每個(gè)新型受體配體復(fù)合物都是獨(dú)一無二的,因此,其與各種輔調(diào)節(jié)蛋白的相互作用也是獨(dú)一無二的,本發(fā)明化合物將根據(jù)其所在的細(xì)胞背景(cellular context)展現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)行為。例如,在一些細(xì)胞類型中,化合物可表現(xiàn)為雌激素激動(dòng)劑,而在其它組織中,表現(xiàn)為雌激素拮抗劑。具有這樣活性的化合物有時(shí)被稱為SERM(選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)。但是,與很多雌激素不同,許多SERM不能增加子宮濕重。這些化合物在子宮中為抗雌激素的,在子宮組織中可完全拮抗雌激素激動(dòng)劑的營養(yǎng)作用。但是,這些化合物在骨、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中卻充當(dāng)雌激素激動(dòng)劑的角色。由于這些化合物的這種組織選擇性性質(zhì),它們可有效用于治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物如人類如女性的由雌激素缺乏(如在某些組織如骨或心血管中)或雌激素過量(如在子宮或乳腺中)引起的或與之相關(guān)的疾病狀態(tài)或綜合征。
甚至除了這樣的細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)之外,本發(fā)明化合物還具有對(duì)一種受體類型表現(xiàn)為激動(dòng)劑而對(duì)另一種受體表現(xiàn)為拮抗劑的功效。例如,已證明化合物可為ERβ拮抗劑同時(shí)又為ERα激動(dòng)劑(參見Meyers,Marvin J.et al.,J.Med.Chem.42(13)2456-2468(1999))。在該系列化合物中,這樣的ERSAA(雌激素受體選擇性激動(dòng)劑拮抗劑)活性提供了藥理學(xué)上獨(dú)特的雌激素活性。
可用其它藥理學(xué)試驗(yàn)方法容易地測(cè)定本發(fā)明代表性化合物的活性曲線。以下簡(jiǎn)要地概述了幾種代表性的試驗(yàn)方法。在美國專利Nos.4,418,068和5,998,402中也提供了對(duì)SERM的藥理學(xué)試驗(yàn)方法,其各自通過引用以其整體結(jié)合到本文中。
大鼠子宮營養(yǎng)/抗子宮營養(yǎng)試驗(yàn)方法所述化合物的雌激素和抗雌激素特性可由未成熟大鼠子宮營養(yǎng)分析(4天)來測(cè)定(參見L.J.Black and R.L.Goode,Life Sciences 261453(1980))。將未成熟Sprague-Dawley大鼠(雌性18天大)分為6組進(jìn)行測(cè)試。每天用50%DMSO/50%鹽水作為注射載體的10μg化合物、100μg化合物、100μg化合物+1μg 17β-雌二醇(用來檢測(cè)抗雌激素能力)和1μg 17β-雌二醇對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行腹膜內(nèi)(ip)注射。在第四天,用CO2窒息處死動(dòng)物,取出它們的子宮并剝?nèi)ザ嘤嗟挠椭?,除去任何流質(zhì),測(cè)定濕重。將一個(gè)角的一小部分用來進(jìn)行組織學(xué)分析,剩余部分用來分離總RNA以評(píng)價(jià)補(bǔ)體成分3的基因表達(dá)。
六(6)周卵巢切除大鼠試驗(yàn)方法-骨和心血管保護(hù)得自Taconic(Greenwood,NY)的卵巢切除或假卵巢切除手術(shù)1天后的雌性Sprague Dawley CD大鼠(重量范圍240-275g)。將其置于房間中分為3或4只大鼠/籠,實(shí)行12/12(光線/黑暗)時(shí)間表,無限制提供食物(Purina Mills5K96C大鼠食物)和水。動(dòng)物到來1天后開始所有的試驗(yàn)處理,每周給予7天,共進(jìn)行6周。每個(gè)試驗(yàn)有一組未接受任何處理的年齡相當(dāng)?shù)募偈中g(shù)大鼠作為未作處理的、雌激素充分的(intact,estrogen replete)對(duì)照組。
所有的處理在1%Tween 80的生理鹽水溶液中制備成確定的濃度,以使所述處理體積為0.1mL/100g體重。將17β雌二醇溶于玉米油(20μg/mL)中,皮下給藥0.1mL/大鼠。所有的劑量根據(jù)組平均體重測(cè)量結(jié)果每隔三周調(diào)整一次。
處理開始5周后,試驗(yàn)結(jié)束1周前,評(píng)價(jià)每只大鼠的骨礦物質(zhì)密度(BMD)。采用XCT-960M(pQCT)(Stratec Medizintechnik,Pforzheim,Germany)在麻醉大鼠中評(píng)價(jià)脛骨近端的總密度和骨小梁密度。如下進(jìn)行測(cè)定在掃描前5分鐘,向每只大鼠腹膜內(nèi)注射45mg/kg氯胺酮、8.5mg/kg塞拉嗪和1.5mg/kg乙酰丙嗪進(jìn)行麻醉。
將右后肢通過直徑為25mm的聚碳酸酯管,用帶子綁在丙烯酸樹脂支架上,使踝關(guān)節(jié)成90°角,膝關(guān)節(jié)成180°角。將聚碳酸酯管附著于可支持它與pQCT的孔保持垂直的滑動(dòng)臺(tái)。調(diào)節(jié)所述臺(tái),以使股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端在掃描范圍內(nèi)。二維探查性圖象(scout view)在長(zhǎng)度為10mm和線分辨率為0.2mm下進(jìn)行。當(dāng)監(jiān)控器上顯示探查性圖象之后,定位脛骨近端。從距該點(diǎn)3.4mm遠(yuǎn)處開始pQCT掃描。PQCT掃描厚1mm,三維象素(voxel)(三維象素)大小為0.140mm,由145個(gè)穿過切片(slice)的投影組成。
完成pQCT掃描后,圖像在監(jiān)控器上顯示。劃出包括脛骨但不包括腓骨的相關(guān)區(qū)。用迭代算法自動(dòng)除去軟組織。報(bào)告用mg/cm3表示剩余骨的密度(總密度)。在同心螺旋(concentric spiral)中剝?nèi)ニ龉堑?5%外部分。報(bào)告用mg/cm3表示的剩余骨的密度(骨小梁密度)。BMD評(píng)價(jià)一周后,通過二氧化碳窒息處死大鼠,采集血液進(jìn)行膽固醇檢測(cè)。取出子宮,稱重。采用Cholesterol/HP試劑盒用Boehringer-Mannheim Hitachi 911臨床用分析儀測(cè)定總膽固醇。采用單向方差分析法(ANOVA)與Dunnet′s測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
MCF-7/ERE抗增殖試驗(yàn)方法在DMSO中制備試驗(yàn)化合物的母液(通常為0.1M),然后用DMSO稀釋10-100倍以使操作溶液為1或10mM。將DMSO母液在4℃(0.1M)或-20℃(<0.1M)下儲(chǔ)存。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基[包含10%(v/v)熱滅活胎牛血清、1%(v/v)青霉素-鏈霉素和2mM glutaMax-1的D-MEM/F-12培養(yǎng)基]使MCF-7細(xì)胞一周傳代2次。將所述細(xì)胞置于通氣燒瓶(vented flasks)中在5%CO2/95%加濕空氣孵育箱內(nèi)保持37℃。在處理前一天,將所述細(xì)胞與生長(zhǎng)培養(yǎng)基一起以25,000/孔置入96孔板中在37℃下孵育過夜。
