專利名稱:用于治療黃病毒感染的2'-c-甲基-3'-o-l-纈氨酸酯核糖呋喃基胞苷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域,特別涉及2’-C-甲基呋喃核糖基胞苷-3’-O-L-纈氨酸酯及其可藥用鹽、衍生物和前藥,以及它們的合成和它們?cè)谥委熡牲S病毒科病毒(Flaviviridae)、特別是丙型肝炎病毒(HCV)感染的寄主、特別是人中作為抗黃病毒科病毒制劑的應(yīng)用。
背景技術(shù):
黃病毒科病毒(Flaviviridae Viruses)黃病毒科病毒包括至少三個(gè)截然不同的屬瘟病毒屬(pestiviruses),其引起牛和豬中的疾?。稽S病毒屬(flaviviruses),其是導(dǎo)致諸如登革熱(dengue fever)和黃熱病(yellow fever)等疾病的首要原因;以及肝病毒屬,其唯一的成員即為HCV。黃病毒屬包括超過68種成員,這些成員根據(jù)血清學(xué)的關(guān)聯(lián)性(Calisher et al.,J Gen.Virol,1993,70,37-43)進(jìn)行分組。不同的臨床癥狀包括發(fā)燒、腦炎和出血熱(Fields Virology,EditorsFields,B.N.,Knipe,D.M.,andHowley,P.M.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,PA,1996,Chapter 31,931-959)。引起全球關(guān)注的與人類疾病相關(guān)的黃病毒屬包括登革出血熱病毒(dengue hemorrhagic feverviruses(DHF))、黃熱病毒(yellow fever virus)、休克綜合癥(shock syndrome)和日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)(Halstead,S.B.,Rev.Infect.Dis.,1984,6,251-264;Halstead,S.B.,Science,239476-481,1988;Monath,T.P.,New Eng.J.Med.,1988,319,641-643)。
瘟病毒屬包括牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬瘟病毒(CSFV,也稱豬瘟病毒(hog choleravirus))以及綿羊邊界病病毒(BDV)(Moennig,V.et al.Adv.Vir.Res.1992,41,53-98)。馴養(yǎng)家畜(牛、豬和綿羊)的瘟病毒感染在世界范圍內(nèi)均導(dǎo)致了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV導(dǎo)致牛的粘膜病,其對(duì)于家畜產(chǎn)業(yè)影響深遠(yuǎn)(Meyers,G.and Thiel,H.-J.,Advances in Virus Research,1996,47,53-118;Moennig V.,et al,Adv.Vir.Res.1992,41,53-98)。雖然人瘟病毒還沒有像動(dòng)物瘟病毒這樣進(jìn)行廣泛地鑒定,但是,血清學(xué)的調(diào)查研究表明人類受到相當(dāng)多的瘟病毒的威脅。
在黃病毒科中,瘟病毒屬和肝病毒屬(hepaciviruses)是非常接近的病毒組。該科中的其它密切相關(guān)的病毒包括GB病毒A(GB virus A)、GB病毒A類似物(GB virus A-likeagents)、GB病毒B(GB virus B)和GB病毒C(GB virus C,也稱為肝炎G病毒(hepatitisG virus,HGV))。肝病毒屬(丙型肝炎病毒;HCV)包括許多非常接近但在基因型上可辨別的感染人類的病毒。大約有6種HCV基因型和超過50種亞型。由于瘟病毒屬和肝病毒屬之間的相似性,并且由于肝病毒屬很難在細(xì)胞培養(yǎng)基中有效地生長(zhǎng),牛病毒性腹瀉病毒(bovineviral diarrhea virus,BVDV)經(jīng)常被用作替代物來研究HCV病毒。
瘟病毒屬和肝病毒屬的基因結(jié)構(gòu)非常類似。這些正鏈的RNA病毒具有病毒復(fù)制所需要的編碼所有病毒蛋白的一個(gè)大的開放讀碼框架(ORF)。這些蛋白表達(dá)為多聚蛋白,其被細(xì)胞的蛋白酶和病毒編碼的蛋白酶進(jìn)行共翻譯和翻譯后加工,從而產(chǎn)生成熟的病毒蛋白。負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的復(fù)制的病毒蛋白大致位于羧基末端。三分之二的ORF被稱為非結(jié)構(gòu)性(NS)蛋白。對(duì)于瘟病毒屬和肝病毒屬,ORF的非結(jié)構(gòu)性蛋白的基因結(jié)構(gòu)和多聚蛋白的加工非常相似。對(duì)于瘟病毒屬和肝病毒屬二者而言,成熟的非結(jié)構(gòu)性(NS)蛋白按照序列順序從非結(jié)構(gòu)性蛋白編碼區(qū)的氨基末端到ORF的羧基末端包含p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B。
瘟病毒屬和肝病毒屬的NS蛋白都有特定蛋白功能特性的序列結(jié)構(gòu)域。例如,在這兩組病毒中的NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶和解旋酶特性的氨基酸序列基序(Gorbalenya et al.(1988)Nature 33322;Bazan and Fletterick(1989)Virology 171637-639;Gorbalenya et AL.(1989)Nucleic Acid Res.17.3889-3897)。類似地,瘟病毒屬和肝病毒屬的NS5B蛋白具有RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶特性的基序。(Koonin,E.V.and Dolja,V.V.(1993)Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.28375-430)。
瘟病毒屬和肝病毒屬的NS蛋白在病毒生命周期中的實(shí)際角色和功能是完全相似的。在兩者中,NS3絲氨酸蛋白酶負(fù)責(zé)在ORF中多聚蛋白前體下游位置的所有蛋白水解加工。(Wiskerchen and Collett(1991)Virology 184341-350;Bartenschlager et al.(1993)JVirol.673835-3844;Eckart et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Comm.192399-406;Grakoui etal.(1993)J.Virol.672832-2843;Grakoui et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010583-10587;Hijikata et al.(1993)J.Virol.674665-4675;Tome et al.(1993)J.Virol.674017-4026)。NS4蛋白在兩者中均作為NS3絲氨酸蛋白酶的輔因子。(Bartenschlager et al.(1994)J.Virol.685045-5055;Failla et al.(1994)J.Virol.683753-3760;Lin et al.(1994)688147-8157;Xu et al.(1997)J.Virol.715312-5322)。兩種病毒屬的NS3蛋白也都還具有解旋酶的功能(Kim et al.(1995)Biochem.Biophys.Res.Comm.215160-166;Jin and Peterson(1995)Arch.Biochem.Biophys.,32347-53;Warrener and Collett(1995)J.Virol.691720-1726)。最后,瘟病毒屬和肝病毒屬的NS5B蛋白具有可預(yù)測(cè)的RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶活性(Behrenset al.(1996)EMBO J.1512-22;Lchmann et al.(1997)J.Virol.718416-8428;Yuan et al.(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.232231-235;Hagedom,PCT WO 97/12033;Zhong et al.(1998)J.Virol.72.9365-9369)。
丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒(HCV)是世界范圍內(nèi)慢性肝病的最主要病因(Boyer,N.et al.J.Hepatol.3298-112,2000)。HCV導(dǎo)致了緩慢增長(zhǎng)的病毒感染并是肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要病因(DiBesceglie,A.M.and Bacon,B.R.,Scientific American,Oct80-85,(1999);Boyer,N.et al.J.Hepatol.3298-112,2000)。估計(jì)在世界范圍內(nèi)有1.7億感染了HCV(Boyer,N.et al.J.Hepatol.3298-112,2000)。在美國(guó)估計(jì)每年因?yàn)槁员透窝撞《靖腥緦?dǎo)致的肝硬化導(dǎo)致8,000-12,000人死亡,并且對(duì)于肝移植而言HCV感染是最主要的指征。
已知HCV導(dǎo)致至少80%的輸血后肝炎和大部分的偶發(fā)性急性肝炎。初步證據(jù)也表明HCV在許多“原發(fā)性”慢性肝炎、“隱發(fā)性”肝硬化和可能在肝細(xì)胞癌的病例中與其它的肝炎病毒,如乙型肝炎病毒(HBV)無關(guān)。一小部分的健康人群看來是慢性HCV的攜帶者,具有地理分布上和其它流行病學(xué)因素的多樣化。雖然僅僅是一個(gè)初步的消息,但其數(shù)目可能實(shí)質(zhì)上超過了HBV的攜帶者;尚不清楚究竟有多少人患有臨床癥狀不明顯的慢性肝病(TheMerck Manual,ch.69,p.901,16thed.,(1992))。
HCV是一種含有大約9.4kb的有義單鏈RNA基因組的有包膜病毒。病毒基因組由一個(gè)5′非翻譯區(qū)(UTR)、一個(gè)編碼大約3011個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體的長(zhǎng)的開放閱讀框、和一個(gè)短的3′UTR組成。5′UTR是HCV基因組的最主要的高度保守部分且對(duì)于啟動(dòng)和控制多聚蛋白的翻譯起重要作用。HCV基因組的翻譯通過已知為內(nèi)部核糖體進(jìn)入的加帽獨(dú)立性機(jī)制啟動(dòng)。該機(jī)制包括核糖體和RNA序列在已知為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)上結(jié)合。一個(gè)RNA假結(jié)結(jié)構(gòu)近來已被測(cè)定是HCV IRES的一個(gè)基本結(jié)構(gòu)元件。病毒結(jié)構(gòu)蛋白包括一種核殼核心蛋白(C)和兩種有包膜糖蛋白,E1和E2。HCV也編碼兩種蛋白酶,一種NS2-NS3區(qū)編碼的依賴于鋅的金屬蛋白酶和一種NS3區(qū)編碼的絲氨酸蛋白酶。對(duì)于剪切前體多聚蛋白的特定區(qū)域形成成熟肽而言,這些蛋白酶是必需的。非結(jié)構(gòu)蛋白5,NS5B,的羧基部分含有RNA依賴的RNA聚合酶。剩余的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A和NS4B以及NS5A(非結(jié)構(gòu)蛋白5的氨基部分)的功能仍然未知。
當(dāng)前抗病毒研究的一個(gè)重要焦點(diǎn)是在于發(fā)展改良的治療人體中慢性HCV感染的方法(Di Besceglie,A.M.and Bacon,B.R.,Scientific American,Oct80-85,(1999))。
用干擾素治療HCV感染近十年來,干擾素(IFNs)已可通過商業(yè)途徑獲得以用于治療慢性肝炎。IFN是由免疫細(xì)胞響應(yīng)病毒感染過程中產(chǎn)生的糖蛋白。IFN抑制許多病毒包括HCV的復(fù)制,但單獨(dú)用于治療丙型肝炎感染時(shí),IFN在某些時(shí)候可以將血清HCV-RNA抑制到可探知的水平。此外,IFN可以將血清氨基轉(zhuǎn)移酶達(dá)到正常水平。然而IFN的效果僅僅是暫時(shí)性的,持續(xù)的響應(yīng)僅在8%~9%的感染了慢性HCV的患者中產(chǎn)生(Gary L.Davis.Gastroenterology 118S104-S114,2000)。但是,大多數(shù)患者難于忍受因干擾素治療而導(dǎo)致的嚴(yán)重的流行性感冒樣癥狀、體重降低、以及疲乏無力。
許多專利都公開了使用基于干擾素的療法治療包括HCV在內(nèi)的黃病毒科。例如,Blatt等人的美國(guó)專利第5,980,884號(hào)公開了用復(fù)合干擾素治療飽受HCV折磨的病人的方法。Bazer等人的美國(guó)專利第5,942,223號(hào)公開了使用羊或牛干擾素-τ(IFN-τ)的抗-HCV療法。Alber等人的美國(guó)專利第5,928,636公開了用于治療由包括HCV在內(nèi)的傳染性疾病的白細(xì)胞介素-12和干擾素α(IFN-α)聯(lián)合療法。Chretien等人的美國(guó)專利第5,849,696號(hào)公開了單獨(dú)使用胸腺素或與干擾素結(jié)合使用來治療HCV。Valtuena等人的美國(guó)專利第5,830,455號(hào)公開了使用干擾素和只有基清除劑的HCV聯(lián)合療法。Imakawa的美國(guó)專利第5,738,845號(hào)公開了使用人干擾素-τ蛋白治療HCV。另外,在Testa等人的美國(guó)專利第5,676,942號(hào)、Blatt等人的美國(guó)專利第5,372,808號(hào)和美國(guó)專利第5,849,696號(hào)中公開了其它的基于干擾素的HCV療法。還有許多專利公開了聚乙二醇化形式的干擾素,這些專利如Hoffmann-La RocheInc的美國(guó)專利第5,747,646,5,792,834和5,834,594號(hào);Enzon的公開號(hào)為WO 99/32139和WO 99/32140的PCT專利;Schering的WO 95/13090美國(guó)專利第5,738,846和5,711,944號(hào),以及Glue等人的美國(guó)專利第5,908,621號(hào)。
干擾素α-2a和干擾素α-2b目前被許可作為治療HCV的單獨(dú)療法。ROFERON_A(Roche)是干擾素α-2a的重組形式。PEGASYS_(Roche)是干擾素α-2a的聚乙二醇化形式(即聚乙二醇修飾的)。INTRON_A(Schering Corporation)是干擾素α-2b的重組形式。PEG-INTRON_(Schering Corporation)是干擾素α-2b的聚乙二醇化形式。
干擾素α的其它形式以及干擾素β,γ,τ和ω目前還處于HCV治療的臨床開發(fā)階段。例如,InterMune的INFERGEN(干擾素alphacon-1),Viragen的OMNIFERON(天然干擾素),Human Genome Sciences的ALBUFERON,Ares-Serono的REBIF(干擾素β-1a),BioMedicine的ω干擾素,Amarillo Biosciences的口服干擾素α,以及InterMune的干擾素γ,干擾素τ和干擾素γ-1b都在研究之中。
利巴韋林(Ribavirin)利巴韋林(1-β-D-核糖呋喃基-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺)是一種合成的、非干擾素誘導(dǎo)的廣譜抗病毒核苷類似物,其商品命為Virazole(The Merck Index,11thedition,EditorBudavari,S.,Merck & Co.,Inc.,Rahway,NJ,p1304,1989)。美國(guó)專利第3,798,209和RE29,835公開并要求保護(hù)利巴韋林。利巴韋林在結(jié)構(gòu)上與鳥苷相似,并且具有對(duì)抗包括黃病毒科在內(nèi)的多種DNA和RNA病毒的體外活性(Gary L.Davis.Gastroenterology 118S104-S114,2000)。
利巴韋林可將40%的患者的血清氨基轉(zhuǎn)移酶水平降低到正常水平,但不能降低HCV-RNA的血清水平(Gary L.Davis.Gastroenterology 118S104-S114,2000)。因此,利巴韋林單獨(dú)給藥無法有效降低病毒RNA水平。此外,利巴韋林具有相當(dāng)?shù)亩拘郧乙阎苷T發(fā)貧血癥。
利巴韋林未獲批準(zhǔn)用于單獨(dú)治療HCV,但被批準(zhǔn)用于和干擾素α-2a或干擾素α-2b聯(lián)合治療HCV。
干擾素和利巴韋林的聯(lián)合給藥當(dāng)前治療慢性丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)是α干擾素和利巴韋林的聯(lián)合療法。對(duì)采用干擾素和利巴韋林的聯(lián)合療法治療HCV感染,已有報(bào)道稱該療法在治療干擾素首次患者(interferon naivepatients)時(shí)有效的(Battaglia,A.M.et al.,Ann.Pharmacother.34487-494,2000),此外,對(duì)于治療存在組織學(xué)疾病的患者的治療,該療法也是有效的(Berenguer,M.et al.Antivir.Ther.3(Suppl.3)125-136,1998)。研究表明,更多的丙型肝炎患者對(duì)聚乙二醇化的干擾素-α/利巴韋林聯(lián)合療法的響應(yīng)比對(duì)與非聚乙二醇化的干擾素-α聯(lián)合療法的響應(yīng)強(qiáng)。但是,與單獨(dú)療法相同的是,在聯(lián)合療法中,產(chǎn)生相當(dāng)大的副作用,這包括溶血、流行性感冒樣癥狀、貧血癥和疲乏(Gary L.Davis.Gastroenterology 118S104-S114,2000)。
采用PEG-INTRON_(peg干擾素α-2b)和REBETOL_(利巴韋林,USP)聯(lián)合療法的膠囊可由Schering Corporation獲得。REBETOL_(Schering Corporation)還被批準(zhǔn)與INTRON_A(干擾素α-2b,重組體,Schering Corporation)聯(lián)合使用。另外,Roche′s PEGASYS_(聚乙二醇化的干擾素α-2a)和COPEGUS_(利巴韋林)也被批準(zhǔn)用于治療HCV。
Schering Corporation的PCT公開號(hào)為WO 99/59621,WO 00/37110,WO 01/81359,WO02/32414 and WO 03/024461的專利申請(qǐng)中公開了使用聚乙二醇化的干擾素α和利巴韋林聯(lián)合療法治療HCV。Hoffmann-La Roche Inc的PCT公開號(hào)為WO 99/15194,WO 99/64016,andWO 00/24355的專利申請(qǐng)中也公開了使用聚乙二醇化的干擾素α和利巴韋林聯(lián)合療法治療HCV。
治療黃病毒科感染的其它方法目前正在進(jìn)行用于黃病毒科感染、特別是丙型肝炎病毒的新的抗病毒制劑的開發(fā)。源自HCV的酶如蛋白酶、解旋酶的特異性抑制劑,和聚合酶抑制劑正在開發(fā)中。另外,用于抑制HCV復(fù)制的其它步驟的抑制劑也在開發(fā)中,例如,阻斷從RNA產(chǎn)生HCV抗原(IRES抑制劑)、阻止HCV蛋白正常加工的藥物(糖基化抑制劑),阻斷HCV進(jìn)入細(xì)胞的藥物(通過阻斷其受體),以及阻止由于病毒感染引起的細(xì)胞損傷的非特異性細(xì)胞保護(hù)制劑。另外,分子學(xué)方法也被發(fā)展用于治療丙型肝炎,例如,正在進(jìn)行研究的有核酶(Ribozyme),其能特異性破壞病毒RNA分子的酶酸;反義寡聚核苷酸,其是DNA的小的互補(bǔ)片段,能結(jié)合病毒RNA并抑制病毒復(fù)制。Bymock等人在Antiviral Chemistry & Chemotherapy,112;79-95(2000)中,以及De Francesco等人在Antiviral Research,581-16(2003)中對(duì)大量的HCV的治療進(jìn)行了綜述。
已被開發(fā)的用于治療黃病毒感染的藥物的分類的實(shí)例包括(1)蛋白酶抑制劑正在研究的有基于底物的NS3蛋白酶抑制劑(Attwood et al.,Antiviral peptide derivatives,PCT WO 98/22496,1998;Attwood et al.,Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999,10,259-273;Attwood et al.,Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viral agents,German Patent Pub.DE 19914474;Tung et al.Inhibitors of serine proteases,particularlyhepatitis C virus NS3 protease,PCT WO 98/17679),包括α酮酰胺(alphaketoamides)和肼基脲(hydrazinoureas),和能終止親電子試劑如硼酸或膦酸鹽中的抑制劑(Llinas-Brunetetal.,Hepatitis C inhibitor peptide analogues,PCT WO 99/07734)。
另外,在研究的還有基于非底物的NS3蛋白酶抑制劑,如2,4,6-三羥基-3-硝基-苯甲酰胺衍生物(Sudo K.et al..,Biochemical and Biophysical Research Communications,1997,238,643-647;Sudo K.et al..Antiviral Chemistry and Chemotherapy,1998,9,186),包括RD3-4082和RD3-4078,前者以碳14鏈取代酰胺,后者加工對(duì)苯氧基苯基。
Sch 68631,一種菲醌,是一種HCV蛋白酶抑制劑(Chu M.et al..,Tetrahedron Letters 377229-7232,1996)。由該作者給出的另一個(gè)例子中,Sch 351633,分離自灰黃青霉(Penicilliumgriseofulvum),被確認(rèn)為一種蛋白酶抑制劑(Chu M.et al..,Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters 91949-1952)。通過基于水蛭蛋白酶抑制劑c(eglin c)設(shè)計(jì)的選擇性抑制劑,可以得到納摩效能的抗HCV NS3蛋白酶的酶。Eglin c分離自水蛭,是幾種絲氨酸蛋白酶如灰色鏈霉菌(S.griseus)蛋白酶A和B,α-糜蛋白酶(α-chymotrypsin),糜蛋白酶(chymase)和枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)的潛在抑制劑。Qasim M.A.et al..,Biochemistry 361598-1607,1997。
一些美國(guó)專利公開了治療HCV的蛋白酶抑制劑。例如,Spruce等人的美國(guó)專利第6,004,933號(hào)公開了用于抑制HCV肽鏈內(nèi)切酶2的一類半胱氨酸蛋白酶。Zhang等人的美國(guó)專利第5,990,276號(hào)公開了丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的合成抑制劑。該抑制劑是一種NS3蛋白酶底物的亞序列或是一種NS4A輔因子的底物。在Reyes等人的美國(guó)專利第5,538,865號(hào)中公開了使用限制酶治療HCV。在Corvas International,Inc的WO 02/008251中和ScheringCorporation的WO 02/008256中公開了以肽作為HCV的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑。
在Boehringer Ingelheim的美國(guó)專利第6,534,523、6,410,531和6,420,380號(hào)中以及Bristol Myers Squibb的WO 02/060926中公開了HCV抑制劑三肽。在Schering Corporation的WO 02/48172中公開了以二芳基肽作為HCV的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑。在ScheringCorporation的WO 02/08198中和在Bristol Myers Squibb的WO 02/48157中公開了以咪唑啉二酮(Imidazoleidinone)作為HCV的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑。Vertex Pharmaceuticals的WO 98/17679和Bristol Myers Squibb的WO 02/48116也中開了HCV蛋白酶抑制劑;(2)噻唑烷(Thiazolidines)衍生物,在采用NS3/4A融合蛋白和NS5A/5B底物進(jìn)行的反相HPLC測(cè)定中顯示了相關(guān)的抑制作用(Sudo K.et al.,Antiviral Research,1996,32,9-18),特別是化合物RD-1-6250,其具有融合的被長(zhǎng)鏈烷基取代的肉桂酰部分,RD4 6205和RD46193;(3)噻唑烷和N-苯甲酰苯胺(benzanilides),其確認(rèn)見Kakiuchi N.et al..J.EBS Letters421,217-220;Takeshita N.et al..Analytical Biochemistry,1997,247,242-246;(4)菲醌(phenan-threnequinone),其在SDS-PAGE和射線自顯跡法測(cè)定中顯示具有抗蛋白酶活性,通過從鏈霉菌(Streptomyces sp.)的發(fā)酵培養(yǎng)肉湯分離(Chu M.et al..,Tetrahedron Letters,1996,37,7229-7232),Sch 68631以及Sch 351633,分離自灰青霉菌(Penicillium griseofulvum),在閃爍近似測(cè)定(SPA)中顯示出活性(Chu M.et al..,Bioorganicand Medicinal Chemistry Letters 9,1949-1952);(5)解旋酶抑制劑(Diana G.D.et al..,Compounds,compositions and methods for treatmentof hepatitis C,美國(guó)專利第5,633,358號(hào);Diana G.D.et al.,Piperidine derivatives,pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment of hepatitis C,PCT WO97/36554);(6)核苷聚合酶抑制劑和膠霉毒素(Ferrari R.et al..Journal of Virology,1999,73,1649-1654),以及天然產(chǎn)物淺藍(lán)菌素(Lohmann V.et al..,Virology,1998,249,108-118);(7)反義硫代磷酸酯寡核苷酸(Antisense phosphorothioate oligonucleotide)(S-ODN),其與延伸入病毒的5’非編碼區(qū)(NCR)(Alt M.et al..,Hepatology,1995,22,707-717)或包含NCR的3’端的核苷326-348以及位于HCV RNA的核心編碼區(qū)的核苷371-388(Alt M.et al..,Archives of Virology,1997,142,589-599;Galderisi U.et al..,Journal of Cellular Physiology,1999,181,251-257)的序列互補(bǔ);(8)依賴于IRES的翻譯的抑制劑(Ikeda Net al..,Agent for the prevention and treatment ofhepatitis C,日本專利公開號(hào)JP-08268890;Kai Y.et al..Prevention and treatment of viraldiseases,日本專利公開號(hào)JP-10101591);(9)核酶,例如抗核酸酶核酶(Maccjak,D.J.et al..,Hepatology 1999,30,abstract 995),以及公開于Barber等人的美國(guó)專利第6,043,077號(hào)和Draper等人的美國(guó)專利第5,869,253和5,610,054號(hào)中的內(nèi)容;(10)核苷類似物也不開發(fā)用于治療黃病毒科感染。
