專利名稱：：鄰苯二甲酰亞胺衍生物在制備抗新血管生成的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及鄰苯二甲酰亞胺衍生物在制備治療涉及新血管生成的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：血管生成(angiogenensis)是指從已存在的血管床中產(chǎn)生新生血管的過程，在正常情況下，血管生成被嚴格控制于某些短暫的、特定的生理過程，如生殖過程、發(fā)育過程及傷口愈合過程等。而持續(xù)的血管生成是某些病變?nèi)缒[瘤組織的惡性增長、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、關(guān)節(jié)炎及骨質(zhì)增生等的特性。腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細胞從原來的部位，轉(zhuǎn)向身體其他部位并形成新的病灶的過程。研究發(fā)現(xiàn)，體積在1-2mm的瘤體可通過滲透作用從周圍組織中獲得營養(yǎng)維持自身的生存，但它的進一步生長則要依賴形成新生血管以獲得充分的營養(yǎng)供應，一旦新生血管長進腫瘤組織，腫瘤即加速生長，且易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。近年來有關(guān)血管生成調(diào)節(jié)方面的研究十分活躍，已發(fā)現(xiàn)許多血管生成刺激因子和抑制因子，它們在腫瘤發(fā)生、發(fā)展整個過程中的生物學意義正逐漸被人們所認識。現(xiàn)有技術(shù)披露，新的血管生成抑制劑不斷被發(fā)現(xiàn)或合成，其中沙利度胺較引人注目。沙利度胺(thalidomide，Thd)，化學名稱為-酞胺哌啶酮(α-N-phthalimidoglutarimide)，其結(jié)構(gòu)式如下沙利度胺是一種合成谷氨酸衍生物，具有鎮(zhèn)靜、催眠藥物作用，曾被推薦用于治療婦女的妊娠反應，由于其強烈的致畸作用，于60年代被撤出市場，但已釀成近代藥物史上最嚴重的藥害事件。沙利度胺近年來被發(fā)現(xiàn)是有效的免疫調(diào)節(jié)劑和抗炎癥藥物，可望應用于AIDS及某些癌癥及多種自身免疫性疾病。這一偶然的重新發(fā)現(xiàn)起源于20世紀60年代早期以色列皮膚病學家Jacobsheski的工作，他將沙利度胺用于麻風結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)獲得良好療效。70年代早期，通過雙盲臨床研究進一步肯定其療效，使之得以應用至今。此外，10余年來還被作為免疫抑制劑應用于骨髓及腎移植患者，它對慢性移植物抗宿主疾病的療效已被確立。臨床研究表明，沙利度胺具有強大的抗腫瘤作用，可對抗多種實體瘤，對骨髓瘤有效率達50％?，F(xiàn)有技術(shù)披露，沙利度胺可抑制bFGF誘導的角膜新生血管生成，并且能顯著下調(diào)靈長目動物胚胎四肢芽細胞上的一些黏附受體分子，使一些黏附受體消失或低密度表達。另一些研究顯示，沙利度胺可抑制單核細胞或巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-G誘導新生血管生成?，F(xiàn)有技術(shù)進一步披露，沙利度胺可有效抑制堿性成纖維細胞因子(bFGF)介導的兔角膜血管生成。沙利度胺可抑制內(nèi)皮細胞增殖，其抑制作用與核因子SP1活性的下調(diào)劑內(nèi)皮細胞核提取物中NF-KB的抑制強度相關(guān)。沙利度胺對血管生成抑制有明顯的種屬特異性，并需要經(jīng)肝細胞粒體活化。但是現(xiàn)有技術(shù)披露沙利度胺及其衍生物的缺點是水溶性差，并且作為藥用毒性較大。在現(xiàn)有文獻中，迄今尚未公開含有本發(fā)明所述鄰苯二甲酰亞胺水溶性衍生物的組合物及本發(fā)明所述鄰苯二甲酰亞胺水溶性衍生物用于預防和治療新血管生成的用途。經(jīng)文獻檢索，與本發(fā)明相關(guān)的文獻報道如下[1]HarrisAL.Antiangiogenesisforcancertherapy.TheLancet，1997，349(SupplII)13-15.BrooksPC，ClarkRAF.ChereshDA.Requirementofvascularintegrinα，β，forAntiangiogenesis.Science，1994，264569-571.鐘裕國，鄧勇，劉紹華，楊大成。非肽類新生血管生成抑制劑.CN1349983A。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和抗新血管生成活性的化合物以及所述化合物用于治療腫瘤、骨質(zhì)疏松、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化等與新血管生成過度有關(guān)的疾病的用途。