專利名稱：柑桔多甲氧基黃酮的提取及純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)副產(chǎn)品有效成分的提取及純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從柑桔皮中提取及純化活性成分多甲氧基黃酮的方法。
背景技術(shù)：
我們知道，柑桔富含黃酮類物質(zhì)，其中的多甲氧基黃酮是柑桔中所特有的，川陳皮素(Nobiletin)、桔皮素(Tangeretin)是其中的代表，它們主要分布在柑桔皮的油胞中，含量在0. 4 0. 6mg/g。這類物質(zhì)由于其具有平面結(jié)構(gòu)，含有多個甲氧基，極性低，因此具有多種藥理作用如抗癌、抗炎、抗氧化、抗誘變以及降低膽固醇等作用，特別其在抗癌方面的作用要比其它黃酮類強(qiáng)。目前對柑桔多甲氧基黃酮主要采用溶劑提取法進(jìn)行粗提，然后用超臨界流體色譜和高效液相制備色譜法對粗提物進(jìn)行分離純化，這兩種提純方法雖然所得多甲氧基黃酮單體的含量較高(90%以上)，但都還存在設(shè)備價格昂貴，工藝步驟繁瑣，制備成本高等缺點(diǎn)； 還有是采用聚酰胺柱和葡聚糖凝膠柱兩次純化柑桔皮粗提物，雖然得到的多甲氧基黃酮含量也較高，但是分離工序較復(fù)雜，而且這兩種分離介質(zhì)價格也較昂貴。大孔樹脂是一種多孔的聚合物吸附劑，通過選擇適宜的樹脂可以對目標(biāo)分離物具有較好的吸附作用，然后通過適宜的洗脫劑洗脫下來達(dá)到分離純化的目的，它具有成本低廉，易得，組裝簡單，分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，其純化的純度基本可以滿足食品、保健品等的需要。因此，本發(fā)明針對這一現(xiàn)狀， 根據(jù)多甲氧基黃酮的特性設(shè)計(jì)出一種成本低廉、工藝簡單、經(jīng)濟(jì)環(huán)保，并適用于工業(yè)化生產(chǎn)的方法，所得到的多甲氧基黃酮含量較高，可以進(jìn)一步開發(fā)成功能食品添加劑、保健品或藥
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對已有柑桔多甲氧基黃酮粗提物純化設(shè)備昂貴，工藝繁雜，成本太高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的缺陷，提出一種純化工藝合理，產(chǎn)品純度高、得率較高，成本低廉， 能滿足食品、保健品等的需要，能用于工業(yè)化生產(chǎn)的柑桔多甲氧基黃酮的提取及純化方法。本發(fā)明的設(shè)計(jì)前期對柑桔多甲氧基黃酮吸附率與洗脫率均較高的大孔樹脂進(jìn)行了篩選，從中測定、篩選出對川陳皮素和桔皮素單體吸附率和洗脫率均較高的大孔樹脂 (見試驗(yàn)例1)，以用于對本發(fā)明柑桔多甲氧基黃酮粗提物的純化。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)柑桔多甲氧基黃酮粗提物的提取與純化方法，該方法按以下步驟進(jìn)行(1)柑桔多甲氧基黃酮的提取1)柑桔皮的預(yù)處理將柑桔皮干燥至含水量< 5%，磨粉過30目篩后，備用；2)柑桔多甲氧基黃酮的粗提與萃取將柑桔皮粉和水按重量體積500g 5L比例拌勻，加熱到100°c提取lh、過濾得水提液；將水提液與正己烷按體積1 0.5比例混合、萃?。粚⑤腿∫涸?0°C下減壓蒸干，得到柑桔多甲氧基黃酮粗提物；
