一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雜交指示劑5,7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制備方法和用途，并以此為指示劑，提供一種基于“膜修飾電極”、“核酸外切酶III輔助靶序列循環(huán)”和“DNA長距式自組裝”三重信號放大技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，并將其用于肺癌相關(guān)靶序列c-erbB-2相關(guān)基因的超高靈敏、高特異性檢測。該傳感器的線性范圍為2aM～50fM，檢出限達到0.5aM，且能較好地識別完全互補和錯配序列，可以實現(xiàn)臨床實際肺癌血清樣本中超低含量靶序列的檢測。
【專利說明】-種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制備方法 和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制備方法和用途，屬 于有機合成領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是世界上威脅人類生命的主要惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率和死亡率逐年 上升，已居惡性腫瘤之首，其中非小細胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC)占 所有肺癌的80%。目前，針對肺癌治療的研究已取得較大進展，但肺癌總的5年生存率仍只 有15%，即使IA期NSCL患者，術(shù)后5年生存率也只有80%。因此，肺癌的早期快速診斷對 于治療方案的選擇及預(yù)后評價至關(guān)重要。
[0003] 近年來，隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)及免疫學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，對肺癌研究的不斷深 入，醫(yī)學(xué)工作者們在肺癌腫瘤標志物篩選方面取得了突破性進展，目前已發(fā)現(xiàn)多種與肺癌 相關(guān)的蛋白、基因等標志物，特別是腫瘤標志物c-erbB-2等。有研究人員發(fā)現(xiàn)，c-erbB-2在 肺癌患者血清中異常表達，且性質(zhì)穩(wěn)定，正逐漸成為可靠的早期診斷肺癌的新型腫瘤標志 物之一。許多學(xué)者通過PCR方法從基因水平來研究與NSCLC關(guān)系密切的基因標志物。雖 然PCR可實現(xiàn)基因表達的定量檢測，但由于存在操作過程繁瑣、成本高、需要專門的技術(shù)人 員等缺點，限制了檢測在臨床肺癌診斷中的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種簡便、快速、靈敏、經(jīng)濟的 c-erbB-2檢測技術(shù)具有極其廣闊的應(yīng)用前景，將有望解決NSCLC早期診斷這一臨床迫切的 實際問題，具有極其重要的意義。
[0004] 生物傳感器是利用生物特異性識別過程來探測蛋白質(zhì)、基因、抗體、毒素等的傳感 檢測器，是新一代的生物檢測技術(shù)。其中電化學(xué)生物傳感是由生物材料（DNA、酶、抗原、細 胞、組織等）作為敏感元件，電極作為轉(zhuǎn)換元件，以電勢或電流為特征檢測信號的傳感器，其 生物分子識別的專一性決定了此傳感器具有高度選擇性。因此，學(xué)者們設(shè)計了很多用于檢 測DNA的電化學(xué)生物傳感策略。雖然這些傳感策略能實現(xiàn)DNA的靈敏特異性檢測，但還存 在如下缺陷：1)復(fù)雜耗時，缺乏經(jīng)濟性。2)傳統(tǒng)指示劑存在價格昂貴，與單雙鏈DNA都會發(fā) 生作用，雜交檢測特異性不高。3)穩(wěn)定性較差。4)某些官能團標記方法，背景信號大，靈敏 度低。5)假陽性和假陰性的現(xiàn)象仍不可避免。這些電生物傳感策略在實際樣本檢測中想取 代臨床傳統(tǒng)技術(shù)，仍面臨巨大的困難。因此，有必要繼續(xù)研究一種電化學(xué)生物傳感新方法。
[0005] 下面所述的為本發(fā)明人設(shè)計并合成一種新型的具有較高水溶性和電化學(xué)活性的 吖啶酮類衍生物-"5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮"，并以此為雜交指示劑，研制出了一種 測定c-erbB-2相關(guān)基因的電化學(xué)傳感器--基于"膜修飾電極"、"核酸外切酶III輔助靶 序列循環(huán)"和"DNA長距式自組裝"三重信號放大技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器：將L-賴氨酸 修飾在玻碳電極表面，通過共價修飾法將發(fā)卡探針DNA固定到聚賴氨酸的末端羧基上。通 過探針DNA與靶DNA的雜交，再經(jīng)過核酸外切酶III切割循環(huán)后，修飾電極表面留有柔性短 寡核苷酸序列，其可與輔助探針基因APl和AP2雜交形成超級三明治結(jié)構(gòu)，選擇5, 7-二硝 基-2-磺基-吖啶酮作為雜交指示劑，其可嵌入到DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，成功實現(xiàn)三重信號 放大技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器的研制。由于聚賴氨酸含有羧基，有利于DNA在電極表面的 固定，另外"聚賴氨酸良好的導(dǎo)電性"、"核酸外切酶III輔助靶序列循環(huán)"及"DNA長距式自 組裝"都極大地增強了傳感器的檢測靈敏度。從而建立了高靈敏度、高特異性的c-erbB-2 相關(guān)基因檢測方法。今后，我們將在此新技術(shù)成功應(yīng)用于肺癌早期診斷的基礎(chǔ)上，推廣應(yīng)用 于其他類型腫瘤的早期診斷及篩選抗腫瘤新藥工作中，因而本發(fā)明具有巨大的潛在應(yīng)用價 值和深遠的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制備方 法和用途，提供一種基于"膜修飾電極"、"核酸外切酶III輔助靶序列循環(huán)"和"DNA長距式 自組裝"三重信號放大技術(shù)的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，并將其用于肺癌相關(guān)靶序列 c-erbB-2相關(guān)基因的超高靈敏、高特異性檢測。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮，所述5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮 結(jié)構(gòu)式為

