本發(fā)明涉及茶氨酸螯合物及其功能性茶飲料的制備方法，具體為一種L-茶氨酸鐵螯合物及制備方法和含該螯合物的速溶茶粉及制備方法。

背景技術(shù)：

鐵元素是人體內(nèi)必須的微量元素。鐵參與機(jī)體組織內(nèi)氧的正常運(yùn)輸，直接影響機(jī)體的能量和蛋白質(zhì)代謝，而且會(huì)影響人體的免疫機(jī)能。據(jù)調(diào)查，中國67.5％的孕婦會(huì)發(fā)生貧血，孕婦貧血的話會(huì)出現(xiàn)疲倦、乏力、頭暈、耳鳴、注意力不集中等癥狀。孕婦貧血對(duì)孕婦和胎兒來說危害性很大，如果嚴(yán)重貧血會(huì)導(dǎo)致胎兒缺氧，引起胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，早產(chǎn)甚至死亡。鐵以二價(jià)鐵(亞鐵)的形式吸收，而以三價(jià)鐵(正鐵)的形式起作用。補(bǔ)鐵劑的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段。第一代為有機(jī)亞鐵鹽類，如硫酸亞鐵、氯化亞鐵、碳酸亞鐵等。第二代為有機(jī)亞鐵鹽類，如乳酸亞鐵、檸檬酸亞鐵；第三代為氨基酸亞鐵，如甘氨酸亞鐵。目前國內(nèi)外使用的補(bǔ)鐵劑主要是第一、第二代產(chǎn)品。第一代產(chǎn)品性質(zhì)不穩(wěn)定，易潮解易氧化，有鐵腥味。第二代補(bǔ)鐵劑吸收利用率有較好提高，但會(huì)引起腸胃不良反應(yīng)。第三代產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定，口感好、利用率高，不刺激腸胃，但生產(chǎn)成本高。我國市場上已有多種氨基酸金屬螯合物產(chǎn)品問世，如母力鐵、紅亮素、佳樂美銅、蛋白微素精等。食品和營養(yǎng)科學(xué)研究表明，在食品中添加氨基酸亞鐵螯合物可明顯改善人體的血紅蛋白和血清血紅素水平，對(duì)貧血患者治療效果顯著。而且氨基酸亞鐵螯合物能增加鐵元素在動(dòng)物腸腔中的溶解度，大大促進(jìn)機(jī)體對(duì)亞鐵離子的吸收。

L-茶氨酸(L-Theanine)是茶葉中含量最高的氨基酸，約占游離氨基酸總量的50％以上，占茶葉干重的1％-2％。L-茶氨酸為白色針狀體，易溶于水。具有甜味和鮮爽味，是茶葉的滋味組分。L-茶氨酸含量約為新茶的1～2％左右，其含量隨發(fā)酵過程減少。L-茶氨酸本身還具有許多生理功能：(1)能影響腦內(nèi)神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)的變化，增強(qiáng)記憶力；(2)有鎮(zhèn)靜作用，可能預(yù)防神經(jīng)失調(diào)癥、失眠癥、經(jīng)期綜合癥等；(3)能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，可用于對(duì)腦栓塞、腦出血、腦中風(fēng)、腦缺血以及老年癡呆等疾病的防治；(4)有降血壓作用；(5)能增強(qiáng)抗癌藥物的療效；(6)能抑制癌細(xì)胞的漫潤；(7)能提高免疫力。1964年，日本批準(zhǔn)了L-茶氨酸為食品添加劑使用，而美國FDA也在1985年給予了L-茶氨酸GRAS的分類，意味著可以自由地用于各種食品中。而在中國L-茶氨酸應(yīng)用的進(jìn)展比較慢，直到2014年7月18日，衛(wèi)計(jì)委終于批準(zhǔn)了它作為新的食品原料。