Idenix Pharmaceuticals在國(guó)際申請(qǐng)公開號(hào)為WO 01/90121和WO 01/92282中公開了使用支鏈的核苷治療黃病毒屬(包括HCV)和瘟病毒屬。具體而言,在Idenix的公開文本中公開的用于治療在人類和其它宿主動(dòng)物體內(nèi)的丙型肝炎病毒感染(黃病毒屬和瘟病毒屬)的方法,該方法包括實(shí)施有效量的具有生物活性的1′,2′,3′或4′-支鏈的β-D或β-L核苷或其可藥用鹽或其衍生物,實(shí)施方式為單獨(dú)實(shí)施或與其它抗病毒制劑聯(lián)合給藥,也可選擇性地采用可藥用載體。
其它的揭示了使用某些核苷類似物治療丙型肝炎病毒的專利申請(qǐng)包括BioChemPharma,Inc.(現(xiàn)在為Shire Biochem,Inc.)提交的PCT/CA00/01316(WO 01/32153;2000年11月3日提交)和PCT/CA01/00197(WO 01/60315;2001年2月19日提交);Merck & Co.,Inc.提交的PCT/US02/01531(WO 02/057425;2002年1月18日提交)和PCT/US02/03086(WO02/057287;2002年1月18日提交),Roche提交的PCT/EP01/09633(WO 02/18404;2001年8月21日公開),和Pharmasset,Ltd的PCT公開號(hào)WO OIT9246(2001年4月13日提交),WO02/32920(2001年10月18日提交)和WO 02/48165。
Emory University的PCT公開號(hào)WO 99/43691,標(biāo)題為″2′-氟代核苷″公開了使用某些2′-氟代核苷治療HCV。
Eldrup等人描述了用于抑制HCV的2′-修飾的核苷的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(Oral Session V,Hepatitis C Virus,F(xiàn)laviviridae;16thInternational Conference on Antiviral Research(April27,2003,Savannah,Ga.))。
Bhat等人描述了作為可能的HCV RNA復(fù)制抑制劑的核苷類似物的合成和藥物動(dòng)力學(xué)特性。作者報(bào)道了2′-修飾的核苷在基于細(xì)胞的復(fù)制子測(cè)定中顯示出潛在的抑制活性(OralSession V,Hepatitis C Virus,F(xiàn)laviviridae;16thInternational Conference on Antiviral Research(April 27,2003,Savannah,Ga.);p A75)。
Olsen等人也描述了2′-修飾核苷對(duì)HCV RNA復(fù)制的作用(Oral Session V,Hepatitis CVirus,F(xiàn)laviviridae;16thInternational Conference on Antiviral Research(April 27,2003,Savannah,Ga.)pA76)。
(11)其它的各種化合物包括1-氨基-烷基環(huán)己烷(Gold等人的美國(guó)專利第6,034,134號(hào)),烷基脂質(zhì)(lipids)(Chojkier等人的美國(guó)專利第5,922,757號(hào)),維生素E和其它抗氧化劑(Chojkier等人的美國(guó)專利第5,922,757號(hào)),鯊烯,金剛烷,膽汁酸(Ozeki等人的美國(guó)專利第5,846,964號(hào)),N-(膦?;阴;?-L-天冬氨酸,(Diana等美國(guó)專利第5,830,905號(hào)),苯二碳酰胺(Diana等人的美國(guó)專利第5,633,388號(hào)),多聚腺苷酸衍生物(Wang等人的美國(guó)專利第5,496,546號(hào)),2′,3′-二脫氧肌苷(Yarchoan等人的美國(guó)專利第5,026,687號(hào)),苯并咪唑(Colacino等人的美國(guó)專利第5,891,874號(hào)),植物提取物(Tsai等人的美國(guó)專利第5,837,257號(hào),Omer等人的美國(guó)專利第5,725,859號(hào)和美國(guó)專利第6,056,961號(hào))和哌啶(Diana等人的美國(guó)專利第5,830,905號(hào))。
(12)當(dāng)前處于臨床前或臨床開發(fā)中的用于治療丙型肝炎病毒的其它化合物包括Schering-Ploughd的白細(xì)胞介素-10,Interneuron的IP-501,Vertex的Merimebodib,Endo LabsSolvay的AMANTADINE_(金剛烷胺),RPI的HEPTAZYME_,Idun Pharma.的IDN-6556,XTL的XTL-002,Chiron的HCV/MF59,NABI的CIVACIR_(丙型肝炎病毒免疫球蛋白),ICN/Ribapharm的LEVOVIRIN_,ICN/Ribapharm的VIRAMIDINE_,Sci Clone的ZADAXIN_(胸腺素α-1),Sci Clone的胸腺素和聚乙二醇化干擾素,Maxim的CEPLENE_(二鹽酸組胺),Vertex/Eli Lilly的VX 950/LY 570310,Pharmaceutical/Elan的Isis 14803,IdunPharmaceuticals,Inc.的IDN-6556,AKROS Pharma的JTK 003,Boehringer Ingelheim的BILN-2061,Roche的Cellcept(霉酚酸嗎啉乙酯),Tularik的T67,β-微管蛋白抑制劑,Innogenetics的針對(duì)E2的治療疫苗,F(xiàn)ujisawa Healthcare,Inc.的FK788,IdB 1016(Siliphos,口服水飛薊素-磷酸噻吡二胺Phytosome(oral silybin-phosphatdylcholine phytosome)),ViroPharma/Wyeth的RNA復(fù)制抑制劑(VP50406),Intercell的治療疫苗,Epimmune/Genencor的治療疫苗,Anadys的IRES抑制劑,Anadys的ANA 245和ANA 246,Avant的免疫療法(Therapore),Corvas/Schering的蛋白酶抑制劑,Vertex的解旋酶抑制劑,Trimeris的融合抑制劑,CellExSys的T細(xì)胞療法,Biocryst的聚合酶抑制劑,PTC Therapeutics的靶向RNA化學(xué),Immtech Int.的雙陽離子(Dication),Agouron的蛋白酶抑制劑,Chiron/Medivir的蛋白酶抑制劑,AVI BioPharma的反義療法,Hybridon的反義療法,Aethlon Medical的血液清潔劑(hemopurifier),Meri的治療疫苗,Bristol-Myers Squibb/Axys的蛋白酶抑制劑,Tripep的Chron-VacC,一種治療疫苗,United Therapeutics的UT 231B,Genelabs Technologies的蛋白酶,解旋酶和聚合酶抑制劑,Immusol的IRES抑制劑,Rigel Pharmaceuticals的R803,InterMune的INFERGEN_(干擾素alphacon-1),Viragen的OMNIFERON_(天然干擾素),Human Genome Science的ALBUFERON_,Ares-Serono的REBIF_(干擾素beta-1a),BioMedicine的ω-干擾素,Amarillo Biosciences的口服α-干擾素,InterMune的γ-干擾素,τ-干擾素和γ-1b干擾素。
先前已經(jīng)描述了核苷前藥用于治療其它類型的肝炎。Idenix Pharmaceuticals的WO01/96353(2001年6月15日提交)公開了2′-脫氧-β-L-核苷,以及它們用于治療HBV的3′-前藥。Beauchamp的美國(guó)專利第4,957,924號(hào)公開了各種治療用的無環(huán)鳥苷(acyclovir)的酯。
考慮到HCV感染已經(jīng)達(dá)到了世界范圍的流行程度,并對(duì)患者造成悲劇性的影響,因此急需提供新而有效的并對(duì)寄主低毒性的治療丙型肝炎的藥物制劑。
另外,考慮到其他的黃病毒科感染的日漸上升的危害,急需提供新而有效的并對(duì)寄主低毒性的藥物制劑。
因此,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種化合物,用于治療感染了丙型肝炎病毒的寄主的方法和組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供用于治療感染了瘟病毒屬、黃病毒屬或肝病毒屬患者的通用方法和組合物。
發(fā)明內(nèi)容
已發(fā)現(xiàn)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-L-纈氨酸酯(以下可稱為val-mCyd)對(duì)黃病毒屬和瘟病毒屬,包括丙型肝炎病毒有非常好的治療效果。基于此發(fā)現(xiàn),提供了用于治療黃病毒科包括HCV的化合物、組合物、方法和用途,其包括將有效量的val-mCyd或其鹽、酯、前藥,以及選擇性的可藥用載體進(jìn)行給藥。在選擇性的實(shí)施方式中,val-mCyd被用于治療通過RNA依賴的RNA聚合酶來復(fù)制的病毒。
因此,第一種實(shí)施方式提供了具有式(I)的化合物,β-D-2′-C-甲基核糖呋喃基胞苷或其可藥用鹽,以及該化合物在醫(yī)學(xué)治療中以及在制備治療感染了包括HCV的黃病毒屬或瘟病毒屬的宿主,特別是人類的藥物中的用途。
化合物val-mCyd通過在胃腸黏膜、血液和肝臟內(nèi)的脫酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槟阁wmCyd,并且在口服后從胃腸內(nèi)腔通過在胃腸管道內(nèi)黏膜中的氨基酸運(yùn)輸體作用(amino acid transporterfunction)而被有效地傳送到血流中。因此,與主要通過核苷運(yùn)輸體作用運(yùn)輸?shù)哪阁w2′-支化的核苷相比,在口服生物利用度上有所增加。并且與通過核苷運(yùn)輸體作用而不是氨基酸運(yùn)輸體作用運(yùn)輸?shù)钠渌暮塑栈蚝塑疹愃莆镏g的競(jìng)爭(zhēng)也減小了。由于在完全吸收之前的部分脫酯化反應(yīng),纈氨酸的單或二酯繼續(xù)通過氨基酸運(yùn)輸體作用而被吸收。因此,獲得了更好的吸收、生物利用度和與其他的核苷或核苷類似物之間的吸收入血流中的競(jìng)爭(zhēng)的減小這樣的極佳的結(jié)果。
對(duì)感染了丙型肝炎的黑猩猩,val-mCyd在7天內(nèi)使HCV RNA水平平均減少了0.83log10copies/ml(8.3mg/kg/day)和1.05log10copies/ml(16.6mg/kg/day)。這些黑猩猩沒有顯示出與藥物相關(guān)的安全問題。
母體核苷(mCyd)結(jié)構(gòu)可以β-D或β-L核苷形式存在。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中,可藥用化合物的給藥形式是至少含90%的β-D對(duì)映體。在另一實(shí)施方式中,val-mCyd至少含95%的β-D對(duì)映體。纈氨酸酯也具有對(duì)映體形式。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中,纈氨酸部分至少為90%的L-對(duì)映體。在另一實(shí)施方式中,纈氨酸部分至少為95%的L-對(duì)映體。在又一實(shí)施方式中,化合物以作為外消旋混合物或以β-D或β-L母體核苷和L或D氨基酸加以利用。
式(I)在一具體的實(shí)施方式中,式(I)化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯·HCl鹽。在另一具體的實(shí)施方式中,式(II)化合物,β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷二鹽酸鹽,被用于對(duì)感染了黃病毒屬或瘟病毒屬感染的宿主,特別是人類的給藥。在其他實(shí)施方式中,提供了甲苯磺酸鹽,甲磺酸鹽,醋酸鹽,檸檬酸鹽,丙二酸鹽,酒石酸鹽,琥珀酸鹽,安息香酸鹽,抗壞血酸鹽,α-酮戊二酸鹽,和α-甘油磷酸,甲酸鹽,延胡索酸鹽,丙酸鹽,乙醇酸鹽,乳酸鹽,丙酮酸鹽,草酸鹽,馬來酸鹽,水楊酸鹽,硫酸鹽,磺酸鹽,硝酸鹽,碳酸氫鹽,氫溴酸鹽,氫溴酸鹽,氫碘酸鹽,碳酸鹽和磷酸鹽。
式(II)在另一實(shí)施方式中,提供了一種藥物組合物,其含有2′-C-甲基-胞苷-3′-O-L-纈氨酸酯或其可藥用鹽,包括單或二鹽酸鹽,酯,前藥或其衍生物以及可藥用載體,賦形劑或稀釋劑。
在又一實(shí)施方式中,5′-羥基被5′-OR代替,其中,R是磷酸鹽(包括單磷酸鹽,二磷酸鹽,三磷酸鹽或穩(wěn)定化的磷酸鹽前藥);?;?包括低級(jí)?;?;烷基(包括低級(jí)烷基);磺酸酯,其包括烷基或芳烷基磺?;?,所述烷基或芳烷基磺?;谆酋:捅寤?,其中,苯基被一個(gè)或多個(gè)取代基選擇性取代,所述取代基符合這里給出的芳基的定義;脂質(zhì),包括磷脂;氨基酸;烴;肽;膽固醇;或其他可藥用離去基團(tuán),這些離去基團(tuán)當(dāng)在體內(nèi)給藥后能夠提供R獨(dú)立為H或磷酸鹽的化合物。
本發(fā)明的活性化合物可以與其他能有效對(duì)抗包括HCV的黃病毒屬或瘟病毒屬(包括在發(fā)明背景中描述或提到的)的其他制劑或其他有用的生物制劑聯(lián)合給藥或交替給藥。因此,另一主要的實(shí)施方式是藥物組合物,其含有β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷-3′-O-L-纈氨酸酯或可藥用鹽(包括單或二鹽酸鹽),酯,前藥或其可藥用衍生物和一種或多種有效抗病毒制劑,以及可選擇的可藥用載體或稀釋劑。在另一實(shí)施方式中,提供了一種方法,即包括將β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷-3′-O-L-纈氨酸酯或鹽,酯,前藥或其衍生物與一種或多種有效抗病毒制劑,以及可選擇的可藥用載體或稀釋劑聯(lián)合或交替給藥。
任何可以賦予期望的生物效應(yīng)的第二種抗病毒制劑都可以選擇。非限制性的例子包括干擾素,利巴韋林,白細(xì)胞介素,NS3蛋白酶抑制劑,半胱氨酸蛋白酶抑制劑,菲醌,噻唑烷衍生物,噻唑烷,N-苯甲酰苯胺,解旋酶抑制劑,聚合酶抑制劑,核苷類似物,膠霉毒素,淺藍(lán)菌素,反義硫代磷酸酯寡核苷酸,IRES-依賴翻譯抑制劑或核酶。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中,第二種抗病毒制劑選自天然干擾素,干擾素α(包括干擾素-α-2a和干擾素-α-2b),干擾素β(包括干擾素β-1a),ω干擾素,干擾素γ(包括干擾素γ-1b),干擾素τ,和復(fù)合干擾素。這些干擾素均可被穩(wěn)定化或加以該性來提高耐受性和生物穩(wěn)定性以及其他生物特性。常用的一種改性是進(jìn)行聚乙二醇化(用聚乙二醇該性)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中,第二種抗病毒制劑是聚乙二醇化或未聚乙二醇化的干擾素2-α。
在又一實(shí)施方式中,活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-氨基酸酯,其中,氨基酸可以是天然的或合成的,并可以為D或L立體構(gòu)型。在另一實(shí)施例中,活性化合物β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-乙?;ァ?br>
圖1a和1b表示了如實(shí)施例1中所描述的兩種制備β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯二鹽酸鹽的方法。
圖2為凝膠照片,其描述了如實(shí)施例9中所描述的通過位于RNA模板的特定鳥嘌呤殘基的β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷三磷酸酯的體外RNA合成的位點(diǎn)特異性(cite-specific)鏈終止。
圖3是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的效價(jià)對(duì)BVDV感染的MDBK細(xì)胞傳代數(shù)關(guān)系的圖片,其顯示了如實(shí)施例10所述那樣采用β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷(16μM)的持續(xù)治療,頑固的BVDV感染被徹底根除。箭頭指示出退出藥物治療的部分的細(xì)胞的點(diǎn)。
圖4a和4b是如實(shí)施例11中描述的被病毒持續(xù)感染的MDBK細(xì)胞中牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的濃度的圖。圖中表明在降低病毒效價(jià)中,β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷與干擾素α2b(IntronA)的協(xié)同作用。圖4a是表示在持續(xù)感染的MDBK細(xì)胞中,β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷與IntronA對(duì)BVDV(菌株NY-1)效價(jià)的影響的圖。圖4b是表示在持續(xù)感染的MDBK細(xì)胞中,β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷與IntronA對(duì)BVDV(菌株I-N-dIns)效價(jià)的影響的圖。
圖5a-d顯示了研究對(duì)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷治療的實(shí)施例12中所述的感染了牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的MDBK細(xì)胞的抵抗性(resistance)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖5a是顯示了在持續(xù)感染的MDBK細(xì)胞中,用β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷或IntronA連續(xù)治療28天的效果的代表性實(shí)驗(yàn)的圖表。圖5b是一覆蓋了感染的MDBK細(xì)胞的圓盤的圖片,其顯示了由野生型BVDV(菌株I-N-dIns)的顯型形成的聚點(diǎn)(foci)相對(duì)于抗β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的BVDV(I-N-dIns 107R)的大小,表明抵抗性的病毒形成了比野生型I-N-dIns菌株小得多的聚點(diǎn)。圖5c是描述在感染的MDBK細(xì)胞中,BVDV菌株I-N-dIns或I-N-dIns 107R的效價(jià)隨感染后的小時(shí)數(shù)變化的圖表。圖5d是描述在用Intron A治療的denovo感染的MDBK細(xì)胞中,Intron A對(duì)BVDV病毒產(chǎn)生的影響的圖表。
圖6是表示在用如實(shí)施例13所描述的β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯治療數(shù)天的單個(gè)黑猩猩中的丙型肝炎病毒的濃度(Log10)隨時(shí)間變化的圖表。
圖7是表示在用如實(shí)施例13所描述的β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯治療數(shù)天的單個(gè)黑猩猩中的丙型肝炎病毒的濃度(Log10)與基線的差別隨時(shí)間變化的圖表。
圖8是表示在實(shí)施例14中描述的當(dāng)藥物在人血漿中于4℃、21℃和37℃中溫育(incubation)后,隨著時(shí)間的變化,殘留在樣品中的總的β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯所占的比例的圖表。
圖9a是表示在實(shí)施例14中所描述的在用10μMβ-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行溫育后,β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷和β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基尿苷(mUrd)的二和三磷酸酯衍生物的相對(duì)水平隨時(shí)間變化的圖表。圖9b是表示在用10μMβ-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行溫育后,β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的三磷酸酯衍生物隨時(shí)間衰減的圖表。圖9c是表示在增加藥物的濃度(μM)的條件下,在用10μMβ-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行溫育后,β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基尿苷(mUrd)的二和三磷酸酯衍生物的濃度的圖表。
圖10是表示在實(shí)施例17中描述的對(duì)患者施用β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯后,人血清中β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的濃度(ng/ml)的圖表。
圖11是表示在實(shí)施例17中描述的對(duì)患者施于β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯后,人類患者中丙型肝炎病毒的效價(jià)的平均變化的圖表。圖中表明了由患者隨訪(patient visit)得到的Log10HCV RNA與基線的變化。
具體實(shí)施例方式
已發(fā)現(xiàn)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯(以下稱為val-mCyd)對(duì)包括丙型肝炎病毒在內(nèi)的黃病毒屬和瘟病毒屬有極好的對(duì)抗性?;诖税l(fā)現(xiàn),提供了用于治療包括HCV的黃病毒科病毒的化合物、組合物、方法和用途,這包括了實(shí)施有效量的val-mCyd或其鹽、酯、前藥或衍生物,也可以還有可藥用載體。在另一實(shí)施方式中,val-mCyd被用于治療任何通過RNA依賴的RNA聚合酶的病毒的復(fù)制。
這些公開的化合物或它們的可藥用衍生物或鹽或可藥用的含有這些化合物的配方(formulation)在預(yù)防和治療黃病毒科病毒(包括HCV)感染和其他相關(guān)疾病如抗-HCV抗體陽性(anti-HCV antibody positive)和HCV-陽性疾病(HCV-positive conditions)以及與丙型肝炎相關(guān)的肝癌(例如,肝細(xì)胞癌)和肝部腫瘤中是有用的。另外,這些化合物或劑型可被預(yù)防性地用于預(yù)防和阻止抗-HCV(或更普遍的是抗-黃病毒科病毒)抗體或HCV-抗原或黃病毒科病毒-抗原陽性的患者或暴露于HCV之下或其他黃病毒科病毒之下的患者的臨床疾病的發(fā)展。
綜上所述,本發(fā)明具有以下特征(a)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯,其可藥用前藥,衍生物和鹽,具體包括單或二鹽酸鹽;(b)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯,其可藥用前藥,衍生物和鹽在醫(yī)學(xué)療法中的應(yīng)用,例如用于治療黃病毒科病毒(包括HCV)感染的預(yù)防;(c)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯,其可藥用前藥,衍生物和鹽在制備用于治療黃病毒科病毒(包括HCV)感染的藥物中的應(yīng)用;(d)藥學(xué)制劑,含有β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯,其可藥用前藥,衍生物和鹽,以及可藥用載體或稀釋劑;(e)制備β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯的方法;(f)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯在治療由通過RNA依賴的RNA聚合酶復(fù)制的病毒引起的感染中的應(yīng)用;(g)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-O-L-纈氨酸酯在與其他抗病毒制劑聯(lián)合或交替實(shí)施用于治療病毒感染中的應(yīng)用。
在另一實(shí)施例中,活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-氨基酸酯,其中的氨基酸可以是天然的或合成的,并且可以是D或L立體構(gòu)型的。在又一實(shí)施方式中,活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-酰基酯。本發(fā)明的化合物或者是具有抗病毒的活性,或者是通過代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞@種活性的化合物。
盡管不拘泥于理論,但體外藥物作用機(jī)制(mechanism of action)研究表明mCyd是染色體組的RNA復(fù)制的特異性抑制劑。并且,細(xì)胞內(nèi)的5′-三磷酸酯部分,mCyd-TP,顯示出對(duì)NS5B RNA依賴的RNA聚合酶的直接抑制。對(duì)在mCyd-TP存在下的RNA合成的分析表明,mCyd-TP在RNA合成中起到鏈終止的作用,但其作用機(jī)理尚未得到確認(rèn)??共《竞塑蘸秃塑疹愃莆锿ǔS杉?xì)胞內(nèi)的激酶轉(zhuǎn)化為活性的代謝物5′-三磷酸酯(TP)衍生物。然后,核苷-TP在病毒復(fù)制中通過抑制病毒聚合酶而表現(xiàn)出它們的抗病毒活性。在培養(yǎng)的細(xì)胞中,細(xì)胞內(nèi)的磷酸化作用將mCyd主要轉(zhuǎn)化為活性型(species)mCyd-三磷酸酯(mCyd-TP),并伴有較少的mCyd-二磷酸酯。另外,還發(fā)現(xiàn)了第二種TP產(chǎn)物,2′-C-甲基-尿苷TP(mUrd-TP),其被認(rèn)為通過細(xì)胞內(nèi)的mCyd或mCyd-5′-磷酸酯型(species)的去氨基化而增加。
對(duì)本發(fā)明范圍內(nèi)的黃病毒屬的一般性討論可以在Fields Virology,EditorsFields,.N.,Knipe,D.M.and Howley,P.M.;Lippincott-Raven Pulishers,Philadelphia,PA;Chapter 31(1996)一書中找到。具體的黃病毒屬病毒包括但不限于Absettarov,Alfuy,Apoi,Aroa,Bagaza,斑齊(Banzi),Bouboui,Bussuquara,Cacipacore,凱里島(Carey Island),達(dá)喀爾蝙蝠(Dakarbat),1型登革熱(Dengue 1),2型登革熱(Dengue 2),3型登革熱(Dengue 3),4型登革熱(Dengue 4),Edge Hill,Entebbe蝙蝠(Entebbe bat),Gadgets Gully,Hanzalova,Hypr,Ilheus,以色列火雞腦膜腦炎(Israel turkey meningoencephalitis),日本腦炎(Japaneseencephalitis),Jugra,胡蒂亞帕病毒(Jutiapa),Kadam,Karshi,Kedougou,科科貝拉(Kokobera),庫坦戈(Koutango),Kumlinge,昆津(Kunjin),庫阿撒魯爾森林病(Kyasanur Forest disease),Langat,跳躍病(Louping ill),Meaban,莫多克(Modoc),蒙大拿腦白質(zhì)炎(Montana myotisleukoencephalitis),墨累谷腦炎(Murray valley encephalitis),Naranjal,勒格西(Negishi),恩他耶(Ntaya),鄂木斯克出血熱(Omsk hemorrhagic fever),金邊蝙蝠(Phnom-Penh bat),玻瓦桑(Powassan),里奧布拉沃(Rio Bravo),羅西奧(Rocio),皇家農(nóng)場(chǎng)(Royal Farm),俄羅斯春夏型腦炎(Russian spring-summer encephalitis),薩波亞(Saboya),圣路易士腦炎(St.Louis encephalitis),Sal Vieja,San Perlita,Saumarez Reef,塞匹克河(Sepik),Sokuluk,Spondweni,斯特拉特福德(Stratford),坦布蘇(Tembusu),秋列尼(Tyuleniy),烏干達(dá)S(Uganda S),烏蘇圖河(Usutu),威塞爾斯布隆(Wesselsbron),西尼羅河(West Nile),雅溫德(Yaounde),黃熱病(Yellow fever)和齊卡(Zika)。
