本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物及其鹽、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

螺吲哚酮骨架作為天然產(chǎn)物和活性分子的優(yōu)勢(shì)骨架，受到了有機(jī)合成和藥物化學(xué)研究人員的廣泛關(guān)注。目前，已經(jīng)報(bào)道了多樣性的螺吲哚酮類化合物，并發(fā)現(xiàn)具有廣泛的藥理活性，如孕激素受體調(diào)節(jié)劑(jaye.wrobeletal，design,synthesis,andsarofnewpyrrole-oxindoleprogesteronereceptormodulatorsleadingto5-(7-fluoro-3,3-dimethyl-2-oxo-2,3-dihydro-1h-indol-5-yl)-1-methyl-1h-pyrrole-2-carbonitrile(way-255348),j.med.chem.2008,51:1861-1873)、抗艾滋病(singhrk.etal,rhodium(ii)acetate-catalyzedstereoselectivesynthesis,sarandanti-hivactivityofnoveloxindolesbearingcyclopropanering,eur.j.med.chem.2011,46:1181-1188)、抗腫瘤(wo2008055812a1)、抗結(jié)核病(waldmann,h.etal,identificationofthiazolidinonesspiro-fusedtoindolin-2-onesaspotentandselectiveinhibitorsofthemycobacteriumtuberculosisproteintyrosinephosphataseb,angew.chem.int.ed.engl.2010,49:5902-5905)、抗瘧疾(diagana,t.t.etal,spiroindolones,apotentcompoundclassforthetreatmentofmalaria,science2010,329:1175-1180)和mdm2抑制劑(wang,s.etal,structure-baseddesignofpotentnon-peptidemdm2inhibitors,j.am.chem.soc.2005,127:10130-10131)等。

發(fā)明人在前期工作中，構(gòu)建了兩類新型吲哚酮螺四氫硫代吡喃類衍生物，并發(fā)現(xiàn)其具有很好的體外抗腫瘤活性(公布號(hào)：cn103992334a、cn106565742a)。在此研究基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步對(duì)吲哚酮螺四氫硫代吡喃類衍生物做更深的入的研究和發(fā)現(xiàn)更好的抗腫瘤化合物，發(fā)明人進(jìn)一步構(gòu)建了一類新型吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物及其鹽、制備方法和應(yīng)用。此類化合物具有全新的骨架結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物，包括其消旋體、d-型或l-型異構(gòu)體，該化合物的結(jié)構(gòu)如通式i所示：

其中r1表示苯環(huán)上的取代基，其中苯環(huán)上的取代基是單取代或多取代，取代基表示氫、鹵素、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)羥基烷基、低級(jí)烷氧基、氨基、低級(jí)烷基氨基、低級(jí)鹵代烷基氨基、低級(jí)環(huán)烷基氨基、低級(jí)鏈炔基氨基、硝基、低級(jí)硝基烷基、氰基、低級(jí)氰基烷基、酰胺基、低級(jí)環(huán)烷基酰胺基、低級(jí)酰胺基烷基；

r2表示芳環(huán)取代基團(tuán)，芳環(huán)為苯環(huán)、取代苯環(huán)或雜芳環(huán)；取代苯環(huán)上的取代基為鹵素、低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)烷氧基、氨基、低級(jí)烷基氨基、低級(jí)環(huán)烷基氨基、硝基、酰胺基或低級(jí)環(huán)烷基酰胺基；雜芳環(huán)為吡咯、呋喃、噻吩或吡啶；

r3表示芳環(huán)取代基團(tuán)或低級(jí)烷基側(cè)鏈，芳環(huán)為苯環(huán)、取代苯環(huán)或者雜芳環(huán)；取代苯環(huán)上的取代基為鹵素、低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)烷氧基、氨基、低級(jí)烷基氨基、低級(jí)環(huán)烷基氨基、硝基、酰胺基或低級(jí)環(huán)烷基酰胺基；雜芳環(huán)為呋喃、噻吩、吡咯或吡啶；

r4表示氫、低級(jí)烷基或低級(jí)羰基側(cè)鏈；

x表示：硫原子、亞砜基團(tuán)或砜基團(tuán)；

所述的“低級(jí)環(huán)烷基”是指含3至7個(gè)碳的環(huán)，所述的“低級(jí)鏈炔基氨基”是指相應(yīng)的炔鏈的碳原子數(shù)量為3至6個(gè)，其它所述的“低級(jí)”取代基是指相應(yīng)的脂肪烴基是直鏈或支鏈的、飽和的、并且含1至6個(gè)碳原子。