(2)柑桔多甲氧基黃酮粗提物的柱層析純化； 1)粗提物溶液的配制將柑桔多甲氧基黃酮粗提物5g溶解于30 50%乙醇溶液 500ml中，過濾后，備用；2)大孔樹脂裝柱把大孔樹脂裝入層析柱中至柱高15 25cm ；3)大孔樹脂的吸附把粗提物溶液500ml，用蠕動泵以1 2. 5ml/min流速流經(jīng)層析柱，并收集流出液；4)大孔樹脂的洗脫、收集與濃縮干燥以60 100%的乙醇溶液500ml為洗脫液，用蠕動泵以lml/min流速流經(jīng)層析柱后，以每40ml為一管進(jìn)行成分測定與收集，其中， 將1至6 7管的洗脫液合并得洗脫液1，把其余洗脫液合并得洗脫液2 ；將洗脫液1與2 分別減壓濃縮、回收乙醇，殘留物烘干、粉碎后，分別得到以川陳皮素為主的純化物1和以桔皮素為主的純化物2。所述的大孔樹脂為AB-8、D-101、NKA-9和DM312中的任選一種。本發(fā)明的有益效果是(1)在粗提物的水提液中，因?yàn)槎嗉籽趸S酮是一種低極性的物質(zhì)，通過低極性正己烷的萃取后，使粗提物中川陳皮素和桔皮素兩種多甲氧基黃酮成分含量得到提高，其中， 川陳皮素含30.8%，桔皮素含22. 7% (見實(shí)施例1)；(2)本發(fā)明粗提物的純化工藝簡單易行，無需大型、貴重的設(shè)備，只需層析柱和一些常規(guī)設(shè)備就可進(jìn)行；且其所用的大孔樹脂和溶劑乙醇都容易得到，對人體也較安全、可靠，并可重復(fù)多次利用，幾乎沒有排放；(3)本發(fā)明所選用的大孔樹脂都是對多甲氧基黃酮具有較高的吸附率與洗脫率， 因此對柑桔多甲氧基黃酮粗提物具有較高純化效果，其總含量可達(dá)74. 5-82. ；總回收率可達(dá) 45. 9-68. 6% (見表 1)； 表1各實(shí)施例的純化效果
純化物1中川陳純化物2中桔純化物1中總gf^^M、
_皮素含量(％) 皮素含量(％)含量(%) <U>UHX#1
實(shí)施例 1 63.9 44 82. 1 68.6 實(shí)施例 2 59.7 38 80.3 56.4 實(shí)施例 3_5^8_345_74A_45. 9(4)本發(fā)明是在對每管洗脫液進(jìn)行分析檢測后，明確洗脫純化工藝的前半段以獲得川陳皮素為主，后半段以獲得桔皮素為主的基礎(chǔ)上，通過將洗脫液分前后兩段收集，并分別減壓濃縮、回收乙醇、烘干粉碎后，得到純度較高的川陳皮素和桔皮素的純化物；這為今后對柑桔多甲氧基黃酮不同成分的分別利用創(chuàng)造了條件；(5)綜合以上幾點(diǎn)，本發(fā)明方法投入低，見效快，易于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1 柑桔多甲氧基黃酮粗提物的提取與純化的流程示意2 川陳皮素的標(biāo)準(zhǔn)圖譜圖3 桔皮素的標(biāo)準(zhǔn)圖譜
圖4 以川陳皮素為主的純化物的高效液相圖譜圖5 以桔皮素為主的純化物的高效液相圖譜
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例對 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。材料說明層析柱內(nèi)徑26mm，長度30cm，上海廈美生化科技發(fā)展有限公司。大孔樹脂AB-8、NKA-9、D-101為南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)，DM312為滄州寶恩吸附材料科技有限公司生產(chǎn)。蠕動泵BT00-300T保定蘭格恒流泵有限公司生產(chǎn)。實(shí)施例1 (柑桔多甲氧基黃酮粗提物的提取與純化方法1)(1)柑桔多甲氧基黃酮的提取1)柑桔皮的預(yù)處理將柑桔皮干燥至含水量< 5%，磨粉過30目篩后，備用；2)柑桔多甲氧基黃酮的粗提與萃取將柑桔皮粉500g和水5. OL拌勻，加熱到 100°c提取lh、過濾得水提液；將水提液與正己烷按體積比1 0. 5混合、萃??；將萃取液在 40°C下減壓蒸干，得到柑桔多甲氧基黃酮粗提物；經(jīng)HPLC分析，該粗提物中含川陳皮素為 30.8%，桔皮素為22. 7% ；(2)柑桔多甲氧基黃酮粗提物的柱層析純化；1)粗提物溶液的配制將柑桔多甲氧基黃酮粗提物5g溶解50%乙醇溶液500ml 中，濾紙過濾后，備用；2)大孔樹脂裝柱把預(yù)處理后的大孔樹脂D-101裝入層析柱中至柱高25cm，并要求柱內(nèi)填裝樹脂至緊實(shí)；3)大孔樹脂的吸附把上述粗提物溶液500ml，用蠕動泵以lml/min流速，化 8. 