對(duì)本發(fā)明范圍內(nèi)的瘟病毒屬的一般性討論也可以在Fields Virology(Id.)一書中找到。具體的瘟病毒屬病毒包括但不限于牛病毒性腹瀉病毒(“VDV”)、古典豬瘟病毒(“CSFV”,也稱之為豬瘟病毒)以及羊邊界病病毒(“DV”)。
定義這里使用的術(shù)語“烷基”,除非特別所指,是指飽和的直鏈、支鏈或環(huán)狀的典型的C1到C10的一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)烴。具體包括CF3,CCl3,CFCl2,CF2CI,CH2CF3,CF2CF3,甲基,乙基,丙基,異丙基,環(huán)丙基,丁基,異丁基,仲丁基,叔丁基,戊基,環(huán)戊基,異戊基,新戊基,己基,異己基,環(huán)己基,環(huán)己基甲基,3-甲級(jí)戊基,2,2-二甲基丁基和2,3-二甲基丁基。該術(shù)語包括取代和未取代的烷基,特別包括鹵化烷基,尤其特別是氟化烷基。可用于取代烷基的部分的非限制性的例子選自由鹵素(氟,氯,溴或碘),羥基,氨基,烷氨基,芳氨基,烷氧基,芳氧基,硝基,氰基,磺酸,硫酸鹽,磷酸,磷酸鹽或膦酸鹽組成的組,可以是未保護(hù)的,也可以是根據(jù)需要而保護(hù)的,這些對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都是已知的,例如在Greene,et al.,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,Second Edition,1991一書中就有教導(dǎo),該書在此引入作為參考。
這里使用的術(shù)語“低級(jí)烷基”,除非特別所指,是指C1到C4的飽和的直鏈、支鏈或環(huán)狀(例如,環(huán)丙基)的烷基,其包括取代和或未取代的形式。在本申請(qǐng)中除非特別所指,作為烷基的合適的部分,以低級(jí)烷基為優(yōu)選。同樣的,作為烷基或低級(jí)烷基的合適部分,以未取代的烷基或低級(jí)烷基為優(yōu)選。
術(shù)語“烷氨基”或“芳氨基”分別指具有一個(gè)或兩個(gè)烷基或芳基取代基的氨基。
這里使用的術(shù)語“保護(hù)的”,除非特別所指,是指為了防止氧、氮或磷原子的進(jìn)一步反應(yīng)或用于其他目的而加到它們上的的基團(tuán)。多種氧和氮保護(hù)基對(duì)于有機(jī)合成領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的。
這里使用的術(shù)語“芳基”,除非特別所指,是指苯基,聯(lián)苯基或萘基,優(yōu)選苯基。該術(shù)語包括取代的和未取代的兩種情況。所述芳基可被任何被描述的基團(tuán)取代,包括但不限于一或多個(gè)選自鹵素(氟,氯,溴或碘),羥基,氨基,烷基氨基,芳基氨基,烷氧基,芳氧基,硝基,氰基,磺酸,硫酸根,膦酸,磷酸根或膦酸根,其或者是未保護(hù)的,或者根據(jù)需要進(jìn)行保護(hù)的,這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的,例如,Greene,et al.,Protective Groups inOrganic Synthesis,John Wiley and Sons,Second Edition,1991,中教導(dǎo)的那樣。
術(shù)語“烷芳基”或“烷基芳基”指具有一個(gè)芳基取代基的烷基。術(shù)語芳烷基或芳基烷基指具有一個(gè)烷基取代基的芳基。
在此使用的術(shù)語“鹵代”分別具體包括氯,溴,碘和氟。
術(shù)語“嘌呤”或“嘧啶”堿基包括,但不限于腺嘌呤,N6-烷基嘌呤,N6-?;堰?其中酰基是C(O)(烷基,芳基,烷基芳基,或芳基烷基),N6-芐基嘌呤,N6-鹵代嘌呤,N6-乙烯基嘌呤,N6-乙炔型嘌呤,N6-?;堰?,N6-羥基烷基嘌呤,N6-烷基氨基嘌呤,N6-硫代烷基嘌呤,N2-烷基嘌呤,N2-烷基-6-硫代嘌呤,胸腺嘧啶,胞嘧啶,5-氟代胞嘧啶,5-甲基胞嘧啶,6-氮雜嘧啶,包括6-氮雜胞嘧啶,2-和/或4-巰基嘧啶,尿嘧啶,5-鹵代尿嘧啶,包括5-氟代尿嘧啶,C5-烷基嘧啶,5-碘代嘧啶,6-碘代嘧啶,2-Br-乙烯基-5-嘧啶,2-Br-乙烯基-6-嘧啶,C5-芐基嘧啶,C5-鹵代嘧啶,C5-乙烯基嘧啶,C5-乙炔型嘧啶,C5-?;奏?,C5-羥基烷基嘌呤,C5-(酰)氨基嘧啶,C5-氰基嘧啶,C5-硝基嘧啶,C5-氨基-嘧啶,N2-烷基嘌呤,N2-烷基-6-硫代嘌呤,5-氮雜胞苷基,5-氮雜尿嘧啶基,三唑并吡啶基,咪唑并吡啶基,吡咯并嘧啶基,和吡唑并嘧啶基。嘌呤堿基包括,但不限于,鳥嘌呤,腺嘌呤,次黃嘌呤,2,6-二氨基嘌呤,和6-氯代嘌呤。在必要或需要時(shí),可以對(duì)堿基上的官能氧和氮進(jìn)行保護(hù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知適當(dāng)?shù)谋Wo(hù)基團(tuán),包括三甲硅烷基,二甲基己基甲硅烷基,叔丁基二甲基甲硅烷基,叔丁基二苯基甲硅烷基,三苯甲基,烷基和?;?,如乙酰基和丙?;?,甲磺酰基,和對(duì)甲苯磺酰基。
術(shù)語“酰基”或“O-連接的酯”指具有式C(O)R’的基團(tuán),其中R’是直鏈,支鏈,或環(huán)烷基(包括低級(jí)烷基),氨基酸的羧酸鹽殘基,芳基包括苯基,雜芳基,烷基芳基,芳基烷基包括卞基,烷氧基烷基,包括甲氧基甲基,芳氧基烷基如苯氧基甲基;或取代的烷基(包括低級(jí)烷基),芳基包括任選被氯,溴,氟,碘,C1至C4烷基或C1至C4烷氧基取代的苯基,磺酸酯如烷基或芳烷基磺酰基包括甲磺?;?,單,二或三磷酸酯,三苯甲基或單甲氧基-三苯甲基,取代的芐基,烷芳基,芳烷基包括芐基,烷氧基烷基包括甲氧基甲基,芳氧基烷基如苯氧基甲基。所述酯中的芳基優(yōu)選包含苯基。
在非限制性實(shí)施方式中,酰基包括乙?;?,三氟代乙酰基,甲基乙?;?,環(huán)丙基乙?;?,環(huán)丙基羧基,丙?;□;?,異丁?;?,己?;;?,辛?;?,新-庚?;?,苯乙?;?,2-乙酸基-2-苯乙?;揭阴;?甲氧基-α-三氟甲基-苯乙?;宕阴;?,2-硝基-苯乙酰基,4-氯-苯乙?;?-氯-2,2-二苯乙?;?,2-氯-2-苯乙?;谆阴;?,氯二氟代乙?;阴;?,氟代乙?;?,溴二氟代乙?;?,甲氧基乙?;?,2-噻吩乙?;?,氯磺?;阴;?,3-甲氧基苯乙?;窖趸阴;?,叔-丁基乙酰基,三氯代乙?;瑔温?乙?;却阴;?,7H-十二氟-庚?;?,全氟-庚?;?,7H-十二-氟代庚酰基,7-氯十二氟-庚?;?,7-氯-十二氟-庚?;?H-十二氟代庚?;?,7H-十二氟代庚?;?,九氟-3,6-二氧雜-庚?;煞?3,6-二氧雜庚?;?,全氟代庚酰基,甲氧基苯甲酰基,甲基3-氨基-5-苯基噻吩-2-羧基,3,6-二氯-2-甲氧基-苯甲?;?,4-(1,1,2,2-四氟-乙氧基)-苯甲酰基,2-溴-丙酰基,ω-氨基辛酰基,癸?;骞秕;?,硬脂酰基,3-環(huán)戊基-丙?;?,1-苯-羧基,O-乙?;嘈尤术;挛祯;阴;?,1-金剛烷-羧基,環(huán)己烷-羧基,2,6-吡啶二羧基,環(huán)丙烷-羧基,環(huán)丁烷-羧基,全氟代環(huán)己基羧基,4-甲基苯甲酰基,氯甲基異噁唑基羰基,全氟代環(huán)己基羧基,巴豆?;?,1-甲基-1H-吲唑-3-羰基,2-丙烯基,異戊?;?,1-吡咯烷羰基,4-苯基苯甲?;?br>
術(shù)語“氨基酸”包括天然存在和合成的α、β、γ或δ氨基酸,包括但不限于,在蛋白中發(fā)現(xiàn)的氨基酸,即甘氨酸,丙氨酸,纈氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,甲硫氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,脯氨酸,絲氨酸,蘇氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,天冬氨酸,谷氨酸,賴氨酸,精氨酸和組氨酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述氨基酸是L-構(gòu)型,但也可以以D-構(gòu)型使用?;蛘?,所述氨基酸可以是丙氨酰,纈氨酰,亮氨酰,異亮氨酰,脯氨酰,苯丙氨酰,色氨酰,甲硫氨酰,甘氨酰,絲氨酰,蘇氨酰,半胱氨酰,酪氨酰,天冬酰胺酰,谷氨酰胺酰,天冬氨酰,谷氨酰,賴氨酰,精氨酰,組氨酰,β-丙氨酰,β-纈氨酰,β-亮氨酰,β-異亮氨酰,β-脯氨酰,β-苯丙氨酰,β-色氨酰,β-甲硫氨酰,β-甘氨酰,β-絲氨酰,β-蘇氨酰,β-半胱氨酰,β-酪氨酰,β-天冬酰胺酰,β-谷氨酰胺酰,β-天冬氨酰,β-谷氨酰,β-賴氨酰,β-精氨?;颚?組氨酰的衍生物。
在此使用的術(shù)語“基本上不含有”或“基本上不存在”指在核苷組合物中包括重量比至少為85%或90%,優(yōu)選95%,98%,99%或100%的所述核苷的指定對(duì)映體。
同樣地,術(shù)語“分離的”指在核苷組合物中包括重量比至少為85%,90%,95%,98%,99%或100%的所述核苷。
在此使用的術(shù)語“宿主“指病毒在其中可復(fù)制的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體,包括細(xì)胞系和動(dòng)物,優(yōu)選人?;蛘?,所述宿主可攜帶一部分黃病毒基因組,其復(fù)制或功能可被本發(fā)明的化合物改變。術(shù)語宿主具體指感染的細(xì)胞、用黃病毒基因組的全部或一部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和動(dòng)物,具體而言是靈長(zhǎng)類(包括黑猩猩)和人。在大多數(shù)動(dòng)物中應(yīng)用本發(fā)明時(shí),所述宿主是人患者。然而,在某些適應(yīng)癥中,獸醫(yī)也可以應(yīng)用本發(fā)明(如用于黑猩猩)。
全文中使用的術(shù)語“可藥用鹽或前藥″來描述核苷化合物的任何可藥用形式(如酯,磷酸酯,酯鹽或相關(guān)基團(tuán)),在將上述所有這些形式施用于患者后,提供了所述的核苷化合物??伤幱名}包括那些衍生自可藥用無機(jī)或有機(jī)堿和酸的鹽。在眾多制藥領(lǐng)域眾所周知的其它酸中,適合的鹽包括那些衍生自堿金屬如鉀和鈉,堿土金屬如鈣和鎂的鹽??伤幱们八幹冈谒拗黧w中被代謝如被水解或氧化以形成本發(fā)明化合物的化合物。前藥的典型實(shí)例包括在所述活性化合物的官能團(tuán)部分具有生物學(xué)不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)的化合物。前藥包括可被氧化、還原、胺化、脫氨基、羥基化、脫羥基、水解、脫水、烷基化、脫烷基、酰化、脫酰基、磷酸化、脫磷酸產(chǎn)生活性化合物的化合物。本發(fā)明的化合物具有抗黃病毒科病毒的抗病毒活性,或被代謝以產(chǎn)生具有該活性的化合物。
I.活性化合物,其生理學(xué)上可接受的鹽和前藥如上所述,用于治療瘟病毒屬病毒、黃病毒屬病毒和丙型肝炎感染的方法和組合物包括對(duì)受感染的宿主施于有效量的2′-C-甲基-胞苷-3′-O-L-纈氨酸或其可藥用鹽、酯或前藥。
在一個(gè)實(shí)施方式中,使用了式(I)化合物的鹽酸鹽。在另一實(shí)施方式中,優(yōu)選使用式(I)化合物的二鹽酸鹽。但是,活性化合物可以以任何鹽或前藥的方式給予接受者,只要是能夠提供直接的或間接的母體化合物或能自身顯示出活性的物質(zhì)。非限制性的例子是可藥用鹽,其也可被成為“生理學(xué)上可接受的鹽”,以及被烷化、?;蛞云渌绞皆?’-位或在嘌呤或嘧啶堿基上進(jìn)行了改性的的化合物,從而形成了“可藥用鹽”的形式。另外,改性可以影響到化合物的生物活性,在某些情況下提高母體化合物的活性。關(guān)于對(duì)此的評(píng)價(jià)可以通過制備鹽或前藥并根據(jù)在此描述的方法測(cè)試其抗病毒活性,或采取其他本領(lǐng)域技術(shù)人員習(xí)知的方法進(jìn)行。
在第一個(gè)主要的實(shí)施方式中,提供了式(I)化合物或其可藥用鹽或前藥 式(I)應(yīng)當(dāng)理解的是,上式中包括了所有的立體異構(gòu)形式、互變異構(gòu)形式和多態(tài)形式的化合物。2’-甲基取代也可以是其他烷基,如乙基、丙基或也可以是乙烯基。
在另一種實(shí)施方式中,活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-氨基酸酯,其中的氨基酸可以是天然的或合成的,并且可以是D或L立體構(gòu)型的。在又一實(shí)施方式中,活性化合物是β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-酰基酯。
在另一選擇性的實(shí)施方式中,5’-羥基被5’-OR代替,其中,R是磷酸酯(包括單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或穩(wěn)定的磷酸酯前藥);穩(wěn)定的磷酸酯前藥;?;?包括低級(jí)酰基);烷基(包括低級(jí)烷基);磺酸酯,其包括烷基或芳烷基磺?;?,包括甲磺?;?,以及卞基,其中,苯基是可被一個(gè)或多個(gè)具有這里給出的芳基定義的取代基取代;脂質(zhì),包括磷脂;氨基酸;碳水化合物;肽;膽固醇;或其他可藥用離去基團(tuán),這些離去基團(tuán)當(dāng)在體內(nèi)給藥后能夠提供R獨(dú)立為H或磷酸鹽的化合物。
II.活性化合物的合成本發(fā)明的化合物可以通過已知的方法進(jìn)行合成。例如,在一個(gè)實(shí)施方式中,制備了核苷、核苷類似物、或其鹽、前藥、立體異構(gòu)體或互變異構(gòu)體,其在2’C上發(fā)生了雙取代。在另一實(shí)施方式中,制備了具有作為活性核苷的意義或可用作過程中間體的β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3,4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。在又一實(shí)施方式中,制備了β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-甲基-2-羥甲基-四氫-呋喃-3-基酯)的3’-O-纈氨酸酯或其鹽酸鹽形式。制備的核苷、核苷類似物、鹽、或酯類前藥可用作在制備大量的其他核苷類似物中的中間體,也可以直接用作抗病毒和/或抗腫瘤制劑。
實(shí)施例1β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷-3′-纈氨酸酯的合成在一種合成方法中,如在圖1a中所示,合成包括將胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈與1,2,3,5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(1)反應(yīng),形成4-氨基-1-(3,4-二苯甲酰氧-5-二苯甲酰氧甲基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(2);以及將(2)與NaOMe/MeOH反應(yīng),提供4-氨基-1-(3,4-二氫-5-羥甲基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(3),也可叫作2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。不使用苯甲酰胞嘧啶而使用胞嘧啶作為起始原料改善了方法的“原子經(jīng)濟(jì)(atom economy)”并簡(jiǎn)化了后續(xù)步驟中的純化操作。
本方法中的下一個(gè)步驟包括將(3)與Me2NCH(OMe)2在DMF中反應(yīng),形成(4),N[1-(3,4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基)-2-氧-1,2-二氫-嘧啶-4-基]-N,N-二甲基-甲脒,其是(3)的氨基-保護(hù)的形式;將(4)與TBDPSCl和咪唑在DCM中反應(yīng),得到(4)的5′-甲硅烷基保護(hù)的形式,即N′-{1-[5-叔丁基-二苯基-硅烷氧甲基]-3,4-二羥基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基}-2-氧-1,2-二氫-嘧啶-4-基}-N,N-二甲基-甲脒(5),其中,使用DCM的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)二甲硅烷基副產(chǎn)物的形成具有更好的控制;將(5)與N-Boc-L-纈氨酸,EDC和DMAP在DCM中于室溫下反應(yīng),形成2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧甲基)-5-[4-(二甲氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫-呋喃-3-基酯(6);將(6)與NH4F在MeOH中在約10摩爾當(dāng)量的乙酸乙酯存在下反應(yīng),在防止3’-O-纈氨酸酯被產(chǎn)生的氨切斷的條件下,除去甲硅烷基和氨基保護(hù)基,回流混合物得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫-呋喃-3-基酯(7);最后,將(7)與HCl在EtOH中反應(yīng)得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫-呋喃-3-基酯,二鹽酸鹽(8),作為最終產(chǎn)物。
選擇性合成在合成本發(fā)明化合物的另一方法中,如圖1b所示,將苯甲酰胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈與1,2,3,5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(1)反應(yīng),形成4-苯甲酰-1-(3,4-二苯甲酰氧-5-苯甲酰氧甲基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(2a);將(2a)與NH3在MeOH中反應(yīng),并用色譜分離產(chǎn)物4-氨基-1-(3,4-二氫-5-羥甲基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(3),也可叫作2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。將(3)與Me2NCH(OMe)2在DMF中于室溫下反應(yīng)1.5小時(shí),形成(4),N[1-(3,4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基)-2-氧-1,2-二氫-嘧啶-4-基]-N,N-二甲基-甲脒;將(4)與TBDPSCl和嘧啶于室溫下反應(yīng)6小時(shí),得到N′-{1-[5-叔丁基-二苯基-硅烷氧甲基]-3,4-二羥基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基}-2-氧-1,2-二氫-嘧啶-4-基}-N,N-二甲基-甲脒(5);將(5)與N-Boc-L-纈氨酸,EDC和DMAP在THF/DCM中于室溫下反應(yīng)兩天,并將在該反應(yīng)中形成的產(chǎn)物通過HPLC,得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧甲基)-5-[4-(二甲氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫-呋喃-3-基酯(6);將(6)與NH4F在MeOH中回流約3小時(shí),除去甲硅烷基和氨基的保護(hù)基,并將產(chǎn)物進(jìn)行色譜純化,得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫-呋喃-3-基酯(7);最后,將(7)與HCl在EtOH中于室溫下反應(yīng)得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫-呋喃-3-基酯,二鹽酸鹽(8),作為最終產(chǎn)物。
實(shí)施例22′-C-甲基-胞苷-3′-O-L-纈氨酸酯(VAL-mCyd)的合成流程1 步驟1化合物9的合成2-C-甲基-D-核糖-γ-內(nèi)酯在配備了懸掛式攪拌器、攪拌軸、數(shù)字溫度讀出裝置和氬氣線的250mL 3口圓底燒瓶中攪拌去離子水(100mL)。向水中鼓入氬氣30分鐘,然后加入D-果糖(20.0g,0.111mol),溶液在幾分鐘內(nèi)變清。在5分鐘內(nèi)分次加入氧化鈣(12.5g,0.223mole),并對(duì)混合物進(jìn)行激烈地?cái)嚢?。觀察到放熱,從開始加入氧化鈣10分鐘后,反應(yīng)溫度上升到39.6℃。經(jīng)過約15分鐘,反應(yīng)物變?yōu)辄S色,并且顏色隨著時(shí)間而加深。3小時(shí)后,取樣用于TLC分析。用草酸的飽和水溶液將取樣酸化到pH2。所得的白色懸浮液在減壓蒸餾下除去水。加入甲苯(2mL)到殘余物中并將混合物進(jìn)行減壓蒸餾(45-50℃),以除去任何殘留的水。再將殘留固體溶于2mL 1∶1的四氫呋喃甲醇混合物中。充分混合后,使懸浮液靜置,浮在表面的清澈的溶液用于進(jìn)行薄層色譜(TLC)(二氧化硅片在含2%甲醇的乙酸乙酯中展開,浸入1%的堿性高錳酸鉀中著色。然后用熱氣槍加熱板,直到在粉色背景中出現(xiàn)黃色的斑點(diǎn))。在上述條件下,期望的內(nèi)酯通常出現(xiàn)在Rf值為0.33之處。極性更強(qiáng)的副產(chǎn)物和未反應(yīng)的物質(zhì)在Rf值為0.0到0.2的范圍內(nèi)被檢測(cè)到。
盡管在3小時(shí)后觀察到產(chǎn)物的生成,反應(yīng)仍繼續(xù)22小時(shí),其間,對(duì)反應(yīng)混合物在25℃加以攪拌。在該期間結(jié)束之際,混合物的pH為13.06。向反應(yīng)混合物中鼓入二氧化碳?xì)饧s2.5小時(shí)(pH為7.25)。形成的碳酸鈣固體通過真空過濾除去,濾餅用50mL的去離子水清洗。合并水層并用草酸(5.0g,0.056mole)處理,對(duì)混合物在25℃劇烈攪拌30分鐘(起始時(shí)的深色基本消失,混合物變?yōu)槟贪咨臐{液)。在此階段的混合物的pH通常為2-3。漿液混合物在45-50℃攪拌過夜。然后將混合物在45-50℃下減壓蒸餾,除去75mL的水。向水性漿液中加入氯化鈉(30g)和四氫呋喃(100mL),對(duì)混合物在25℃劇烈攪拌30分鐘。分離各層,并向水層中加入75mL的新鮮的四氫呋喃,攪拌10分鐘。重復(fù)該過程3次,合并四氫呋喃溶液并加入10g無水硫酸鎂攪拌30分鐘。過濾混合物,硫酸鎂濾餅用60mL的四氫呋喃洗。將濾液在40℃減壓蒸餾,得到10.86g呈深橙色半固體狀的粗產(chǎn)物。(當(dāng)提高生產(chǎn)規(guī)模時(shí),四氫呋喃將被丙酮替代,這樣不用通過蒸餾來使粗產(chǎn)物干燥)。粗產(chǎn)物用丙酮(20mL)在20℃攪拌3小時(shí)。通過真空過濾收集產(chǎn)物,并用12mL的丙酮洗濾餅,得到目標(biāo)產(chǎn)物9,其為白色結(jié)晶的固體。真空下干燥產(chǎn)物,得到2.45g(產(chǎn)率13.6%)。化合物9的熔點(diǎn)為158-162℃(文獻(xiàn)值160-161℃)。′H NMR(DMSO-d6)δppm5.69(s,1H,用D2O交換),5.41(d,1H,用D2O交換),5.00(t,1H,用D2O交換),4.15(m,1H),3.73(m,2H),3.52(m,1H),1.22(s,3H).13C NMR(DMSO-d6)δppm176.44,82.95,72.17,72.02,59.63,20.95。(C6H10O5;計(jì)算值C,44.45;H,6.22。實(shí)測(cè)值C,44.34;H,6.30)。
步驟2化合物10的合成2,3,5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖-γ-內(nèi)酯將內(nèi)酯1(3.0g,18.50mmol.)、4-二甲基氨基吡啶(0.45g,3.72mmol.)和三乙氨(25.27g,249.72mmol.)在1,2-二甲氧基乙烷(50mL)中的混合物在25℃下、氬氣氛中攪拌30分鐘。將該白色懸浮液冷卻到5℃,在15分鐘內(nèi)加入苯甲酰氯(11.7g,83.23mmol.)。再將混合物在25℃攪拌兩小時(shí)。TLC分析(二氧化硅片,含2%甲醇的乙酸乙酯)表明起始原料已全部消耗。向反應(yīng)混合物中加入冰水(100g),繼續(xù)攪拌30分鐘。通過真空過濾收集形成的白色固體,濾餅用冷水(50mL)洗。將該粗產(chǎn)物在叔丁基甲醚(60mL)中于20℃攪拌30分鐘,然后過濾,濾餅用叔丁基甲醚(25mL)洗冰真空干燥得到7.33g(產(chǎn)率83.4%)的化合物10,其我白色固體,純度97.74%(HPLC/AUC)?;衔?0的熔點(diǎn)為137-140℃(文獻(xiàn)值141-142℃)。1H NMR(CDCl3)δppm8.04(d,2H),7.92(d,2H),7.73(d,2H),7.59(t,1H),7.45(M,4H),7.32(t,2H),7.17(t,2H),5.51(d,1H),5.17(m,1H),4.82-4.66(d,(AB四重峰),2H),1.95,(s,3H).13CNMR(CDCl3)δppm172.87,166.17,166.08,165.58,134.06,133.91,133.72,130.09,129.85,129.80,129.37,128.78,128.60,128.49,127.96,127.89,79.67,75.49,72.60,63.29,23.80。TOFMSES+(M+1475)。
步驟3化合物11的合成2,3,5-三-O-苯甲酰2-C-甲基-β-D-呋喃核糖將Red-Al(65wt.%,甲苯中,2.0mL,6.56mmol.)在無水甲苯(2.0mL)中的溶液于0℃在氬氣氣氛中攪拌。在5分鐘內(nèi),將無水乙醇(0.38mL,6.56mmol.)在無水甲苯(1.6mL)中的溶液加入到甲苯溶液。所得混合物在0℃攪拌15分鐘,將2mL(2.18mmol.)的該Red-Al/乙醇試劑在10分鐘內(nèi)加入到冷的(-5℃)2,3,5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖內(nèi)酯2(475mg,1.0mmol.)在無水甲苯(10mL)的溶液中。在-5℃攪拌該反應(yīng)混合物40分鐘。TLC分析(二氧化硅片,含2%甲醇的乙酸乙酯)表明起始原料已全部消耗。HPLC分析表明只有0.1%的起始原料剩余。在0℃用丙酮(0.2mL)、水(15mL)和1N HCI(15mL)使反應(yīng)結(jié)束,并升溫到室溫。加入1N HCI(5mL)溶解無機(jī)鹽(pH2-3)?;旌衔镉靡宜嵋阴?3×25mL)萃取,用鹽水(25mL)洗有機(jī)溶液,干燥(無水硫酸鈉,10g),40℃減壓除去溶劑,得到目標(biāo)產(chǎn)物11,定量產(chǎn)率(480mg)。該物質(zhì)用于后面的步驟。