優(yōu)選地，在r1表示的取代基中，所述鹵素為氟、氯或溴，所述低級(jí)烷基為甲基。

優(yōu)選地，在r2表示的芳環(huán)取代基團(tuán)中，取代苯環(huán)取代基團(tuán)為4-溴苯基、4-甲氧基苯基、3,4-二氯苯基；芳雜環(huán)取代基團(tuán)為呋喃-2基。

優(yōu)選地，在r3表示的芳環(huán)取代基團(tuán)中取代苯環(huán)取代基團(tuán)為：4-氯苯基、4-氟苯基、4-溴苯基、4-硝基苯基、4-甲氧基苯基或2-甲氧基苯基；r3表示的低級(jí)烷基側(cè)鏈為正丙基。

優(yōu)選地，該化合物為如下表1所示的化合物1～21中的任一個(gè)，其結(jié)構(gòu)如通式i(編號(hào)1到21),其中r1、r2、r3、r4、x的組合如下：

表1：優(yōu)選化合物中r1、r2、r3、r4、x的組合方式

一種吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物的制備方法，其特征在于，反應(yīng)流程如下：

具體步驟為：

a、目標(biāo)化合物viii的制備:

a)取代的(e)-1-溴-2-(2-硝基乙烯基)苯的制備：將硝基甲烷、取代的苯甲醛i和醋酸銨加入到乙酸中，并在90～110℃下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化，得到取代的(e)-1-溴-2-(2-硝基乙烯基)苯；優(yōu)選地，按照摩爾量計(jì)，硝基甲烷：取代的苯甲醛＝1：(1.5～1.8)；

b)中間體iii的制備：在二氯甲烷中，加入取代的(e)-1-溴-2-(2-硝基乙烯基)苯、乙酰氯和無水三氯化鐵，20～30℃下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化得到中間體iii；優(yōu)選地，按照摩爾量計(jì)，取代的(e)-1-溴-2-(2-硝基乙烯基)苯：乙酰氯：無水三氯化鐵＝1：(2～2.2)：(1.8～2.1)；

c)中間體v的制備：在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將中間體iii、中間體iv、三乙胺加入到二氯甲烷中，并20～30℃攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完全后，蒸干溶劑，柱層析純化，得到中間體v；優(yōu)選地，按照摩爾量計(jì)，中間體iii：中間體iv＝1：(1.1～1.5)；

d)目標(biāo)化合物viii的制備：在二氯甲烷中，依次加入催化劑vii、中間體v、中間體vi，20～30℃下攪拌，反應(yīng)完全后，蒸干溶劑，殘留物經(jīng)柱層析純化，得到目標(biāo)化合物viii；所述的催化劑vii為l-脯氨酸，用量為中間體v摩爾量的10％優(yōu)選地，按照摩爾量計(jì)，中間體v：中間體vi＝1：(1.1～1.4)；

b、目標(biāo)化合物ix的制備:

在二氯甲烷中，加入化合物viii、取代試劑和4-二甲胺基吡啶，反應(yīng)完全后，柱層析純化，得到目標(biāo)產(chǎn)物ix；

其中，所述取代試劑為酸酐或溴代烷烴；

c、目標(biāo)化合物x的制備:

在二氯甲烷中，加入化合物viii、間氯過氧苯甲酸，在20～30℃下反應(yīng)完全后，柱層析純化，得到硫原子氧化為亞砜基團(tuán)的目標(biāo)產(chǎn)物x；其中，按照摩爾量計(jì)算，化合物viii：間氯過氧苯甲酸＝1：(1.3～1.8)；

在二氯甲烷中，加入化合物viii、間氯過氧苯甲酸，在20～30℃下反應(yīng)完全后，柱層析純化，得到硫原子氧化為砜基團(tuán)的目標(biāo)產(chǎn)物x；其中，按照摩爾量計(jì)算，化合物viii：間氯過氧苯甲酸＝1：(4～6)；

d、目標(biāo)化合物xi的制備:

在二氯甲烷中，加入化合物ix、間氯過氧苯甲酸，在20～30℃下反應(yīng)完全后，柱層析純化，得到硫原子氧化為亞砜基團(tuán)的目標(biāo)產(chǎn)物xi；其中，按照摩爾量計(jì)算，化合物ix：間氯過氧苯甲酸＝1：(1.3～1.8)；