為了完成本發(fā)明之目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案本發(fā)明涉及通式I所示的鄰苯二甲酰亞胺衍生物在制備治療與新血管生成有關(guān)的疾病的藥物中的用途式中n為1至6的整數(shù)；R1選自氫、鹵素、直鏈或支鏈烷基、硝基、腈基等；R2選自直鏈或支鏈烷基、芳基、芳基烷基或雜環(huán)基等(優(yōu)選所述芳基烷基或雜環(huán)基含有5-12個碳原子，所述烷基含有1-12個碳原子)。優(yōu)選所述通式(I)中n為2或3；R2選自含2至12個碳原子的烷基。進一步優(yōu)選的是R1為氫原子。更優(yōu)選所述的化合物(I)中n為2或3；R1為氫原子；R2選自甲基、乙基、丙基、丁基、嗎啉基、哌啶基和吡咯烷基。本發(fā)明還涉及通式II所示的鄰苯二甲酰亞胺衍生物在制備治療與新血管生成有關(guān)的疾病的藥物中的用途式中n為1至6的整數(shù)；R1選自氫、鹵素、直鏈或支鏈烷基、硝基、腈基等；R2選自直鏈或支鏈烷基、芳基、芳基烷基或雜環(huán)基等(優(yōu)選所述芳基烷基或雜環(huán)基含有5-12個碳原子，所述烷基含有1-12個碳原子)。優(yōu)選所述通式(II)中n為2或3；R2選自含2至12個碳原子的烷基。進一步優(yōu)選的是R1為氫原子。更優(yōu)選所述的化合物(II)中n為2或3；R1為氫原子；R2選自甲基、乙基、丙基、丁基、嗎啉基、哌啶基和吡咯烷基。本發(fā)明所述化合物的可藥用鹽選自可作為藥用的各種有機和無機羧酸鹽，包括鹽酸、氫溴酸、磷酸、亞磷酸、硫酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、以及各種天然或非天然氨基酸的鹽等。本發(fā)明所述的化合物及其可藥用鹽可用于制備具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和抗新血管生成作用的藥物組合物。特別是可用于制備治療腫瘤、骨質(zhì)疏松、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化等與新血管生成過度有關(guān)的疾病。為了制備發(fā)明通式I中所示的化合物，本發(fā)明包括，將鄰苯二甲酰亞胺與合適烷胺基鹵代烴在適當?shù)娜軇┲泻蛪A作用下，于室溫至回流溫度下，進行胺化反應。通式I的鄰苯二甲酰亞胺衍生物的合成[1]鄰苯二甲酰亞胺；[2]丙酮，室溫至回流；[3]無水碳酸鉀；[4]仲胺，苯；[5]氯化氫乙醚溶液通式I所代表的化合物可按本領(lǐng)域已知或慣用的合成類似化合物的方法制備，例如參見(1)《全國原料藥生產(chǎn)工藝匯編》，1980205-210；(2)FrederickLeonardandLeonSimer.Antispamodics.II.Studiesonthesynthesisof2-diethylaminoethyl-(2-cycloalken-1-yl)-2-thienylacetates.JournaloftheAmericanChemicalSociety，1952，743218-3223。將仲胺溶于干燥的苯中，緩慢滴入含有N-(溴代烷基)-鄰苯二甲酰亞胺的干燥苯中，滴完后攪拌回流至反應結(jié)束。反應液中加入水，振蕩分層后，分離苯層，加入10％鹽酸，分離水層并用苯萃取。水層用1N氫氧化鈉溶液中和至pH為9-13(優(yōu)選pH為11)，乙醚萃取，合并乙醚液，依次用飽和氯化鈉溶液和水洗滌至中性，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，濾液中加入鹽酸乙醚溶液，立即有大量白色沉淀生成，重結(jié)晶得白色晶體。通式II的鄰苯二甲酰亞胺衍生物的合成[6]乙醚或苯，常溫；[7]沙利度胺；[8]二氧六環(huán)，回流；[9]氯化氫乙醚溶液通式II所代表的化合物可按本領(lǐng)域已知或慣用的合成類似化合物的方法制備，例如參見(1)楊若林，李娜.葛根素衍生物的制備及活性，中國藥科大學學報，1999，3081-85；(2)FrederickLeonardandLeonSimer.Antispamodics.III.Basicalkylesteracidadditionandquaternaryammoniumsaltsofα-(2-cycloalken-1-yl)-2-thienyaceticacids.JournaloftheAmericanChemicalSociety，1955，772855-2918。采用無水碳酸鉀作為縛酸劑，鹵代脂肪胺與沙利度胺(7)反應的方法合成通式II化合物。當仲胺不同時，反應的溶劑也相應不同，二甲胺、二乙胺可用低沸點試劑如乙醚；而二丙胺、二丁胺等可以用苯等試劑使反應更完全。