33h流經(jīng)層析柱，并收集流出液；經(jīng)分析多甲氧基黃酮含量，可知層析柱對多甲氧基黃酮的總吸附率為99% ；4)大孔樹脂的洗脫、收集與濃縮干燥先用蒸餾水以lml/min的流速沖洗步驟 (2) -3)層析柱1 2h洗去雜質(zhì)；然后以80 %乙醇水溶液500ml為洗脫液，用蠕動泵以Iml/ min流速流經(jīng)層析柱，以每40ml為一管進(jìn)行成分測定并收集，其中，將1至6管的洗脫液合并得洗脫液1，把其余的洗脫液合并得洗脫液2 ；將洗脫液1與2分別減壓濃縮、回收乙醇， 殘留物烘干、粉碎后，從前者得到以川陳皮素為主的純化物1為1.012g，其中桔皮素和川陳皮素的含量分別為18. 2%和63. 9% ；從后者得到以桔皮素為主的純化物2為0. 49g，其中桔皮素和川陳皮素的含量分別為44%和33. 5% ；柑桔多甲氧基黃酮總回收率為68. 6%。實(shí)施例2 (柑桔多甲氧基黃酮粗提物的提取與純化方法2)本例中，步驟(2)柑桔多甲氧基黃酮粗提物的柱層析純化；1)粗提物溶液的配制將柑桔多甲氧基黃酮粗提物5g溶解于30 %乙醇溶液 500ml 中；2)大孔樹脂裝柱把預(yù)處理后的大孔樹脂DM312裝入層析柱中至柱高20cm ；3)大孔樹脂的吸附把粗提物溶液500ml，用蠕動泵以1. 5ml/min流速，化5. 56h 流經(jīng)層析柱，并收集流出液；經(jīng)分析多甲氧基黃酮含量，可知層析柱對多甲氧基黃酮的總吸附率為80% ；4)大 孔樹脂的洗脫、收集與濃縮干燥以100%的乙醇500ml為洗脫液；將1至6 管的洗脫液合并得洗脫液1，把其余的洗脫液合并得洗脫液2 ；從洗脫液1得到純化物1為 0. 824g，其中桔皮素和川陳皮素的含量分別為20. 6%和59. 7% ；從洗脫液2得到純化物2 為0.41g，其中桔皮素和川陳皮素的含量分別為38%和36.5% ；柑桔多甲氧基黃酮的總回收率為56. 4% ；其余步驟工藝同于實(shí)施例1。實(shí)施例3 (柑桔多甲氧基黃酮粗提物的提取與純化方法3)本例中，步驟(2)柑桔多甲氧基黃酮粗提物的柱層析純化；1)粗提物溶液的配制將柑桔多甲氧基黃酮粗提物5g溶解40%乙醇溶液500ml 中；2)大孔樹脂裝柱把預(yù)處理后的大孔樹脂AB-8裝入層析柱中至柱高15cm ；3)大孔樹脂的吸附把粗提物溶液500ml，用蠕動泵以2. Oml/min流速，化4. 17h 流經(jīng)層析柱，并收集流出液；經(jīng)分析多甲氧基黃酮含量，可知層析柱對多甲氧基黃酮的總吸附率為68% ；4)大孔樹脂的洗脫、收集與濃縮干燥以60%的乙醇500ml為洗脫液；將1至7 管的洗脫液合并得洗脫液1，把其余的洗脫液合并得洗脫液2 ；從洗脫液1得到純化物1為 0. 684g，其中桔皮素和川陳皮素的含量分別為18. 3%和55.8% ；從洗脫液2得到純化物2 為0. 32g，其中桔皮素和川陳皮素的含量分別為34. 5%和35. 6% ；柑桔多甲氧基黃酮的總回收率為45.9% ；其余步驟工藝同于實(shí)施例1。試驗(yàn)例1 (大孔樹脂對柑桔多甲氧基黃酮吸附率與洗脫率的篩選)參篩大孔樹脂的種類；AB-8、NKA-II、NKA-9、D-101、HPD100、HPD300、D312、DM312篩選的目標(biāo)篩選出對川陳皮素和桔皮素具有較高的吸附和洗脫率的樹脂。1)吸附液的預(yù)備分別以含川陳皮素單體5 10g/L的30 50%的乙醇溶液，和含桔皮素單體1. 