將細(xì)胞在37℃用50μl/孔的1∶10稀釋的腺病毒5-ERE-tk-熒光素酶在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基[包含10%(v/v)熱滅活活性炭處理的胎牛血清、1%(v/v)青霉素-鏈霉素、2mM glutaMax-1、1mM丙酮酸鈉的無酚紅D-MEM/F-12培養(yǎng)基]中感染2小時(shí)。然后將所述細(xì)胞用150μl實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基洗滌一次。最后,將細(xì)胞用150μl/孔的載體(≤0.1%v/vDMSO)或在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中稀釋≥1000-倍的化合物在37℃下處理24小時(shí),每組平行處理8孔。
試驗(yàn)化合物的初期篩選以1μM的單劑量進(jìn)行,其單獨(dú)進(jìn)行試驗(yàn)(激動(dòng)劑模式)或與0.1nM 17β-雌二醇聯(lián)用(EC80;拮抗劑模式)進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)96孔板還包括載體對(duì)照組(0.1%v/v DMSO)和激動(dòng)劑對(duì)照組(0.1或1nM 17β-雌二醇)。劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)以激動(dòng)劑和/或拮抗劑模式,用10-14M到10-5M對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的活性化合物進(jìn)行。從這些劑量反應(yīng)曲線可分別得出EC50和IC50值。每個(gè)處理組的最終的孔包含5μl的3×10-5M ICI-182,780(10-6M終濃度)作為ER拮抗劑對(duì)照。
處理后,將細(xì)胞與25μl/孔的1X細(xì)胞培養(yǎng)溶解試劑(PromegaCorporation)在振搖器上溶解15分鐘。將溶胞產(chǎn)物(20μl)轉(zhuǎn)移到96孔光度計(jì)(luminometer)平板,在MicroLumat LB 96P光度計(jì)(EG & GBerthold)中用100μl/孔的熒光酶底物(Promega Corporation)測(cè)定熒光酶活性。在注射底物前,對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行1秒背景測(cè)量。注射底物后,在1秒延遲后測(cè)定熒光酶活性10秒。將所得數(shù)據(jù)從光度計(jì)傳輸?shù)組acintosh個(gè)人電腦,并用JMP軟件(SAS Institute)分析;該程序從每個(gè)孔的熒光酶值測(cè)定減去背景讀數(shù),然后確定每個(gè)處理的均值和標(biāo)準(zhǔn)差將熒光酶數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化,使用Huber M-估計(jì)器(estimator)下調(diào)逸出的轉(zhuǎn)化觀測(cè)值的權(quán)重。用JMP軟件分析轉(zhuǎn)化和加權(quán)的數(shù)據(jù)用于單向ANOVA(Dunnett′s檢驗(yàn))。將化合物處理組與激動(dòng)劑模式的載體對(duì)照組結(jié)果或與拮抗劑模式的陽性激動(dòng)劑對(duì)照組結(jié)果(0.1nM17β-雌二醇)相比較。對(duì)于開始的單劑量實(shí)驗(yàn),如果化合物處理組結(jié)果與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組有顯著性差異(p<0.05),則所述結(jié)果以相對(duì)于17β-雌二醇對(duì)照組的百分率[即((化合物-載體對(duì)照)/(17β-雌二醇對(duì)照-載體對(duì)照))×100]表示。還用JMP從非線性劑量反應(yīng)曲線確定EC50和/或IC C50值。
抑制LDL氧化-抗氧化劑活性將得自屠宰場(chǎng)的豬主動(dòng)脈洗滌,置入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中,采集主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。為了采集所述細(xì)胞,要避免(tiedoff)主動(dòng)脈的肋間脈管(the intercostal vessels of the aorta),并將主動(dòng)脈的一端夾住。在脈管中置入新鮮的無菌過濾的0.2%膠原酶(SigmaType I),然后夾位脈管的另一端以形成封閉系統(tǒng)。將該主動(dòng)脈在37℃下孵育15-20分鐘,然后收集膠原酶溶液在2000x g離心5分鐘。將每個(gè)沉淀物懸浮于7mL內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中,該培養(yǎng)基包含加有活性炭處理的胎牛血清(FBS;5%)、NuSerum(5%)、L-谷氨酰胺(4mM)、青霉素-鏈霉素(1000U/ml,100μg/ml)和慶大霉素(gentimicin)(75μg/ml)的無酚紅DMEM/Ham′s F12,在100mm培養(yǎng)皿中接種,在5%CO2中在37℃下孵育。20分鐘后,將細(xì)胞用PBS沖洗,加入新鮮培養(yǎng)基,在24小時(shí)后再次重復(fù)該操作。約1周后細(xì)胞融合。通常一周喂飼內(nèi)皮細(xì)胞兩次,當(dāng)融合時(shí),用胰蛋白酶作用,并以1∶7比率接種。使細(xì)胞介導(dǎo)的12.5μg/mL LDL氧化作用在待評(píng)價(jià)化合物(5μM)存在下在37℃下進(jìn)行4小時(shí)。用分析游離醛的TBARS(丙二酰硫脲反應(yīng)性物質(zhì)(thiobarbituric acid reactivesubstances))方法測(cè)定氧化過程的抑制百分率,并用該抑制率表示結(jié)果(Yagi K.,Biochem Med 15212-216(1976))。
D12下丘腦細(xì)胞試驗(yàn)程序D12大鼠下丘腦細(xì)胞亞克隆自RCF17親代細(xì)胞系并冷凍儲(chǔ)存。使它們?cè)贒MEM∶F12(1∶1)、glutaMAX-1(2mM)、青霉素(100U/ml)-鏈霉素(100mg/ml)和10%FBS中常規(guī)生長(zhǎng)。將所述細(xì)胞以亞融合密度(1-4×106細(xì)胞/150mm培養(yǎng)皿)置于包含2-10%活性炭處理的FBS無酚紅培養(yǎng)基(DMEM∶F12、glutaMAX、青霉素-鏈霉素)中。24小時(shí)后用包含2%活性炭處理過的血清的培養(yǎng)基再次喂飼(refed)細(xì)胞。為了測(cè)試激動(dòng)劑活性,將細(xì)胞用10nM 17β-雌二醇或各種劑量的試驗(yàn)化合物(1mM或1pM-1mM范圍)處理。為了測(cè)試拮抗劑活性,將細(xì)胞用0.1nM 17β-雌二醇在沒有或有不同劑量(100pM-1mM)的試驗(yàn)化合物存在下處理。對(duì)照培養(yǎng)皿也用DMSO處理作為陰性對(duì)照。激素加入48小時(shí)后,細(xì)胞溶解,進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)程序?qū)τ诿總€(gè)結(jié)合試驗(yàn)程序,將100-150mg蛋白與10nM3H-R5020+100-倍過量的R5020在150mL體積中孵育。在96孔板上制備一式3份反應(yīng)物(3個(gè)有R5020,3個(gè)沒有R5020)。首先加入蛋白提取物,接著加入3H-R5020或3H-R5020+100x未標(biāo)記的R5020。將反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1-2小時(shí)。通過加入100mL冷5%活性炭(Norit SX-4)、pH 7.4的0.5%葡聚糖69K(Pharmacia)的TE溶液終止反應(yīng)。5分鐘后,在室溫下離心(5分鐘,1000RCF,4℃)分離結(jié)合和未結(jié)合的配體。除去上清液(~150ml),轉(zhuǎn)移到閃爍瓶中。然后加入閃爍液(Beckman Ready Protein+),在閃爍計(jì)數(shù)器中將樣品計(jì)數(shù)1分鐘。