本發(fā)明所涉及的化合物在常溫條件下在水中的溶解度優(yōu)于沙利度胺。藥理學研究表明，通式I和通式II所代表的化合物，對ECV304細胞的增殖具有抑制作用，提示該類化合物能抑制新血管生成。本發(fā)明化合物可用口服方法或非腸胃道通用藥?？诜幙梢允瞧瑒⒛z囊劑、包衣劑、非經(jīng)腸用藥劑型有注射劑和栓劑等。這些制劑是按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法制備的。為了制造片劑、膠囊劑、包衣劑所用的輔料是常規(guī)的助劑，例如淀粉，明膠，阿拉伯膠，硅石，聚乙二醇，液體劑型所用的溶劑例如水，乙醇，丙二醇，植物油類如玉米油，花生油，橄欖油等。含有本發(fā)明化合物的制劑中還可以有其它助劑，例如表面活性劑，潤滑劑，崩解劑，防腐劑，矯味劑，色素等。另一方面，本發(fā)明化合物的水溶性優(yōu)于沙利度胺，因此易于制成全身給藥制劑用于腫瘤的防治。在片劑、膠囊劑、包衣劑、注射劑和栓劑中含有本發(fā)明式通式I和通式II化合物的劑量是以單元劑型中存在的化合物計算的。圖1表示鄰苯二甲酰亞胺衍生物對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用；A生理鹽水；B化合物TD-1；C化合物TD-2；D化合物TD-3；E化合物TD-5；F化合物TD-7；G化合物TD-13。圖2表示鄰苯二甲酰亞胺衍生物對雞胚絨毛尿囊膜血管分支點數(shù)的影響；A化合物TD-1；B化合物TD-2；C化合物TD-3；D化合物TD-5；E化合物TD-13；F化合物TD-7。與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。圖3表示化合物TD-2對昆明小鼠移植性腫瘤S180肉瘤的作用。與生理鹽水組比較，*P＜0.05，***P＜0.001具體實施方案以下將結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明，但并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1通式I的鄰苯二甲酰亞胺衍生物(TD-1至TD-18)的制備將仲胺(0.05mol)溶于10ml干燥的苯中，緩慢滴入含有N-(溴代烷基)-鄰苯二甲酰亞胺(0.01mol)的干燥的苯中。滴完后攪拌回流24h。反應液中加入水50ml，振蕩分層后，分離苯層，加入10％鹽酸，分離水層并用苯萃取(20ml×3)。水層用1N氫氧化鈉溶液中和至pH為11，乙醚提取，合并乙醚液，依次用飽和氯化鈉溶液和水，洗滌至中性，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，濾液中加入鹽酸乙醚溶液，立即有大量白色沉淀生成，過濾，白色沉淀重結(jié)晶(乙醇∶乙醚)，得白色晶體。衍生物的結(jié)構(gòu)和代號為N-(2-二甲胺基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-1)；N-(2-二乙胺基-乙基)-鄰苯二酰亞胺鹽酸鹽(TD-2)；N-(2-二正丙胺基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-3)；N-(2-二正丁胺基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-4)；N-(2-嗎啉基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-5)；N-(2-哌啶基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-6)；N-(2-吡咯烷基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-7)；N-(3-二甲胺基-丙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-8)；N-(3-二乙胺基-丙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-9)；N-(3-正丙胺基-丙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-10)；N-(3-二正丁胺基-丙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-11)；N-(3-嗎啉基-丙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-12)；N-(3-哌啶基-丙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-13)；N-(4-乙基-丁基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-14)；N-(3-二正丙胺基-丁基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-15)；N-(3-二正丁胺基-丁基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-16)；N-(3-嗎啉基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-17)；N-(3-哌啶基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-18)。