專利名稱：獲得活的人肝細胞,包括肝干/祖細胞的方法
背景技術(shù)：
正常的肝通過修復(fù)或替換受傷組織而使自身具有再生的能力。盡管有這種保護，但是一旦關(guān)鍵的肝細胞塊由于疾病或損傷死亡，該肝就會衰竭，從而導(dǎo)致疾病或死亡。肝衰竭是嚴重的健康問題，在美國每年大約有300,000人因為慢性肝疾病而住院治療，且30,000人死亡。現(xiàn)在，治療許多肝病的唯一方法是肝移植，但是，在美國每年只有約5,000個捐贈肝可以使用。到2002年5月，大約有18,000個患者在等待肝移植，比過去四年增加了100％，而十年前為1,700個。另外，在美國大約有100,000個成年人正患有嚴重的肝硬化和其它形式的慢性肝衰竭，這些人都會成為肝移植的候選人。
由于捐贈器官的短缺，因此等待可利用的捐贈肝的需要肝移植的患者經(jīng)常不得不等待數(shù)年?，F(xiàn)今，全器官肝移植步驟需要捐贈者的大腦已經(jīng)死亡而心臟仍然在跳動。這種情況的發(fā)生率只占醫(yī)院死亡的約1-2％。很顯然，大部分的肝疾病患者不能依靠器官移植作為解決方法，迫切需要新的技術(shù)來滿足肝損傷的患者。
肝的再生能力表明肝細胞移植可能可以有效地改變?nèi)蔚耐灰浦?。將捐贈的肝細胞注入到肝病患者體內(nèi)，其可能會重建該受體的肝(和/或脾，只要注入到該器官中)并恢復(fù)功能。但是成熟肝細胞移植后的成活期限和擴增數(shù)量并不確定。
傳統(tǒng)理論認為所有成熟的成人肝細胞都能夠分化很多次，而使器官在損傷后再生。然而，對來源于肝的器質(zhì)性細胞的再生潛力的范圍有越來越多的關(guān)注。在研究嚙齒動物的肝細胞時，發(fā)現(xiàn)周邊區(qū)的成熟肝細胞在任何情況下都能完成有限次數(shù)的細胞分化。門靜脈周圍的成人肝細胞，有時也稱“小肝細胞”具有更強的再生能力，但也只能完成有限次數(shù)的細胞分化。最強的再生能力存在于一小群具有干或祖樣屬性的二倍體間質(zhì)細胞中，其能廣泛增殖并產(chǎn)生成熟肝細胞。[Kubota H和Reid LM.2000.Clonogenic hepatoblasts，common precursors forhepatocytic and biliary lineages，are lacking classical majorhistocompatiblity complex class I antigen.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences(USA)9712132-12137]肝干/祖細胞是屬于干細胞系的不成熟細胞群落，但其不具有成熟干細胞的大部分功能。然而，它們既能廣泛地增生，還能產(chǎn)生完全分化的不具有肝功能的子代細胞。對嚙齒動物模型進行研究表明，存在于胎兒和成人肝中的干/祖細胞至少具有兩種潛能，即它們的后代包括兩種細胞型，命名為肝實質(zhì)細胞和膽管細胞。[Kubota H和Reid LM.2000.Clonogenic hepatoblasts，common precursors for hepatocytic andbiliary lineages，are lacking classical major Histocompatiblity complexclass I antigen.Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)9712132-12137.]在成人肝中，該干/祖細表明參予肝的再生，并在某種類型的肝損傷使受體的成熟肝細胞遭破壞或增生能力下降時廣泛地再建宿主肝。
從成人肝中分離肝實質(zhì)細胞，然后灌輸?shù)剿拗鹘M織中。在過去的30年中，積累了大量的科技文獻，這些文獻驗證了這些灌輸?shù)母螌嵸|(zhì)細胞存活、增生、發(fā)揮功能和參予再生過程的能力。已經(jīng)表明將肝實質(zhì)細胞移植到脾或肝中，能糾正許多動物模型在新陳代謝方面的遺傳性缺陷，能在宿主的肝細胞受損或壽命減少時完全地重建宿主肝(如在FAH缺陷的鼠模型中)，能在不同的傷害導(dǎo)致急性肝衰竭過程中發(fā)揮肝功能，能改善肝功能并能延長CCl4誘導(dǎo)的硬化模型動物的存活時間。