早在20世紀(jì)70年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氨基酸和小肽具有促進(jìn)鐵吸收的作用，而且氨基酸和肽的金屬復(fù)合體如Fe、Zn和Mg的生物學(xué)利用率比無機(jī)鹽高，且無毒副作用。因此，開發(fā)兼具L-茶氨酸多種生理功能和微量元素高生物學(xué)利用率的的氨基酸螯合鐵保健品具有重要意義。無論是單一氨基酸還是用蛋白質(zhì)水解得到的復(fù)合氨基酸，當(dāng)其與金屬離子螯合時(shí)，螯合工藝大致相同，主要有：水體系合成法、微波固相法、室溫固相法及電解合成法。水體系合成法工藝周期長，螯合反應(yīng)溫度和pH較難控制，易被廢液污染，但產(chǎn)率較高。此工藝是氨基酸螯合微肥生產(chǎn)較為理想的選擇。微波固相法合成操作簡便省時(shí)，制得產(chǎn)品純度較高，但易產(chǎn)生副產(chǎn)物且在微波下易焦糊，很難大規(guī)模生產(chǎn)。室溫固相法主要用于納米材料的合成，對(duì)螯合原料純度要求較高。電解合成法昂貴又費(fèi)時(shí)。目前國內(nèi)外研究較多的是甘氨酸亞鐵、蛋氨酸亞鐵、酪氨酸亞鐵等，而對(duì)于L-茶氨酸與亞鐵離子的螯合物幾乎沒有相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種L-茶氨酸鐵螯合物及制備方法和含該螯合物的速溶茶粉及制備方法，生產(chǎn)成本較低，不受資源限制，環(huán)境污染小，可大量生產(chǎn)且產(chǎn)品比較安全。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種L-茶氨酸鐵螯合物的制備方法，以L-茶氨酸和亞鐵鹽為原料，以pH值為3-7的緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在30-80℃下混合，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液分離純化，獲得L-茶氨酸鐵螯合物；

所述L-茶氨酸與亞鐵鹽溶液質(zhì)量比為(4-1)：1；所述的L-茶氨酸由枯草芽孢桿菌發(fā)酵所產(chǎn)的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，以L-谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽為底物發(fā)酵制備得到。

優(yōu)選的，所述L-茶氨酸鐵螯合物具體制備步驟如下：

步驟1，合成L-茶氨酸原料液；

步驟2，將L-茶氨酸原料液脫色過濾后，濾液備用；

步驟3，在濾液中加入濾液體積10％的抗壞血酸用于防止亞鐵離子被氧化，攪拌后加入質(zhì)量濃度為20％的亞鐵鹽溶液；用檸檬酸調(diào)節(jié)至pH值為3-7，氮?dú)獯祾撸?0-80℃下攪拌10-30min進(jìn)行螯合反應(yīng)；

步驟4，螯合反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，進(jìn)行純化；將反應(yīng)液離心后，除去上清液，將沉淀用95％的乙醇洗滌抽濾多次，取濾餅干燥后得到L-茶氨酸鐵螯合物。

進(jìn)一步，所述的步驟1的具體步驟如下，

1.1將枯草芽孢桿菌接種在平板培養(yǎng)基上，在37℃下靜置培養(yǎng)16h進(jìn)行一次活化后，再轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基上進(jìn)行二次活化；將經(jīng)兩次活化好的枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液按體積分?jǐn)?shù)3％接種量轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)12-16h；

1.2收集振蕩培養(yǎng)的發(fā)酵液離心后得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液；采用分光光度計(jì)測定酶活，選取酶活0.01U/mL-0.2U/mL的粗酶液備用，進(jìn)行催化反應(yīng)；

1.3分別加入粗酶液質(zhì)量10％的L-谷氨酰胺和粗酶液質(zhì)量10％的乙胺鹽酸鹽溶液進(jìn)行催化反應(yīng)，L-谷氨酰胺的濃度為15-50mmol/L，乙胺鹽酸鹽的濃度為20-80mmol/L；用乙胺水調(diào)節(jié)催化反應(yīng)體系至pH值為10，37℃靜置培養(yǎng)5-8h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

再進(jìn)一步，步驟2中，加入L-茶氨酸原料液重量2％的活性炭進(jìn)行吸附脫色，反應(yīng)過程溫度為60-80℃，反應(yīng)時(shí)間為3-8min。

優(yōu)選的，所述亞鐵鹽為硫酸亞鐵或氯化亞鐵。

一種由本發(fā)明所述的方法制備得到的L-茶氨酸鐵螯合物。

一種含L-茶氨酸鐵螯合物的速溶茶粉制備方法，包括如下步驟，

步驟1，將本發(fā)明所述的L-茶氨酸鐵螯合物配制成質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10％-30％的溶液，添加營養(yǎng)物和賦形劑溶解后混合均勻；得到混合溶液；

步驟2，將混合溶液依次經(jīng)過濕熱滅菌和噴霧干燥，出粉后采用液化床冷卻，過篩后即獲得含L-茶氨酸鐵螯合物的速溶茶粉。

優(yōu)選的，濕熱滅菌的滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為15min；噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度為160-180℃，排風(fēng)溫度為80-85℃；過篩時(shí)篩孔的大小為60目。