所得化合物的性狀和熔點見下表實施例2(±)-N-(2-二甲胺基-乙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮鹽酸鹽(TD-19)的制備。取1-氯-2-二甲氨基-乙烷鹽酸鹽2g加入5ml水溶解，冰浴，加10％氫氧化鈉溶液，調(diào)PH值為11，乙醚萃取(10ml×3)，合并萃取液，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，乙醚液減壓低溫(20-25℃)除去，在此過程中，有少量固體出現(xiàn)，為1-氯-2-二甲氨基-乙烷自身反應產(chǎn)物，濾出固體，加入二氧六環(huán)20ml，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，無水碳酸鉀0.27g攪拌回流2h，過濾，濾液中加入水20ml，振蕩分層后，分離二氧六環(huán)層，加入10％鹽酸20ml，分離水層并用乙醚萃取(20ml×3)。水層用1N氫氧化鈉溶液中和至pH為11，乙醚萃取(20ml×3)，合并乙醚液，依次用飽和氯化鈉溶液和水洗滌至中性，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，濾液中加入鹽酸乙醚溶液，立即有大量白色沉淀生成，過濾，白色沉淀重結(jié)晶(乙醇∶乙醚)，得白色雪花狀晶體0.15g。產(chǎn)率41.09％，mp188-190℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.90(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，4.05(m，2H，H-5)，2.85(m，2H，H-4)，2.5(j，2H，-CH2CH2-)，2.25(s，6H，-CH3)，2.20(j，2H，-CH2CH2-)。實施例3(±)-N-(2-二乙胺基-乙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮鹽酸鹽(TD-20)的制備。取1-氯-2-二乙氨基-乙烷鹽酸鹽3g加入5ml水溶解，溶液為淡紫紅色，冰浴，加10％氫氧化鈉溶液，調(diào)PH值為11，乙醚萃取(10ml×3)，合并萃取液，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，濾液為淡黃色，乙醚液減壓低溫(20-25℃)除去，在此過程中，有少量白色固體出現(xiàn)，為1-氯-2-二乙氨基-乙烷自身反應產(chǎn)物，濾出固體，加入二氧六環(huán)20ml，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，無水碳酸鉀0.27g攪拌回流2h。純化方法同TD-19。大量白色沉淀生成，過濾，白色沉淀重結(jié)晶(乙醇∶乙醚)，得白色顆粒狀晶體0.08g。產(chǎn)率21.02％，mp192-195℃。1HNMR(CDCl3，ppm)9.65(s，1H，HCl)，7.65-7.82(dq，4H，Ph)，4.80(m，1H，H-3)，3.65-3.75(m，2H，H-5)，3.00-3.25(m，6H，CH2N(CH2)2)，2.65(j，2H，H-4)，2.40(j，2H，CH2CH2-)，1.30(j，2H，-CH2-)。實施例4(±)-N-(3-二甲胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮鹽酸鹽(TD-21)的制備。取(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.13g，1-氯-3-二甲胺基丙烷鹽酸鹽0.11g，加入甲苯50ml，攪拌回流7h。減壓除去甲苯，殘余物乙醚提取(20ml×3)，合并提取液，外置水浴，滴加氯化氫乙醚溶液，有白色固體析出，重結(jié)晶(乙醇∶乙醚)，得顆粒狀晶體0.13g。