【權(quán)利要求】
1. 一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮，其特征在于：所述5, 7-二硝 基-2-磺基-吖啶酮結(jié)構(gòu)式為
2. -種如權(quán)利要求1所述的一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的制備 方法，其特征在于：所述步驟為：稱取0. 6g吖啶酮，加入5mL濃H2SO4，攪拌溶解后，加熱 至KKTC反應(yīng)30min，趁熱將溶液倒入(T4°C冰水中，固體析出，過濾干燥得到淺綠色固體 2-磺基-吖啶酮；稱取0· 6g2-磺基-吖啶酮，加入3mL36 %乙酸，再依次加入0· 36mL 的濃硝酸和0.8mL的冰醋酸，于56飛0 °C下攪拌反應(yīng)2h，趁熱將溶液倒入冰水中，固體析 出，過濾，用ΚΓ20mL水沖洗，并用無水乙醇進一步重結(jié)晶純化，得到黃色針狀粉末5, 7-二 硝基-2-磺基-吖啶酮。
3. -種如權(quán)利要求1所述的一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學(xué) 傳感器上的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學(xué)傳 感器上的應(yīng)用，其特征在于：所述的電化學(xué)傳感器制備方法包括： 1) 電極的預(yù)處理 將玻碳電極在〇. 05μm的Al2O3粉上打磨，并先后用無水乙醇和雙蒸水超聲震蕩5min，以除去附在電極表面上的雜質(zhì)，用10mM鐵氰化鉀表征電極表面，直至前后峰位電壓 差值小于80V，蒸餾水洗凈擦干后取出，氮氣吹干； 2) 探針修飾電極的制備 將處理后的玻碳電極置于含0.01M/L賴氨酸的pH8. 0、0. 2MPBS緩沖液中，用循環(huán) 伏安法電合修飾聚賴氨酸膜，再用雙蒸水徹底沖洗電極并在室溫下干燥，得到聚賴氨酸修 飾電極，將聚賴氨酸修飾電極倒置，表面滴加20μL偶聯(lián)活化劑，室溫自然蒸干，然后用超 純水清洗10s，除掉未結(jié)合在修飾電極表面的偶聯(lián)活化劑，氮氣吹干待用；然后在電極表面 滴加10μLIyM發(fā)卡結(jié)構(gòu)的探針基因P溶液，室溫自然蒸干，用超純水清洗除掉未結(jié)合在 電極表面的探針基因Ρ，再用10mMΡΗ7.0PBS緩沖液清洗，室溫干燥，制得發(fā)卡探針修飾電 極； 3) 酶輔助靶序列循環(huán) 將發(fā)卡探針修飾電極置于一系列濃度的靶序列c-erbB-2相關(guān)基因溶液中，室溫下雜 交Ih后清洗吹干，將雜交后的電極置于10U核酸外切酶III的緩沖液中，37 °C下反應(yīng) 30min后，清洗吹干待用； 4. DNA長距式自組裝及電化學(xué)檢測 分別取10KL?μΜ的輔助探針基因APl和AP2溶液滴涂在上述電極表面，室溫下進 行DNA長距式自組裝，2h后清洗吹干；分別在含有質(zhì)量比例為1:1的5mMK3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6]的100mMpH7.0PBS+ 0.IMKCl緩沖溶液測量不同修飾電極的CV曲線，掃 描速率為0.05V/s，采樣間隔為0.001V，靜置時間為2s;將DNA長距式自組裝后的電極 置于含100μM5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮的10mMpH7.0PBS緩沖溶液中，20min 后清洗吹干；而后將電極置于100mMpH5.0磷酸鹽PB緩沖溶液中掃描CV和方波伏安法 曲線。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學(xué)傳 感器上的應(yīng)用，其特征在于：所述循環(huán)伏安法的條件為：電壓-1.0 ~ +2.4V，掃描速率為 100mVs-1，表征圈數(shù)為14圈。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學(xué)傳 感器上的應(yīng)用，其特征在于：所述偶聯(lián)活化劑為含5mM的EDC和8mM的NHS的pH7. 4磷 酸緩沖液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學(xué)傳 感器上的應(yīng)用，其特征在于：所述CV法的掃描速率為0.50V/s，采樣間隔為0.001V，靜置 時間為2s;方波伏安法的掃描電位范圍為-0. 2V?+0. 15V，電位增量為0. 005V，幅度 為 0· 025V。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雜交指示劑5, 7-二硝基-2-磺基-吖啶酮在電化學(xué)傳 感器上的應(yīng)用，其特征在于：所述探針P序列為5'-NH2-MAAATTTATTTGATAGGCGAACT ATTTGTTTTTAATATCAAATAATGGTT-3' ；所述探針API序列為 5'-CAAAATATATGA TAGGCGAA-3' ；探針AP2 序列為 5'-ATATATTTTGTTCGCCTATC-3'。
【文檔編號】G01N27/327GK104316705SQ201410628402
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】陳敬華, 李春艷, 趙燕蘋, 劉智晶, 吳冬枝, 陳梅, 章溪, 劉映昕 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)