CNS視前區(qū)的孕酮受體將六十(60)日齡的雌性Sprague-Dawley大鼠切除卵巢。將所述動(dòng)物裝在配有12小時(shí)光線、12小時(shí)黑暗光周期的籠中,可自由使用自來水和嚙齒類動(dòng)物食物。
將切除卵巢的動(dòng)物隨機(jī)分組,注射載體(50%DMSO,40%PBS,10%乙醇載體)、17β-雌二醇(200ng/kg)或試驗(yàn)化合物。另外的動(dòng)物在注射17β-雌二醇前1小時(shí)注射試驗(yàn)化合物以評(píng)價(jià)該化合物的拮抗特性。皮下(sc)注射6小時(shí)后,用致死劑量的CO2處死動(dòng)物,收集它們的大腦并冷凍。
將從動(dòng)物收集的組織在恒冷切片機(jī)上在-16℃切片,收集在甲硅烷包被的載玻片上。然后將裝有切片的載玻片在保持在42℃的載玻片加熱器上干燥,并在-80℃下儲(chǔ)存于干燥的載玻片盒中。在處理前,將干燥的載玻片盒緩慢升至室溫(用12-16小時(shí)升至-20℃;再用2小時(shí)升至4℃;再用1小時(shí)升至室溫)以避免載玻片上的冷凝形成,并因此使組織和RNA的降解最小化。將干燥的載玻片裝在金屬支架上,在4%多聚甲醛(pH 9.0)中后固定(post-fixed)5分鐘,并用如前所述的方法處理。
將包含大鼠PR cDNA 9(配體結(jié)合區(qū)域)的815bp片段的質(zhì)粒線性化,并用來產(chǎn)生可與大鼠PR mRNA的一部分互補(bǔ)的S 35-UTP標(biāo)記的探針。將處理過的裝有切片的載玻片與200ml包含核糖核酸探針(4-6×106DPM/片)和50%甲酰胺的雜交混合物雜交,并在55℃的加濕室中孵育過夜。第二天早上,將該載玻片置于浸在2xSSC(0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉;pH 7.0)/10mM DTT的金屬支架上。將支架全部轉(zhuǎn)移到大容器中,在2xSSC/10mM DTT中在室溫和輕微攪拌下洗滌15分鐘。然后將載玻片在Rnase緩沖液中在37℃下洗滌30分鐘,在37℃下用RNase A(2mg/ml)處理30分鐘,然后在室溫1xSSC中洗滌15分鐘。然后,將載玻片在0.1xSSC在65℃下洗滌(2×30分鐘)以除去非特異性標(biāo)記,在室溫0.1xSSC中沖洗15分鐘,用梯度系列的乙醇∶乙酸銨(70%、95%和100%)脫水。將風(fēng)干的載玻片在x-射線膠片上曝光3天,然后顯影處理。將得自所有動(dòng)物的載玻片一起雜交、洗滌、曝光并顯影處理以消除條件上的測(cè)定間差異引起的差別。
大鼠熱潮紅-CNS作用切除卵巢的60日齡的Sprague-Dawley大鼠,經(jīng)下面的手術(shù)得到。至少要在第一次處理前8天做手術(shù)。將動(dòng)物在12/12小時(shí)光線/黑暗周期下各自裝籠,給予無限量的標(biāo)準(zhǔn)大鼠食物和水。
在每個(gè)試驗(yàn)中包括兩個(gè)對(duì)照組。根據(jù)mg/kg平均組體重在10%DMSO的芝麻油溶液中(sc試驗(yàn))或在1.0%Tween 80的鹽水溶液中((po)試驗(yàn))配置劑量。給予動(dòng)物劑量范圍為0.01-10mg/kg平均組體重的試驗(yàn)化合物。每個(gè)試驗(yàn)中包括載體和乙炔基雌二醇(EE)對(duì)照(0.1mg/kg,sc或0.3mg/kg,po)的對(duì)照組。當(dāng)測(cè)定化合物的拮抗劑活性時(shí),對(duì)于sc或po試驗(yàn)分別同時(shí)給予0.1或0.3mg/kg的EE。試驗(yàn)化合物一直給藥到測(cè)定尾部皮膚溫度的那天。
在4天的適應(yīng)期之后,用感興趣的化合物每天一次處理動(dòng)物。每處理組有10動(dòng)物??稍陬i部的頸背處sc注射0.1ml或po 0.5ml體積的化合物。在處理的第三天,皮下植入嗎啡微型片(75mg硫酸嗎啡)。在處理的第五天,再植入1或2個(gè)嗎啡微型片。在第八天,給約半數(shù)的動(dòng)物注射氯胺酮(80mg/kg,肌肉注射),將與MacLab數(shù)據(jù)獲得系統(tǒng)(API儀器,Milford,MA)連接的熱電偶綁在距尾根處約1英寸的尾巴上。該系統(tǒng)可連續(xù)測(cè)量尾部皮膚的溫度。測(cè)定溫度基線15分鐘,然后皮下給予納洛酮(1.0mg/kg)(0.2mL)以阻滯嗎啡的作用,1小時(shí)后測(cè)定尾部皮膚溫度。在第九天,安排對(duì)剩余的動(dòng)物進(jìn)行同樣的分析。
分離的大鼠主動(dòng)脈環(huán)的血管舒縮功能將Sprague-Dawley大鼠(240-260g)分成4組1.正常未切除卵巢的(intact)2.切除卵巢的(ovex)用載體處理的3.切除卵巢的用17-β雌二醇處理的(1mg/kg/天)4.切除卵巢的用試驗(yàn)化合物處理(即1mg/kg/天)的動(dòng)物。
在處理前約3周對(duì)動(dòng)物進(jìn)行卵巢切除。通過胃管飼法給予每只動(dòng)物1mg/kg/天硫酸17-β雌二醇或懸浮于含1%Tween-80的蒸餾的、去離子水的試驗(yàn)化合物。給予載體處理動(dòng)物藥物處理組中所用的適當(dāng)體積的載體。
通過吸入CO2和放血法處死動(dòng)物??焖僖瞥鏊鼈兊男刂鲃?dòng)脈并置于具有下述成分的37℃的生理溶液中(mM)NaCl(54.7)、KCl(5.0)、NaHCO3(25.0)、MgCl2-2H2O(2.5)、D-葡萄糖(11.8)和充有95%/5%CO2-O2的CaCl2(0.2),終pH為7.4。將血管外膜從外表面除去,將血管切成2-3mm寬的環(huán)。將所述環(huán)懸浮于10mL組織浴中,環(huán)的一端與所述浴的底部相連另一端與力傳感器相連。在所述環(huán)上加1g的靜息張力。將環(huán)保持平衡1小時(shí),同時(shí)獲取信號(hào)并分析。
平衡后,將所述環(huán)暴露于遞增濃度的去氧腎上腺素(10-8-10-4M)并記錄張力。然后用新鮮緩沖液沖洗浴3次。洗凈后,將200mML-NAME加入到組織浴中,保持平衡30分鐘。然后重復(fù)去氧腎上腺素濃度反應(yīng)曲線。
8-臂放射狀迷宮-認(rèn)知增強(qiáng)作用采用剛到的雄性重200-250g的Sprague-Dawley,CD大鼠(Charles River,Kingston,NY)。將大鼠裝在自由飲食標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食物和水的籠中一周,每籠六只。所居住的飼養(yǎng)室保持22℃,12/12小時(shí)光/暗周期循環(huán),光照在6:00AM開始。習(xí)慣了該設(shè)施后,將動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)并使其保持自由進(jìn)食時(shí)體重的85%。一旦達(dá)到穩(wěn)定重量,將大鼠置于8臂放射迷宮中適應(yīng)環(huán)境。