文獻中的病例研究和病例報告描述了向患者用肝細胞給藥的研究，其中的患者患有不同急性和慢性、遺傳性和獲得性肝病，年齡40歲以上。[Strom SC，Chowdhury JR，和Fox IJ.1999.Hepatocytetransplantation for the treatment of human disease(Review).Seminars inLiver Disease 1939-48.]大量這些報告的數(shù)據(jù)表明上述細胞確實能移植、存活并發(fā)揮作用幾個月。在一研究中，清蛋白水平和凝血時間得到提高，這表明了移植后四到六個月肝的綜合能力得到提高。表明移植的肝細胞的嫁接和功能的最佳公開報道涉及一10歲女孩，該女孩患有克果納杰氏癥(Crigler Najjar syndrome)，一種遺傳性疾病，患該疾病的個體缺乏與膽紅素鰲合的UDP葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，于是導(dǎo)致嚴重的黃疸。Fox等.，″Treatment ofthe Crigler-Najjar Syndrome.Type I withhepatocyte transplantation，″New England Journal Of Medicine，(1998)3381422-1426。在移植后18個月內(nèi)，該個體膽汁中的鰲合膽紅素的分泌明顯增加，她的肝組織切片中的酶活性提高，對紫外線光線治療的需求減小。然而，這些使用肝細胞移植的在先實驗都只產(chǎn)生短時間的效果，成熟肝細胞有限的增生能力必然地限制了單獨用肝細胞治療的有效時間。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用本發(fā)明的細胞群可以克服治療肝病的在先嘗試所存在的上述問題，本發(fā)明的細胞群富集活的功能性肝細胞。本發(fā)明的這些細胞具有廣泛的增生能力，從而使組織再生最大化和使進行成功移植所需細胞的劑量降低。干/祖細胞的存在也提高了肝細胞治療的有效時間，因為相對于成熟肝細胞，它們存活、增生、發(fā)揮功能和參予再生過程的能力得到了提高。
如果肝細胞療法在商業(yè)上變?yōu)楝F(xiàn)實，并成為大量患者可行的治療選擇，那么必須足量提供肝組織。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的方法獲得的細胞可以來源于某個器官捐贈者的肝，由于時間/運輸?shù)南拗?，該肝不適于全器官移植或不能及時使用。用本發(fā)明的方法可以從肝中分離得到活的功能性肝細胞，該肝根據(jù)常規(guī)的教導(dǎo)并不適于同位移植或制備大量的用于細胞移植的成熟肝細胞。更重要的是，用本發(fā)明的方法純化人肝細胞，包括干/祖細胞能顯著地擴增捐贈池(donor pool)而用于肝細胞治療。而且，由于干/祖細胞對缺血性損傷具有明顯的相對抗性，因此用本發(fā)明可以從許多心博停止(如無心跳)的捐贈者中得到這些細胞。
本發(fā)明的分離方法確保了低溫保存的細胞混合物中含有來源于捐贈肝的活的功能性肝細胞。該方法從捐贈的全人肝中或其切片中(與天然肝制劑相比)分離出含有更高比例活肝細胞的懸液，并去除了死細胞和沒有完全衰竭的碎片，保留了小的肝干/祖細胞群落。獲得的這些細胞群落在冷凍保存前可以含有高于80％的活細胞，在融化后含有高于70％的活細胞，且有75％以上的細胞是肝細胞。
相反，已知的肝細胞分離方法使用低速離心，在許多情況下通過含有Percoll的介質(zhì)來富集肝細胞(離心后的團粒)。雖然用該方法來分離大的活肝細胞，特別是較大肝細胞是非常有效的，但是其使肝干/祖細胞大量衰竭，而且大量的較小成人肝細胞丟失。
本發(fā)明提供了藥物學(xué)質(zhì)量的肝細胞移植或細胞治療的產(chǎn)品和獲得大量活的功能性肝細胞群，包括肝干/祖細胞的方法，以前該肝細胞群是通過常規(guī)方法獲得的，因此，本發(fā)明滿足了上文所述的需要，推動了肝細胞移植或細胞治療方面的研究。本發(fā)明的肝細胞移植或細胞治療產(chǎn)品包括品質(zhì)優(yōu)良的含有肝干/祖細胞及其它在肝中可以發(fā)現(xiàn)的細胞類型的肝細胞混合物。
發(fā)明的簡要描述本發(fā)明涉及獲得富集有活的人肝細胞的細胞群落的方法，該方法包括用蛋白水解酶制劑消化整個人肝或其切片以得到消化了的整個人肝或其切片；離解消化了的整個人肝或其切片以得到細胞懸液；調(diào)整該細胞懸浮介質(zhì)的密度以在離心時在密度屏障的作用下產(chǎn)生至少兩條分離的細胞帶，該至少兩條帶中至少有一條的密度低于該至少兩條帶中的另一條帶的密度；收集該至少一條較低密度帶以獲得富集有活的人肝細胞，包括肝干/祖細胞的細胞群落。