在二氯甲烷中，加入化合物ix、間氯過氧苯甲酸，在20～30℃下反應(yīng)完全后，柱層析純化，得到硫原子氧化為砜基團(tuán)的目標(biāo)產(chǎn)物xi；其中，按照摩爾量計(jì)算，化合物ix：間氯過氧苯甲酸＝1：(4～6)；

所述的吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物的可藥用鹽。

所述的吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物或其可藥用鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述的腫瘤為肺癌、腸癌、乳腺癌或肝癌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供具有以下有益的效果：

本發(fā)明提供的吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物，對(duì)a549(人肺癌細(xì)胞)、mcf-7(人乳腺癌細(xì)胞)和腸癌hct116均產(chǎn)生了較為明顯的增殖抑制作用，部分化合物的抗腫瘤活性強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥nutlin-3。如化合物13對(duì)三種細(xì)胞的ic50分別為2.3μm、11.3μm和7.4μm，化合物23對(duì)三種細(xì)胞的ic50分別為1.5μm、8.8μm和5.9μm，nutlin-3對(duì)三種細(xì)胞的ic50分別為10.9μm、21.9μm和17.7μm。本發(fā)明提供的化合物具有全新的骨架結(jié)構(gòu)，含有羥基、氨基等基團(tuán)，有利于進(jìn)一步地快速衍生化；較前期研究成果相比，這些化合物具有全新的骨架結(jié)構(gòu)；而且這類化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可以進(jìn)行抗腫瘤藥物的開發(fā)。

本發(fā)明提供的合成方法，合成路線簡(jiǎn)單，合成原料易得、合成方法容易實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明提供的吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物或其可藥用鹽在制備抗癌藥物制劑中的應(yīng)用，能夠?yàn)榕R床治療提供更多的選擇。

附圖說明

圖1：為化合物1的x單晶衍射數(shù)據(jù)。單晶解析時(shí)，化合物1為消旋體形式。

圖2為實(shí)施例1.2制備的化合物1的ee測(cè)定分析圖，其中，測(cè)定結(jié)果顯示，其ee值為30％。

圖3為實(shí)施例1.1中采用l-脯氨酸制備的化合物1的ee測(cè)定分析圖，其中，測(cè)定結(jié)果顯示，其ee值為-7％。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

以下實(shí)施例所涉化合物對(duì)應(yīng)通式ⅰ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式、¹h-nmr、¹³c-nmr和hrms數(shù)據(jù)詳見表2，其中編號(hào)1～21分別對(duì)應(yīng)表1中的化合物1～21、表3中的化合物1～21、實(shí)施例1～21。

表2本發(fā)明部分優(yōu)選化合物的¹h-nmr,¹³c-nmr和hrms數(shù)據(jù)

實(shí)施例1：化合物1的合成

a中間體(e)-1-溴-2-(2-硝基乙烯基)苯的制備(中間體ii)

參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法(advancedsynthesis&catalysis2013,355:829-835)。將硝基甲烷(7.2ml,0.134mol)、2-溴苯甲醛(4.0g,0.022mol)和醋酸銨(0.20g，2.6mmol)加入到80ml的乙酸中，并在100℃下反應(yīng)10h。反應(yīng)完全后，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯＝100:3)，得到(e)-1-溴-2-(2-硝基乙烯基)苯為黃色固體4.21g，收率為85.4％。

b中間體4-溴-3-氯吲哚-2-酮的制備(中間體iii)

參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法(advancedsynthesis&catalysis2013,355:829-835)。在50ml的二氯甲烷中，加入(e)-1-溴-2-(2-硝基乙烯基)苯(3.2g,14.0mmol)、乙酰氯(2.1ml,29.6mmol)和無水三氯化鐵(4.64g,28.6mmol)，室溫下反應(yīng)3h。反應(yīng)完全后，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化(dcm:meoh＝100:1)，得到4-溴-3-氯吲哚-2-酮為黃白色固體2.25g，收率為65.6％。

c中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮的制備(中間體v)

在20ml的二氯甲烷中，加入4-溴-3-氯吲哚-2-酮(0.3g,1.22mmol)、2-巰基-1-苯乙酮(0.24g,1.59mmol)和0.1ml的三乙胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后，蒸干溶劑，殘留物柱層析純化(dcm:meoh＝100:1)，得到中間體v為黃白色固體0.27g，收率為62％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.11(d,j＝15.5hz,1h),4.34(d,j＝15.5hz,1h),4.48(s,1h),6.82(d,j＝7.4hz,1h),7.10-7.17(m,2h),7.46(t,j＝7.7hz,2h),7.59(t,j＝7.4hz,1h),7.93(d,j＝8.0hz,2h),8.37(s,1h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ36.13,45.49,108.95,120.63,124.97,126.57,128.60(2c),128.68(2c),130.84,133.52,135.55,142.76,175.76,194.37.hrms(esi+)m/zcalculatedforc16h13brno2s(m+h):361.9850,found361.9848.