對(duì)Peele和Baron(Pharmacology,Biochemistry,and Behavior29143-150(1988))設(shè)計(jì)的迷宮做了改動(dòng),形成8臂迷宮結(jié)構(gòu)。將迷宮提高到75.5cm高度,該迷宮包括環(huán)狀區(qū)域和周圍的8個(gè)臂,8個(gè)臂從中心伸出,呈放射狀,相互間等距。每個(gè)臂長(zhǎng)58cm,高13cm。開始每個(gè)時(shí)間段之前,將透明有機(jī)玻璃筒降低,以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入迷宮的中心部分。迷宮的每個(gè)臂裝配有3套光電池,通過數(shù)據(jù)采集裝置,最終與計(jì)算機(jī)相連。光電池用來示蹤大鼠在迷宮中的活動(dòng)。顆粒喂食器放在每個(gè)臂末端的食物杯上方,當(dāng)臂的外部光電池在給定的時(shí)間段內(nèi)第一次活化時(shí),喂食器給出兩個(gè)45mg的巧克力顆粒。迷宮置于測(cè)試室中,用黑和白色幾何圖形貼在每個(gè)壁上作為視覺提示。在訓(xùn)練和測(cè)試程序的整個(gè)過程中,都可聽到白噪聲(~70db)。
訓(xùn)練程序包括5個(gè)階段,每個(gè)階段的每天的時(shí)間段持續(xù)5-10分鐘。在將大鼠放進(jìn)迷宮中心部分與將透明筒升高開始計(jì)時(shí)之間加上10秒鐘的延遲時(shí)間。在階段1期間,兩只限食的大鼠被置于迷宮中,45mg的巧克力食物粒散在分布于迷宮的8個(gè)臂中。在階段II期間,將每只大鼠單獨(dú)置于迷宮中10分鐘,食物粒散在分布于各臂的食物杯的中部光電池處。在階段III期間,將每只大鼠置于迷宮中10分鐘,食物粒僅置于各臂的食物杯周圍。在階段IV,給每只大鼠10分鐘從每個(gè)臂收集兩個(gè)食物粒。重進(jìn)入臂被認(rèn)為是錯(cuò)誤。將大鼠每天以該方式訓(xùn)練直到它們達(dá)到在連續(xù)3天的訓(xùn)練中總錯(cuò)誤小于或等于2個(gè)的表現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)??傔m應(yīng)和訓(xùn)練時(shí)間為約3周。
試驗(yàn)化合物在磷酸鹽緩沖鹽水中制備,以1ml/kg的體積給藥。用東莨菪堿HBr(0.3mg/kg sc)作為損傷劑,使錯(cuò)誤率增加(失憶)。在任何給定的試驗(yàn)日首次暴露于迷宮前的30分鐘,腹膜內(nèi)給予試驗(yàn)化合物,同時(shí)給予東莨菪堿。
為了評(píng)價(jià)試驗(yàn)化合物,設(shè)計(jì)了可重復(fù)測(cè)量的8×8平衡拉丁方,以用最少的試驗(yàn)動(dòng)物達(dá)到高實(shí)驗(yàn)效率的目的。八個(gè)試驗(yàn)時(shí)間段,每周兩個(gè),在每個(gè)時(shí)間段隨機(jī)進(jìn)行8種處理(載體、東茛菪堿、3個(gè)劑量的試驗(yàn)化合物與東茛菪堿聯(lián)用)。每個(gè)處理之間的時(shí)間保持一致。因此,每個(gè)處理的殘余效果可被估計(jì)并從直接處理效果中除去。按照ANOVA,采用對(duì)校正均數(shù)的Dunnett′s雙向檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。
在首次面對(duì)迷宮期間未在5分鐘內(nèi)做4次正確選擇的動(dòng)物,或在第二次面對(duì)迷宮結(jié)束時(shí)總計(jì)未做8個(gè)選擇的動(dòng)物被認(rèn)為在所述時(shí)間段“超時(shí)”(″timed-out″)。從分析中排除任何給予超過一劑量的實(shí)驗(yàn)化合物后“超時(shí)”的動(dòng)物。
神經(jīng)保護(hù)作用對(duì)在原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)物中的細(xì)胞時(shí)間依賴型死亡的抑制作用(Inhibition of Time-Dependent Death of Cells in Primary CorticalNeuron Cultures)用變動(dòng)的Monyer et al.,Brain Research 483347-354(1989)中描述的方法從0-1日齡的大鼠腦制備原代皮質(zhì)神經(jīng)元(Primary corticalneurons)。將分散的腦組織在DMEM/10%PDHS(懷孕供體馬血清)中生長(zhǎng)3天,然后用阿糖胞苷(ARC)處理2天以除去污染的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在第5天,除去ARC培養(yǎng)基,用DMEM/10%PDHS代替。在使用前將神經(jīng)元細(xì)胞再培養(yǎng)4-7天。
對(duì)照原代神經(jīng)元培養(yǎng)物在培養(yǎng)中的第12-18天顯示出程序性細(xì)胞死亡。在第9天向保持在DMEM和10%PDHS中的6個(gè)培養(yǎng)物中加入試驗(yàn)化合物并保持剩下的培養(yǎng)作為對(duì)照之后,在第12天和16天對(duì)12個(gè)培養(yǎng)物的乳酸脫氫酶(LD)的水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。LD用Wroblewski et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.90210-213(1955)中描述的方法的變更方法來測(cè)定。LD為胞質(zhì)酶,通常在臨床和基礎(chǔ)研究中用于測(cè)定組織生存能力。培養(yǎng)基中LD的增加與細(xì)胞死亡直接相關(guān)。
對(duì)抗由低血糖引起的細(xì)胞毒性的神經(jīng)保護(hù)作用將得自美國組織培養(yǎng)中心(ATCC)的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以1×106細(xì)胞/ml的濃度置于裝在FALCON25cm2組織培養(yǎng)燒瓶中的含F(xiàn)BS的RPMI培養(yǎng)基中。在低血糖開始前4小時(shí),棄去維持培養(yǎng)基,用合適的培養(yǎng)基洗滌單層兩次,然后在無血清或無血清加試驗(yàn)化合物中在37℃下孵育4小時(shí)。在加入合適的葡萄糖處理之前,用Kreb′s Ringer磷酸鹽緩沖液洗滌單層2次。RPMI培養(yǎng)基包含2mg葡萄糖/mL;將燒瓶分為6組,每組接受100%葡萄糖(2mg/ml)、80%葡萄糖(1.6mg/ml)、60%葡萄糖(1.2mg/ml)或0%葡萄糖(緩沖劑)或添加有試驗(yàn)化合物。將所有燒瓶孵育20小時(shí),然后用錐蟲藍(lán)進(jìn)行總、活和死細(xì)胞數(shù)目評(píng)價(jià)。
對(duì)抗興奮毒性氨基酸的神經(jīng)保護(hù)作用(Neuroprotection AgainstExcitotoxic amino Acids)將包含SK-N-SH成神經(jīng)瘤細(xì)胞的五個(gè)培養(yǎng)皿用試驗(yàn)化合物處理,并將5個(gè)培養(yǎng)皿用RPMI培養(yǎng)基處理。四小時(shí)后,將所有細(xì)胞用NMDA(500μM)處理5分鐘。測(cè)定總活細(xì)胞和死細(xì)胞。
對(duì)抗缺氧缺糖的神經(jīng)保護(hù)作用(Neuroprotection Against Oxygen-Glucose Deprivation)-分析固縮核來測(cè)定細(xì)胞凋亡(Analysis of pyknoticnuclei to measure apoptosis)將從E18大鼠胎兒制備的皮質(zhì)神經(jīng)元以100,000細(xì)胞/孔的密度置于用聚-D-賴氨酸(poly-D-lysine)(10ng/ml)和血清預(yù)包被的8孔小室載玻片中。將細(xì)胞置于包含10%FCS的高糖DMEM中,并置于充有10%CO2/90%空氣的37℃的孵育箱中。第二天,通過用包含B27添加物的高糖DMEM更換培養(yǎng)基來除去血清,并將細(xì)胞置于孵育箱中不再變化培養(yǎng)基直至實(shí)驗(yàn)的那天。在第6天,將載玻片分為兩組對(duì)照組和OGD組。對(duì)照組的細(xì)胞接受含葡萄糖和定制的B27(無抗氧化劑)的DMEM。OGD組的細(xì)胞接受在真空下除氣15分鐘的含定制B27的無葡萄糖DMEM。將細(xì)胞在氣密室中用90%N2/10%CO2沖洗10分鐘,并在37℃下孵育6小時(shí)。6小時(shí)后,將對(duì)照組和OGD組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基更換,將其置于包含載體(DMSO)或在含定制B27的含葡萄糖DMEM中的試驗(yàn)化合物的培養(yǎng)基中。將細(xì)胞送回含氧量正常的37℃的孵育箱。24小時(shí)后,將細(xì)胞在4℃下在4%PFA中固定10分鐘,用Topro(熒光細(xì)胞核結(jié)合染料)染色。用激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過測(cè)定固縮核來評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡。