產(chǎn)率68.5％，mp165-167℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.90(dq，4H，Ph)，4.85(m，1H，H-3)，3.25-3.35(m，2H，H-5)，2.95-3.10(m，2H，H-4)，2.65-2.74(m，8H，-CH2N(CH2)2)，2.45(j，2H，CH2CH2CH2-)，1.90(m，2H，CH2CH2CH2-)。實施例5(±)-N-(2-二乙胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮鹽酸鹽(TD-22)的制備。取1-氯-3-二乙氨基-丙烷鹽酸鹽2g加入5ml水溶解，冰浴，加10％氫氧化鈉溶液，調(diào)PH值為11，乙醚萃取(10ml×3)，合并萃取液，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，乙醚液減壓低溫(20-25℃)除去，在此過程中，有少量固體出現(xiàn)，為1-氯-2-二乙氨基-丙烷自身反應產(chǎn)物，濾出固體，加入二氧六環(huán)20ml，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，無水碳酸鉀0.27g攪拌回流2h。純化方法同TD-19。得針狀結(jié)晶0.11g。產(chǎn)率26.9％，mp198-200℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.85(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，4.03(m，2H，H-5)，3.82(j，2H，H-4)，2.85(j，2H，CH2CH2CH2-)，2.65(m，4H，N(CH2)2)，1.70(m，2H，4H，CH2CH2CH2-)，1.00(j，5H，-CH3)。實施例6(±)-N-(3-二正丙胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮鹽酸鹽(TD-23)的制備。取1-氯-3-二正丙氨基-丙烷0.71g，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，無水碳酸鉀0.27g，二氧六環(huán)20ml，攪拌回流2h。純化方法同TD-19。得雪花狀結(jié)晶0.20g。產(chǎn)率36.8％，mp203-205℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.85(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，3.85(m，2H，H-5)，2.75(m，2H，H-4)，2.55-2.65(m，6H，-CH2N(CH2)2)，1.50-1.70(m，4H，CH2CH2CH2-)，0.90(j，6H，-CH3)。實施例7(±)-N-(3-嗎啉基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮鹽酸鹽(TD-24)的制備。取1-氯-3-嗎啉基-丙烷0.50g，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，無水碳酸鉀0.27g，二氧六環(huán)20ml，攪拌回流2h。純化方法同TD-19。得顆粒狀結(jié)晶0.14g。產(chǎn)率34.2％，mp215-216℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.85(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，3.92(m，2H，H-5)，3.90(j，2H，H-5)，3.75(j，4H，0(CH2)2)，2.85(m，2H，H-4)，2.43-2.62(m，6H，CH2N(CH2)2)，2.20(j，2H，CH2CH2CH2-)，1.85(m，2H，CH2CH2CH2-)。實施例8(±)-N-(3-哌啶基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮鹽酸鹽(TD-25)的制備。取1-氯-3-哌啶基-丙烷0.49g，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，無水碳酸鉀0.27g，二氧六環(huán)20ml，攪拌回流2h。純化方法同TD-19。得顆粒狀結(jié)晶0.17g。產(chǎn)率40.4％，mp222-224℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.90(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，3.90(m，2H，H-5)，2.75(m，2H，H-4)，2.23-2.34(m，6H，CH2N(CH2)2)，1.80(j，2H，CH2CH2CH2-)，1.40(m，2H，CH2CH2CH2-)。