d目標(biāo)化合物1的制備

在2ml的dcm中，依次加入催化劑vii(0.01mmol)、中間體v(0.10mmol)和vi(0.12mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)3d。反應(yīng)完全后，蒸干溶劑。殘留物經(jīng)柱層析純化(dcm)得到主產(chǎn)物為目標(biāo)化合物1白色固體(32mg)，收率為64％。所用催化劑vii為l-脯氨酸。

本發(fā)明的化合物可通過采用不同構(gòu)型和不同種類的催化劑vii制備目標(biāo)化合物viii的不同異構(gòu)體?？梢赃x用的催化劑如下所示：

例如：

實(shí)施例1.1：催化劑vii為l-脯氨酸，得到的化合物1的ee值為-7％(如圖3所示)。

實(shí)施例1.2：催化劑vii為得到的化合物1的ee值為30％(如圖2所示)。

在測(cè)定化合物1的ee值時(shí)，所選用的hplc的條件為chiralpakoz,0.46cmi.d.×25cml×5μm,25℃,異丙醇/正己烷＝15:85,流速0.8ml/min,λ＝254nm。

化合物2-18的合成參照化合物1的合成方法。

實(shí)施例2：化合物2的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與4-氯肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，制備化合物2為白色固體(31mg)，收率58％。

實(shí)施例3：化合物3的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與4-溴肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，制備化合物3為白色固體(31mg)，收率54％。

實(shí)施例4：化合物4的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與4-氟肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物4為白色固體(29mg)，收率56％。

實(shí)施例5：化合物5的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與4-硝基肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物5為黃色固體(36mg)，收率66％。

實(shí)施例6：化合物6的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與4-甲氧基肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，制備化合物6為白色固體(30mg)，收率57％。

實(shí)施例7：化合物7的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與2-甲氧基肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，制備化合物7為白色固體(28mg)，收率53％。

實(shí)施例8：化合物8的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與2-呋喃丙烯醛(0.12mmol)反應(yīng)，制備化合物8為白色固體(30mg)，收率62％。

實(shí)施例9：化合物9的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-氯-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，制備化合物9為白色固體(30mg)，收率66％。

實(shí)施例10：化合物10的合成

參照實(shí)施例1。中間體5-氟-3-((2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，制備化合物10為白色固體(27mg)，收率62％。

實(shí)施例11：化合物11的合成

參照實(shí)施例1。中間體6-甲基-3-((2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物11為白色固體(26mg)，收率60％。

實(shí)施例12：化合物12的合成

參照實(shí)施例1。中間體3-((2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物12為白色固體(27mg)，收率64％。

實(shí)施例13：化合物13的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，制備化合物13為白色固體(34mg)，收率59％。

實(shí)施例14：化合物14的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-(4-溴苯基)-2-氧代乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與4-溴肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物14為白色固體(40mg)，收率61％。

實(shí)施例15：化合物15的合成

參照實(shí)例1。中間體4-溴-3-((2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物15為白色固體(35mg)，收率66％。

實(shí)施例16：化合物16的合成

參照實(shí)施例1。中間體4-溴-3-((2-(3,4-二氯苯基)-2-氧代乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物16為白色固體(34mg)，收率60％。

實(shí)施例17：化合物17的合成

參照實(shí)例1。中間體4-溴-3-((2-(呋喃-2-基)-2-氧代乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與肉桂醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物17為白色固體(30mg)，收率62％。

實(shí)施例18：化合物18的合成

參照實(shí)例1。中間體4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)與反式-2-己烯醛(0.12mmol)反應(yīng)，得到化合物18為白色固體(32mg)，收率70％。

實(shí)施例19：化合物19的合成

在5ml二氯甲烷中，加入化合物1(30mg,0.061mmol)、乙酸酐(15mg,0.15mmol)和4-二甲胺基吡啶(3mg)，在常溫下反應(yīng)完全后，柱層析純化，洗脫劑為pe:etoac＝5:1，得到化合物19為白色固體(31mg)，收率為95％。

實(shí)施例20：化合物20的合成

在5ml二氯甲烷中，加入化合物1(30mg,0.061mmol)、間氯過氧苯甲酸(17mg,0.10mmol)，在常溫下反應(yīng)完全后，柱層析純化，洗脫劑為二氯甲烷:甲醇＝100:1，得到化合物20為白色固體(28mg)，收率為90％。