步驟4化合物12的合成1,2,3,5-四-O-苯甲酰2-C-甲基-β-D-呋喃核糖向化合物11(480mg,1.0mmol),4-二甲基氨基吡啶(12.3mg,0.1mmol)和三乙胺(506mg,5.0mmol)在無水四氫呋喃(5mL)中的冷溶液(5℃)中,加入苯甲酰氯(283mg,2.0mmol)。反應(yīng)混合物在室溫氬氣氛圍下攪拌過夜。HPLC分析表明有0.25%的未反應(yīng)的起始原料。加入冰冷水(10g)和飽和碳酸氫鈉水溶液結(jié)束反應(yīng)。減壓下除去四氫呋喃,用乙酸乙酯(50mL)萃取混合物。用水(25mL)、鹽水(25mL)洗有機(jī)溶液,干燥(無水硫酸鈉,12g),減壓下除去溶劑得到650g厚重的油狀產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物用5mL叔丁基甲醚攪拌5分鐘,再加入庚烷(5mL)和水(0.1mL),繼續(xù)在20℃下攪拌2小時(shí)。通過真空過濾收集固體,濾餅用1∶1的庚烷叔丁基甲醚溶液(6mL)和叔丁基甲醚(2mL)洗。真空下干燥固體,得到300mg(52%)的目標(biāo)產(chǎn)物12(HPLC/AUC測(cè)定的純度未98.43%),其為白色固體,在154-156.3℃熔化(文獻(xiàn)值記載的熔點(diǎn)155-156℃)。1H NMR(CDCl3)δppm 8.13(m,4H),8.07(d,2H),7.89(d,2H),7.63(m,3H),7.48(m,6H),7.15(m,3H),7.06(s,1H),5.86(dd,1H),4.79(m,1H),4.70-4.52(d,AB四重峰,2H),1.95,(s,3H)。13C NMR(CDCl3)δppm166.31,165.83,165.01,164.77,134.01,133.86,133.70,133.17,130.44,130.13,129.97,129.81,129.59,129.39,129.07,128.84,128.76,128.37,98.01,86.87,78.77,76.35,64.05,17.07。(C34H28O9計(jì)算值C,70.34;H,4.86。實(shí)測(cè)值C,70.20;H,4.95)。
流程2 步驟5化合物13的合成4-氨基-1-(3,4-二苯甲酰氧基-5-芐氧基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮在配備了回流冷凝器、懸掛式攪拌器和氬氣入口轉(zhuǎn)接器的12L的圓底燒瓶中,將胞嘧啶(89g,0.80mol)懸浮于乙腈(900ml)中。在20℃氬氣氛圍中攪拌該懸浮液,并加入一部分N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(537ml,2.2mol)。所得溶液加熱到80℃并在相同溫度下繼續(xù)攪拌1小時(shí)。將1,2,3,5-四-O-苯甲酰2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(425.0g,0.73mol)懸浮于乙腈(4000ml)中并加入到反應(yīng)混合物中。幾分鐘后反應(yīng)混合物變得清澈,溫度降到約50℃。在15分鐘內(nèi)加入氯化錫(IV)(154ml,1.31mol)并繼續(xù)在80℃攪拌。一小時(shí)后,加入碳酸氫鈉水溶液使反應(yīng)混合物的等分試樣結(jié)束反應(yīng),并用乙酸乙酯萃取水層。用TLC(硅膠,20%乙酸乙酯的庚烷溶液,糖衍生物的Rf為0.40)檢查乙酸乙酯層。TLC分析表明糖衍生物被完全消耗。目標(biāo)產(chǎn)物用TLC使用10%的甲醇的二氯甲烷溶液(Rf為0.37)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)還用HPLC(方法#2)進(jìn)行監(jiān)控。反應(yīng)混合物冷卻到20℃并在30分鐘內(nèi)加入飽和碳酸氫鈉水溶液(3000ml)結(jié)束反應(yīng)(當(dāng)?shù)稳腩^幾滴碳酸氫鈉溶液時(shí)即觀察到勒放熱)。分次加入固體碳酸氫鈉(1350g)以避免起泡。確認(rèn)混合物的pH大于等于7。停止攪動(dòng),使之分層20分鐘。放出水層與乙酸乙酯(1500ml)攪拌,使混合物分層(30分鐘)。分離有機(jī)層與乙腈溶液合并。有機(jī)溶液用鹽水(500ml)洗,然后除去溶劑至約750ml。產(chǎn)物可被直接用于后面的反應(yīng)。此外耶可以進(jìn)一步除去溶劑得到白色泡沫狀固體獲得定量產(chǎn)率?;衔?0的結(jié)構(gòu)通過1HNMR分析得到了確認(rèn)。
步驟6化合物mCyd的合成4-氨基-1-(3,4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基-1H-嘧啶-2-酮向化合物10(416g,0.73mol)在甲醇(2000ml)溶液中,加入甲醇鈉(13.8g,0.26mol)。反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢璨⒂肨LC監(jiān)控(硅膠,10%的甲醇的二氯甲烷溶液,化合物9的Rf為0.53)和(硅膠,30%的甲醇的二氯甲烷溶液,化合物11的Rf為0.21)。30分鐘后產(chǎn)物開始沉淀,TLC表明反應(yīng)在2小時(shí)后完成。反應(yīng)還用HPLC(方法#2)進(jìn)行監(jiān)控。減壓下除去甲醇至體積為約500ml,接著加入750ml的乙醇,在20℃攪拌混合物1小時(shí)。過濾收集產(chǎn)物,濾餅用乙醇(100ml)和叔丁基甲醚(100ml)洗,干燥,得到168g的產(chǎn)物11(兩步的產(chǎn)率為90%),純度大于97%(HPLC/AUC)。產(chǎn)物還用1H NMR和13C NMR進(jìn)行了分析。
步驟7化合物14的合成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫-呋喃-3-基酯對(duì)在2L圓底燒瓶中的N-(叔丁氧羰基)-L-纈氨酸(46.50g,214mmol.),羰基二咪唑(34.70g,214mmol)和無水四氫呋喃(1000mL)中的溶液在25℃氬氣氛圍中攪拌1.5小時(shí),然后再在40-50℃下攪拌20分鐘。在一配備了懸掛式攪拌器、冷卻塔、溫度檢測(cè)器、加料漏斗和氬氣線的分離式5L的5口圓底燒瓶中,加入4-氨基-1-(3,4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫-呋喃-2-基-1H-嘧啶-2-酮(50.0g,195mmol)和無水N,N-二甲基甲脒(1000mL)。將該混合物在100℃加熱20分鐘,直到所有的嘧啶-2-酮衍生化合物都進(jìn)入到溶液中,然后,向溶液中加入三乙胺(500mL)和4-二甲基氨基吡啶(2.38g,19mmol)。然后混合物在97℃加熱20分鐘,緩慢通過加料漏斗在2小時(shí)內(nèi)加入四氫呋喃溶液,保持溫度不低于82℃。反應(yīng)混合物在82℃加熱1小時(shí)并用HPLC監(jiān)控(產(chǎn)物=68%,SM=11%,在大約12分鐘時(shí)的純度=17%,不含二甲基氨基吡啶)。反應(yīng)混合物冷卻到室溫,然后在30℃下真空除去三乙胺和四氫呋喃。溶液再用乙酸中和,使pH為7.69。在35℃下真空除去N,N-二甲基甲脒,隨后加入乙酸乙酯(2×200mL)。粗產(chǎn)物與乙酸乙酯(500mL)和水(300mL)攪拌。分成兩層,水層用乙酸乙酯(500mL)萃取。合并的有機(jī)層用飽和鹽水溶液(500mL)洗。然后,有機(jī)層用丙二酸(4×400mL,10wt.%)水溶液萃取。用TLC(硅膠,20%的甲醇的二氯甲烷溶液)檢測(cè)有機(jī)層,以確保所有的目標(biāo)產(chǎn)物都從有機(jī)層中除去。合并酸性萃取物并在冰水浴中冷卻,用三乙胺中和到pH為7.40,析出固體。然后,向水層中加入乙酸乙酯。真空過濾收集白色固體。真空干燥所得固體,得到81.08g純度99.01(HPLC)的首次產(chǎn)物。
步驟8val-mCyd-2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2羥基-甲基-4-甲基-四氫-呋喃-3-基酯(二鹽酸鹽)的合成在配備了懸掛式攪拌器、溫度檢測(cè)器、氬氣線和氯化氫氣體鼓泡口的圓底燒瓶中,攪拌化合物14(21.0g,0.046mol)在乙醇(168ml)中的溶液。氯化氫氣體(22g)被鼓入清澈的溶液中1小時(shí)。用冰水浴將反應(yīng)溫度保持在30℃。當(dāng)引入氯化氫氣體幾分鐘后開始形成固體。4小時(shí)后,HPLC(方法#3)表明僅有0.8%的起始原料。過濾收集固體,濾餅用乙醇(20ml)和二乙醚(100ml)洗。真空干燥產(chǎn)物16小時(shí)后,獲得19.06g(96.5%)的val-mCyd,純度為97.26%HPLC(方法#3);m.p.210℃(棕色),248-250℃(熔化);1H NMR(DMSO-D6)δppm10.0(s,IH,1/2NH2,D2O可交換),8.9-8.6(2 br s,4H,1/2NH2,NH3,D2O可交換),8.42(d,1H,H-6,J5-6=7.9Hz),6.24(d,1H,H-5,J5-6=7.9Hz),5.84(s,1H,H-1′),5.12(d,1H,H-3′,J3′-4′-=8.8Hz),4.22(d,1H,H-4,J3′-4′=8.7Hz),4.0-3.9(m,1H,CH),3.8-3.5(m,2H,H-5′,H-5″),2.3-2.1(m,1H,CH),1.16(s,3H,CH3),1.0(m,6H,(CH3)2CH);FAB>0(GT)713(2M+H)+,449(M+G+H)+,357(M+H)+,246(S)+,112(B+2H)+;FAB<0(GT)747(2M+Cl)-,483(M+G+CI)-,391(M+Cl)-,355(M-H)-,116(VAL)-,110(B)-,35(Cl)-。
兩種不同的HPLC方法被用來分析上述化合物。兩種方法均使用了反相色譜柱方法1按如下所述進(jìn)行HPLC分析254nm,乙腈/水線性梯度洗脫,流速1.00ml/min。運(yùn)行時(shí)間20分鐘。各次操作間隔5分鐘到達(dá)平衡。
表1重要中間體的保留時(shí)間
方法2檢測(cè)波長(zhǎng)272nm。色譜柱采用Waters Novapak C18,3.9×150mm ID,4μm的顆粒尺寸,60_的孔尺寸或與其等同。色譜條件如下注射體積=10μl,柱溫=25℃,流速=1.00ml/min,紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為272nm,運(yùn)行時(shí)間35分鐘。對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與參考標(biāo)準(zhǔn)的百分比的系統(tǒng)適應(yīng)性要求小于1.0%。
表2a純凈物和雜質(zhì)在272nm進(jìn)行檢測(cè)
表2b重要中間體和最終藥物物質(zhì)的保留時(shí)間
立體化學(xué)應(yīng)意識(shí)到本發(fā)明的核苷具有多個(gè)手性中心并能夠以旋光體和外消旋體形式存在和被分離。一些化合物具有同質(zhì)多晶現(xiàn)象。應(yīng)理解的是本發(fā)明包含本發(fā)明化合物的任何的外消旋體、旋光體、非對(duì)映體、多晶型物、或立體異構(gòu)體,或它們的混合物,它們都具有在此所描述的用途。在本領(lǐng)域眾所周知如何制備旋光體(例如,通過重結(jié)晶技術(shù)拆分外消旋體,通過從旋光性起始原料合成,通過手性合成,或通過使用手性固定相的色譜分離)。
具體而言,因?yàn)楹塑盏?′和4′碳是手性的,至于糖環(huán)系統(tǒng),它們的非氫取代基(分別是,堿基和CHOR)可以是順式(在同側(cè))或反式(在對(duì)側(cè))。因此,四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體表示為如下構(gòu)型(當(dāng)糖部分定向于水平面時(shí),使得氧原子位于后面)順式(兩個(gè)基團(tuán)位于“上方”,相應(yīng)于天然存在的β-D核苷的構(gòu)型),順式(兩個(gè)基團(tuán)位于“下方”,相應(yīng)于天然存在的β-L核苷的構(gòu)型),反式(C2′取代基位于“上方”和C4′取代基位于“下方”),和反式(C2′取代基位于“下方”和C4′取代基位于“上方”)?!癉-核苷”在天然構(gòu)型中是順式核苷而“L-核苷”在非天然存在的構(gòu)型中是順式核苷。
同樣地,大多數(shù)氨基酸也是手性的(指定為L(zhǎng)或D,其中L對(duì)映體是天然存在的構(gòu)型)和能以分離的對(duì)映體存在。
獲得旋光性原料的方法的實(shí)例是本領(lǐng)域公知的,并包括至少如下方法i)晶體的機(jī)械拆分法-在該技術(shù)中,通過人工分離單獨(dú)的對(duì)映體的肉眼可見晶體。如果分離的對(duì)映體的晶體存在,,即,原料是聚結(jié)體,和晶體在視覺上可區(qū)別,則可使用該技術(shù);ii)同時(shí)結(jié)晶法-在該技術(shù)中,各對(duì)映體分別從外消旋體溶液中結(jié)晶,只有在后者在固體狀態(tài)下是凝結(jié)體的情況下才由可能;iii)酶拆分法-在該合成技術(shù)中,通過對(duì)映體與酶的反應(yīng)速度的不同,部分或全部地分離外消旋體;iv)酶不對(duì)稱合成法-在該合成技術(shù)中,合成過程中的至少一步使用酶反應(yīng)來獲得異構(gòu)純的或富集的期望的對(duì)映體的合成前體;v)化學(xué)不對(duì)稱合成法-在該合成技術(shù)中,通過使用手性催化劑或手性助劑來達(dá)到在產(chǎn)物中產(chǎn)生不對(duì)稱(即,手性)的條件下從手性前體合成期望的對(duì)映體;vi)非對(duì)映體拆分法-在該技術(shù)中,外消旋化合物與對(duì)映純?cè)噭?手性助劑)反應(yīng)將各對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映體。產(chǎn)生的非對(duì)映體接著根據(jù)具有的更截然不同的結(jié)構(gòu)差異通過色譜或結(jié)晶而被分離,隨后將手性助劑除去以獲得期望的對(duì)映體;vii)一級(jí)和二級(jí)非對(duì)稱轉(zhuǎn)化法-在該技術(shù)中,外消旋物中的非對(duì)映體達(dá)到平衡,從而從期望的對(duì)映體產(chǎn)生溶液中占優(yōu)勢(shì)的非對(duì)映體,或者,在期望的對(duì)映體中的非對(duì)映體的占優(yōu)的結(jié)晶微擾了該平衡,使得最后所有的原料基本上都從期望的對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶的非對(duì)映體,然后,期望的對(duì)映體從非對(duì)映體中釋放出;viii)動(dòng)力學(xué)拆分法-該技術(shù)是指,利用在動(dòng)力學(xué)條件下,對(duì)映體和手性、非外消旋試劑或催化劑反應(yīng)具有不同反應(yīng)速率,來獲得對(duì)外消旋體的部分或完全的拆分(或?qū)Σ糠植鸱值幕衔锏倪M(jìn)一步拆分);ix)從非外消旋前體起始的對(duì)映特異性合成法-在該合成技術(shù)中,從非手性起原料獲得期望的對(duì)映體,并且,在合成過程中,其立體化學(xué)完整性未受到或僅僅受到最低程度的危害。
x)手性液相色譜法-在該技術(shù)中,外消旋體的對(duì)映體在液體流動(dòng)相中根據(jù)它們與固定相具有不同的相互作用而被分離。該固定相可以由手性原料制成或該流動(dòng)相可含有額外的手性原料以誘導(dǎo)不同的相互作用;xi)手性氣相色譜法-在該技術(shù)中,通過外消旋體和對(duì)映體在氣體流動(dòng)相中與含有固定的非外消旋手性吸收相具有不同的相互作用,外消旋體揮發(fā)且對(duì)映體被分離;xii)手性溶劑萃取法-在該技術(shù)中,通過在一種特定的手性溶劑中選擇性溶解一種對(duì)映體而分離對(duì)映體的技術(shù);xiii)手性膜貫穿拆分法-在該技術(shù)中,將外消旋體與薄隔離膜接觸。該隔離膜通常將兩種互溶液體分開,一種含有該外消旋體,這種分離利用濃度差或壓力差等驅(qū)動(dòng)力促使對(duì)隔離膜選擇性通過而進(jìn)行。由于該膜利用了僅允許一種外消旋體的對(duì)映體通過的特性,從而分離產(chǎn)生了非外消旋手性體。
III.藥物組合物通過可藥用載體或稀釋劑存在的條件下給患者施用有效量的活性化合物或可藥用前藥或它們的鹽,可治療被瘟病毒、黃病毒、HCV或具有任何其它在此描述的病癥或通過RNA依賴的RNA病毒聚合酶復(fù)制的其它生物體感染的宿主包括人,,或達(dá)到治療任何在此描述的病癥的目的。所述活性物質(zhì)可以通過任何適當(dāng)?shù)耐緩剑?,?jīng)口、腸胃外、靜脈、經(jīng)皮、皮下或局部,以液體或固體形式施用。
對(duì)于瘟病毒,黃病毒或HCV感染而言,所述化合物的優(yōu)選劑量約為每公斤體重每天1-50mg,優(yōu)選1-20mg,更通常為患者每公斤體重每天0.1-約100mg。優(yōu)選更低的劑量,例如每公斤體重每天0.5-100mg,0.5-50mg,0.5-10mg或0.5-5mg劑量。甚至更低的劑量也是有效地,因此該范圍可包括每公斤體重每天0.1-0.5mg??伤幱名}和前藥的有效劑量范圍可基于待釋放的母體核苷的重量來計(jì)算。如果所述鹽或前藥本身具有活性的話,那么可以如上述用所述鹽或前藥的重量或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法估計(jì)有效劑量。
所述化合物可以任何適當(dāng)劑量單位方便地予以施用,包括但不限于每劑量單位中含有7-3000mg,優(yōu)選70-1400mg活性化合物。50-1000mg的口服劑量通常很方便,包括以50,100,200,250,300,400,500,600,700,800,900或1000mg的一種或多種劑量。優(yōu)選更低的劑量,例如10-100或1-50mg。預(yù)期的劑量也可為0.1-50mg或0.1-20mg或0.1-10.0mg。此外,在通過非口服途徑,如通過注射或吸入的情況下,可使用更低的劑量。
理想的是以下面方式施用的活性成分,即使該活性化合物的血漿峰值濃度約為0.2-70μM,優(yōu)選約1.0-10μM。該目標(biāo)可通過如靜脈注射0.1-5%活性成分的溶液,任選為鹽溶液,或以施用活性成分的藥丸來達(dá)到。
藥物組合物中活性化合物的濃度取決于該藥物的吸收、失活和排泄率,也取決于其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的因素。應(yīng)注意的是劑量也應(yīng)隨著要緩解的疾病的嚴(yán)重性而有所變化。同時(shí)還應(yīng)該理解,對(duì)于任何特定的患者而言,特定的給藥方案應(yīng)該根據(jù)個(gè)體的需要和施用或監(jiān)督該組合物給藥的人員的專業(yè)判斷而隨時(shí)進(jìn)行調(diào)整,而且前述的濃度范圍僅僅是示例性的,并不意欲限制所要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵤?梢允且淮涡允┯盟龌钚猿煞郑部梢詫⑵浞譃閿?shù)個(gè)小劑量以不同的時(shí)間間隔施用,并且可以有也可以沒有抗病毒制劑。
所述活性化合物的優(yōu)選給藥方式為經(jīng)口給藥??诜M合物通常包括惰性稀釋劑或可食用的載體。可以將其裝入明膠膠囊中,也可以將其壓制成片劑。用于經(jīng)口給藥治療時(shí),可將活性化合物與賦形劑混合并以片劑、錠劑或膠囊形式使用。組合物中也可以加入藥學(xué)上可配伍的粘合劑、和/或佐劑。
片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有任何下列成分或類似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃芪膠或明膠;賦形劑如淀粉或乳糖,崩解劑如藻酸,Primogel或玉米淀粉;潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes;助流劑如膠體二氧化硅;甜味劑如蔗糖或糖精;或調(diào)味劑如薄荷油,水楊酸甲酯或橙類調(diào)味劑(orange flavoring)。當(dāng)所述單位劑型為膠囊時(shí),除上述類型物質(zhì)外,還可含有液體載體如脂肪油。此外,單位劑型還可含有各種可改變?cè)搫┬偷奈锢硇问降钠渌镔|(zhì),例如糖包衣物、蟲膠或其他腸包衣劑。
也可以將所述化合物作為酏劑、懸浮劑、糖漿劑、干膠片劑、咀嚼膠等組分施用。除所述活性成分外,糖漿劑可含有作為甜味劑的蔗糖和某些防腐劑、染料和著色劑及調(diào)味劑。
也可以將所述化合物或其可藥用前藥或鹽與其他不影響它們的期望作用的活性物質(zhì)、或者與能補(bǔ)充該期望作用的物質(zhì)混合,這些物質(zhì)如抗生素、抗真菌劑、抗炎劑或其他抗病毒劑,包括其他的核苷化合物。用于腸胃外、皮內(nèi)、皮下或局部使用的溶液或懸浮液可包括如下組分無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑;抗菌劑如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯;抗氧化劑,如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑如乙二胺四乙酸;緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽,以及用于調(diào)節(jié)浸透壓的試劑,如氯化鈉或葡萄糖。母體制劑可裝入安瓿、一次性注射器或多劑量的玻璃或塑料小瓶中。
如果通過靜脈注射給藥,優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖液(PBS)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,將所述活性化合物與可保護(hù)該化合物不從體內(nèi)快速消除的載體一起制備為制劑,這些載體如控釋制劑,包括植入物和微囊遞藥系統(tǒng)??梢圆捎每缮锝到獾暮蜕锵嗳莸木酆衔铮缫蚁┮宜嵋蚁?、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,制備此類制劑的方法是顯而易見的。上述物質(zhì)可購自AlzaCorporation。
脂質(zhì)體懸浮劑(包括靶向侵染細(xì)胞的具有病毒抗原的單克隆抗體的脂質(zhì)體)也是優(yōu)選的可藥用載體??梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法,如描述于美國(guó)專利第4,522,811號(hào)(在此全文一并引入作為參考)的方法,制備這樣的制劑。例如,通過將適當(dāng)?shù)闹|(zhì)(如硬脂酰磷脂乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、arachadoyl磷脂酰膽堿和膽固醇)溶于無機(jī)溶劑中,然后蒸發(fā)并在容器表面形成干燥的脂質(zhì)薄膜以制備脂質(zhì)體制劑。隨后向容器中加入所述活性或其單磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液。接著用手旋轉(zhuǎn)容器使脂質(zhì)物質(zhì)與容器表面脫離并使脂質(zhì)聚集體分散,由此形成脂質(zhì)體懸浮劑。
IV.前藥和衍生物鹽的形式將核苷以可藥用鹽的形式施藥在本發(fā)明的范圍之內(nèi)??伤幱名}的例子有與酸形成的有機(jī)酸加成的鹽,其提供生理學(xué)上可接受的鹽。包括如甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸、甲酸鹽、延胡索酸鹽、丙酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、水楊酸鹽。另外,也可形成適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽,包括硫酸鹽、磺酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽、氫溴酸鹽、碳酸鹽和正磷酸鹽。一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案是單或二鹽酸鹽。
采用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法,例如通過使具有足夠堿性的化合物如胺與提供生理上可接受的陰離子的適合的酸反應(yīng),可以獲得可藥用鹽。也可以獲得羧酸的堿金屬(例如,鈉、鉀或鋰)或堿土金屬(例如鈣)鹽。在一實(shí)施方案中,所述的鹽是該化合物的鹽酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述的可藥用鹽是式(1)化合物的二鹽酸鹽。本發(fā)明的化合物具有抗黃病毒、瘟病毒或HCV的抗病毒活性,或者經(jīng)代謝而稱為顯示該活性的化合物。
核苷前藥在此描述的核苷可以核苷酸前藥形式施用以增加核苷的活性、生物利用度、穩(wěn)定性或通過其他方式改變所述核苷的性質(zhì)。已知有許多核苷酸前藥配體。一般而言,對(duì)所述核苷的單、二或三磷酸酯進(jìn)行烷基化、?;蚱渌H脂性修飾能減少其極性并進(jìn)入細(xì)胞。在磷酸酯部分能取代一或多個(gè)氫的取代基的實(shí)例是烷基、芳基、甾族化合物、碳水化合物包括糖、1,2-二?;视秃痛碱?。許多在R.Jones and N.Bischoferger,Antiviral Research,1995,271-17中被描述。其中任何一種均可以與在此公開的核苷聯(lián)合使用以獲得期望的效果。
所述活性核苷也可以以5′-磷酸醚醚脂或5′-醚脂的形式提供。非限制性實(shí)例在包括下述的參考文獻(xiàn)(其在此一并引入作為參考)中被描述Kucera,L.S.,N.Iyer,E.Leake,A.Raben,Modest E.K.,D.L.W.,和C.Piantadosi.1990.“抑制HIV-1感染產(chǎn)生并誘導(dǎo)缺陷型病毒形成的新的與膜相互作用的醚脂類似物(Novel membrane-interactive ether lipod analogs thatinhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation)”AIDS Res.Hum.RetroViruses.6491-501;Piantadosi,C.,J.Marasco C.J.,S.L.Morris-Natschke,K.L.Meyer,F(xiàn).Gumus,J.R.Surles,K.S.Ishaq,L.S.Kucera,N.Iyer,C.A.Wallen,S.Piantadosi,和E.J.Modest.1991.“具有抗HIV活性的新的醚脂核苷軛合物的合成和評(píng)估(Synthesis andevaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity)”109J.Med.Chem.341408.1414;Hosteller,K.Y.,D.D.Richman,D.A.Carson,L.M.Stuhmiller,G.M.T.vanWijk,和H.van den Bosch.1992.“二肉豆蔻?;视?′-脫氧胸腺嘧啶二磷酸酯,3′-脫氧胸腺嘧啶的脂質(zhì)前藥大大增加人免疫缺陷病毒1型在CEM和HT4-6C細(xì)胞中復(fù)制的抑制作用(Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM andHT4-6C cells by 3′-deoxythymine diphosphate dimyristoylglycerol,a lipid produg of3,-deoxythymine)”,Antimicrob.Agents Chemother..362025.2029;Hosetler,K.Y.,L.M.Stuhmiller,H.B.Lenting,H.van den Bosch,and D.D.Richman,1990.“疊氮基胸腺嘧啶及其他抗病毒核苷的磷脂類似物的合成可抗反轉(zhuǎn)錄病毒活性(Synthesis and antiretroviral activity ofphospholipid analogs of azidothymine and other antiviral nucleosides)”J.Biol.Chem.26561127。
美國(guó)專利中公開的可共價(jià)結(jié)合到核苷,優(yōu)選在核苷的5′-OH位的合適的親脂性取代基或親脂性制劑的非限制性實(shí)例包括美國(guó)專利第5,149,794號(hào)(1992年9月22日,Yatvin等);第5,194,654號(hào)(1993年3月16日,Hostetler等);第5,223,263號(hào)(1993年6月29日,Hostetler等);第5,256,641號(hào)(1993年10月26日,Yatvin等);第5,411,947號(hào)(1995年5月2日,Hostetler等);第5,463,092號(hào)(1995年10月31日,Hostetler等);第5,543,389號(hào)(1996年8月6日,Yatvin等);第5,543,390號(hào)(1996年8月6日,Yatvin等);第5,543,391號(hào)(1996年8月6日,Yatvin等);和第5,554,728號(hào)(1996年9月10日,Basava等),所有的內(nèi)容在此一并引入作為參考。外國(guó)專利中公開了可與本發(fā)明的核苷連接的親脂性取代基或親脂性制劑的申請(qǐng)包括WO 89/02733,WO 90/00555,WO 91/16920,WO 91/18914,WO 93/00910,WO 94/26273,WO 96/15 132,EP 0 350 287,EP 93917054.4和WO 91/19721。