實施例9(±)-N-(3-(4-乙基哌嗪基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮鹽酸鹽(TD-26)的制備。取1-氯-3-(4-乙基哌嗪基)-丙烷1.00g，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-異吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，無水碳酸鉀0.27g，二氧六環(huán)20ml，攪拌回流2h。純化方法同TD-19。得顆粒狀結(jié)晶0.11g。產(chǎn)率24.5％，mp235-238℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.78-7.90(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，3.85(m，2H，H-5)，2.85(m，2H，H-4)，2.50(m，12H，-CH2N(CH2)2，-(CH2)2NCH2-)，1.75(j，2H，H-4)，1.40(m，2H，CH2CH2CH2-)，1.12(j，3H，CH3)。下面的生物活性實驗用來進一步說明本發(fā)明生物活性實驗實施例1抗血管活性評價試驗根據(jù)本發(fā)明，一組優(yōu)選的通式I化合物是通式III，一組優(yōu)選的通式II化合物是通式IV。根據(jù)藥理實驗結(jié)果的統(tǒng)計學分析，表1中的化合物TD-3、TD-4、TD-5、TD-6、TD-8、TD-13、TD-14、TD-17、TD-18能夠顯著抑制ECV304細胞生長，其中特別優(yōu)選的是N-(2-哌啶基-乙基)-鄰苯二甲酰亞胺鹽酸鹽(TD-6)。表2中的化合物TD-19，TD-21，TD-22，TD-23，TD-25對ECV304細胞生長也有抑制作用。表1鄰苯二甲酰亞胺衍生物(通式III)對ECV304細胞增殖的抑制作用結(jié)果(N＝7，X±SD)<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>*P＜0.05，**P＜0.01vs對照組表2通式IV的鄰苯二甲酰亞胺衍生物對ECV304細胞增殖的抑制作用結(jié)果(N＝7，X±SD)*P＜0.05，**P＜0.01vs對照組經(jīng)過上述試驗結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可得知，本發(fā)明的化合物對哺乳動物具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和抗新血管生成的活性。本發(fā)明在制備哺乳動物包括人抗新血管生成藥物的應用上具有良好的前景和潛在的價值。生物活性實驗實施例1的研究方法內(nèi)皮細胞增殖是血管生成的關(guān)鍵步驟，因而能抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的化合物就有可能抑制血管生成。因此我們采用體外臍靜脈血管細胞株(ECV304細胞)培養(yǎng)的方法，觀察合成的化合物對ECV304細胞增殖的抑制作用來進行初步篩選具有抑制新生血管生成的活性化合物，抑制細胞增殖的檢測方法采用四氮唑鹽還原法(MTT法)，篩選結(jié)果用血管內(nèi)皮細胞增殖百分抑制率作為衡量目標化合物活性的指標。材料ECV304細胞；MTT，瑞典AMERSHAM公司產(chǎn)品；方法(1)ECV304細胞的復蘇、傳代與培養(yǎng)a從液氮罐中取出細胞凍存管，迅速放入37℃水浴中；b輕輕搖晃凍存管，使其盡快解凍；用75％乙醇擦拭外壁，進行無菌操作；用吸管吸出細胞懸液，加入10ml離心管中，再加入8ml培養(yǎng)液(RMP+10％小牛血清和60μg/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，吹打使細胞懸??；1000g離心5min；f棄上清，加入10ml培養(yǎng)液吹打；g1000g離心5min，棄上清；加入5ml適量培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中；在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；倒去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，PBS洗滌并棄去PBS；加入0.25％胰酶和0.02％EDTA消化液消化；半分鐘后，加入培養(yǎng)液終止反應，吹打，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管中；1000g離心5min，棄上清；加入培養(yǎng)液吹打，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中；在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(2)MTT法檢測根據(jù)各化合物分子量，用無血清培養(yǎng)液配成10-2M濃度，再取10-2M各化合物10μl+99μl無血清培養(yǎng)液制成10-4M；104mlECV304細胞，接種于96孔板中，90μl/孔在在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時；實驗分生理鹽水對照組、沙利度胺陽性對照組和各待試化合物。