作為細(xì)胞死亡指征的LDH釋放的測(cè)定將從E18大鼠胎兒制備的皮質(zhì)神經(jīng)元以150,000細(xì)胞/孔的密度置于用聚-D-賴氨酸(10ng/ml)和血清預(yù)包被的48孔培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞置于包含10%FCS的高糖DMEM中,并置于充有10%CO2/90%空氣的37℃的孵育箱中。第二天,通過用包含B27添加物的高糖DMEM更換培養(yǎng)基來除去血清。在第6天,將細(xì)胞分為兩組對(duì)照組和OGD組。對(duì)照組的細(xì)胞接受含葡萄糖和定制的B27(無抗氧化劑)的DMEM。OGD組的細(xì)胞接受在真空下除氣15分鐘的含定制B27的無葡萄糖DMEM。在氣密室中將細(xì)胞用90%N2/10%CO2沖洗10分鐘,并在37℃下孵育6小時(shí)。6小時(shí)后,將對(duì)照組和OGD組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基更換,將其置于包含載體(DMSO)或在含定制B27的含葡萄糖DMEM中的試驗(yàn)化合物的培養(yǎng)基中。將細(xì)胞送回含氧量正常的37℃的孵育箱。24小時(shí)后,通過檢測(cè)細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中的LDH(乳酸脫氫酶)來評(píng)價(jià)細(xì)胞死亡。對(duì)于LDH測(cè)定,將50μl培養(yǎng)基等分試樣轉(zhuǎn)移到96孔板中。加入140μl 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)和100μl 0.2mg/ml NADH后,將板在室溫下置于黑暗中20分鐘。通過加入10μl丙酮酸鈉開始反應(yīng)。將板立即在Thermomax板讀數(shù)器(Molecular Devices)中在340nM處讀數(shù)。每6秒記錄吸光度(NADH濃度的指數(shù)),記錄5分鐘,用表示NADH消失速率的斜率來計(jì)算LDH活性
LDH活性(U/ml)=(ΔA/min)(TCF)(20)(0.0833)/(.78)其中0.0833=正比常數(shù),和0.78=儀器光徑長(zhǎng)(cm)。
HLA大鼠試驗(yàn)方法-Crohn′s病和炎性腸病得自Taconic的雄性HLA-B27大鼠,提供無限制使用的食物(Purina MillsLabDiet500l)和水。在試驗(yàn)開始時(shí),大鼠為22-26周齡。
給大鼠每天皮下注射一劑下面列出的制劑之一,進(jìn)行7天。每組5只動(dòng)物,最后一劑在處死前2小時(shí)給予。
·載體(50%DMSO/50%Dulbecco′s PBS);·17α-乙炔基-17β-雌二醇(10μg/kg);或·試驗(yàn)化合物。
根據(jù)下面的標(biāo)準(zhǔn)每天觀察糞便性質(zhì)并評(píng)分腹瀉=3;軟便=2;正常便=1。在試驗(yàn)操作最后,采集血清并在-70℃下保存。制備結(jié)腸切片以進(jìn)行組織學(xué)分析,其它部分用于髓過氧化物酶活性分析。
下面的方法用于測(cè)定髓過氧化物酶的活性。收集結(jié)腸組織并快速在液氮中冷凍。用整個(gè)結(jié)腸的代表性樣品來確保樣品間的一致性。將所述組織儲(chǔ)存在-80℃待用。然后,將組織稱重(約500mg),并在1∶15w/v of 5mM H2KPO4(pH 6)洗滌緩沖液中勻漿化。將該組織在Sorvall RC 5B離心機(jī)中在2-8℃以20,000xg離心沉淀45分鐘。然后棄去上清液。將組織重懸浮于含10mM EDTA和0.5%Hex溴化銨的2.5mL(1∶5w/v)的50mM H2KPO4中并勻漿化以幫助細(xì)胞內(nèi)MPO溶解。將組織在液氮中冷凍,在37℃的水浴中解凍,并進(jìn)行15秒鐘的聲處理以確保膜溶解。將該程序重復(fù)3次。然后將樣品置于冰上20分鐘,在2-8℃以12,000xg離心15分鐘。按照下面的步驟分析上清液。
通過將含0.167鄰聯(lián)茴香胺/ml的2.9mL的50mM H2KPO4與0.0005%H2O2加入反應(yīng)管中而制得試驗(yàn)混合物。當(dāng)過氧化氫降解時(shí),鄰聯(lián)茴香胺被氧化并在460nm處以濃度依賴方式吸收。將該混合物加熱至25℃。向反應(yīng)管中加入一百(100)μL組織上清液,在25℃下孵育1分鐘,然后取1ml轉(zhuǎn)移到一次性塑料管中。在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)每2分鐘在460nm處相對(duì)于包含2.9mL反應(yīng)混合物和100μL0.5%溴化銨溶液的空白測(cè)定光密度(OD)。
酶活性單位通過將在460nm處的吸收度與用純化人MPO 31.1單位/管繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來定量。將MPO重新溶解并用含10mM EDTA和0.5%Hex溴化銨的50mM H2KPO4連續(xù)稀釋成4個(gè)已知濃度。將樣品吸收度與該曲線相比較以確定活性。
如下進(jìn)行組織學(xué)分析。將結(jié)腸組織浸于10%中性緩沖的福爾馬林中。將每個(gè)結(jié)腸樣品分為四個(gè)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。將福爾馬林固定的組織在真空抽濾機(jī)中處理以進(jìn)行石蠟包埋。將樣品在以5μm厚度切片,然后用蘇木精和伊紅(H&E)染色,采用有所改動(dòng)的Boughton-Smith評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)盲評(píng)。評(píng)分完成后,使樣品脫盲,將數(shù)據(jù)列表,用多重均值比較通過ANOVA線性模型進(jìn)行分析。
根據(jù)本文描述標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)試驗(yàn)方法中得到的結(jié)果,本發(fā)明的化合物為雌激素受體調(diào)節(jié)劑,可有效用于治療或抑制至少部分由雌激素缺乏或過量介導(dǎo)的或可通過使用雌激素藥物來治療或抑制的癥狀、病癥和疾病狀態(tài)。