在本發(fā)明的另一具體實施方案中，提供了獲得富集有活的人肝細胞，包括肝干/祖細胞的細胞群落的方法，該方法包括用蛋白水解酶制劑消化整個人肝或其切片以得到消化了的整個人肝或其切片；分離消化了的整個人肝或其切片以得到細胞的懸液；調(diào)整該細胞懸浮介質(zhì)的密度以在離心時產(chǎn)生至少一條細胞帶，該至少一條細胞帶的密度比細胞或細胞碎片的團粒的密度低；和收集該至少一條較低密度帶以獲得富集有活的人肝細胞，包括肝干/祖細胞的細胞群落。本發(fā)明其它的具體實施方案包括但不限于還含有功能性肝細胞、功能性膽管細胞、功能性造血細胞或其組合的細胞群落。
在本發(fā)明的其它具體實施方案中，上述肝或其切片可以從心臟跳動的或心博停止的初生兒、幼年、少年或成年捐贈者中獲得。具體地，通過本發(fā)明的方法獲得的細胞可以來源于經(jīng)歷過一段時間的溫缺血或從心博停止的捐贈者中獲得的捐贈肝。
本發(fā)明還涉及組合物，該組合物含有富集有活的功能性肝細胞的肝細胞群落，該細胞群落含有功能性肝細胞和肝干/祖細胞。在本發(fā)明的特定具體實施方案中，該富集的細胞群落富集有直徑約為9-13微米，陽性表達EP-CAM(也稱作GA733-2、C017-1A、EGP40、KS1-4、KSA)、CD133或兩者的肝干/祖細胞。
在其它具體實施方案中，本發(fā)明涉及到含有肝細胞群落的組合物，與從肝中獲得的天然細胞懸液相對應(yīng)，該肝細胞群落富集有活的功能性肝實質(zhì)細胞和肝干/祖細胞。在又一具體實施方案中，該組合物還含有膽管細胞。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的細胞群落的膽管細胞陽性表達細胞角質(zhì)蛋白-19(CK-19)，陰性表達請蛋白。
本發(fā)明還涉及到治療肝病的方法，該方法包括用有效量的富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的細胞群給藥。本發(fā)明包括各種給藥方式，包括但不限于通過脾動脈或門靜脈注入，直接注入到肝髓中，通過肝被膜注入或直接注入到脾中。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明涉及到藥物組合物，該組合物含有富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的肝細胞群和藥物學(xué)上可接受的載體。在另一具體實施方案中，該藥物學(xué)上可接受的載體可以包括防腐劑，如HYPOTHERMOSOLTM。
在又一具體實施方案中，本發(fā)明涉及到在體外進行毒性測試的方法，該方法包括將富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的肝細胞群暴露于測試試劑，然后觀察該測試試劑對肝細胞群可能產(chǎn)生的至少一種效果(如細胞生存能力，細胞功能或兩者)。本發(fā)明還涉及在體外進行藥物代謝研究的方法，該方法包括將富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的肝細胞群暴露于測試試劑，并在預(yù)定的測試時間后觀察該測試試劑有關(guān)的可能產(chǎn)生的至少一種改變。該至少一種改變包括但不限于該測試試劑的結(jié)構(gòu)、濃度或兩者發(fā)生變化。
本發(fā)明的另一具體實施方案涉及肝輔助裝置，該裝置包括裝有富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的肝細胞群落的小室。該肝細胞可以包括人肝細胞或豬肝細胞。
本發(fā)明還涉及治療基因表達錯誤的方法，該方法包括將功能性基因拷貝導(dǎo)入到包含有活的功能性肝干/祖細胞的人肝細胞群中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化群落，將該轉(zhuǎn)化群落的至少一部分導(dǎo)入到需要該功能性基因拷貝的患者的肝中。本發(fā)明上述方法所使用的組合物是本發(fā)明的另一具體實施方案。
本發(fā)明提供的其它方法包括促進受傷或疾病肝的再生的方法，治療肝感染的有效試劑的測試方法，制備有益蛋白的方法和制備有益疫苗的方法。