在ECV304細胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期后，加入10-4M的各化合物10μl/孔，藥物的終濃度為10-5M，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時；每孔加入MTT25μl，孵育4小時；棄上清，加入DMSO100μl，輕振10min，570nm測A值。生物活性實驗實施例2本發(fā)明的化合物對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響如表3所示，在實驗開始時，每個待測化合物的受精雞卵數(shù)為10個，到第11天取膜時各組存活的雞胚均在6枚以上。本發(fā)明的典型化合物TD-1，TD-2，TD-3，TD-4，TD-5，TD-7，TD-9，TD-10，TD-12和TD-13對雞胚絨毛尿囊膜的血管生成有顯著抑制作用。表3通式III的鄰苯二甲酰亞胺衍生物對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用(x±s，n＝6-10)與生理鹽水組相比，*P＜0.05，*P＜0.05。將上述實驗篩選出來的10種化合物按不同濃度分組，每組10枚雞卵，至第11天時存活的雞胚在7枚以上，在此10個化合物中，發(fā)現(xiàn)化合物TD-1，TD-2，TD-3，TD-5，TD-7和TD-13等6個化合物在1-1000mmol.L-1濃度范圍內(nèi)，對CAM的血管生成均有抑制作用(見圖1和圖2)。以上生物活性實驗實施例2提示通過對鄰苯二甲酰亞胺衍生物的研究，優(yōu)選的化合物TD-1，TD-2，TD-3，TD-5，TD-7和TD-13對雞胚絨毛尿囊膜的新血管生成有明顯的抑制作用。生物活性實驗實施例2的研究方法受精雞卵，每蛋重51-65克。第一批實驗，取各化合物濃度均為1000mmol/L，將雞卵隨機分成18組，每組10枚雞卵，同時用沙利度胺、生理鹽水作為陽性及陰性對照，因沙利度胺是用二甲基亞砜溶解，故將二甲基亞砜同時作溶劑對照。通過初篩后選擇有抑制作用的化合物，各按1mmol/L、10mmo1/L、100mmol/L、1000mmol/L濃度分成4組，每組10枚雞卵，同時做陽性及陰性對照及溶劑對照，進行第二批實驗。新鮮受精雞卵以1‰新潔爾滅清洗后放入37℃，60％相對濕度的孵箱內(nèi)孵育，每天翻蛋2次。孵育至第7天在照蛋器指示下距胚頭右下方1.5cm處做標記，用碘酒、酒精消毒后，以標記處為中心開出一個1×1cm的小窗，滴加2滴生理鹽水使雞胚絨毛尿囊膜下塌，與卵殼膜分離，去除卵殼膜，暴露雞胚絨毛尿囊膜，制成假氣室，用無菌貼膜封口，窗口朝上繼續(xù)孵育，不再翻蛋。開窗后第2天揭開貼膜，將事先準備好的明膠海綿載體放于兩條前卵黃靜脈間的相對無血管的雞胚絨毛尿囊膜上，用微量移液器向載體上加入待測的不同濃度的樣品，每次20μl，每天一次，共3天，每次加完藥后繼續(xù)孵育。繼續(xù)孵育至第11天，揭去貼膜，向假氣室內(nèi)加入等量甲醇、丙酮配成的固定液，固定15分鐘，剪下雞胚絨毛尿囊膜，平鋪于濾紙上，攝片。以載體為中心，計數(shù)載體周圍0.5cm范圍內(nèi)的血管分支點數(shù)。實驗方法詳見參考文獻付生法等。檢測血管生長因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)。軍事醫(yī)學科學院院刊，1993；17(4)294-297。生物活性實驗實施例3本發(fā)明式I代表性化合物TD-2對昆明小鼠移植性腫瘤S180肉瘤的影響如表4和圖3所示，化合物TD-2在50，100和200mg/kg均可顯著抑制S180肉瘤生長，其瘤重均顯著小于對照組，P均小于0.05，其抑瘤率分別為26.5％，30.1％和28.9％。相同實驗條件下，沙利度胺100mg/kg組抑瘤率為31.9％，與TD-2抑瘤作用近似。陽性對照藥環(huán)磷酰胺30mg/kg對昆明小鼠S180肉瘤生長具有顯著抑制作用，其瘤重顯著低于對照組瘤重(P＜0.01)，抑瘤率為68.1％。表4化合物TD-2對昆明小鼠移植性腫瘤S180肉瘤的作用以上生物活性實驗實施例3提示化合物TD-250，100和200mg/kg均可顯著抑制昆明小鼠移植性腫瘤S180肉瘤的生長。