優(yōu)選的，所述的營養(yǎng)物采用維生素C；所述的賦形劑采用麥芽糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇中的至少一種。

一種由本發(fā)明所述的方法制備得到的含L-茶氨酸鐵螯合物的速溶茶粉。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明采用微生物酶法制備L-茶氨酸，在此基礎(chǔ)上，采用水體系合成法螯合亞鐵離子和L-茶氨酸，得到L-茶氨酸鐵螯合物，生產(chǎn)成本低，環(huán)境安全性高，資源消耗少，能夠進(jìn)行大量安全生產(chǎn)。L-茶氨酸被評(píng)為“最值得開發(fā)的食品新材料”，其特有的生理功能與亞鐵離子補(bǔ)血功能相結(jié)合，不但能提高彼此的生物利用率，還能獲得清香茶風(fēng)味，在食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)具有廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明制備的L-茶氨酸鐵螯合率穩(wěn)定性高，如圖1所示；不會(huì)被胃酸或食物中的植物酸、草酸等破壞，因此不會(huì)受到食物的干擾而影響吸收，無任何毒副作用。

本發(fā)明所述的含L-茶氨酸鐵螯合物的速溶茶粉，作為保健茶，既有L-茶氨酸所含的茶香味和鮮爽味，又具有提高免疫力等多重功能。茶粉沖服成水飲品之后色澤清潤透亮、氣味香甜，茶香濃郁，飲用方便、口感極佳。

進(jìn)一步的，通過乙醇純化析出結(jié)晶，得到產(chǎn)品純度較好，含量可到95％以上，回收率為96％-99％，晶體質(zhì)地均勻，色澤純凈，質(zhì)量上佳。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)例中所述L-茶氨酸和L-茶氨酸鐵螯合物由紫外掃描儀U-1800得到的吸收光譜曲線。

圖中：a為L-茶氨酸的吸收光譜曲線，b為L-茶氨酸鐵螯合物的吸收光譜曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

實(shí)施例1

一種含L-茶氨酸鐵螯合物的速溶茶粉制備方法，包括如下步驟：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)16h，再轉(zhuǎn)接到3mL液體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液按體積分?jǐn)?shù)3％接種量轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)12h。

第二：收集發(fā)酵液于8000rpm離心25min，得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。采用分光光度計(jì)測定酶活。選取酶活0.01U/mL的粗酶液20mL備用進(jìn)行催化反應(yīng)。

第三：分別加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(濃度15mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度20mmol/L)溶液進(jìn)行催化反應(yīng)，用乙胺水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至pH10，37℃靜置培養(yǎng)5h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：將原料液過濾，除去雜質(zhì)。加入原料液重量2％的活性炭攪拌，進(jìn)行吸附脫色，反應(yīng)過程溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為3min。脫色后再次過濾，濾液備用。

第五：加入濾液體積10％的抗壞血酸防止亞鐵離子被氧化，攪拌后加入質(zhì)量濃度為20％的亞鐵鹽溶液，加入量為濾液質(zhì)量的25％，用檸檬酸調(diào)節(jié)至pH3，氮?dú)獯祾?，?0℃下攪拌10min進(jìn)行螯合反應(yīng)。采用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質(zhì)量及穩(wěn)定性。所述亞鐵鹽為氯化亞鐵。

第六：螯合反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻。將反應(yīng)液在4000rpm下離心20min，除去上清液，用適量無水乙醇處理得到沉淀，抽濾，收集濾餅。具體的，離心3次后，用體積濃度95％乙醇溶液洗滌抽濾3次，最后對(duì)濾餅真空冷凍干燥得L-茶氨酸鐵螯合物。真空冷凍干燥溫度為5℃-40℃，本具體實(shí)施例優(yōu)選5℃。

第七：制備L-茶氨酸鐵螯合物溶液(10％，w/v)、添加營養(yǎng)物維生素C和賦形劑麥芽糊精各5％(w/v)，蔗糖3％(w/v)溶解混勻。

第八：將上述混合液進(jìn)行濕熱滅菌(121℃，15min)，噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度160℃，排風(fēng)溫度80℃)，出粉后采用液化床冷卻，過60目篩，制粒，裝袋。

實(shí)施例2

一種含L-茶氨酸鐵螯合物的速溶茶粉制備方法，包括如下步驟：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)16h，再轉(zhuǎn)接到3mL液體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液按體積分?jǐn)?shù)3％接種量轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)16h。