V.聯(lián)合治療或交替治療本發(fā)明的活性化合物可與其它的抗黃病毒或瘟病毒劑或具體而言是抗HCV劑聯(lián)合給藥或交替給藥以治療在此描述的任何一種病癥。在聯(lián)合治療中,有效劑量的兩種或更多種藥劑被一起施用,而在交替或連續(xù)治療中,有效劑量的每種藥劑被連續(xù)或順序地施用。劑量取決于該藥物的吸收、失活和排泄率,也取決于其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的因素。應(yīng)注意的是劑量也應(yīng)隨著要緩解的疾病的嚴(yán)重性而有所變化。同時(shí)還應(yīng)該理解,對(duì)于任何特定的患者而言,特定的給藥方案和給藥時(shí)間表應(yīng)該根據(jù)個(gè)體的需要和施用或監(jiān)督該組合物給藥的人員的專業(yè)判斷而隨時(shí)進(jìn)行調(diào)整。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,具有10-15μM或優(yōu)選小于1-5μM的EC50的抗-HCV(或抗瘟病毒或抗黃病毒)化合物是所期望的。
已經(jīng)認(rèn)識(shí)到,在用抗病毒劑延長(zhǎng)治療一段時(shí)間后,會(huì)出現(xiàn)黃病毒、瘟病毒或HCV的抗藥性變體。最普遍的抗藥性是由于編碼病毒復(fù)制的酶的基因發(fā)生突變所致。通過將所述化合物和第二種或第三種抗病毒化合物聯(lián)合或交替給藥,可以延長(zhǎng)、增加或恢復(fù)藥物抗病毒感染的效能,所述第二種和第三種抗病毒化合物能誘導(dǎo)與主要藥物引起的突變不同的突變。或者,通過此類聯(lián)合治療或交替治療,可改變所述藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布或其它參數(shù)。一般而言,相對(duì)于交替治療,通常優(yōu)選聯(lián)合治療,因?yàn)槁?lián)合治療對(duì)所述病毒同時(shí)產(chǎn)生多重脅迫作用。
任何在本發(fā)明背景中描述的抗病毒劑可與在說明書中描述的化合物用于聯(lián)合治療或交替治療。非限制性實(shí)例包括(1)蛋白酶抑制劑實(shí)例包括基于底物的NS3蛋白酶抑制劑(Attwoodet al,Antiviral peptide derivatives(抗病毒肽衍生物),PCT WO 98/22496,1998;Attwoodet al.,Antiviral Chemistry and Chemotherapy1999,10,259-273;Attwood et al.,Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viralagents(制備和使用作為一種抗病毒劑的氨基酸衍生物),德國(guó)專利公開號(hào)DE 19914474;Tunget al.,Inhibitiors of serine proteases,particularly hepatitis C virus NS3 protease(絲氨酸蛋白酶,特別是丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的抑制劑),PCT WO 98/17679),包括α-酮酰胺和肼基脲(hydrazinoureas),和能終止親電子試劑如硼酸或膦酸鹽的抑制劑(Llinas-Brunet et al,HepatitisC inhibitorpeptide analogues(丙型肝炎病毒抑制劑肽類似物),PCT WO 99/07734);基于非底物的NS3蛋白酶抑制劑如2,4,6-三羥基-3-硝基-苯甲酰胺衍生物(Sudo K.et al,Biochemicaland Biophysical Research Communications,1997,238,643-647;Sudo K.et al.,AntiviralChemistry and Chemotherapy,1998,9,186),包括RD3-4082和RD3-4078,前者在酰胺上被14碳鏈取代,后者加工對(duì)苯氧基苯基,和Sch 68631,一種菲醌,是一種HCV蛋白酶的抑制劑(Chu M.et al.,Tetrahedron Letters 377229-7232,1996)。
Sch 351633,分離自灰黃青霉(Penicillium griseofulvum),被確認(rèn)為一種蛋白酶抑制劑(Chu M.et al.,Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 91949-1952)。Eglin c分離自水蛭,是幾種絲氨酸蛋白酶如灰色鏈霉菌(S.Griseus)蛋白酶A和B、α-糜蛋白酶、糜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶潛在的抑制劑。Qasim M.A.et al.,Biochemistry 361598-1607,1997。
公開了用于治療HCV的蛋白酶抑制劑的美國(guó)專利包括,例如,Spruce等的美國(guó)專利第6,004,933號(hào)公開了一類用于抑制HCV肽鏈內(nèi)切酶2的半胱氨酸蛋白酶抑制劑;Zhang等的美國(guó)專利第5,990,276號(hào)公開了丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的合成抑制劑;Reyes等的美國(guó)專利第5,538,865號(hào);Corvas International,Inc的WO 02/008251及Schering Corporation的WO02/08187和WO 02/008256。HCV抑制劑肽公開于Boehringer Ingelheim的美國(guó)專利第6,534,523號(hào),6,410,531號(hào)和6,420,380號(hào)和Bristol Myers Squibb的WO 02/060926中。作為HCVNS3絲氨酸蛋白酶抑制劑的二芳基肽公開于Schering Corporation的WO 02/48172中。作為HCV NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑的咪唑啉二酮(Imidazoleidinones)公開于Schering Corporation的WO 02/08198和Bristol Myers Squibb的WO 02/48157中。Vertex Pharmaceuticals的WO98/17679和Bristol Myers Squibb的WO 02/48116也公開了HCV蛋白酶抑制劑。
(2)噻唑烷(Thiazolidines)衍生物,在采用NS3/4A融合蛋白和NS5A/5B底物進(jìn)行的反相HPLC測(cè)定中顯示了相關(guān)的抑制作用(Sudo K.et al.,Antiviral Research,1996,32,9-18),特別是具有融合的被長(zhǎng)鏈烷基取代的肉桂酰部分的化合物RD-1-6250,,以及RD4 6205和RD4 6193;(3)噻唑烷和N-苯甲酰苯胺(benzanilides),其確認(rèn)見Kakiuchi N.et al.,J.EBS Letters421,217-220;Takeshita N.et al.,Analytical Biochemistry,1997,247,242-246;(4)菲醌(phenan-threnequinone),其在SDS-PAGE和射線自顯跡法測(cè)定中顯示具有抗蛋白酶活性,通過從鏈霉菌(Streptomyces sp.)的發(fā)酵培養(yǎng)肉湯分離(Chu M.et al.,Tetrahedron Letters,1996,37,7229-7232),Sch 68631以及Sch 351633,分離自灰青霉菌(Penicillium griseofulvum),在閃爍近似測(cè)定(SPA)中顯示出活性(Chu M.et al.,Bioorganicand Medicinal Chemistry Letters 9,1949-1952);(5)解旋酶抑制劑(例如,Diana G.D.et al.,Compounds,compositions and methods fortreatment of hepatitis C,美國(guó)專利第5,633,358號(hào);Diana G.D.et al.,Piperidine derivatives,pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment of hepatitis C,PCT WO97/36554);(6)核苷聚合酶抑制劑和膠霉毒素(Ferrari R.et al.,Journal of Virology,1999,73,1649-1654),和天然產(chǎn)物淺藍(lán)菌素(Lohmann V.et al.,Virology,1998,249,108-118);(7)反義硫代磷酸酯寡核苷酸(S-ODN)其與延伸入病毒的5’非編碼區(qū)(NCR)(Alt M.et al.,Hepatology,1995,22,707-717),或包含NCR的3’端的核苷326-348以及位于HCV RNA的核心編碼區(qū)的核苷371-388(Alt M.et al.,Archives of Virology,1997,142,589-599;Galderisi U.et al.,Journal of Cellular Physiology,1999,181,251-257))的序列互補(bǔ);(8)依賴于IRES的翻譯的抑制劑(Ikeda N et al.,Agent for the prevention and treatmentof hepatitis C((用于預(yù)防和治療丙型肝炎的藥劑)),日本專利公開號(hào)JP-08268890;Kai Y.et al.,Prevention and treatment of viral diseases,(病毒性疾病的預(yù)防和治療),日本專利公開號(hào)JP-10101591);(9)核酶,如抗核酸酶核酶(Maccjak D.J.et al.,Hepatology 1999,30,摘要995)和那些公開于Barber等的美國(guó)專利第6,043,077號(hào)和Draper等的美國(guó)專利第5,869,253號(hào)和5,610,054號(hào)中的內(nèi)容;和(10)核苷類似物也被開發(fā)用于治療黃病毒科病毒感染。
(11)在Idenix Pharmaceuticals的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O 01/90121和WO 01/92282中描述的任何化合物;(12)其它的揭示了使用某些核苷類似物治療丙型肝炎病毒的專利申請(qǐng)包括BioChemPharma,Inc.(現(xiàn)在為Shire Biochem,Inc.)提交的PCT/CA00/01316(WO 01/32153;2000年11月3日提交)和PCT/CA01/00197(WO 01/60315;2001年2月19日提交);Merck & Co.,Inc.提交的PCT/US02/01531(WO 02/057425;2002年1月18日提交)和PCT/US02/03086(WO02/057287;2002年1月18日提交),Roche提交的PCT/EP01/09633(WO 02/18404;2001年8月21日公開),和Pharmasset,Ltd的PCT公開號(hào)WO OIT9246(2001年4月13日提交),WO02/32920(2001年10月18日提交)和WO 02/48165。
(13)Emory University的PCT公開號(hào)WO 99/43691,標(biāo)題為″2′-氟代核苷″公開了使用某些2′-氟代核苷治療HCV。
(14)其它的各種化合物包括1-氨基-烷基環(huán)己烷(Gold等美國(guó)專利第6,034,134號(hào)),烷基脂質(zhì)(Chojkier等美國(guó)專利第5,922,757號(hào)),維生素E和其它抗氧化劑(Chojkier等美國(guó)專利第5,922,757號(hào)),鯊烯,金剛烷胺、膽汁酸(Ozeki等美國(guó)專利第5,846,964號(hào)),N-(膦?;阴;?-L-天冬氨酸,(Diana等美國(guó)專利第5,830,905號(hào)),苯二碳酰胺(Diana等美國(guó)專利第5,633,388號(hào)),多聚腺苷酸衍生物(Wang等美國(guó)專利第5,496,546號(hào)),2′,3′-二脫氧肌苷(Yarchoan等美國(guó)專利第5,026,687號(hào)),苯并咪唑(Colacino等美國(guó)專利第5,891,874號(hào)),植物抽提物(Tsai等美國(guó)專利第5,837,257號(hào),Omer等美國(guó)專利第5,725,859號(hào),和美國(guó)專利第6,056,961號(hào)),和哌啶(piperidenes)(Diana等美國(guó)專利第5,830,905號(hào))。
(15)當(dāng)前處于臨床前或臨床開發(fā)中的用于治療丙型肝炎病毒的其它化合物,包括Schering-Plough的白細(xì)胞介素-10,Interneuron的IP-501,Vertex的Merimebodib(VX-497),Endo Labs Solvay的AMANTADINE_(金剛烷胺),RPI的HEPTAZYME_,Idun Pharma的IDN-6556,XTL的XTL-002,Chiron的HCV/MF59,NABI的CIVACIR_(丙型肝炎病毒免疫球蛋白),ICN/RIBAPHARM的LEVOVIRIN_,ICN/RIBAPHARM的VIRAMIDINE_,Sci Clone的ZADAXIN_(胸腺素α-1),Sci Clone的胸腺素和聚乙二醇化干擾素,Maxim的CEPLENE_(二鹽酸組胺),Vertex/Eli Lilly的VX 950/LY 570310,IsisPHARMACEUTICAL/ELAN的ISIS 14803,Idun Pharmaceuticals Inc.的IDN-6556,AKROSPharma的JTK 003,Boehringer Ingelheim的BILN-2061,Roche的CellCept(霉酚酸嗎啉乙酯),Tularik的T67,一種β-微管蛋白抑制劑,Innogenetics的針對(duì)E2的治療疫苗,F(xiàn)ujisawaHealthcare,Inc的FK788,IdB 1016(Siliphos,口服水飛薊素-磷酸噻吡二胺Phytosome(oralsilybin-phosphatdylcholine phytosome)),ViroPharma/Wyeth的RNA復(fù)制抑制劑(VP50406),Intercell的治療疫苗,Epimmune/Genencor的治療疫苗,Anadys的IRES抑制劑,Anadys的ANA 245和ANA 246,Avant的免疫療法(Therapore),Corvas/Schering的蛋白酶抑制劑,Vertex的解旋酶抑制劑,Trimeris的融合抑制劑,CellExSys的T細(xì)胞療法,Biocryst的聚合酶抑制劑,PTC Therapeutics的靶向RNA化學(xué),Immtech,Int的雙陽離子(Dication),Agouron的蛋白酶抑制劑,Chiron/Medivir的蛋白酶抑制劑,AVIBioPharma的反義療法,Hybridon的反義療法,Aethlon Medical的血液清潔劑(hemopurifier),Merix的治療疫苗,Bristol-MyersSquibb/Axys的蛋白酶抑制劑,Tripep的Chron-VacC,一種治療疫苗,United Therapeutics的UT 231B,Genelabs Technologies的蛋白酶、解旋酶和聚合酶抑制劑,Immusol的IRES抑制劑,Rigel Pharmaceuticals的R803,InterMune的INFERGEN_(干擾素alphacon-1),Viragen的OMNIFERON_(天然干擾素),Human Genome Sciences的ALBUFERON_,Ares-Serono的REBIF(β-1a干擾素),BioMedicine的ω-干擾素,Amarillo Biosciences的口服α-干擾素,InterMune的γ-干擾素、τ-干擾素和γ-1b干擾素。
V.生物數(shù)據(jù)用于確定抗病毒活性的細(xì)胞培養(yǎng)基系統(tǒng)利用一種有用的檢測(cè)HCV及其抑制性的基于細(xì)胞的測(cè)定來評(píng)價(jià)源自為HCV復(fù)制子提供棲所的Huh7細(xì)胞的復(fù)制子RNA的水平。這些細(xì)胞可以在標(biāo)準(zhǔn)的介質(zhì)中培養(yǎng),例如,在DMEM介質(zhì)中(高濃度的葡萄糖,無丙酮酸鹽)輔以10%的胚胎牛血清,1×非必需氨基酸,Pen-Strip-Glu(分別為100單位/升,100毫克/升和2.92毫克/升),以及G418(C20H40N4O10,500~1000毫克/升)??共《竞Y選測(cè)定可以在相同的介質(zhì)中在沒有G418的條件下進(jìn)行。為了保持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將細(xì)胞在96-孔板上以低密度種植(例如,每孔1000個(gè)細(xì)胞)。在將細(xì)胞種植后立即加入測(cè)試化合物,并在培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)3~7天。然后除去介質(zhì),將細(xì)胞用于制備總RNA提取液(復(fù)制子RNA+宿主RNA)。復(fù)制子RNA可再用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法RT-PCR(Q-RT-PCR)進(jìn)行擴(kuò)增和定量。
在復(fù)制子RNA的定量中觀察到的差異是測(cè)試化合物的表達(dá)抗病毒能力的一種途徑。在典型的實(shí)驗(yàn)中,在負(fù)調(diào)控和非活性化合物下產(chǎn)生了可比較量的復(fù)制子。如果在兩種條件下測(cè)量得到的HCV RT-PCR的閥值周期大致相同,則可以得到上述結(jié)論。在這樣的實(shí)驗(yàn)中,用于表達(dá)化合物的抗病毒效果的方法是從測(cè)試化合物的閥值RT-PCR周期(Ct測(cè)試化合物)減去負(fù)調(diào)控的平均閥值RT-PCR周期(Ct負(fù))。該值被稱為ΔCt(ΔCt=Ct測(cè)試化合物-Ct負(fù))。ΔCt的值為3.3表示在復(fù)制子產(chǎn)生中的1-log減少。作為正調(diào)控,重組干擾素α-2a(例如,Roferon-A,Hoffmann-Roche,NJ,USA)可與測(cè)試化合物一同使用。另外,也可以稀釋后的化合物進(jìn)行測(cè)試(通常稀釋到100,33,10,3和1μM)。
通過每種濃度下的ΔCt的值可以計(jì)算得到50%有效濃度(EC50)。
如上所述的測(cè)定在改變了細(xì)胞體系和病毒病原體后能夠適用于黃病毒科的其它病毒。用于確定這些抗病毒化合物的效力的方法學(xué)包括對(duì)描述于以下著作中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的改進(jìn)Holbrook MR et al.Virus Res.2000,69,31;Markland W et al.Antimicrob.Agents.Chemother.2000,44,859;Diamond MS et al.,J.Virol.2000,74,7814;Jordan I et al.J.Infect.Dis.2000,182,1214;Sreenivasan V et al.J.Virol.Methods1993,45(1),1;或Baginski SG et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000,97(14),7981或者實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)。作為實(shí)例如可采用HuH7細(xì)胞中的HCV復(fù)制子體系(Lohmann V et al.Science1999,285(5424),110)或者對(duì)其的改進(jìn)(Blight et al.2000)。
適用于檢測(cè)HCV的非基于細(xì)胞的測(cè)定核酸擴(kuò)增技術(shù)目前是用于確認(rèn)生物試樣中大量且還在增長(zhǎng)的微生物例如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis),人類免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)的選擇方法。核酸擴(kuò)增技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR),依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA),鏈替代擴(kuò)增(SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)。許多FDA批準(zhǔn)的診斷產(chǎn)品中均包含了這些分子診斷方法(見下表)。核酸擴(kuò)增技術(shù)測(cè)試不僅包括擴(kuò)增,還包括檢測(cè)方法。分子診斷的前景在于其在樣品處理、擴(kuò)增和靶檢測(cè)步驟上的改進(jìn),以及在于將這些步驟結(jié)合成為自動(dòng)化的形式。
擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)流程擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)流程有兩種基本類型異質(zhì)和均質(zhì)型。異質(zhì)性檢測(cè)的特征是含有如清洗這樣的特殊步驟,其目的是從雜交的探針中除去未雜交的探針,而在均質(zhì)性檢測(cè)中,沒有從束縛探針上除去自由探針的物理分離步驟。存在著多元異質(zhì)性檢測(cè)和均質(zhì)性檢測(cè)的方法。這些異質(zhì)性或均質(zhì)性測(cè)定可被用于評(píng)價(jià)本發(fā)明的化合物相對(duì)于RNA依賴的RNA聚合酶病毒,如HCV的有效性。
異質(zhì)性檢測(cè)例如,DNA印跡法(Southern blotting)是一種異質(zhì)性檢測(cè)技術(shù)。在DNA印跡法中,運(yùn)用電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物依據(jù)其大小和電荷加以分離。將按照大小分級(jí)的產(chǎn)物通過擴(kuò)散,抽真空或電印記而轉(zhuǎn)移到膜或過濾器上。然后,標(biāo)記的檢測(cè)探針被雜交到溶液中膜束縛的靶上,清洗過濾器,除去未雜交的探針,用各種方法檢測(cè)膜上的雜交的探針。
其它類型的異質(zhì)性檢測(cè)是基于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性捕獲,其方式是聯(lián)免疫吸附分析(ELISAs)。與PCR一同使用的一種方法包括用半抗原或配體如生物素標(biāo)記一個(gè)引物,擴(kuò)增后,用抗體包被的或鏈霉抗生物素蛋白包被的微盤將其捕獲。其它的引物用報(bào)道基因(reporter)如熒光素標(biāo)記,并通過加入抗熒光素抗體,辣根過氧化物酶(HRP)而使檢測(cè)得以進(jìn)行。這種類型的方法的特異性比使用探針雜交來限定靶擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的方法的特異性低。
LCx探針系統(tǒng)(Abbott Laboratories;Abbott Part,IL)和Amplicor HIV-1測(cè)試(RocheMolecular Systems Inc.;Pleasanton,CA)是使用異質(zhì)性檢測(cè)方法的系統(tǒng)。在LCx系統(tǒng)中,半抗原-標(biāo)記的寡核苷酸探針在連接酶鏈反應(yīng)中熱循環(huán)。捕獲半抗原或檢測(cè)半抗原均共價(jià)連接到四個(gè)引物寡核苷酸中的每一個(gè)上。當(dāng)擴(kuò)增完成時(shí),LCx系統(tǒng)儀器將反應(yīng)轉(zhuǎn)移到新的井(well)中,在這里抗體-包被的微粒連接到捕獲半抗原上。然后,每個(gè)微粒不可逆地連接到玻璃纖維的基質(zhì)上。通過洗滌步驟從微粒中除去僅含檢測(cè)半抗原的探針。LCx儀器添加連接到檢測(cè)半抗原的堿性磷酸酶(AP)-抗體結(jié)合體(conjugate)。用于AP的熒光生成基質(zhì)是4-甲基傘形酮酰(4-methylumbelliferyl)。由AP對(duì)4-甲基傘形酮酰的脫磷酸作用將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袩晒庑缘?-甲基傘形酮(umbelliferone)。
Amplicor HIV-1測(cè)試采用ELISA形式。在用PCR擴(kuò)增后,對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行化學(xué)改性。擴(kuò)增子特異性寡核苷酸探針將改性的鏈捕獲到被包被的微盤上。在洗滌步驟,操縱基因(operator)洗去任何未插如的引物和未雜交的材料,然后將抗生物素蛋白(avidin)-HRP結(jié)合體(conjugate)加入到各孔(well)中。該結(jié)合體連接到捕獲到盤上的生物素-標(biāo)記的擴(kuò)增子上。然后該擴(kuò)增子加入3,3′,5,5′-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB),一種發(fā)色的HRP基質(zhì)。當(dāng)存在過氧化氫時(shí),HRP氧化TMB??捎杀壬ù_定信號(hào)。
均質(zhì)性檢測(cè)由于雜交的和非雜交的檢測(cè)探針在均質(zhì)性檢測(cè)系統(tǒng)中不被物理分離,這些方法要求比異質(zhì)性檢測(cè)方法更少的步驟,因此較不易受到污染。在可商業(yè)獲得的試劑盒中,使用熒光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的均質(zhì)檢測(cè)的試劑盒有TaqMan系統(tǒng)(Applied Biosystems;FosterCity,CA),BDProbeTecET系統(tǒng)(Becton Dickinson;Franklin Lakes,NJ),QPCR系統(tǒng)5000(Perkin-Elmer Corp.;Norwalk,CT),和Hybridization Protection Assay(Gen-Probe Inc.;SanDiego)。
TaqMan系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。雜交到擴(kuò)增子內(nèi)部區(qū)域的檢測(cè)探針含有供體熒光基團(tuán),如在其5’末端的熒光素(fluoroscein)和淬火劑部分,例如,在其3’末端的若丹明。當(dāng)淬火劑和熒光基團(tuán)均在同一寡核苷酸上時(shí),供體熒光被抑制。在擴(kuò)增過程中,探針連接到靶上。當(dāng)Taq檢測(cè)探針合成勒替代鏈后,聚合酶將其替代并切斷。將檢測(cè)探針切斷導(dǎo)致將熒光基團(tuán)從淬火劑分離,從而供體熒光信號(hào)的增強(qiáng)。在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中,都重復(fù)該過程。隨著擴(kuò)增子的量的增加,熒光信號(hào)也增強(qiáng)。