實(shí)施例21：化合物21的合成

在5ml二氯甲烷中，加入化合物1(30mg,0.061mmol)、間氯過氧苯甲酸(57mg,0.31mmol)，在常溫下反應(yīng)完全后，柱層析純化，洗脫劑為二氯甲烷:甲醇＝100:1，得到化合物20為白色固體(30mg)，收率為93％。

實(shí)施例22：合成方法探討

為了進(jìn)一步探討不同反應(yīng)條件對(duì)合成結(jié)果，如收率、ee值、產(chǎn)物等的影響，發(fā)明人測(cè)試了不同的催化劑以及實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示在表3中。

其中，采用的反應(yīng)為：

向2.0ml溶劑加入中4-溴-3-((2-氧代-2-苯乙基)硫)吲哚-2-酮(0.10mmol)、肉桂醛(0.20mmol)、催化劑(20mol％)，室溫反應(yīng)。其中，在部分反應(yīng)中，反應(yīng)體系中還具有添加劑。

實(shí)驗(yàn)所用到的催化劑為：

實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

表3：實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果

其中，所述的收率，是經(jīng)過柱色譜分離后的分離產(chǎn)品的收率。

其中，dr是通過¹hnmr分析測(cè)定的。

其中，ee是通過手性hplc分析測(cè)定的。

其中，n.r.表示不反應(yīng)。

其中，n.d.表示未測(cè)量。

實(shí)施例23：本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性試驗(yàn)

對(duì)本發(fā)明的化合物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)，試驗(yàn)方法采用常規(guī)的mtt法(如呂秋軍主編《新藥藥理學(xué)研究方法》，2007：242-243)。

細(xì)胞株選用肺癌a549、乳腺癌mcf-7，腸癌hct116，均購(gòu)自上海市醫(yī)藥工業(yè)研究院。我們首先測(cè)試了化合物在單濃度10μm條件下，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，若抑制率大于50％，則進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，計(jì)算半數(shù)抑制濃度ic50。

培養(yǎng)液為dmem+15％nbs+雙抗。

樣品液配制：用dmso(merck)溶解后，加入pbs(-)配成100μg/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用dmso的pbs(-)稀釋，最終濃度分別為10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml。

將抗腫瘤化合物nutlin-3以同樣的條件配成對(duì)照品溶液。

96孔板每孔加入濃度為3×10⁴個(gè)/ml的細(xì)胞懸液100μl，即3000個(gè)細(xì)胞/孔，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)。24小時(shí)后，分別加入樣品液和對(duì)照品液，10μl/孔，37℃作用72小時(shí)。每孔加入5mg/ml的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑翁溴化物)溶液20μl，作用4小時(shí)后加入溶解液dmso，100μl/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)，次日用mk-2全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)570nmod值，計(jì)算半數(shù)抑制濃度ic50。

部分優(yōu)選化合物的抗腫瘤活性詳見表3，其中，樣品1～21是指相應(yīng)實(shí)施例中制備的吲哚酮螺四氫硫代吡喃類化合物，如化合物1表示在實(shí)施例1中所得到的化合物，同理類推。其中化合物22為專利cn201610924937.7中活性最優(yōu)的化合物，化合物23為專利cn201410233972.5中活性最優(yōu)的化合物，結(jié)構(gòu)如表4所示。其中化合物21未進(jìn)行活性測(cè)試。

表4本發(fā)明部分化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度ic50(單位：μm)

10μm(％)為在化合物濃度為10μm條件下對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，若大于50％，則進(jìn)一步通過濃度梯度測(cè)試其ic50；cpt為喜樹堿。

結(jié)果顯示，本專利申請(qǐng)的化合物總體表現(xiàn)出廣譜、中等的抗腫瘤活性，部分化合物的活性要優(yōu)于對(duì)照化合物22和23。其中化合物7,9,11,13,16對(duì)肺癌a549的半數(shù)抑制濃度ic50低于5μm，優(yōu)于對(duì)照藥22，23和nutlin-3。化合物13總體表現(xiàn)廣譜、較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)三種腫瘤細(xì)胞株的ic50都低于12μm，明顯優(yōu)于對(duì)照藥nutlin-3，可作為抗腫瘤的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行更加深入的研究。此外，本專利申請(qǐng)的化合物含有羥基、氨基等易于衍生化的基團(tuán)，便于快速衍生化，發(fā)現(xiàn)活性優(yōu)良的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。