在此專利文件中提到的每個(gè)專利、申請(qǐng)和印刷的出版物,包括書,都通過引用以其整體結(jié)合到本文中。該申請(qǐng)要求了2004年9月7日提交的序列號(hào)為60/607,766的美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán),其通過引用以其整體結(jié)合到本文中。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會(huì)了解對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案可做許多不偏離本發(fā)明精神的改變和修飾。所有這些變更都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種具有下述結(jié)構(gòu)的式I化合物 其中A和A′各自獨(dú)立為OH、H或OR;每個(gè)R獨(dú)立選自C1-C6烷基、烯基、芐基、?;?、芳?;?C(=O)-OR′、磺?;土柞;?,其中每個(gè)R′獨(dú)立選自C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基或C3-C10環(huán)烷基,各自任選被1-3個(gè)選自C1-C6烷基或鹵素的取代基取代;R1和R2獨(dú)立選自H、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6全鹵代烷基、CF3、C2-C7烯基和C1-C6烷氧基;R3、R4、R5和R6各自獨(dú)立選自H、鹵素、CF3、C1-C6全鹵代烷基、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、CN、-CHO、酰基、苯基、芳基和雜芳基;其中R3、R4、R5和R6的烷基或烯基部分各自可任選被最多3個(gè)獨(dú)立選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、OH、CN、三氟烷基、三氟烷氧基、NO2或苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3、R4、R5和R6的炔基部分各自可任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、-CHO、?;⑷榛?、三烷基甲硅烷基或苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3、R4、R5和R6的苯基、芳基或雜芳基部分各自可任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、烷基、烷氧基、全氟烷基或全氟烷氧基;每個(gè)R10獨(dú)立選自鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、-OH、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、-NO2、氨基、C1-C6烷基氨基、二-(C1-C6)烷基氨基、巰基和C1-C6烷硫基;和n為0、1、2或3;條件是A和A′中至少一個(gè)不為H;如果n為0,則R3不為鹵素;和R3、R4和R5中至少一個(gè)為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、?;?、苯基、芳基或雜芳基;或其N-氧化物或其藥學(xué)可接受鹽或其前藥。
1.權(quán)利要求1的化合物,其中A和A′各自為OH。
2.權(quán)利要求1的化合物,其中A和A′之一為OH,A和A′中的另外一個(gè)為OR。
3.權(quán)利要求1的化合物,其中A和A′之一為OH,A和A′中的另外一個(gè)為O-C1-C6烷基。
4.權(quán)利要求1的化合物,其中A和A′各自為OR。
5.權(quán)利要求5的化合物,其中A和A′各自為-O-C1-C6烷基。
6.權(quán)利要求1的化合物,其中A和A′之一為H,A和A′中的另外一個(gè)為OH或OR。
7.權(quán)利要求1的化合物,其中A和A′之一為H,A和A′中的另外一個(gè)為OH或O-C1-C6烷基。
8.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物,其中R3和R5各自獨(dú)立為H、鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO、?;蛉缜八龅娜芜x取代的苯基。
9.權(quán)利要求9的化合物,其中R3不為H。
10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物,其中R3為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO或任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代的苯基鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基和CN;且R5為H、鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO或任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代的苯基鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基和CN。
11.權(quán)利要求11的化合物,其中所述R3的所述苯基任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代F、Cl、Br、CN、OCH3和CF3。
12.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物,其中R3為鹵素、C2-C7炔基或-CN。
13.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物,其中R3和R5各自獨(dú)立為鹵素、C2-C7炔基或-CN。
14.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的化合物,其中R1和R2之一為鹵素。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的化合物,其中R1和R2之一為氟。
16.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的化合物,其中R1和R2之一為鹵素,R1和R2中的另外一個(gè)為H。
17.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的化合物,其中R1和R2之一為氟,R1和R2中的另外一個(gè)為H。
18.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的化合物,其中R1和R2各自獨(dú)立為鹵素。
19.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的化合物,其中R1和R2各自為H。
20.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的化合物,其中R1和R2各自為氟。
21.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的化合物,其中R4為H、鹵素或-CN。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的化合物,其中R4為H。
23.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的化合物,其中R3為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO或任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代的苯基鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基和CN;R5為H、鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、-CN、-CHO或任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代的苯基鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基和CN;R1和R2之一為鹵素;且R4為H、鹵素或-CN。