分子信標(biāo)(molecular beacon)也采用淬火劑和熒光基團(tuán)。信標(biāo)(beacon)是與靶擴(kuò)增子互補(bǔ)的、但在各端含短序列(約5個(gè)核苷酸)互補(bǔ)寡核苷酸的探針。各信標(biāo)的5′和3′末端分別用熒光基團(tuán)和淬火劑標(biāo)記。當(dāng)信標(biāo)未雜交到靶上時(shí),形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),與熒光基團(tuán)和淬火劑接觸并且導(dǎo)致熒光淬火。環(huán)狀區(qū)域含有與擴(kuò)增子互補(bǔ)的區(qū)域。當(dāng)雜交到靶上后,發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,淬火劑和熒光基團(tuán)分離,從而能夠形成熒光信號(hào)14。用熒光儀實(shí)時(shí)測(cè)量熒光信號(hào)。
BDProbeTecET系統(tǒng)使用結(jié)合勒TaqMan和分子信標(biāo)兩者的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。探針具有發(fā)夾圈的結(jié)構(gòu)并含有熒光素和若丹明標(biāo)記。但是,在該系統(tǒng)中,與靶分子互補(bǔ)的區(qū)域不是在環(huán)中,而是在若丹明標(biāo)記的區(qū)域3’內(nèi)。該單鏈的環(huán)不是含有與靶互補(bǔ)的序列,而是含有限制酶BsoBI用的限制酶切位點(diǎn)。單鏈序列不是酶的基質(zhì)。在擴(kuò)增前熒光素和若丹明標(biāo)記相互靠近,以淬火熒光素的熒光。鏈替換的擴(kuò)增將探針轉(zhuǎn)化為雙鏈的分子。然后,限制酶BsoBI可切斷該分子,使得標(biāo)記分離并增強(qiáng)熒光信號(hào)。
QPCR系統(tǒng)5000采用釕標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光。使用了生物素化的引物。在擴(kuò)增后,生物素產(chǎn)物被捕獲到包被了鏈霉抗生素蛋白(streptavindin)的順磁性珠子上。通過以氣吸和磁吸當(dāng)方式將珠子固定到電極上,從而將其轉(zhuǎn)化為流動(dòng)池。經(jīng)電刺激后,該釕標(biāo)記的探針就發(fā)出光。
雜交保護(hù)測(cè)定(Hybridization Protection Assay)被用于Gen-Probe′s非擴(kuò)增的PACE測(cè)定以及擴(kuò)增的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)測(cè)定中。在HPA中的檢測(cè)寡核苷酸探針被化學(xué)發(fā)光的吖啶(acridinium)酯(AE)通過連接臂(linker arm)的方式加以標(biāo)記。在進(jìn)行擴(kuò)增的試管中,在60℃下進(jìn)行15分鐘雜交。雜交后,加入為一種溫和的堿性緩沖液的選擇性試劑,以水解任何未雜變的探針上的AE,從而消除這些AE的化學(xué)發(fā)光性。位于雜交的探針上的AE折疊在雙螺旋的小溝內(nèi),從而保護(hù)自己不被選擇性試劑水解。當(dāng)先后用過氧化氫和氫氧化鈉水解后,AE發(fā)出化學(xué)發(fā)光的信號(hào)。用發(fā)光儀記錄該化學(xué)發(fā)光的信號(hào)2秒鐘(該期間被稱為信時(shí)(light-off))并以相對(duì)光單元(RLU)報(bào)告發(fā)射的光子。
在使用探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的所有方法體系中,檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)是很關(guān)鍵的。好的檢測(cè)探針僅雜化特異的擴(kuò)增產(chǎn)物而不雜化非特異的產(chǎn)物。其他的優(yōu)化檢測(cè)方法體系的關(guān)鍵包括標(biāo)記探針以及實(shí)現(xiàn)樣品量的最大化。
標(biāo)記方法和報(bào)道基因分子。檢測(cè)探針可通過各種不同的方法加以標(biāo)記。通過酶將32P或35S插入到探針中的方法最普遍的同位素標(biāo)記方法。在雜交和洗滌后,信號(hào)在放射自顯影膠片上被檢測(cè)到。
為了進(jìn)行非放射性的檢測(cè),探針可以通過酶而標(biāo)記上各種分子。生物素可通過酶被插入,然后用鏈霉抗生素蛋白(streptavidin)-結(jié)合的堿性磷酸酶檢測(cè),其間使用AP基質(zhì),如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)和硝基藍(lán)四氮唑(NBT)?;瘜W(xué)發(fā)光的基質(zhì)包括如Lumi-Phos530或Lumi-Phos Plus(Lumigen,Southfield,MI)也可與AP一同使用。此外,洋地黃毒苷-11-dUTP可通過酶插入到DNA或RNA中,而抗洋地黃毒苷AP結(jié)合體可與比色檢測(cè)或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)一同使用。
另外,還有許多其他類型的報(bào)道基因(reporter)分子,包括化學(xué)發(fā)光的部分,如吖啶酯。也有許多熒光部分可獲得。電化學(xué)發(fā)光的化合物如三(2,2′-二吡啶)釕(II)也可被使用。關(guān)于這些技術(shù)和類似技術(shù)的進(jìn)一步的討論可參見SchiffER,de Medina M,Kahn RS.Semin LiverDis.1999;19(Suppl 13-15)。
實(shí)施例32′-C-甲基-胞苷-3′-O-L-纈氨酸酯(VAL-mCyd)的細(xì)胞藥理學(xué)核苷轉(zhuǎn)化為活性三磷酸酯的磷酸化測(cè)定為了確定化合物的細(xì)胞代謝,從美洲型培養(yǎng)收集物(American Type Culture Collection(Rockville,MD))中獲得HepG2細(xì)胞,使其在225cm2的補(bǔ)充了非必需氨基酸,1%青霉素-鏈霉素的含最少基本介質(zhì)的組織培養(yǎng)燒瓶中生長(zhǎng)。每隔3天更換一次介質(zhì),細(xì)胞每隔一周進(jìn)行一次次培養(yǎng)。當(dāng)在暴露于30mL的胰島素-EDTA 10分鐘和用介質(zhì)進(jìn)行3次連續(xù)的洗滌而分離粘著的單層后,將融合性的HepG2細(xì)胞種植到密度為2.5×106細(xì)胞/孔的6-孔板上,并暴露在10μM的[3H]標(biāo)記的活性化合物(500dpm/pmol)特定的時(shí)間。將細(xì)胞在37℃的5%CO2氣氛中保持。在選定的時(shí)刻,用冰冷卻的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗細(xì)胞3次。細(xì)胞內(nèi)的活性化合物及其相應(yīng)的代謝物通過對(duì)細(xì)胞球在-20℃下用甲醇培養(yǎng)過夜后另用20μL冷的甲醇在冰水浴中提取1小時(shí)而被提取。接著合并提取物,在溫和的過濾過的空氣流中干燥,并儲(chǔ)存在-20℃,以用于HPLC分析。
抗病毒核苷及核苷類似物通常使轉(zhuǎn)化為活性代謝物,即通過細(xì)胞內(nèi)的激酶轉(zhuǎn)化為5′-三磷酸酯(TP)。然后,該核苷-三磷酸酯通過抑制在病毒復(fù)制中的病毒的聚合物來表現(xiàn)其抗病毒作用。在原發(fā)性人肝細(xì)胞(primary human hepatocyte)培養(yǎng)物中,在人肝癌細(xì)胞系(humanhepatoma cell line)(HepG2)中,和在牛腎細(xì)胞系(MDBK)中,mCyd被轉(zhuǎn)化為主要的代謝物,2′-C-甲基-胞苷-5′-三磷酸酯(mCyd-TP),以及少量的尿苷5′-三磷酸酯衍生物,2′-C-甲基-尿苷-5′-三磷酸酯(mUrd-TP)。mCyd-TP當(dāng)在體外測(cè)試對(duì)抗BVDV復(fù)制酶,NS5B RNA依賴的RNA聚合酶時(shí)顯示出抑制性,并被認(rèn)為對(duì)mCyd的抗病毒活性其決定作用。
mCyd的細(xì)胞內(nèi)的代謝通過將MDBK細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和人原發(fā)性肝細(xì)胞暴露于10μM的[3H]-mCyd中進(jìn)行檢測(cè)。高效液相色譜(HPLC)分析顯示mCyd在三種細(xì)胞類型中均被磷酸酯化,且mCyd-TP在24小時(shí)后為主要的代謝物。測(cè)試了在將人肝細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞暴露于10μM的[3H]-mCyd中48小時(shí)后而獲得的代謝廓圖。在HepG2細(xì)胞中,mCyd-TP的水平在41.5±13.4μM、24小時(shí)后達(dá)到峰值(見表3),然后下降。在原發(fā)性人肝細(xì)胞中,mCyd-TP濃度的峰值在24小時(shí)時(shí)為10.7±6.7μM,低4倍。MDBK牛腎細(xì)胞產(chǎn)生了中間水平的mCyd-TP(24小時(shí)時(shí)為30.1±6.9μM)。
將肝細(xì)胞暴露于mCyd導(dǎo)致了第二種5′-三磷酸酯衍生物,mUrd-TP的產(chǎn)生。在暴露于10μM的[3H]-mCyd的HepG2細(xì)胞種,該mUrd-TP的水平在24小時(shí)后達(dá)到1.9±1.6μM,可于在MDBK細(xì)胞種的8.1±3.4μM和在原發(fā)性人肝細(xì)胞中的3.2±2.0μM相比。雖然MDBK和HepG2細(xì)胞在24小時(shí)產(chǎn)生的磷酸化的種類的總量接近(分別為約43對(duì)47μM),但mUrd-TP卻包含了MDBK細(xì)胞中的總產(chǎn)物的19%和HepG2細(xì)胞中的總產(chǎn)物的4%。mUrd-TP濃度隨時(shí)間穩(wěn)定地增長(zhǎng),但在24小時(shí)后達(dá)到平臺(tái)或下降。
表3mCyd(10μM)在干細(xì)胞和MDBK細(xì)胞中的活化代謝物(μM)
a細(xì)胞用[3H]-mCyd培養(yǎng)24小時(shí),特異性活性HepG2測(cè)定=0.5Ci/mmol;人和猴肝細(xì)胞測(cè)定=1.0Ci/mmol。
b代謝物濃度以皮摩爾/百萬細(xì)胞來進(jìn)行確定。一皮摩爾/百萬細(xì)胞大致相當(dāng)于1μM。
ND表示未檢測(cè)到。
mCyd-TP的明顯的細(xì)胞內(nèi)的半衰期是在HepG2細(xì)胞中為13.9±2.2小時(shí),在MDBK細(xì)胞中為7.6±0.6小時(shí)該數(shù)據(jù)不適合于計(jì)算mUrd-TP的半衰期。除了上述的特異性上的差別外,在原發(fā)性人肝細(xì)胞中檢測(cè)到的磷酸化模式與使用了HepG2或MDBK細(xì)胞的性質(zhì)類似。
實(shí)施例4細(xì)胞毒性線粒體毒性測(cè)定如上所述,HepG2細(xì)胞在12-孔板內(nèi)培養(yǎng),并如在Pan-Zhou X-R,Cui L,Zhou X-J,Sommadossi J-P,Darley-Usmer VM.″Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs onmitochondrial function in HepG2 cells″Antimicrob.Agents Chemother.2000;44496-503中教導(dǎo)暴露于各種濃度的藥物之下。在暴露于藥物4天后的培養(yǎng)介質(zhì)中的乳酸水平用Boehringer乳酸測(cè)定盒進(jìn)行測(cè)量。乳酸水平用由血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
毒性測(cè)定將細(xì)胞以5×103到5×104/孔的比率種植到96-孔板中,在37℃和潮濕的CO2(5%)氛圍中在生長(zhǎng)介質(zhì)中過夜。然后加入含有藥物連續(xù)稀釋的新的生長(zhǎng)介質(zhì)。培養(yǎng)4天后,培養(yǎng)物用50%TCA固定,并用磺酰羅丹明B染色。在550nm讀取光學(xué)密度。細(xì)胞毒素的濃度表達(dá)為將細(xì)胞數(shù)目降低50%所要求的濃度(CC50)。
傳統(tǒng)的細(xì)胞增殖測(cè)定被用于評(píng)價(jià)mCyd的細(xì)胞毒性以及其在快速分裂的細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)的代謝物。mCyd的抑制效果被確定為天然地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的,這是由于mCyd在融合性的細(xì)胞中即使?jié)舛冗h(yuǎn)遠(yuǎn)超過用于特定細(xì)胞系的相應(yīng)的CC50時(shí),也沒有顯示毒性的緣故。mCyd對(duì)快速生長(zhǎng)的Huh7人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞或H9c2鼠心肌細(xì)胞在最高測(cè)試濃度(CC50>250μM)顯示出無毒性。mCyd的CC50值在BHK-21倉鼠腎和HepG2人肝癌細(xì)胞系中分別為132和161μM。當(dāng)細(xì)胞在包被了膠原質(zhì)的盤上生長(zhǎng)4或10天,mCyd在HepG2細(xì)胞中的CC50值將增到200μM。為便于比較,用利巴韋林在HepG2和Huh7細(xì)胞中測(cè)試時(shí),其CC50值為35-36μM。在用于BVDV抗病毒研究的MDBK牛腎細(xì)胞中,mCyd的CC50值為36μM。在用mCyd對(duì)抗MT-4人T淋巴細(xì)胞時(shí)確定了類似的CC50值(34μM)。此外,由National Institutesof Health(NIH)Antiviral Research and Antimicrobial Chemistry Program進(jìn)行的測(cè)試表明,對(duì)于其他的許多人類以及其他源于喃乳動(dòng)物的細(xì)胞系,包括多個(gè)人癌細(xì)胞系,mCyd或者是無毒性的,或者是弱毒性的(CC50>50~>250μM)。例外的情況是快速增殖的HFF人包皮纖維原細(xì)胞(HFF human foreskin fibroblast)和MEF鼠胚胎纖維原細(xì)胞(MEF mouse embryofibroblasts),其中,mCyd顯示出較強(qiáng)的毒性(CC50分別為16.9和2.4μM)。并且,mCyd對(duì)于纖維原細(xì)胞的穩(wěn)定期的毒性要小得多。
mCyd用量的增加對(duì)細(xì)胞DNA或RNA合成的毒性影響通過將HepG2細(xì)胞暴露于[3H]-胸苷或[3H]-尿苷而進(jìn)行測(cè)試。在HepG2細(xì)胞中,使放射標(biāo)記的胸苷和尿苷結(jié)合到細(xì)胞DNA和RNA中的量減少50%所需要的mCyd的CC50分別是112和186μM。而測(cè)得的用于DNA或RNA合成的利巴韋林(RBV)的CC50值分別為3.16和6.85μM。這些值反應(yīng)出在常規(guī)的細(xì)胞增殖毒性測(cè)定中,mCyd和RBV的CC50通常分別是161和36μM。為了評(píng)價(jià)mCyd插入細(xì)胞的RNA和DNA,將HepG2細(xì)胞暴露在10μM[3H]-mCyd或?qū)φ蘸塑?特異活性5.6-8.0Ci/mmole,在堿基上標(biāo)記)30小時(shí)。標(biāo)記的細(xì)胞的RNA或DNA被分別分離,并用閃爍計(jì)數(shù)法加以確定。將HepG2細(xì)胞暴露于mCyd會(huì)導(dǎo)致非常低水平的核苷類似物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA(0.0013-0.0014pmol/μg核酸)。這些水平與ZDV和ddC進(jìn)入RNA的各自為0.0009和0.0013pmol/μg的值接近。這是由于這些脫氧核苷不被認(rèn)為會(huì)進(jìn)入RNA,這些水平有可能反應(yīng)出測(cè)定背景。ZDV和ddC進(jìn)入DNA的量相當(dāng)?shù)母?分別為0.103和0.0055pmol/μg)。利巴韋林(RBV)進(jìn)入DNA和RNA的水平比mCyd高10倍。
表4a細(xì)胞的核酸合成和HepG2細(xì)胞中的進(jìn)入研究(10μM藥物和核苷對(duì)照)
a.表示3次試驗(yàn)的平均值的數(shù)據(jù)b.表示1次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)c.表示2次試驗(yàn)的平均值的數(shù)據(jù)nd,未檢測(cè)到表4bmCyd在喃乳動(dòng)物細(xì)胞系中的毒性
a.所有細(xì)胞毒性測(cè)試均在快速細(xì)胞分裂的條件下進(jìn)行b.細(xì)胞在包被了膠原質(zhì)的盤上生長(zhǎng)4或10天對(duì)人骨髓祖細(xì)胞(Human Bone Marrow Progenitor cell)的影響骨髓毒性測(cè)定從正常的健康志愿者中收集人骨髓細(xì)胞,通過Ficoll-Hypaque分級(jí)離心分離單核種群。該分級(jí)分離在Sommadossi J-P,Carlisle R.″Toxicity of 3′-azido-3′-deoxythymidine and 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hematopoietic progenitor cells invitro″Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1987;31452-454;和Sommadossi J-P,SchinaziRF,Chu CK,Xie M-Y.″Comparison of cytotoxicity of the(-)-and(+)-enantiomer of 2′,3′-dideoxy-3′-thiacytidine in normal human bone marrow progenitor cells″BiochemicalPharmacology 1992;441921-1925中已有描述。對(duì)CFU-GM和BFU-E的培養(yǎng)基測(cè)定是通過使用雙層軟瓊脂或甲基纖維素法來進(jìn)行的。藥物在組織培養(yǎng)介質(zhì)中稀釋并過濾。在37℃和潮濕的含5%CO2的空氣氛圍中14-18天后,用反相顯微鏡對(duì)大于50個(gè)細(xì)胞的菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為與溶液對(duì)照培養(yǎng)相比在藥物存在下的菌落形成的抑制性的百分比。
細(xì)胞保護(hù)測(cè)定(CPA)該測(cè)定主要是按照下述文獻(xiàn)的描述進(jìn)行Baginski,S.G.;Pevear,D.C.;Seipel,M.;Sun,S.C.C.;Benetatos,C.A.;Chunduru,S.K.;Rice,C.M.and M.S.Collett″Mechanism of action of apestivirus antiviral COMPOUND″PNAS USA 2000,97(14),7981-7986。在使用前將MDBK細(xì)胞(ATCC)種植到96-孔培養(yǎng)盤(每孔4000細(xì)胞)。當(dāng)在0.02噬斑(plaque)形成單位(PFU)/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)下感染了BVDV(菌株NADL,ATCC)之后,測(cè)試化合物的連續(xù)稀釋被加入感染的和未感染的細(xì)胞,使在生長(zhǎng)介質(zhì)種的DMSO的最終濃度為0.5%。每種稀釋物均被測(cè)試四次。調(diào)整細(xì)胞密度和病毒接種體,以保證試驗(yàn)過程中細(xì)胞的連續(xù)生長(zhǎng)并在未處理過的對(duì)照物中獲得后感染(post-infection)4天后的超過90%的病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞破壞。4天后,盤用50%TCA固定,并用磺酰羅丹明B染色。在550nm用顯微盤讀取器讀取孔的光學(xué)密度。50%的有效濃度(EC50)值被定義為使病毒的細(xì)胞病理效應(yīng)得以降低50%的化合物的濃度。
某些核苷類似物的脊髓抑制(myelosuppressive)效果使人們認(rèn)識(shí)到需要在克隆源性測(cè)定中對(duì)被研究的藥物對(duì)人骨髓祖細(xì)胞的生長(zhǎng)的潛在的影響進(jìn)行測(cè)試。特別的,貧血癥和嗜中性白血球減少癥是與HCV治療中使用的標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合治療中的組分抗-HIV藥物齊多夫定(zidovudine,ZDV)或利巴韋林(RBV)相聯(lián)系的最普遍的與藥物相關(guān)的臨床毒性。這些毒性已在體外測(cè)定中采用來自健康自愿者的骨髓細(xì)胞進(jìn)行了模型構(gòu)建(Sommadossi J-P,Carlisle R.Antimicrob.Agents Chemother.1987;31(3)452-454)。已有結(jié)果顯示,在該模型中,ZDV在臨床相關(guān)濃度1-2μM下,直接抑制人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞菌落形成(CFU-GM)和(BFU-E)活性(Berman E,et al.Blood 1989;74(4)1281-128紅細(xì)胞爆裂形成6;Yoshida Y,Yoshida C.AIDS Res.Hum.Retroviruses 1990;6(7)929-932.;Lerza R,et al.Exp.Hematol.1997;25(3)252-255;Domsife RE,Averett DR.Antimicrob.Agents Chemother.1996;40(2)514-519;Kurtzberg J,Carter SG.Exp.Hematol.1990;18(10)1094-1096;Weinberg RS,et al.Mt.Sinai.J.Med.1998;65(1)5-13)。使用人骨髓克隆源性測(cè)定,mCyd的CC50值在CFU-GM和BFU-E中為14.1±4.5和13.9±3.2μM(見表5)。mCyd對(duì)骨髓細(xì)胞的毒性明顯比ZDV和RBV低(見表5)。
表5mCyd在粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞和紅血球前體細(xì)胞中的骨髓毒性
a.由RBV的3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)和mCyd和ZDV的5-8個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)。所有的試驗(yàn)都進(jìn)行三次。
對(duì)線粒體功能的影響經(jīng)核準(zhǔn)用于HIV治療的抗病毒核苷類似物,如ZDV,司他夫定(stavudine)(d4T),去羥肌苷(didanosine)(ddl)和扎西他濱(zalcitabine)(ddC)有時(shí)與臨床限制性延時(shí)的毒性有關(guān),這些毒性如周圍神經(jīng)病,肌病和胰腺炎(Browne MJ,et al.J.Infect.Dis.1993;167(1)21-29;Fischl MA,et al.Ann.Intern.Med.1993;18(10)762-769.;Richman DD,et al.N.Engl.J.Med.1987;317(4)192-197;Yarchoan R,et al.Lancet 1990;336(8714)526-529)。一些專家認(rèn)為這些臨床的不利現(xiàn)象歸因于因線粒體DNA(mtDNA)含量的減少和核苷類似物進(jìn)入mtDNA而產(chǎn)生的對(duì)線粒體功能的抑制。此外,一個(gè)特別的核苷類似物,非阿尿苷(fialuridine)(1,-2′-脫氧-2′-氟-1-β-D-阿糖基(arabinofuranosyl)-5-碘-尿嘧啶;FIAU)-引起的肝衰竭,胰腺炎,神經(jīng)病,肌病和乳酸酸中毒直接由線粒體毒性引起((McKenzie R,et al.N Engl J Med 1995;333(17)1099-1105))。與藥物相關(guān)的乳酸產(chǎn)量的增加可認(rèn)為是導(dǎo)致受損的線粒體功能或氧化性磷酸化的原因(Colacino,J.M.Antiviral Res 1996 29(2-3)125-39)。
為了評(píng)價(jià)mCyd產(chǎn)生線粒體毒性的潛在可能性,進(jìn)行了多項(xiàng)使用人肝癌細(xì)胞系HepG2或Huh7的體外研究。這些研究包括對(duì)乳酸產(chǎn)量,mtDNA含量的分析,以及確定線粒體超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)上的變化(例如,嵴(cristae)的失去,基質(zhì)溶解和膨脹,以及脂滴形成)。
mCyd對(duì)線粒體的影響示于表6中。在經(jīng)mCyd治療的細(xì)胞中和未經(jīng)治療的細(xì)胞中,未觀察到乳酸產(chǎn)量的區(qū)別,其中,在Huh7細(xì)胞中mCyd用量最高為50μM,或者在HepG2細(xì)胞中mCyd用量最高為10μM。在用50μM的mCyd治療的HepG2細(xì)胞中觀察到了中等的乳酸產(chǎn)量的增加(38%)。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的意義還不明確,主要是因?yàn)閙Cyd不太可能在臨床中保持50μM的血漿濃度。為便于比較,在用10μM的FIAU治療的細(xì)胞中,其乳酸產(chǎn)量與對(duì)照細(xì)胞相比,增長(zhǎng)為100%(Cui L,Yoon,et al.J.Clin.Invest.1995;95555-563)。將HepG2細(xì)胞暴露于濃度最高為50μM的mCyd下6或14天,對(duì)線粒體DNA含量沒有不良影響,而在ddC治療的細(xì)胞中,分別出現(xiàn)56%或80%的減少。
在暴露于10μM的mCyd之下14天后,用透射電子顯微鏡檢查HepG2細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),具體的是線粒體。在絕大多數(shù)細(xì)胞中,沒有觀察到在細(xì)胞結(jié)構(gòu)或在線粒體數(shù)量或形態(tài)學(xué)(包括嵴)中的變化。在17%的細(xì)胞中,平均每個(gè)細(xì)胞的25個(gè)線粒體中的1到2個(gè)線粒體顯示出增大。這樣小的變化不太可能對(duì)線粒體功能產(chǎn)生顯著的影響。ddC-治療的細(xì)胞顯示出異常的線粒體的形態(tài)學(xué),如失去脊膜(cristae)以及脂肪滴積聚。(Medina,D.J.,C.H.Tsai,et al.Antimicrob.Agents Chemother.1994 38(8)1824-8;Lewis W,et al.J.Clin.Invest.1992;89(4)1354-1360.,Lewis,L.D.,F(xiàn).M.Hamzeh,et al.Antimicrob.Agents Chemother.1992 36(9)2061-5)。
表6mCyd對(duì)肝細(xì)胞增殖,線粒體功能和HepG2細(xì)胞中的形態(tài)學(xué)的影響
對(duì)人DNA聚合酶α,β和γ的影響細(xì)胞DNA聚合酶負(fù)責(zé)正常的核和線粒體DNA的合成和修復(fù)。核苷類似物三磷酸酯是DNA聚合酶的潛在抑制劑,因此能夠破壞關(guān)鍵的細(xì)胞功能。特別的,人聚合酶γ的抑制,負(fù)責(zé)線粒體DNA合成的酶被認(rèn)為與線粒體功能缺陷有關(guān)。(Lewis,W.,E.S.Levine,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 1996 93(8)3592-7)。已進(jìn)行了確定mCyd-TP是否抑制人DNA聚合酶的試驗(yàn)。如表7所示,mCyd-TP不是人DNA聚合酶α,β或γ的基質(zhì)。即使是1mM的mCyd-TP也不能在絕大多數(shù)的復(fù)制測(cè)定中抑制50%的這些酶,且IC50值僅被確認(rèn)為超過880-1000μM。與此相對(duì),ddC是三種人DNA聚合酶,特別是聚合酶β和γ的現(xiàn)在抑制劑(IC50分別為4.8和2.7μM)。對(duì)作為對(duì)照藥物的DNA依賴的DNA聚合酶的已知抑制劑放線菌素D,也觀察到潛在的抑制。
表7mCyd-三磷酸酯對(duì)人聚合酶的抑制
a.由4組數(shù)據(jù)得到的平均數(shù)±S.D.
b.由2組數(shù)據(jù)得到的平均數(shù)±S.D.