生物活性實驗實施例3的研究方法昆明小鼠，雌雄各半，體重17-22g，隨機分為7組生理鹽水組，溶劑對照組(甲基纖維素)，陽性對照組(環(huán)磷酰胺30mg/kg)，TD-250mg/kg，100mg/kg和200mg/kg組以及沙利度胺100mg/kg組。藥物配制方法用生理鹽水溶解TD-2到所需濃度，過篩除菌。沙利度胺微溶于水，其溶解度在1‰-1％之間，不能滿足試驗對溶解度的要求，故選用甲基纖維素M450作溶劑，將Tha過80目篩，用生理鹽水配制1％甲基纖維素M450混懸劑，然后按給藥劑量，將沙利度胺懸浮于其中，臨用現(xiàn)配。給藥容積為0.2ml/10g體重，使用前搖勻。無菌條件下抽取體內(nèi)傳代的小鼠S180肉瘤腹水，用無菌生理鹽水按V∶V＝1∶3稀釋，制成細胞懸液，以每只0.2ml體積接種于昆明小鼠右腋皮下，24h后分組給藥。TD-2設50，100，200mg/kg三個劑量組，采用po途徑給藥，每天1次，連續(xù)給藥7天，給藥容積0.2ml/10g。選用環(huán)磷酰胺作為陽性對照藥，劑量30mg/kg，采用皮下注射給藥，1次/日，連給3天，給藥容積0.1ml/10g。沙利度胺組100mg/kg，采取po途徑給藥，連續(xù)給藥7天，給藥容積0.2ml/10g。溶劑對照為等體積1％甲基纖維素M450，采用po途徑給藥，每天1次，連續(xù)7天。生理鹽水組采用po途徑給藥，每天1次，連續(xù)7天。給藥7天后，于停藥次日處死小鼠，稱重后剝?nèi)∑は铝鰤K稱瘤重，計算各組平均瘤重，并計算抑瘤率。權(quán)利要求1.通式(I)的化合物或其可藥用鹽在制備抗新血管生成的藥物中的用途，式中n為1至6的整數(shù)；R1選自氫、鹵素、直鏈或支鏈烷基、硝基、腈基等；R2選自直鏈或支鏈烷基、芳基、芳基烷基或雜環(huán)基等(優(yōu)選其中所述芳基或雜環(huán)基含有5-14個碳原子，所述烷基含有1-12個碳原子)。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述通式(I)中n為2或3；R1為氫原子；R2選自含2至12個碳原子的烷基。3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物(I)中n為2或3；R1為氫原子；R2選自甲基、乙基、丙基、丁基、嗎啉基、哌啶基和吡咯烷基。4.通式II的化合物或其可藥用鹽在制備抗新血管生成的藥物中的用途，式中n為1至6的整數(shù)；R1選自氫、鹵素、直鏈或支鏈烷基、硝基、腈基等；R2選自直鏈或支鏈烷基、芳基、芳基烷基或雜環(huán)基等(優(yōu)選其中所述芳基或雜環(huán)基含有5-14個碳原子，所述烷基含有1-12個碳原子)。5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述通式(II)中n為2或3；R1為氫原子；R2選自含2至12個碳原子的烷基。6.如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于所述的化合物(I)中n為2或3；R1為氫原子；R2選自甲基、乙基、丙基、丁基、嗎啉基、哌啶基和吡咯烷基。7.如權(quán)利要求1-6任一項所述的化合物的用途，其特征在于所述的化合物的可藥用鹽選自可作為藥用的各種有機和無機羧酸鹽，優(yōu)選化合物與鹽酸、氫溴酸、磷酸、亞磷酸、硫酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、以及各種天然或非天然氨基酸等的鹽。8.如權(quán)利要求1-6任一項所述的化合物的用途，其特征在于所述的化合物及其可藥用鹽可用于制備具有抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和抗新血管生成作用的藥物。9.如權(quán)利要求1-6任一項所述的化合物的用途，其特征在于所述的化合物及其可藥用鹽可用于制備治療腫瘤、骨質(zhì)疏松、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化等與新血管生成過度有關(guān)的疾病的藥物。10.如權(quán)利要求9所述的化合物的用途，其特征在于所述藥物可用于治療腫瘤。全文摘要本發(fā)明涉及通式I和II的鄰苯二甲酰亞胺衍生物在制備抗新血管生成的藥物中的作用。其中各個取代基的定義如說明書中所述。文檔編號A61P3/10GK1961876SQ200510120018公開日2007年5月16日申請日期2005年11月8日優(yōu)先權(quán)日2005年11月8日發(fā)明者汪海,楊永林,王林,劉靜霞,包存剛申請人:北京恩華醫(yī)藥研究院,中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所