24.權(quán)利要求2的化合物,其中R3為鹵素,且R1、R2、R4、R5和R6為氫。
25.權(quán)利要求2的化合物,其中R3為OH,且R1、R2、R4、R5和R6為氫。
26.權(quán)利要求2的化合物,其中R3為C2-C7烯基,且R1、R2、R4、R5和R6為氫。
27.權(quán)利要求2的化合物,其中R3為CN,且R1、R2、R4、R5和R6為氫。
28.權(quán)利要求2的化合物,其中R3為C2-C7炔基,且R1、R2、R4、R5和R6為氫。
29.權(quán)利要求6的化合物,其中R3為C1-C6烷基,且R1、R2、R4、R5和R6為氫。
30.權(quán)利要求6的化合物,其中R3為任選取代的苯基,且R1、R2、R4、R5和R6為氫。
31.權(quán)利要求31的化合物,其中所述苯基的所述取代基選自鹵素、C1-C6烷氧基、全氟烷基和CN。
32.權(quán)利要求1-23或25-32中任一項(xiàng)的化合物,其中n為1。
33.權(quán)利要求24的化合物,其中n為1。
34.一種化合物,其為a)3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉-7-醇;b)7-氯-3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;c)7-溴-3,9-二甲氧基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;d)7-氯-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;e)7-溴-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;f)3,9-二羥基-7-乙烯基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;g)3,9-二羥基-7-[(三甲基甲硅烷基)乙炔基]-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;h)3,9-二羥基-7-乙炔基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;i)3,9-二羥基-7-乙基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;j)7-氰基-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;k)7-(4-氯苯基)-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;l)7-(4-氰基苯基)-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;m)3,9-二羥基-7-(4-甲氧基苯基)-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;n)3,9-二羥基-7-[4-(三氟甲基)苯基]-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;o)7-(3-氯苯基)-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;p)3,9-二羥基-7-(3-甲氧基苯基)-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;q)7-(3-氰基苯基)-3,9-二羥基-6H-色原烯并[4,3-b]喹啉;或其藥學(xué)可接受鹽、螯合物、絡(luò)合物或前藥。
35.一種組合物,所述組合物包含權(quán)利要求35的化合物。
36.一種組合物,所述組合物包含權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的化合物。
37.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的骨質(zhì)疏松或抑制骨脫礦質(zhì)作用的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
38.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的腸炎、Crohn′s病、潰瘍性直腸炎或結(jié)腸炎的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
39.一種降低需要其的哺乳動(dòng)物的膽固醇、甘油三酯、Lp(a)或LDL水平;抑制或治療需要其的哺乳動(dòng)物的高膽固醇血癥;高脂血癥;心血管疾?。粍?dòng)脈粥樣硬化(atheroclerosis);外周血管疾??;再狹窄或血管痙攣;或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的血管損傷的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
40.一種向需要其的哺乳動(dòng)物提供認(rèn)知增強(qiáng)作用或神經(jīng)保護(hù)作用;或治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的老年癡呆、Alzheimer′s病、認(rèn)知減退、中風(fēng)、焦慮癥或神經(jīng)退化性疾病的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
41.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的自由基誘導(dǎo)的疾病狀態(tài)的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
42.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的陰道或外陰萎縮;萎縮性陰道炎;陰道干燥;瘙癢癥;性交困難;排尿困難;尿頻;尿失禁;泌尿道感染的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
43.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的血管舒縮癥的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
44.權(quán)利要求44的方法,其中所述血管舒縮癥為熱潮紅。
45.一種使需要其的哺乳動(dòng)物避孕的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
46.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松或脊椎關(guān)節(jié)病的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
47.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的繼關(guān)節(jié)鏡或手術(shù)操作而發(fā)生的關(guān)節(jié)損傷的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
48.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的不育癥的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