a.HepG2或Huh7細(xì)胞用化合物處理4天,數(shù)據(jù)由至少3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)表示b.HepG2細(xì)胞用化合物處理6天或14天,數(shù)據(jù)由至少3組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)表示c.HepG2細(xì)胞用化合物處理14天d.在2組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中,17%的細(xì)胞(64中的11個(gè))含有1或2個(gè)增大的線粒體(25個(gè)線粒體中)nd,未檢測(cè)到實(shí)施例5對(duì)BVDV的體外抗病毒活性通過抑制在復(fù)制周期中的其他酶或其他途徑,化合物可通過抑制黃病毒或瘟病毒聚合酶而顯示出抗黃病毒或瘟病毒的活性。
噬斑減少測(cè)定(Plaque Reduction Assay)通過噬斑減少測(cè)定在兩個(gè)相同的24-孔板中確定每種化合物的有效濃度。使細(xì)胞單層感染100PFU/孔的病毒。然后,向該單層中加入測(cè)試化合物的MEM的連續(xù)稀釋(補(bǔ)充了2%的滅活的血清和0.75%甲基纖維素)。培養(yǎng)物進(jìn)一步在37℃培養(yǎng)3天,然后用50%乙醇和0.8%結(jié)晶紫固定,洗滌和空氣干燥。然后對(duì)噬斑計(jì)數(shù)以確定獲得90%的病毒抑制的濃度。
產(chǎn)率減少測(cè)定通過產(chǎn)率減少測(cè)定,在兩個(gè)相同的24-孔板中確定獲得病毒載量減少6-log的每種化合物的濃度。該測(cè)定主要按照文獻(xiàn)中描述的方式進(jìn)行,但作了微小的改變Baginski,S.G.;Pevear,D.C.;Seipel,M.;Sun,S.C.C.;Benetatos,C.A.;Chunduru,S.K.;Rice,C.M.and M.S.Collett″Mechanism of action of a pestivirus antiviral compound″PNAS USA 2000,97(14),7981-7986。簡(jiǎn)言之,在用BVDV(NADL菌株)的0.1PFU/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)進(jìn)行感染之前,將MDBK細(xì)胞種植到24孔板(2×105細(xì)胞/孔)中24小時(shí)。將測(cè)試化合物的連續(xù)稀釋物加入到細(xì)胞中使得生長(zhǎng)介質(zhì)中的DMSO的最終濃度為0.5%。每個(gè)稀釋物都進(jìn)行3次測(cè)試。3天后,細(xì)胞培養(yǎng)物(細(xì)胞單層和上清)通過3次冷凍-解凍循環(huán)而裂解,用噬斑測(cè)定對(duì)病毒產(chǎn)量進(jìn)行定量。簡(jiǎn)言之,將MDBK細(xì)胞種植到6孔板(5×105細(xì)胞/孔),洗滌,并在生長(zhǎng)介質(zhì)中用0.5%的瓊脂糖覆蓋。3天后,細(xì)胞單層用3.5%的甲醛固定并用1%的結(jié)晶紫(w/v在50%的乙醇中)染色顯示出噬斑。對(duì)噬斑進(jìn)行計(jì)數(shù)以確定獲得病毒載量減少6-log的濃度。
在培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行mCyd的抗病毒活性的研究。用于確定mCyd的抗病毒能力的主要測(cè)定是基于BVDV的細(xì)胞飽和測(cè)定(CPA)。該測(cè)定衡量mCyd在保護(hù)生長(zhǎng)的MDBK牛腎病毒不受BVDV的細(xì)胞病變的NADL菌株的破壞方面的能力。測(cè)試藥物對(duì)未感染細(xì)胞的毒性進(jìn)行平行測(cè)定。mCyd和利巴韋林在CPA中的抗病毒活性的比較列于表8a。mCyd以濃度依賴的方式(EC50=0.67±0.22μM)有效地保護(hù)de novo-感染的MDBK細(xì)胞(表8a)。在遠(yuǎn)低于該測(cè)定的mCyd的CC50(38±9μM)的濃度下,mCyd提供了完全的細(xì)胞保護(hù)。在CPA以及其他如下所述的測(cè)定中,利巴韋林未顯示出明顯的抗病毒效果由于利巴韋林的毒性與保護(hù)效果重疊并發(fā)生掩蓋,因此明顯的細(xì)胞保護(hù)(50%或更大)在大多數(shù)測(cè)定中未獲得。因此,在CPA中,利巴韋林的CC50為4.3±0.6μM,EC50>4.3μM。
表8a在細(xì)胞飽和測(cè)定中,mCyd對(duì)BVDV的體外活性
表8bβ-D-2′-C-甲基-胞苷(化合物G),β-D-2′-C-甲基-胞苷二鹽酸鹽的′-O-纈氨酸酯(化合物M)和β-D-2′-C-甲基-尿嘧啶(化合物N)的CC50測(cè)試結(jié)果
注使用的細(xì)胞系包括用于HIV的MT-4;Vero 76,用于SARS的非洲綠猴腎細(xì)胞;用于牛病毒性腹瀉病毒的BHK;用于脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓1型的Sb-1;用于柯薩奇病毒B-2,B-3,B-4和A-9的CVB-2,CVB-3,CVB-4和CVA-9;以及用于雙鏈RNA病毒的REO-1。
表8cβ-D-2′-C-甲基-胞苷(化合物G)的CC50和EC50測(cè)試結(jié)果
注使用的細(xì)胞系包括用于HIV的MT-4;Vero 76,用于SARS的非洲綠猴腎細(xì)胞;用于牛病毒性腹瀉病毒的BHK;用于脊髓灰質(zhì)炎病毒薩賓1型的Sb-1;用于柯薩奇病毒B-2,B-3,B-4和A-9的CVB-2,CVB-3,CVB-4和CVA-9;以及用于雙鏈RNA病毒的REO-1。
mCyd對(duì)不同的BVDV菌株和細(xì)胞病變的(cp)和非細(xì)胞病變的(ncp)生物型的總的抗病毒能力在細(xì)胞保護(hù)測(cè)定和噬斑減少及產(chǎn)量減少測(cè)定中得以確定。后面的測(cè)定測(cè)量的是細(xì)胞中的感染性病毒的產(chǎn)量,因此提供了抗病毒效力的嚴(yán)格的測(cè)試。表9中顯示了在三中測(cè)定中的不同的數(shù)據(jù)的抑制性。mCyd的在50%到90%范圍內(nèi)的有效抑制濃度(EC50和EC90)值分別為0.3-2.8μM和0.87-4.8μM。
在BVDV產(chǎn)量減少測(cè)定中,mCyd的亞細(xì)胞毒素的(subcytotoxic)濃度(約20μM)抑制了de novo BVDV產(chǎn)量達(dá)6log10,達(dá)到了無感染性病毒被檢測(cè)到的程度。在6.0-13.9μM的mCyd中獲得了4log10的有效BVDV產(chǎn)量的減少(EC4log10或EC99.99)。相反,干擾素α2b(IFNα2b)盡管在給測(cè)定(EC502.6IU/ml)中對(duì)BVDV有活性,但即使在1000IU/ml也未得到2logs的病毒減少。因此,mCyd對(duì)BVDV的抗病毒效果比IFNα2b或RBV要高得多。
實(shí)施例6對(duì)其他正鏈RNA病毒的體外抗病毒活性mCyd對(duì)除BVDV外的其他正鏈RNA病毒的效力進(jìn)行了測(cè)試。獲得的數(shù)據(jù)總結(jié)于表9和10中。對(duì)于黃病毒屬病毒,mCyd顯示出中等的活性。由兩點(diǎn)確定的復(fù)合EC50的范圍(μM)為西尼羅河病毒(46-97);黃熱病毒(9-80);登革病毒(59-95)。對(duì)于mCyd對(duì)α病毒,委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒而言,EC50值為1.3-45μM。mCyd對(duì)小核糖核酸病毒,如脊髓灰質(zhì)炎病毒(EC50=6μM),柯薩奇病毒(EC50=15μM),5型和14型鼻病毒(EC50s=<0.1和0.6μg/ml),以及2型鼻病毒(EC502-10μM)具有廣泛的活性。除了正鏈RNA病毒外,mCyd對(duì)所有測(cè)試的RNA和DNA病毒通常都不具有活性。還發(fā)現(xiàn)mCyd對(duì)MT-4人淋巴細(xì)胞中的HIV或HepG2.2.15細(xì)胞中的HBV沒有活性。
表9mCyd對(duì)正鏈RNA病毒的體外抗病毒活性
cp,細(xì)胞病變的病毒;ncp,非細(xì)胞病變的病毒I-NADL cp和I-N-dIns ncp表示重組BVDV病毒表10mCyd的體外抗病毒活性,選擇性和細(xì)胞毒性
a.HFF,人包皮纖維原細(xì)胞(HFF human foreskin fibroblast);Daudi,Burkitt′s B-細(xì)胞淋巴瘤;MDCK,犬腎細(xì)胞;CV-1,非洲綠猴腎細(xì)胞;KB,人鼻咽癌;MA-104,恒河猴腎細(xì)胞;LLC-MK2,恒河猴腎細(xì)胞;A549,人肺癌細(xì)胞;MEF,鼠胚胎纖維原細(xì)胞;Vero,非洲綠猴腎細(xì)胞;Hela,人子宮頸腺癌細(xì)胞。
b.EC50=50%有效濃度。
c.CC50=50%細(xì)胞毒性濃度。
d.用μg/mL而非μM表示的結(jié)果。
實(shí)施例7感染復(fù)數(shù)(MOI)和抗病毒效力使用細(xì)胞保護(hù)測(cè)定形式來檢測(cè)BVDV病毒量的增長(zhǎng)對(duì)mCyd的EC50的影響。該測(cè)定中,BVDV的感染復(fù)數(shù)(MOI)從0.04增加到0.16,導(dǎo)致mCyd的EC50線性地從0.5μM增加到約2.2μM。
實(shí)施例8mCyd治療的細(xì)胞中的病毒回彈斷續(xù)地用mCyd治療的效果在受BVDV的持續(xù)感染的非引起細(xì)胞病變的菌株(菌株I-N-dIns)的MDBK細(xì)胞中被測(cè)試。一旦進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)物,這些細(xì)胞就連續(xù)不斷地隨處產(chǎn)生106到大于107(每ml介質(zhì))的感染性的病毒顆粒。該病毒可通過向未感染的MDBK細(xì)胞中加入來自治療的MDBK(BVDV)細(xì)胞的培養(yǎng)物的上清,并在用BVDV-特異性抗體進(jìn)行免疫染色后,對(duì)所得的暴露的病毒聚點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。用4μM的mCyd對(duì)持續(xù)感染的細(xì)胞系進(jìn)行為期一個(gè)細(xì)胞傳代(3天)的處理,將BVDV效價(jià)從僅低于107的感染單元/ml的處理前或?qū)φ占?xì)胞水平降低了約3log10。在此點(diǎn)上,mCyd處理是非連續(xù)的。在單個(gè)傳代過程中,BVDV效價(jià)回彈到剛超過107的感染單元/ml的未治療的對(duì)照水平。
實(shí)施例9藥物作用機(jī)制在標(biāo)準(zhǔn)BVDV CPA測(cè)定中,mCyd處理導(dǎo)致了總細(xì)胞RNA含量隨細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著增加,其不受BVDV的細(xì)胞毒素作用的影響。這與由mCyd引起的BVDV RNA產(chǎn)量的顯著減少有關(guān)。相反,在沒有mCyd時(shí),由于受到引起細(xì)胞病變的病毒的破壞,總細(xì)胞RNA實(shí)際上隨著BVDV RNA的增加而減少。為進(jìn)一步測(cè)試mCyd對(duì)病毒的和細(xì)胞的RNA的影響,在MDBK細(xì)胞內(nèi)使用了實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)18小時(shí)的后感染(在大約一個(gè)病毒復(fù)制周期后)細(xì)胞內(nèi)BVDVRNA的積聚進(jìn)行監(jiān)控。與之平行的,通過使用特定引物的RT-PCR也對(duì)細(xì)胞內(nèi)看家(housekeeping)核糖體蛋白質(zhì)mRNA(rig S15 mRNA)進(jìn)行定量。該結(jié)果表明,mCyd在denovo-感染的MDBK細(xì)胞中顯著地降低了BVDV RNA的水平,其EC50為1.7μM,EC90為2.3μM。最高的由病毒引起的RNA減少在受測(cè)最高抑制劑濃度下是4log10(125μM)。沒有觀察到對(duì)rig S15細(xì)胞mRNA對(duì)照物水平的影響。并且,以前的發(fā)現(xiàn)表明mCyd通過特異性地干擾病毒的基因組RNA合成而不影響細(xì)胞RNA含量來抑制BVDV。該觀點(diǎn)得到如下事實(shí)的進(jìn)一步支持(表4a)即通過HepG2細(xì)胞中[3H]-尿苷的吸收測(cè)定的抑制RNA合成需要高濃度的mCyd(EC50=186μM)。
在使用純化的BVDV NS5B RNA依賴的RNA聚合酶(Kao,C.C.,A.M.Del Vecchio,et al.(1999).″De novo initiation of RNA synthesis by a recombinant flaviviridae RNA-dependent RNApolymerase.″Virology 253(1)1-7)和合成RNA模板的體外研究中,mCyd-TP以0.74μM的IC50抑制了RNA的合成,并且是BVDV NS5B RNA依賴的RNA聚合酶對(duì)天然CTP基質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑。mCyd-TP的抑制常數(shù)(Ki)為0.16μM,而CTP的Michaelis-Menten常數(shù)(Km)為0.03μM。mCyd-TP對(duì)RNA合成的抑制要求在RNA模板中有同源物G殘基的存在。在對(duì)無CTP時(shí)的mCyd-TP對(duì)RNA合成的影響的更詳細(xì)的研究中,使用了連續(xù)的短的(21mer)合成的RNA模板,該模板含有單股的G殘基,其逐步地沿著模板被移動(dòng)。對(duì)由這些模板在mCyd-TP存在下產(chǎn)生的新合成的轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行的分析表明,增長(zhǎng)僅持續(xù)到G殘基,然后停止(圖2)。在含有超過1個(gè)G殘基的模板中,RNA合成停止在遭遇到聚合酶的第一個(gè)G殘基處。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地表明mCyd-TP是作為非專性的鏈終止者。對(duì)于該明顯的鏈終止基質(zhì)的研究還正在進(jìn)行。
實(shí)施例10持續(xù)性BVDV感染的根除對(duì)mCyd根除病毒性感染的能力的測(cè)試在持續(xù)感染了BVDV的非引起細(xì)胞病變的菌株(菌株I-N-dIns)的MDBK細(xì)胞中進(jìn)行(Vassilev,V.B.and R.O.Donis Virus Res 2000 69(2)95-107.)。與未治療的細(xì)胞相比,當(dāng)用16μM的mCyd對(duì)持續(xù)感染的細(xì)胞進(jìn)行為期兩個(gè)細(xì)胞傳代(3-4天/傳代)的處理,病毒產(chǎn)量由超過6logs病毒/ml降低到不可檢測(cè)的水平。用mCyd進(jìn)行為期12個(gè)細(xì)胞傳代的連續(xù)處理后再無可測(cè)的病毒產(chǎn)量。在傳代8,9和10代(箭頭,圖3)時(shí),一部分細(xì)胞被培養(yǎng)以用于后續(xù)的無藥物存在的傳代,這樣使得mCyd-TP有足夠的時(shí)間進(jìn)行衰變并且使得病毒的復(fù)制得以恢復(fù)。對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)中重新出現(xiàn)的病毒進(jìn)行如下重復(fù)測(cè)試向未感染的MDBK細(xì)胞中加入來自治療的MDBK(BVDV)細(xì)胞的培養(yǎng)物的上清,并用BVDV-特異性抗體進(jìn)行免疫染色使所得病毒聚點(diǎn)顯示后進(jìn)行計(jì)數(shù)。盡管該測(cè)定能夠檢測(cè)處單個(gè)的病毒顆粒,但在藥物處理后,細(xì)胞中無病毒出現(xiàn)。因此,用mCyd處理8或更多傳代能夠成功地從持續(xù)感染的細(xì)胞中消除病毒。
實(shí)施例11與干擾素α2B的聯(lián)合研究第一項(xiàng)研究是在持續(xù)感染了BVDV的紐約-1(NY-1)菌株的MDBK細(xì)胞中進(jìn)行,比較單獨(dú)使用mCyd(8μM)或干擾素α2b(200/ml)或者聯(lián)合使用兩種藥物的效果(圖4A)。在該實(shí)驗(yàn)中,但使用8μM的mCyd在一個(gè)傳代后將病毒效價(jià)降低約3.5log10,并繼續(xù)維持在該水平2個(gè)傳代。除了對(duì)de novo BVDV感染有活性外,單獨(dú)使用干擾素α2b基本上對(duì)持續(xù)BVDV感染(病毒效價(jià)降低約0.1log10)無效。但是,在mCyd上聯(lián)合使用干擾素α2b后,在2個(gè)傳代后將病毒減少至檢測(cè)不到的水平,并清楚地顯示出較單獨(dú)療法更好的效果。
在持續(xù)感染了BVDV的I-N-dIns非引起細(xì)胞病變的菌株的MDBK細(xì)胞中進(jìn)行的研究中(圖4B),mCyd以固定的劑量0,2,4和8μM供給,而干擾素α2b從0到2000IU/ml被滴定。同樣的,干擾素α2b基本上無活性(病毒效價(jià)降低約0.1log),而mCyd單獨(dú)地以劑量依賴的方式抑制著BVDV(菌株I-N-dIns)的繁殖。8μM的mCyd降低了病毒產(chǎn)量6.2log10,幾乎達(dá)到了背景水平。
實(shí)施例12抵抗性發(fā)展在早期細(xì)胞培養(yǎng)研究中,在mCyd存在下的MDBK細(xì)胞中重復(fù)進(jìn)行的引起細(xì)胞病變的BVDV菌株的傳代沒有產(chǎn)生抵抗性突變異種,這就說明了分離mCyd-抵抗性BVDV突變異種使困難的。但是,對(duì)持續(xù)感染了非引起細(xì)胞病變的BVDV形式的細(xì)胞系的研究使得能夠通過在未達(dá)最佳的治療濃度的藥物(2-8μM,取決于實(shí)驗(yàn))下相對(duì)地延長(zhǎng)mCyd的治療來選擇抵抗性的病毒。在圖5A顯示的代表性試驗(yàn)中,在8μM的mCyd存在下經(jīng)過傳代2代后,再也沒有檢測(cè)到病毒,但在傳代6代后又重新出現(xiàn)。從以下數(shù)據(jù)可以明顯得出重新出現(xiàn)的病毒具有較低的效價(jià)抵抗性病毒通常具有比野生型病毒低10倍或更低的效價(jià),并能夠容易地被使用了IntronA的聯(lián)合療法抑制(圖5A)。重新出現(xiàn)的顯型病毒與野生型病毒存在顯著的區(qū)別如圖5B所示,其產(chǎn)生了小得多的聚點(diǎn)(通常比野生型病毒的直徑小3-10倍)。這種顯型在存在抑制劑的培養(yǎng)基中經(jīng)過延長(zhǎng)的傳代后(至少72天)沒有變化,但是,其在斷續(xù)的處理后很快轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧偷娘@型(大的聚點(diǎn))。
抵抗性突變異種的RT-PCR測(cè)序被用于確定產(chǎn)生抵抗性的突變異種。測(cè)序工作集中在BVDV的NS5B RNA依賴的RNA聚合酶區(qū)域,其被認(rèn)為是核苷抑制劑可能發(fā)生作用的靶。
在聚合酶的高度保守的B區(qū)域基序的開始處,特異性S405T氨基酸取代被確認(rèn)。B區(qū)域是聚合酶活性位點(diǎn)的一部分,被認(rèn)為參與核苷結(jié)合(Lesburg,C.A.,M.B.Cable,et al.Nature Structural Biology 1999 6(10)937-43)。其他病毒如HBV對(duì)核苷的抵抗性已繪于該區(qū)域(Ono et al,J Clin Invest.2001 Feb;107(4)449-55)。為了確認(rèn)這種突變決定觀察到的抵抗性,將突變?cè)僖氲紹VDV的重組分子克隆的骨架上。所得的克隆在顯型特性上不能區(qū)別于分離的突變異種病毒,這就證實(shí)了S405T突變決定了抵抗性,且NS5B RNA依賴的RNA聚合酶是mCyd的分子靶向。通過在核苷序列中的該基序的高度保守的特性(Lai,V.C.,C.C.Kao,et al.J Virol 1999 73(12)10129-36)和在正鏈RNA病毒中的結(jié)構(gòu)級(jí)(包括HCV)可以預(yù)測(cè),在NS5B RNA依賴的RNA聚合酶中的相同的突變可能會(huì)是S282T。
S405T突變異種BVDV對(duì)最高可測(cè)試濃度的mCyd(EC50>32μM)具有抵抗性,但是與野生型病毒相比,成活力也受到顯著的損害。如上所述,S405T突變異種顯示出比野生型BVDV低1-2log10的效價(jià),并產(chǎn)生小得多的病毒噬斑。此外,突變異種病毒顯示出在復(fù)制單循環(huán)速率上的顯著的降低(12h時(shí),低于1000倍的病毒效價(jià)),甚至在復(fù)制36小時(shí)后積累到約比野生型病毒低100倍的水平(圖5C)。同樣的,該病毒在除去藥物后很快地轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧筒《?。最后,突變異種對(duì)用IFNα2b治療的敏感性比野生型病毒的高約40倍(圖5D)。
第二種附加突變,C446S,在S405T突變異種病毒在藥物存在下繼續(xù)經(jīng)過傳代后被觀察到。該突變產(chǎn)生在BVDV的NS5B RNA依賴的RNA聚合酶的C區(qū)域的主要GDD基序的緊前方。初步的研究表明,具有兩種突變的病毒與S405T突變異種相比,在復(fù)制上并未顯示出很大的優(yōu)勢(shì),因此,這種突變對(duì)病毒適應(yīng)性的貢獻(xiàn)仍不清楚。
實(shí)施例13動(dòng)物效驗(yàn)?zāi)P椭械膙al-mCyd的體內(nèi)抗病毒活性慢性感染了HCV的黑猩猩時(shí)最為廣泛接受的人類患者感染HCV的動(dòng)物模型(Lanford,R.E.,C.Bigger,et al.Ilar J 2001 42(2)117-26;Grakoui,A.,H.L.Hanson,et al. Hepatology2001 33(3)489-95)。對(duì)感染了慢性肝病毒屬病毒的黑猩猩模型進(jìn)行了口服val-mCyd的單一體內(nèi)研究。
西南基礎(chǔ)靈長(zhǎng)類的動(dòng)物中心(Southwest Foundation Primate Center)對(duì)5只黑猩猩進(jìn)行了HCV基因型化,作為他們的委托的內(nèi)部健康和維護(hù)項(xiàng)目(Health and Maintenance Program)的一部分,目的在于探知所有動(dòng)物的疾病狀態(tài),從而有利于確定對(duì)雇員的潛在安全威脅。用于該項(xiàng)研究的5只黑猩猩在對(duì)將基因型1HCV從所有其他基因型的RT PCT基因型化測(cè)定中顯示出高的HCV效價(jià),但是不能區(qū)別基因型1a和1b。這表明用于該項(xiàng)研究的黑猩猩受基因型1HCV(HCV-1)感染。
表11慢性HCV感染的黑猩猩模型中的val-mCyd體內(nèi)活性研究總結(jié)
在慢性丙型肝炎病毒感染的黑猩猩模型種的7日的抗病毒研究4只黑猩猩(每?jī)芍灰唤M,各組服用劑量為10mg/kg/日或20mg/kg/日)接受了新鮮地溶解在風(fēng)味水果飲料載體(vehicle)中val-mCyd二鹽酸鹽。這些劑量分別相當(dāng)于88.3和16.6mg/kg/日的自由基。第5只僅服用載體的動(dòng)物作為安慰劑對(duì)照(placebo control)。
研究設(shè)計(jì)包括3次治療前放血以建立病毒載量的基線波動(dòng),以及在一周的處理中的3次放血(在治療的第2,5和7天)以評(píng)價(jià)抗病毒效力。分析在一周的給藥期內(nèi)完全完成。
HCV RNA的確定在整個(gè)研究中,HCV RNA的血清水平在兩個(gè)臨床醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室被獨(dú)立地確定。使用定量RT-PCR核酸擴(kuò)增測(cè)定(Roche擴(kuò)增子HCV監(jiān)控器(Roche Amplicor HCV Monitor),2.0版)分析HCV RNA。該測(cè)定具有檢測(cè)下限(LLOD)為600IU/mL,線性范圍為600-850,000IU/mL。
為幫助解釋在治療中觀察到的病毒載量的下降,將重點(diǎn)放于確定(i)在動(dòng)物個(gè)體中的基線HCV病毒載量的波動(dòng)程度,和(ii)HCV病毒載量測(cè)定的內(nèi)在可變性和再現(xiàn)性。為此,比較了由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室獲得的全部病毒載量數(shù)據(jù)組。由兩處獲得的結(jié)果非常接近可比,并確定了治療前HCV病毒載量的穩(wěn)定性和HCV Roche擴(kuò)增子測(cè)定的可靠性。為了對(duì)研究有一個(gè)綜合的評(píng)價(jià),將兩組數(shù)據(jù)結(jié)合得到的平均值列于圖6和7中。圖6表示了劑量組的平均數(shù)據(jù),而圖7表示了單個(gè)動(dòng)物的數(shù)據(jù)。對(duì)各個(gè)動(dòng)物在每處的治療中觀察到的病毒載量對(duì)基線的改變也都總結(jié)于表12中。
由兩處得到的HCV病毒載量分析揭示了,治療前HCV病毒載量(i)在所有的五只動(dòng)物和所有的3個(gè)劑量組中都非常相似,(ii)在3周的治療前期都非常穩(wěn)定。平均治療前l(fā)og10病毒載量和五只動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.8±0.1(場(chǎng)所1)和5.6±0.1(場(chǎng)所2)。這些數(shù)據(jù)表明測(cè)定的變異系數(shù)在兩處僅為約2%。在治療前觀察到的任何動(dòng)物的HCV病毒載量的最大波動(dòng)為約0.3log10。
如圖6和7所示,每天一次的口服val-mCyd產(chǎn)生了快速的抗病毒作用,而這在服用安慰劑的動(dòng)物中沒有出現(xiàn),且在治療前期也未出現(xiàn)。對(duì)于所有的接受了val-mCyd治療兩天后的動(dòng)物而言,病毒效價(jià)均顯著地較基線有下降,并且在兩個(gè)治療臂(treatment arms)中的持續(xù)治療下趨于進(jìn)一步的下降。在處理結(jié)束時(shí)(第7天),由基線HCV病毒載量的平均下降對(duì)于8.3和16.6mg/kg/日的劑量組分別未0.83log10和1.05log10。服用安慰劑的動(dòng)物的效價(jià)在治療期內(nèi)幾乎保持與基線相同。
