專利名稱：茶氨酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制造茶氨酸的新方法背景技術(shù)茶氨酸是已知的綠茶味道的主要成分，是以茶為代表的食品的重要的香料物質(zhì)。另外，有文獻(xiàn)指出，包括茶氨酸在內(nèi)的γ-谷氨酰胺衍生物，在動、植物體內(nèi)作為生理活性物質(zhì)發(fā)揮作用。例如，在Chem.Parm.Bull.，19(7)，1301-1307(1971)；同一刊物中的19(6)，1257-1261(1971)；同一刊物中的34(7)，3053-3057(1986)；藥學(xué)雜志，95(7)，892-895(1975)等文獻(xiàn)中，揭示了茶氨酸、谷氨酰胺等可抑制由咖啡因引發(fā)的抽搐的內(nèi)容。由此說明這些化合物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生作用，有望作為有效的生理活性物質(zhì)發(fā)揮作用。
一直以來，茶氨酸的常見制造方法是從生產(chǎn)含茶氨酸的玉露茶的茶園中得到的干茶葉中提取的方法。但由于茶氨酸在干茶葉中存量僅有1.5％左右，且由于一般煎茶用茶園的茶葉因活躍的光合作用會使茶氨酸迅速分解，所以，很難保證充足的產(chǎn)量。因此，從干茶葉提取茶氨酸的方法被指工業(yè)上不實(shí)用。
因此，人們對工業(yè)化生產(chǎn)方法的開發(fā)有所期待，其一就是化學(xué)有機(jī)合成茶氨酸的方法(Chem.Parm.Bull.，19(7)，1301-1308(1971))。但這類技術(shù)存在著有機(jī)合成反應(yīng)時(shí)收率低、合成產(chǎn)物分離、精制等時(shí)需要復(fù)雜操作的問題。
另外，還有利用谷氨酰胺酶的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，由谷氨酰胺、乙胺合成茶氨酸的酶法(日本特公平07-55154號公報(bào))。但該方法存在著因谷氨酰胺酶的水解反應(yīng)而在生成茶氨酸的同時(shí)，還生成副產(chǎn)物谷氨酸，而使茶氨酸的精制變得麻煩的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是考慮到上述情況而作出的發(fā)明，目的在于提供有效的茶氨酸制造方法，能使茶氨酸的生產(chǎn)變得簡單，并有利于工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明人等為解決上述問題，反復(fù)從自然界的土壤中分離、選定新型茶氨酸生產(chǎn)菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特定微生物所具有的谷氨酰胺酶與日本特公平07-55154中所揭示的硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)IFO 12694的谷氨酰胺酶相比，具有高茶氨酸合成活性和低谷氨酸合成活性，從而基本上完成了本發(fā)明。上述茶氨酸生產(chǎn)菌是本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)鑒定的新型菌株，名為香茅醇假單孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA(保藏機(jī)關(guān)名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心地址日本茨城縣筑波市東一丁目1番地中央第6，保藏日2002年7月31日，保藏編號FERM BP-8353)。
根據(jù)本發(fā)明，能提供高效的制造茶氨酸的新方法，能使茶氨酸的生產(chǎn)變得簡單，并有利于工業(yè)生產(chǎn)。


圖1為茶氨酸的IR光譜示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面，詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受限于下述實(shí)施方式，在不改變其要點(diǎn)的前提下，可做各種改變進(jìn)行實(shí)施。另外，本發(fā)明的技術(shù)范圍延及均等的范圍。
本發(fā)明的茶氨酸是指γ-谷氨?；野?、L-谷氨酸-γ-乙胺等。茶氨酸是茶的味道成分，是用于調(diào)味用途的食品添加劑。