第二：收集發(fā)酵液于8000rpm離心25min，得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。采用分光光度計(jì)測定酶活。選取酶活0.15U/mL的粗酶液20mL備用進(jìn)行催化反應(yīng)。

第三：分別加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(濃度30mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度50mmol/L)溶液進(jìn)行催化反應(yīng)，用乙胺水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至pH10，37℃靜置培養(yǎng)6h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：將原料液過濾，除去雜質(zhì)。加入原料液重量2％的活性炭進(jìn)行吸附脫色，反應(yīng)過程溫度為70℃，反應(yīng)時(shí)間為6min。脫色后再次過濾，濾液備用。

第五：加入濾液體積10％的抗壞血酸防止亞鐵離子被氧化，攪拌后加入質(zhì)量濃度為20％的亞鐵鹽溶液，加入量為濾液質(zhì)量的50％，用檸檬酸調(diào)節(jié)至pH5，氮?dú)獯祾?，?0℃下攪拌20min進(jìn)行螯合反應(yīng)。采用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質(zhì)量及穩(wěn)定性。所述亞鐵鹽為硫酸亞鐵。

第六：螯合反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻。將反應(yīng)液在4000rpm下離心30min，除去上清液，用適量無水乙醇處理得到沉淀，抽濾，收集濾餅。具體的，離心3次后，用體積濃度95％乙醇溶液洗滌抽濾4次，最后對(duì)濾餅真空冷凍干燥得L-茶氨酸鐵螯合物。真空冷凍干燥溫度為20℃。

第七：制備L-茶氨酸鐵螯合物溶液(25％，w/v)、添加營養(yǎng)物維生素C和賦形劑山梨醇各5％(w/v)，木糖醇3％(w/v)，乳糖3％(w/v)溶解混勻。

第八：將上述混合液進(jìn)行濕熱滅菌(121℃，15min)，噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度170℃，排風(fēng)溫度83℃)，出粉后采用液化床冷卻，過60目篩，制粒，裝袋。

實(shí)施例3

一種含L-茶氨酸鐵螯合物的速溶茶粉制備方法，包括如下步驟：

第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)16h，再轉(zhuǎn)接到3mL液體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液按體積分?jǐn)?shù)3％接種量轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)，隔夜培養(yǎng)14h。

第二：收集發(fā)酵液于8000rpm離心25min，得γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液。采用分光光度計(jì)測定酶活。選取酶活0.2U/mL的粗酶液20mL備用進(jìn)行催化反應(yīng)。

第三：分別加入粗酶液重量10％的L-谷氨酰胺(濃度50mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度80mmol/L)溶液進(jìn)行催化反應(yīng)，用乙胺水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至pH10，37℃靜置培養(yǎng)8h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。

第四：將原料液過濾，除去雜質(zhì)。加入原料液重量2％的活性炭進(jìn)行吸附脫色，反應(yīng)過程溫度為80℃，反應(yīng)時(shí)間為8min。脫色后再次過濾，濾液備用。

第五：加入濾液體積10％的抗壞血酸防止亞鐵離子被氧化，攪拌后加入質(zhì)量濃度為20％的亞鐵鹽溶液，加入量為濾液質(zhì)量的100％，用檸檬酸調(diào)節(jié)至pH7，氮?dú)獯祾?，?0℃下攪拌30min進(jìn)行螯合反應(yīng)。采用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質(zhì)量及穩(wěn)定性。所述亞鐵鹽為氯化亞鐵。

第六：螯合反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻。將反應(yīng)液在4000rpm下離心40min，除去上清液，用適量無水乙醇處理得到沉淀，抽濾，收集濾餅。具體的，離心3次后，用體積濃度95％乙醇溶液洗滌抽濾5次，最后對(duì)濾餅真空冷凍干燥得L-茶氨酸鐵螯合物。真空冷凍干燥溫度為40℃。

第七：制備L-茶氨酸鐵螯合物溶液(30％，w/v)、添加營養(yǎng)物維生素C和賦形劑甘露醇5％(w/v)，木糖醇3％(w/v)，蔗糖3％(w/v)溶解混勻。

第八：將上述混合液進(jìn)行濕熱滅菌(121℃，15min)，噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度180℃，排風(fēng)溫度85℃)，出粉后采用液化床冷卻，過60目篩，制粒，裝袋。

本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各方面的單個(gè)例子，本發(fā)明范圍還包括功能等同的方法和組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有脫離權(quán)利要求限定范圍的前提下，仍然可以對(duì)本發(fā)明做出各種改進(jìn)和變換，所做的改進(jìn)和變換仍然屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。