49.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的局部缺血、再灌注損傷、哮喘、胸膜炎、多發(fā)性硬化癥、全身性紅斑狼瘡、肌痛、關(guān)節(jié)痛、失眠癥、易激癥、眼葡萄膜炎、膿毒癥、出血性休克或II型糖尿病的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
50.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的低鈣血癥、高鈣血癥、Paget′s病、骨軟化癥、骨鈣質(zhì)缺乏、多發(fā)性骨髓瘤的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
51.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的良性或惡性異常組織增生包括前列腺肥大、子宮平滑肌瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜息肉、良性乳房疾病、子宮腺肌病、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌或CNS癌的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
52.權(quán)利要求52的方法,其中所述良性或惡性異常組織增生為前列腺肥大、子宮平滑肌瘤、乳腺癌、癌癥、多囊性卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜息肉、良性乳房疾病、子宮腺肌病、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌或CNS癌。
53.權(quán)利要求53的方法,其中所述CNS癌為神經(jīng)膠質(zhì)瘤或成星形細(xì)胞瘤。
54.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥或外傷、骨病、衰老、炎性疾病、外周血管疾病、自身免疫性疾病、呼吸性窘迫、肺氣腫、病毒性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎、肺結(jié)核、銀屑病、成人呼吸性窘迫綜合征的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
55.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的皮膚萎縮、痤瘡或男性型禿發(fā)的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
56.一種治療或抑制需要其的哺乳動(dòng)物的白血病、子宮內(nèi)膜切除、慢性腎臟疾病、肝病或血凝固疾病或病癥的方法,所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物提供有效量的權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的一種或多種化合物。
57.一種制備式IV化合物的方法 其中A和A′各自獨(dú)立為OH、H或OR;每個(gè)R獨(dú)立選自C1-C6烷基、烯基、芐基、?;⒎减;?、-C(=O)-OR′、磺?;土柞;?,其中每個(gè)R′獨(dú)立選自C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基或C3-C10環(huán)烷基,各自任選被1-3個(gè)選自C1-C6烷基或鹵素的取代基取代;R1和R2獨(dú)立選自H、鹵素、C1-C6烷基、C1-C6全鹵代烷基、CF3、C2-C7烯基和C1-C6烷氧基;R3、R4、R5和R6各自獨(dú)立選自H、鹵素、CF3、C1-C6全鹵代烷基、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、CN、-CHO、?;?、苯基、芳基和雜芳基;其中R3、R4、R5和R6的烷基或烯基部分各自可任選被最多3個(gè)獨(dú)立選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、OH、CN、三氟烷基、三氟烷氧基、NO2或苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3、R4、R5和R6的炔基部分各自可任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、-CHO、酰基、三氟烷基、三烷基甲硅烷基或苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3、R4、R5和R6的苯基、芳基或雜芳基部分各自可任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、烷基、烷氧基、全氟烷基或全氟烷氧基;每個(gè)R10獨(dú)立選自鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、-OH、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、-NO2、氨基、C1-C6烷基氨基、二-(C1-C6)烷基氨基、巰基和C1-C6烷硫基;和n為0、1、2或3;條件是A和A′中至少一個(gè)不為H;如果n為0,則R3不為鹵素;和R3、R4和R5中至少一個(gè)為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、酰基、苯基、芳基或雜芳基;或其N-氧化物或其藥學(xué)可接受鹽或其前藥。包括以下步驟a)提供式II的化合物 和;b)將式II化合物與式III化合物反應(yīng) 產(chǎn)生式IV化合物。
58.權(quán)利要求58的方法,還包括將式IV化合物與修飾試劑接觸形成式I化合物的步驟 其中R3選自H、鹵素、CF3、C1-C6全鹵代烷基、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、CN、-CHO、?;?、苯基、芳基和雜芳基;其中R3的烷基或烯基部分任選被最多3個(gè)獨(dú)立選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、OH、CN、三氟烷基、三氟烷氧基、NO2和苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3的炔基部分任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、-CHO、?;?、三氟烷基、三烷基甲硅烷基和苯基,其中所述苯基任選被最多3個(gè)獨(dú)立選擇的R10基團(tuán)取代;其中R3的苯基、芳基或雜芳基部分任選被最多3個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基取代鹵素、-CN、烷基、烷氧基、全氟烷基或全氟烷氧基;條件是A和A′中至少一個(gè)不為H;如果n為0,則R3不為鹵素;和R3、R4和R5中至少一個(gè)為鹵素、C1-C6烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C6烷氧基、-CN、-CHO、?;?、苯基、芳基或雜芳基;或其N-氧化物或其藥學(xué)可接受鹽或其前藥。
59.權(quán)利要求58的方法的產(chǎn)物。
60.權(quán)利要求59的方法的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有式I結(jié)構(gòu)的6H-[1]苯并吡喃并[4,3-b]喹啉化合物。本發(fā)明還提供了包含所述化合物的組合物、使用所述化合物的方法以及所述化合物的制備方法。
文檔編號(hào)A61K31/47GK101052641SQ200580037955
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月7日
發(fā)明者A·-T·伍 申請(qǐng)人:惠氏公司