本發(fā)明所用的香茅醇假單孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA，保藏編號FERM BP-8353)，是由本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的新菌株，屬于假單胞菌屬、香茅(citronellosis)種，是具有γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的茶氨酸生產(chǎn)菌。另外，本發(fā)明所用的香茅醇假單孢菌GEA的鑒定，是通過根據(jù)一定法則的菌類學(xué)性質(zhì)、生物化學(xué)性質(zhì)的分析和相當(dāng)于16s rRNA的DNA堿基序列與已知微生物的比較來進(jìn)行的。
本發(fā)明的谷氨酰胺酶是來自香茅醇假單孢菌GEA的酶。該反應(yīng)的酶活性源可直接使用活菌體或各種處理標(biāo)準(zhǔn)品，例如菌體磨碎物、超聲波處理菌體、溶劑處理菌體、低溫干燥菌體、硫酸銨鹽析物、精制酶標(biāo)準(zhǔn)品等，或上述制品的定形品。為高效進(jìn)行本發(fā)明的酶反應(yīng)，pH值范圍優(yōu)選為9～12、更優(yōu)選為10～11。而反應(yīng)溫度優(yōu)選為10～55℃、更優(yōu)選為25～35℃。
從如上所述而得的反應(yīng)液中分離精制茶氨酸采用公知方法。例如，可很容易地通過組合各種色譜(例如，溶劑分配色譜、HPLC等)進(jìn)行。
下面，通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例實(shí)施例1茶氨酸營養(yǎng)性菌(utilizing bacteria)的分離采用日本滋賀縣、京都府的土壤，配制成土壤懸濁液后，利用以茶氨酸為碳源的選擇培養(yǎng)基，其中，茶氨酸0.5％、酵母提取物0.03％、KH2PO40.05％、K2HPO40.05％、MgSO4·7H2O 0.03％、pH為7，進(jìn)行3次傳代培養(yǎng)，分離100株茶氨酸營養(yǎng)性菌。
實(shí)施例2無細(xì)胞提取液的配制在1升實(shí)施例1的選擇培養(yǎng)基中，分別將100株茶氨酸營養(yǎng)性菌在30℃下培養(yǎng)20小時(shí)。然后收集菌體并洗凈，懸濁在50毫升30mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，在5℃～20℃下超聲波破碎，得到無細(xì)胞提取液。
實(shí)施例3酶反應(yīng)使用實(shí)施例2的無細(xì)胞提取液，在含谷氨酰胺0.3M、乙胺0.6M的100mM硼酸緩沖液(Na2B4O7-NaOH、pH11)中，在30℃下進(jìn)行24小時(shí)的酶反應(yīng)，合成了茶氨酸。
實(shí)施例4茶氨酸合成活性、谷氨酸合成活性的測定將實(shí)施例3中進(jìn)行了茶氨酸合成的酶反應(yīng)液適當(dāng)稀釋，通過進(jìn)行逆相HPLC，分別對茶氨酸、谷氨酸的合成量進(jìn)行定量。分析條件如下。分析柱使用Develosil ODS HG-5(野村化學(xué)(株))，檢測儀使用Waters 2487DualλUV/VIS(Waters社制)檢測儀。而內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用煙酰胺(Nacalai Tesque，Inc.)。移動相使用以純水∶甲醇∶三氟乙酸＝980∶20∶1的比例混合的混合物。
比較例1將硝基還原假單胞菌的無細(xì)胞提取液用作100株茶氨酸營養(yǎng)性菌的對照菌株，進(jìn)行茶氨酸合成活性與谷氨酸合成活性的測定。
試驗(yàn)例1以茶氨酸合成活性為標(biāo)準(zhǔn)，從茶氨酸營養(yǎng)性菌群中選擇高茶氨酸生產(chǎn)菌用實(shí)施例2的方法分別調(diào)制實(shí)施例1中分離的100株茶氨酸營養(yǎng)性菌各菌株的無細(xì)胞提取液，用實(shí)施例3的方法進(jìn)行酶反應(yīng)，用實(shí)施例4的方法測定茶氨酸的合成量。結(jié)果與成功得到1種與以往報(bào)告的硝基還原假單胞菌茶氨酸合成活性相比，具有4倍以上高活性的新型茶氨酸生產(chǎn)菌的菌株。
表1