對(duì)來自兩個(gè)定量處所的數(shù)據(jù)所作的對(duì)治療的響應(yīng)的基線HCV病毒載量變化的分析見表12。總的來說,兩組數(shù)據(jù)相互很符合,這就確認(rèn)了測(cè)定的可信度。除了動(dòng)物501外,在兩處的病毒載量的區(qū)別一般為0.3log10或更低,與治療前期觀察到的波動(dòng)類似。對(duì)于動(dòng)物501,差異接近0.5log10。觀察到對(duì)治療響應(yīng)的病毒載量從0.436(動(dòng)物501,場(chǎng)所1)降低到1.514log10(動(dòng)物497,場(chǎng)所2)。后者對(duì)應(yīng)于HCV病毒載量從535,000(治療前)變?yōu)?6,500(第7日)基因組/ml的改變。
表12治療期間基線log10HCV RNA病毒載量改變的總結(jié)
將黑猩猩暴露于mCyd用有限的HPCL分析確定服用了val-mCyd的黑猩猩的血清中獲得的mCyd的濃度。在2和5天給藥的給藥后的1-2小時(shí)后取得的血清中,在治療的動(dòng)物中的mCyd的水平一般為2.9-12.1μM(分別為750和3100ng/mL)。在治療前的血清或服用安慰劑的對(duì)照血清中,未檢測(cè)到mCyd。在最后服用的24小時(shí)內(nèi),mCyd的血清水平降到0.2-0.4μM(分別未50和100ng/mL)。盡管使用mUrd的方法中采用0.4μM(100ng/mL)的下限,但在任何的血清樣品中均未檢測(cè)到mUrd。
mCyd在感染了慢性HCV的黑猩猩模型中的安全性由受過訓(xùn)練的獸醫(yī)對(duì)黑猩猩在整個(gè)研究中的體重的減少,體溫,胃口和一般性健康以及血液化學(xué)概況和CBCs進(jìn)行監(jiān)控。未發(fā)現(xiàn)由于藥物引起的不良影響。在接受治療的所有4只動(dòng)物中,均顯示出對(duì)藥物的良好的耐受性。在研究中所有的5只動(dòng)物均發(fā)生一些失重,并表現(xiàn)出一些天冬氨酸鹽氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的增高,但這些通常由采樣的鎮(zhèn)靜過程有關(guān),而與研究的藥物無關(guān)。單個(gè)動(dòng)物在服用藥物的治療前期經(jīng)歷了丙胺酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的突發(fā),但在治療中ALT水平小時(shí)。因此,該孤立的ALT與藥物無關(guān)。
實(shí)施例14體外代謝對(duì)val-mCyd和mCyd在人血漿中的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。val-mCyd在人血漿中于0,21或37℃溫育,并在達(dá)到10小時(shí)的不同時(shí)刻對(duì)樣品進(jìn)行分析(圖8)。在37℃,val-mCyd被有效地轉(zhuǎn)變?yōu)閙Cyd,在10小時(shí)后僅有2%的輸入的val-mCyd剩余。在人血漿中的人val-mCyd的體外半衰期為1.81小時(shí)。在人血漿中的mCyd的體外穩(wěn)定性研究中,或在人胞苷/脫氧胞苷脫氨基酶中富集的粗制備物處理后,mCyd幾乎保持不變,并在37℃溫育后,沒有mCyd(mUrd)的尿苷衍生物的脫氨基發(fā)生。僅在恒河猴和食蟹猴(cynomologus monkey)的血漿中觀察到有限的脫氨基作用。mCyd在37℃在食蟹猴的血漿中溫育24和48小時(shí)后,分別產(chǎn)生了6.7和13.0%的mUrd脫氨基產(chǎn)物,其條件時(shí)對(duì)照的胞苷類似物發(fā)生了高度的脫氨化。
除了mCyd和mUrd的TP衍生物外,在所有的三種細(xì)胞類型種還觀察到少量mCyd-5’-二磷酸酯,mCyd-DP,約為相應(yīng)的TP的量的10%。僅在兩種細(xì)胞類型中,原發(fā)性人肝細(xì)胞和MDBK細(xì)胞中檢測(cè)到更少量的mUrd-DP。在任何一種細(xì)胞類型中均物單磷酸酯代謝物被檢測(cè)出。沒有任何的細(xì)胞內(nèi)的mUrd的痕跡,并且沒有證據(jù)支持形成了脂質(zhì)核苷代謝物如在其他胞苷類似物的細(xì)胞代謝中出現(xiàn)的5’-二膽堿磷酸類。
圖9顯示了在將HepG2細(xì)胞暴露于10μM[3H]-mCyd24小時(shí)后確定的mCyd-TP的衰減廓圖。mCyd-TP的明顯的細(xì)胞內(nèi)半衰期是在HepG2細(xì)胞中為13.9±2.2小時(shí),和在MDBK細(xì)胞中為7.6±0.6小時(shí)該數(shù)據(jù)不適于計(jì)算mUrd-TP的半衰期。mCyd-TP在人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中的長(zhǎng)的壽命支持了在治療HCV療法的臨床試驗(yàn)中每天服用一次val-mCyd的觀點(diǎn)。如圖9C的HepG2細(xì)胞所示,mCyd的磷酸化在所有的3種細(xì)胞類型中以劑量依賴的模式發(fā)生達(dá)50μM的藥物。除了上述的特定的區(qū)別外,在原發(fā)性人肝細(xì)胞中檢測(cè)到的磷酸化模式在性質(zhì)上與使用HepG2細(xì)胞或MDBK細(xì)胞獲得的相似。
mUrd的作用除了細(xì)胞內(nèi)的活性部分mCyd-TP,不同種類的細(xì)胞還顯示出通過細(xì)胞內(nèi)mCyd的脫氨基而產(chǎn)生了不同的和更少量的二磷酸酯mUrd-TP。mUrd-TP對(duì)BVDV NS5B RNA依賴的RNA聚合酶的活性雖還未測(cè)試但其進(jìn)行已在計(jì)劃之中。到目前為止,由對(duì)mUrd的抗病毒效力和細(xì)胞毒性的探測(cè)性的細(xì)胞培養(yǎng)物研究所獲得的數(shù)據(jù)表明,mUrd(a)約比mCyd在對(duì)BVDV的效力上低10倍;(b)基本上對(duì)其他廣譜病毒無活性;(c)在不同的細(xì)胞毒性測(cè)試中(包括骨髓測(cè)定,線粒體功能測(cè)定和進(jìn)入細(xì)胞核酸),當(dāng)高濃度測(cè)試時(shí)無作用?;谶@些結(jié)果,可以看出mUrd對(duì)mCyd的總的抗病毒活性或毒性的廓圖的貢獻(xiàn)可能很小。在猴子身上進(jìn)行的使用val-mCyd的亞慢性研究中,存在著mCyd的代謝物mUrd的更廣泛的毒理學(xué)范圍。
實(shí)施例15代謝活化的細(xì)胞途徑在基質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中,研究了對(duì)mCyd磷酸化其作用的酶的性質(zhì)。胞苷(Cyd)是胞質(zhì)尿苷-胞苷激酶(UCK)的天然基質(zhì)。UCK是將Cyd轉(zhuǎn)化未Cyd-5’-單磷酸酯(CMP)的嘧啶補(bǔ)救酶(pyrimidine salvage enzyme)。在胞苷或尿苷存在下,mCyd到mCyd-TP的細(xì)胞內(nèi)磷酸化以劑量依賴的模式減少(對(duì)胞苷,EC50值為19.17±4.67μM,對(duì)尿苷,EC50值為20.92±7.10)。相反,脫氧胞苷,酶脫氧胞苷激酶(dCK)的基質(zhì)對(duì)EC50>100μM的mCyd-TP的形成作用很小。除脫氧胞苷外,胞苷和尿苷對(duì)mCyd磷酸化的抑制表明mCyd是通過嘧啶補(bǔ)救酶,尿肝-胞苷激酶而磷酸化的(Van Rompay,A.R.,A.Norda,et al.Mol Pharmacol 200159(5)1181-6)。對(duì)這些激酶在mCyd活化中所起作用還需進(jìn)一步的試驗(yàn)加以確定。
實(shí)施例16mUrd-TP的細(xì)胞生物合成的途徑如上所概述,mUrd-TP是在不同種類的細(xì)胞中產(chǎn)生的含量不同的少量的代謝物。由于在細(xì)胞介質(zhì)中無mUrd,而該介質(zhì)也缺少脫氨基活性,因此mUrd不是由mCyd的細(xì)胞內(nèi)脫氨基而產(chǎn)生。細(xì)胞代謝數(shù)據(jù)支持了mUrd-TP是通過細(xì)胞內(nèi)大mCyd種類的生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的觀點(diǎn)。對(duì)已知的核苷代謝途徑的考慮表明,最有可能的途徑包括由兩種獨(dú)特的脫氨基酶將兩種mCyd種類中的一種加以脫氨基或者是通過胞嘧啶核苷酸脫氨基酶(例如脫氧胞嘧啶核苷酸脫氨基酶,dCMPD)對(duì)mCyd-MP脫氨基,或者是通過胞苷脫氨基酶(CD)對(duì)mCyd的脫氨基。進(jìn)一步的磷酸化步驟產(chǎn)生了mUrd-TP。這些可能性還有待于進(jìn)一步研究。
實(shí)施例17val-mCyd的臨床評(píng)價(jià)符合要求的患者被隨機(jī)引入處于基線(第1天,即研究施藥的第一天)的研究中。每組劑量的病人為12人,以10∶2的比例隨機(jī)分配進(jìn)行施藥或分配安慰劑的治療。在第1,2,4,8,11和15天,患者隨訪研究中心進(jìn)行治療方案的評(píng)價(jià)。15天后,停止藥物研究。此后,患者在第16,17,22和29天參加追蹤隨訪(follow-up visit)。在治療的第1天和最后1天(第1天和第15天),在禁食的條件下對(duì)所有患者進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)的采樣。
對(duì)Val-mCyd的抗病毒效果進(jìn)行以下評(píng)價(jià)(i)在第15天時(shí),HCV RNA水平由基線降低a≥1.0log10的患者的比例,(ii)血清HCV RNA水平降低到a≥1.01og10的時(shí)間,(iii)HCV RNA水平從第1天到第15天的變化,(iv)HCV RNA水平從第1天到第29天的變化,(v)在第29天經(jīng)歷了血清HCV RNA水平返回基線的患者的比例,(vi)從第1天到第15天的val-mCyd劑量與HCV RNA改變的關(guān)系。
以逐漸增加的劑量口服val-mCyd后的臨床的藥代動(dòng)力學(xué)在第一天的第一劑后8小時(shí)和第15天后的最后一劑后的期間對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià),使用到在的2,4,8,11和16天監(jiān)測(cè)到的24小時(shí)槽式水平(trough level),以及在第17天監(jiān)測(cè)到的48小時(shí)槽式水平。mCyd,mUrd和val-mCyd的血漿濃度用HPLC/MS/MS的方法進(jìn)行測(cè)定,定量下限(LOQ)為20ng/ml。
用非區(qū)劃(non-compartmental)的方法對(duì)mCyd的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了分析。如在下表中
(screening)而獲得。篩選的血清HCV RNA值必須≥5log10IU/mL(根據(jù)在中心研究實(shí)驗(yàn)室的擴(kuò)增子HCV監(jiān)控TM測(cè)定得到)。
在研究期間,HCV RNA的血清樣品在基線處(第1天)、每個(gè)治療方案規(guī)定的后基線研究隨訪處(at every protocol-stipulated post-Baseline study visit)(第2,4,8,11,15,16,17,22和29天)獲得。HCV RNA的血清樣品也從過早地終止研究的患者的治療方案規(guī)定的后續(xù)隨訪期間收集。
在正在進(jìn)行的研究中,與前兩組(50和100mg/天)相關(guān)的抗病毒活性總結(jié)于以下的表和圖中。盡管劑量的持續(xù)時(shí)間短(15天)且起始劑量水平低,但對(duì)感染的患者的血漿中的HCV RNA的水平已表現(xiàn)出明顯的影響。
表15HCV RNA在Log10標(biāo)準(zhǔn)中的統(tǒng)計(jì)學(xué)總結(jié)
表16在Log10HCV RNA中由基線(第1天)的變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)總結(jié)
圖11描述了在Log10HCV RNA中由隨訪得到的與基線的平均變化本發(fā)明通過以上實(shí)施例的描述而得以說明。應(yīng)當(dāng)理解,對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,這些實(shí)施例不應(yīng)限制本發(fā)明,并且在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)可以作適當(dāng)?shù)母淖儭?br>
權(quán)利要求
1.式(I)化合物或其可藥用鹽
2.權(quán)利要求1的化合物,其中,可藥用鹽是鹽酸鹽。
3.權(quán)利要求1的化合物,其中,可藥用鹽是式(II)所示的二鹽酸鹽。
4.藥物組合物,在可藥用載體中含有有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽,用于治療黃病毒科感染。
5.權(quán)利要求4的組合物,其中,可藥用鹽是鹽酸鹽。
6.權(quán)利要求4的組合物,其中,可藥用鹽是二鹽酸鹽。
7.權(quán)利要求4的組合物,其中,可藥用載體適合于口服給藥。
8.權(quán)利要求4的組合物,進(jìn)一步含有第二種抗病毒制劑。
9.權(quán)利要求8的組合物,其中,第二種抗病毒制劑選自干擾素,利巴韋林,白細(xì)胞介素,NS3蛋白酶抑制劑,半胱氨酸蛋白酶抑制劑,菲醌,噻唑烷衍生物,噻唑烷,N-苯甲酰苯胺,解旋酶抑制劑,聚合酶抑制劑,核苷類似物,膠霉毒素,淺藍(lán)菌素,反義硫代磷酸酯寡核苷酸,IRES-依賴翻譯抑制劑和核酶。
10.權(quán)利要求8的組合物,其中,第二種抗病毒制劑是干擾素。
11.權(quán)利要求8的藥物組合物,其中,第二種抗病毒制劑選自聚乙二醇化的干擾素α2a,干擾素alphacon-1,天然干擾素,albuferon,干擾素β-1a,ω干擾素,干擾素α,干擾素γ,干擾素τ,干擾素δ和干擾素γ-1b。
12.權(quán)利要求8的組合物,其中,第二種抗病毒制劑是干擾素α2。
13.權(quán)利要求4的組合物,其中,化合物為劑量單位的形式。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物,其中,劑量單位含有0.01-50mg的化合物。
15.權(quán)利要求13的組合物,其中,所述劑量單位為片劑或膠囊劑。
16.權(quán)利要求4的組合物,其中,化合物基本上是純的形式。
17.權(quán)利要求1-3的化合物,其中,化合物的至少90%(重量)為β-D-異構(gòu)體。
18.權(quán)利要求1-3的化合物,其中,化合物的至少95%(重量)為β-D-異構(gòu)體。
19.治療感染了黃病毒或瘟病毒的宿主的方法,包括根據(jù)宿主需要對(duì)其施用任選存在于可藥用載體中的有效量的具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽或前藥。
20.權(quán)利要求19的方法,其中,可藥用鹽是鹽酸鹽。
21.權(quán)利要求19的方法,其中,可藥用鹽是二鹽酸鹽。
22.權(quán)利要求19的方法,進(jìn)一步包括以含在可藥用載體,稀釋劑或賦形劑中的化合物給藥。
23.權(quán)利要求19的方法,其中,化合物與第二種抗病毒制劑聯(lián)合給藥或交替給藥。
24.權(quán)利要求23的方法,其中,第二種抗病毒制劑選自干擾素,利巴韋林,白細(xì)胞介素,NS3蛋白酶抑制劑,半胱氨酸蛋白酶抑制劑,菲醌,噻唑烷衍生物,噻唑烷,N-苯甲酰苯胺,解旋酶抑制劑,聚合酶抑制劑,核苷類似物,膠霉毒素,淺藍(lán)菌素,反義硫代磷酸酯寡核苷酸,IRES-依賴翻譯抑制劑和核酶。
25.權(quán)利要求23的方法,其中,第二種抗病毒制劑是干擾素。
26.權(quán)利要求19的方法,其中,第二種抗病毒制劑選自聚乙二醇化的干擾素α2a,干擾素alphacon-1,天然干擾素,albuferon,干擾素β-1a,ω干擾素,干擾素α,干擾素γ,干擾素τ,干擾素δ和干擾素γ-1b。
27.權(quán)利要求26的方法,其中,第二種抗病毒制劑是干擾素α2。
28.權(quán)利要求19的方法,其中,宿主為人。
29.權(quán)利要求19的方法,其中,化合物為劑量單位的形式。
30.權(quán)利要求29的方法,其中,劑量單位含有10-500mg的化合物。
31.權(quán)利要求29的方法,其中,所述劑量單位為片劑或膠囊劑。
32.權(quán)利要求19的方法,其中,可藥用載體適合于口服或靜脈給藥。
33.權(quán)利要求19的方法,其中,化合物以基本上純的形式給藥。
34.權(quán)利要求19的方法,其中,化合物的至少90%(重量)為β-D-異構(gòu)體。
35.權(quán)利要求19的方法,其中,化合物的至少95%(重量)為β-D-異構(gòu)體。
36.權(quán)利要求19的方法,其中,病毒是HCV。
37.式I或II的化合物,其中,5’-羥基被5’-OR代替,其中,R是磷酸酯(包括單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或穩(wěn)定的磷酸酯前藥);?;?;烷基;磺酸酯,其包括烷基或芳烷基磺?;?,包括甲磺?;约氨寤?,其中,苯基被選擇性取代;脂質(zhì);氨基酸;碳水化合物;肽;膽固醇;或其他可藥用離去基團(tuán),當(dāng)在體內(nèi)給予后該離去基團(tuán)能夠提供R獨(dú)立為H或磷酸鹽的化合物。
38.藥物組合物,在可藥用載體中含有式I或II的化合物,其中,5’-羥基被5’-OR代替,其中,R是磷酸酯(包括單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或穩(wěn)定的磷酸酯前藥);穩(wěn)定的磷酸酯;酰基;烷基;磺酸酯,其包括烷基或芳烷基磺?;?,包括甲磺?;?,以及卞基,其中,苯基被選擇性取代;脂質(zhì);氨基酸;碳水化合物;肽;膽固醇;或其他可藥用離去基團(tuán),當(dāng)在體內(nèi)給予后該離去基團(tuán)能夠提供R獨(dú)立為H或磷酸鹽的化合物。
39.治療感染了RNA依賴的RNA聚合酶病毒的宿主的方法,包括施用存在于可藥用載體中的有效量的式I或II的化合物,其中,5’-羥基被5’-OR代替,其中,R是磷酸酯(包括單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或穩(wěn)定的磷酸酯前藥);穩(wěn)定的磷酸酯;烷基或芳烷基磺?;?,包括甲磺?;?,以及卞基,其中,苯基是可被一個(gè)或多個(gè)具有這里給出的芳基定義的取代基取代;脂質(zhì),包括磷脂;氨基酸;碳水化合物;肽;膽固醇;或其他可藥用離去基團(tuán),當(dāng)在體內(nèi)給予后該離去基團(tuán)能夠提供的化合物中R獨(dú)立地是H或磷酸酯。
40.權(quán)利要求39的方法,其中,病毒是黃病毒科病毒。
41.權(quán)利要求39的方法,其中,黃病毒科病毒是丙型肝炎病毒。
42.權(quán)利要求39,40或41的方法,其中,宿主為人。
43.具有式(I)或其可藥用鹽或其前藥的結(jié)構(gòu)的化合物在制備治療感染了黃病毒或瘟病毒的宿主的藥物中的用途。
44.權(quán)利要求43的用途,其中,可藥用鹽是鹽酸鹽。
45.權(quán)利要求43的用途,其中,可藥用鹽是二鹽酸鹽。
46.權(quán)利要求43的用途,進(jìn)一步包括將化合物包含在可藥用載體,稀釋劑或賦形劑中給藥。
47.權(quán)利要求43的用途,其中,化合物與第二種抗病毒制劑進(jìn)行聯(lián)合制藥。
48.權(quán)利要求47的用途,其中,第二種抗病毒制劑選自干擾素,利巴韋林,白細(xì)胞介素,NS3蛋白酶抑制劑,半胱氨酸蛋白酶抑制劑,菲醌,噻唑烷衍生物,噻唑烷,N-苯甲酰苯胺,解旋酶抑制劑,聚合酶抑制劑,核苷類似物,膠霉毒素,淺藍(lán)菌素,反義硫代磷酸酯寡核苷酸,IRES-依賴翻譯抑制劑和核酶。
49.權(quán)利要求47的用途,其中,第二種抗病毒制劑是干擾素。
50.權(quán)利要求47的用途,其中,第二種抗病毒制劑選自聚乙二醇化的干擾素α2a,干擾素alphacon-1,天然干擾素,albuferon,干擾素β-1a,ω干擾素,干擾素α,干擾素γ,干擾素τ,干擾素δ和干擾素γ-1b。
51.權(quán)利要求47的用途,其中,第二種抗病毒制劑是干擾素2α。
52.權(quán)利要求47的用途,其中,宿主為人。
53.權(quán)利要求47的用途,其中,化合物為劑量單位的形式。
54.權(quán)利要求43的用途,其中,劑量單位含有10-500mg的化合物。
55.權(quán)利要求43的用途,其中,所述劑量單位為片劑或膠囊劑。
56.權(quán)利要求43的用途,其中,可藥用載體適合于口服給藥。
57.權(quán)利要求43的用途,其中,化合物以基本上純的形式給藥。
58.權(quán)利要求43的用途,其中,化合物的至少90%(重量)為β-D-異構(gòu)體。
59.權(quán)利要求43的用途,其中,化合物的至少95%(重量)為β-D-異構(gòu)體
60.權(quán)利要求43的用途,其中,病毒是HCV。
61.任選存在于可藥用載體中的式(1)的化合物或其可藥用鹽或前藥,用于治療感染了黃病毒或瘟病毒的宿主。
62.權(quán)利要求61的化合物,其中,可藥用鹽是鹽酸鹽。
63.權(quán)利要求61的化合物,其中,可藥用鹽是二鹽酸鹽。
64.權(quán)利要求61的化合物,進(jìn)一步包含在可藥用載體,稀釋劑或賦形劑。
65.權(quán)利要求61的化合物,其中,進(jìn)一步包含第二種抗病毒制劑。
66.權(quán)利要求65的化合物,其中,第二種抗病毒制劑選自干擾素,利巴韋林,白細(xì)胞介素,NS3蛋白酶抑制劑,半胱氨酸蛋白酶抑制劑,菲醌,噻唑烷衍生物,噻唑烷,N-苯甲酰苯胺,解旋酶抑制劑,聚合酶抑制劑,核苷類似物,膠霉毒素,淺藍(lán)菌素,反義硫代磷酸酯寡核苷酸,IRES-依賴翻譯抑制劑和核酶。
67.權(quán)利要求65的化合物,其中,第二種抗病毒制劑是干擾素。
68.權(quán)利要求65的化合物,其中,第二種抗病毒制劑選自聚乙二醇化的干擾素α2a,干擾素alphacon-1,天然干擾素,albuferon,干擾素β-1a,ω干擾素,干擾素α,干擾素γ,干擾素τ,干擾素δ和干擾素γ-1b。
69.權(quán)利要求65的化合物,其中,第二種抗病毒制劑是干擾素2α。
70.權(quán)利要求65的化合物,其中,宿主為人。
71.權(quán)利要求65的化合物,其中,化合物為劑量單位的形式。
72.權(quán)利要求61的化合物,其中,劑量單位含有10-500mg的化合物。
73.權(quán)利要求72的化合物,其中,所述劑量單位為片劑或膠囊劑。
74.權(quán)利要求61的化合物,其中,可藥用載體適合于口服給藥。
75.權(quán)利要求61的化合物,其中,化合物以基本上純的形式給藥。
76.權(quán)利要求61的化合物,其中,化合物的至少90%(重量)為β-D-異構(gòu)體。
77.權(quán)利要求61的化合物,其中,化合物的至少95%(重量)為β-D-異構(gòu)體。
78.權(quán)利要求61的化合物,其中,病毒是HCV。
79.權(quán)利要求1或61的化合物,其中,可藥用鹽選自甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸、甲酸鹽、延胡索酸鹽、丙酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、水楊酸鹽。另外,也可形成適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽,包括硫酸鹽、磺酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽、氫溴酸鹽、碳酸鹽和正磷酸鹽。
80.權(quán)利要求4的組合物,其中,可藥用鹽選自甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸、甲酸鹽、延胡索酸鹽、丙酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、水楊酸鹽。另外,也可形成適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽,包括硫酸鹽、磺酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽、氫溴酸鹽、碳酸鹽和正磷酸鹽。
81.權(quán)利要求19的方法,其中,可藥用鹽選自甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸、甲酸鹽、延胡索酸鹽、丙酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、水楊酸鹽。另外,也可形成適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽,包括硫酸鹽、磺酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽、氫溴酸鹽、碳酸鹽和正磷酸鹽。
82.權(quán)利要求42的用途,其中,可藥用鹽選自甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸、甲酸鹽、延胡索酸鹽、丙酸鹽、乙醇酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、水楊酸鹽。另外,也可形成適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽,包括硫酸鹽、磺酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽、氫溴酸鹽、碳酸鹽和正磷酸鹽。
全文摘要
已發(fā)現(xiàn)β-D-2′-C-甲基-核糖呋喃基胞苷的3′-L-纈氨酸酯(以下可稱為val-mCyd)對(duì)黃病毒屬和瘟病毒屬,包括丙型肝炎病毒有非常好的治療效果?;诖税l(fā)現(xiàn),提供了用于治療黃病毒科包括HCV的化合物、組合物、方法和用途,其包括將有效量的val-mCyd或其鹽、酯、前藥,以及選擇性的可藥用載體進(jìn)行給藥。在選擇性的實(shí)施方式中,val-mCyd被用于治療通過RNA依賴的RNA聚合酶來復(fù)制的病毒。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1678326SQ03820701
公開日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者讓-皮埃爾·索馬多西, 保羅·拉科拉 申請(qǐng)人:埃迪尼克斯(開曼)有限公司, 卡利亞里大學(xué)