9 3g/L的30 50%的乙醇溶液為吸附液，備用；2)樹脂吸附率的測定取上述兩種吸附液各20ml，分別加入已裝有經(jīng)預(yù)處理(方法先用95%的乙醇浸泡8 12h，用水洗凈乙醇，再用2%的NaOH溶液浸泡4 8h，水洗至中性，最后用5%的鹽酸溶液浸泡2 4h，水洗至中性即可)大孔吸附樹脂2 8g的容器中，經(jīng)搖床處理24h后，吸取上清液各10ml，分別蒸干后稱得殘?jiān)亓縓1和X2,以C1和C2 為吸附液中川陳皮素和桔皮素單體的原始重量，則樹脂吸附量分別為C1-X1和C2-X2,并計(jì)算出樹脂對兩種單體的吸附率；3)樹脂洗脫率的測定將步驟2)的樹脂浙干，先用10 20ml的蒸餾水洗滌1_2 次，以除去雜質(zhì)，再將70 100%的乙醇20ml為洗脫液加入樹脂中，經(jīng)搖床處理24h后，吸取IOml上清液、蒸干，稱得殘?jiān)亓縂1和G2,并計(jì)算解吸率；經(jīng)上述方法測定后，從參篩大孔樹脂中篩選出對柑桔多甲氧基黃酮吸附率與洗脫率均較高的大孔樹脂——AB-8、NKA-9、D-IOl和DM312。試驗(yàn)例2 (柑桔多甲氧基黃酮粗提物采用不同純化方法的效果比較)本例把本發(fā)明的純化效果與目前報(bào)道的各種純化方法的純化效果作一對比，具體見表2。其中，①、②、③為本發(fā)明實(shí)施例1、2、3的純化樣品，川陳皮素與桔皮素的含量分別為純化物1和純化物2中的含量，總含量指純化物1中兩種黃酮的總含量。表2多甲氧基黃酮不同純化該法的效果對比
權(quán)利要求
1.柑桔多甲氧基黃酮粗提物的提取與純化方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)柑桔多甲氧基黃酮的提取1)柑桔皮的預(yù)處理將柑桔皮干燥至含水量<5%，磨粉過30目篩后，備用；2)柑桔多甲氧基黃酮的粗提與萃取將柑桔皮粉和水按重量體積500g 5L比例拌勻，加熱到100°C提取lh、過濾得水提液；將水提液與正已烷按體積1 0.5比例混合、萃?。粚⑤腿∫涸?0°C下減壓蒸干，得到柑桔多甲氧基黃酮粗提物；(2)柑桔多甲氧基黃酮粗提物的柱層析純化；1)粗提物溶液的配制將柑桔多甲氧基黃酮粗提物5g溶解于30 50%乙醇溶液 500ml中，過濾后，備用；2)大孔樹脂裝柱把大孔樹脂裝入層析柱中至柱高15 25cm；3)大孔樹脂的吸附把粗提物溶液500ml，用蠕動泵以1 2.5ml/min流速流經(jīng)層析柱，并收集流出液；4)大孔樹脂的洗脫、收集與濃縮干燥以60 100%的乙醇溶液500ml為洗脫液，用蠕動泵以lml/min流速流經(jīng)層析柱后，以每40ml為一管進(jìn)行成分測定與收集，其中，將1至 6 7管的洗脫液合并得洗脫液1，把其余洗脫液合并得洗脫液2 ；將洗脫液1與2分別減壓濃縮、回收乙醇，殘留物烘干、粉碎后，分別得到以川陳皮素為主的純化物1和以桔皮素為主的純化物2。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔樹脂為AB-8、D-10UNKA-9和 DM312中的任選一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了柑桔多甲氧基黃酮的提取及純化方法，屬于農(nóng)副產(chǎn)品有效成分的提取及純化技術(shù)領(lǐng)域。方法包括(1)柑桔多甲氧基黃酮的提??；(2)柑桔多甲氧基黃酮粗提物的柱層析純化等步驟工藝。本發(fā)明粗提物中川陳皮素和桔皮素的含量可分別達(dá)到30.8％和22.7％；所選用的大孔樹脂對粗提物有較高的純化效果，其總含量可達(dá)74.1-82.1％，總回收率可達(dá)45.9-68.6％；且具設(shè)備簡單，工藝合理易行，成本低廉，產(chǎn)品能滿足食品、保健品等需要的特點(diǎn)。本方法可在柑桔產(chǎn)地與生化企業(yè)中推廣應(yīng)用。
文檔編號C07D311/40GK102344429SQ201110207429
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者夏其樂, 楊穎 , 邢建榮, 鄭美瑜, 陸勝民, 陳劍兵 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院