單位mM(h·mg)實(shí)施例5新型茶氨酸生產(chǎn)菌的鑒定按照一定法則，將試驗(yàn)例1所得新型茶氨酸生產(chǎn)菌的菌類學(xué)性質(zhì)、生物化學(xué)性質(zhì)，對下述項(xiàng)目，即革蘭氏染色、細(xì)胞形態(tài)、過氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))、硝酸鹽還原活性、吡嗪酰胺酶、吡咯烷酮酰芳基酰胺酶(pyrrolidonyarylamidase)、堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶、尿素酶、明膠液化能力、七葉苷利用能力、葡萄糖利用能力、核糖利用能力、木糖利用能力、甘露醇利用能力、麥芽糖利用能力、乳糖利用能力、蔗糖利用能力、糖原利用能力進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)這些試驗(yàn)的結(jié)果，參照Bergey′s manual(第8版)的結(jié)果，得出菌屬是假單孢菌屬(Pseudomonas)的結(jié)論。
另外，決定相當(dāng)于16s rRNA的DNA堿基序列，與已知微生物的同序列比較。結(jié)果，本菌株鑒定為假單孢菌屬(Pseudomonas)，香茅(citronellosis)種，是一種新菌種，據(jù)此命名為香茅醇假單孢菌GEA。
實(shí)施例6香茅醇假單孢菌GEA培養(yǎng)條件的最優(yōu)化本發(fā)明人等研究了使用實(shí)施例1中的菌選擇培養(yǎng)基(碳源茶氨酸)之外的碳源的培養(yǎng)基的香茅醇假單孢菌GEA的培養(yǎng)。在研究了谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖、甘油等碳源后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甘油時(shí)能達(dá)到最佳結(jié)果。而在研究了培養(yǎng)基中的甘油濃度后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3％甘油濃度下，可得到具有最佳茶氨酸合成活性的無細(xì)胞提取液。同時(shí)，在研究了酵母提取物濃度后發(fā)現(xiàn)，0.3％時(shí)可得到具有最佳茶氨酸合成活性的無細(xì)胞提取液。
表2

單位mM/(h·mg)實(shí)施例7使用來自香茅醇假單孢菌GEA的無細(xì)胞提取液的酶反應(yīng)條件的最優(yōu)化按照實(shí)施例1中的酶反應(yīng)條件，研究使用來自香茅醇假單孢菌GEA的無細(xì)胞提取液時(shí)的谷氨酰胺、乙胺的各種濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用0.3M谷氨酰胺與0.9M乙胺反應(yīng)48小時(shí)可得到最大的茶氨酸合成量。
表3

The茶氨酸，Glu谷氨酸，()內(nèi)是反應(yīng)時(shí)間(單位小時(shí))，單位mM實(shí)施例8使用香茅醇假單孢菌GEA制造茶氨酸使用20升含有3.0％甘油、0.3％酵母提取物、0.05％KH2PO4、0.05％K2HPO4、0.03％MgSO4·7H2O的培養(yǎng)液，在容積30升的發(fā)酵罐(30℃、轉(zhuǎn)速2000rpm)中將香茅醇假單孢菌GEA培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)后，利用離心分離收集菌體并洗凈，得到180g菌體。
使用10g配制的菌體，以0.3M谷氨酰胺、0.9M乙胺、pH10、30℃的條件進(jìn)行酶反應(yīng)，24小時(shí)后得到每升40g的茶氨酸。從反應(yīng)液中分離精制茶氨酸是通過從反應(yīng)液中除去菌體后，通過Dowex 50×8、Dowe×1×2譜柱，用乙醇處理而施行的。
用氨基酸分析儀與紙色譜分析法分析該分離物，結(jié)果顯示出與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同樣的特性。而當(dāng)用鹽酸或谷氨酰胺酶進(jìn)行水解處理后，會按照1∶1的比例產(chǎn)生谷氨酸與乙胺。由于利用谷氨酰胺酶可使該分離物水解，所以表明乙胺結(jié)合在谷氨酸的γ位。另外，還利用谷氨酸脫氫酶(GluDH)確認(rèn)水解生成的谷氨酸為L型。圖1表示茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的IR光譜。分離物得到與圖1的IR光譜同樣的光譜。根據(jù)上述結(jié)果可以確認(rèn)分離物為茶氨酸。
實(shí)施例9使用來自香茅醇假單孢菌GEA的谷氨酰胺酶的固定化酶制造茶氨酸(1)無細(xì)胞提取液的采取洗凈160g實(shí)施例8得到的菌體后，懸濁于2升30mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，以5℃～20℃下超聲波破碎，得到無細(xì)胞提取液。
(2)硫酸銨分級分離(fractionation)在2升上述(1)所得無細(xì)胞提取液中，用7％氨水將pH值調(diào)至7，同時(shí)加入硫酸銨。在得到35％飽和溶液的階段，利用離心分離除去沉淀，再添加硫酸銨。在得到90％飽和溶液的階段放置一夜，由離心分離回收沉淀，將其溶于0.01M磷酸鉀緩沖液，對該緩沖液進(jìn)行透析，得到透析酶液。
(3)使用DEAE-纖維素色譜柱的精制以0.01M磷酸鉀緩沖液緩沖上述(2)所得的透析酶液。然后使之吸附于DEAE-纖維素柱(15×60cm)，用含有0.1M食鹽的緩沖液洗提谷氨酰胺酶。結(jié)果得到800mg谷氨酰胺酶部分精制(partially purified)品。
(4)固定化谷氨酰胺酶的制備預(yù)先對以水膨潤的市售固定化載體Chitopearl 3510(富士紡織(株))充分水洗，然后用0.1M磷酸鈉(pH6.8)平衡。將該濕潤載體2g懸濁于5ml含35mg上述(3)制備的谷氨酰胺部分精制品的20mM磷酸鈉(pH6.8)中，在4℃下攪拌一夜。然后添加戊二醛使最終濃度為2.5％(V/V)，在4℃下放置3小時(shí)使之交聯(lián)。用0.1M磷酸鈉(pH6.8)充分洗凈根據(jù)上述操作而得的固定化酶，在4℃下保存。
(5)由固定化谷氨酰胺酶引起的酶反應(yīng)在上述(4)所制備的固定化谷氨酰胺酶中，以30℃、SV＝0.2的流速使基質(zhì)溶液(4％谷氨酰胺、25％乙胺、pH10.0)通過后，能得到收率65％的茶氨酸。從反應(yīng)液中分離精制茶氨酸是通過使反應(yīng)液通過Dowex 50×8、Dowex 1×2譜柱，用乙醇處理而進(jìn)行。
用氨基酸分析儀與紙色譜分析法分析該分離物，結(jié)果顯示出與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同樣的特性。而當(dāng)用鹽酸或谷氨酰胺酶進(jìn)行水解處理后，會按照1∶1的比例產(chǎn)生谷氨酸與乙胺。由于利用谷氨酰胺酶可使該分離物水解，所以表明乙胺結(jié)合在谷氨酸的γ位。另外，還利用谷氨酸脫氫酶(GluDH)確認(rèn)水解生成的谷氨酸為L型。經(jīng)過茶氨酸的IR光譜分析后，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和分離物都得到與實(shí)施例8同樣的光譜。因此可確認(rèn)分離物為茶氨酸。
權(quán)利要求
1.茶氨酸的制造方法，其特征在于，使用香茅醇假單孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA)。
2.如權(quán)利要求1所述的茶氨酸制造方法，其特征在于，使用來自香茅醇假單孢菌GEA(Pseudomonas citronellosis GEA)的谷氨酰胺酶。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供高效的茶氨酸制造方法，能使茶氨酸的生產(chǎn)變得簡單，并有利于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明人等從自然界的土壤中分離、選定的香茅醇假單孢菌GEA是屬于假單胞菌屬香茅(citronellosis)種，具有γ－谷氨酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的茶氨酸生產(chǎn)菌。通過在9～12的pH值的條件下將來自上述生產(chǎn)菌的谷氨酰胺酶用于谷氨酰胺和乙胺混合物，能以與現(xiàn)有方法相比非常高的效率制造茶氨酸。
文檔編號C12P13/02GK1688705SQ03821300
公開日2005年10月26日 申請日期2003年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月6日
發(fā)明者立木隆, 岡田幸隆, 小關(guān)誠, 大久保勉, L·R·朱內(nèi)賈, 山崎長宏 申請人:太陽化學(xué)株式會社