在測試治療肝感染的有效試劑的方法中，用目標(biāo)感染試劑感染人肝細胞群落，然后，將該受感染的群落暴露于預(yù)定量的測試試劑，觀察該暴露對受感染的群落可能產(chǎn)生的影響。在制備有益蛋白的方法中，將編碼該有益蛋白的功能性基因?qū)氲胶懈胃?祖細胞的肝細胞群落中，然后將產(chǎn)生的細胞群落在合適條件下培養(yǎng)以使有效地產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄、翻譯和任選的翻譯后修飾，接著收集該目的蛋白。還可以制備疫苗產(chǎn)品，將重組病毒或病毒粒子導(dǎo)入到含有肝干/祖細胞的細胞群落中，該病毒或病毒粒子至少能感染該細胞群落的一些成員而使該受感染的成員表達抗原，于是在向個體導(dǎo)入該群落的受感染成員時產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其中的個體需要免疫來對抗向與該抗原有關(guān)的感染性試劑的進一步暴露。
除非另有說明，實施本發(fā)明將會使用細胞生物學(xué)、細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)方面的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。描述這些技術(shù)的文獻見，如MolecularCloning A Laboratory Manual，第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；DNA Cloning，卷I和II(D.N.Glover編，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Mullis等，美國專利No4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins編.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins編.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；論文Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos編，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vol.154和155(Wu等編)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker編，Academic Press，London，1987)；Handbook of ExperimentalImmunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)；Applications and Products 2001Density Gradient Media(Axis-Shield PoC AS，Oslo，Norway，2001)。
通過結(jié)合附圖對本發(fā)明進行如下詳細描述，本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將會更清楚，該附圖以舉例的方式闡述了本發(fā)明的原理。
附圖的簡要說明

圖1顯示了對新的OptiPrepTM分離方法用粒子計數(shù)器測得的大小曲線，其顯示了兩個細胞波峰我們指定為相對“小”(一般為9-13uM)和相對大(一般為18-22uM)的細胞。該“小”細胞群含有干/祖細胞，這些細胞大小大約為10uM；圖2顯示了對標(biāo)準(zhǔn)(常規(guī))的Percoll方法用粒子計數(shù)器測得的大小曲線，其顯示了在Percoll團粒(100×g)中較大細胞(直徑為18-22uM)的相關(guān)量比相應(yīng)的上清(300×g)中要多；圖3顯示了用FACS分析和接下來的人EP-CAM抗體特異性免疫著色的結(jié)果，該結(jié)果表明Percoll團粒(100×g)含有的EP-CAM陽性著色細胞(左圖，0.12％的EP-CAM群(+))比起始材料(右圖，0.76％的EP-CAM群(+))少6倍；圖4顯示了用FACS分析和接下來的人EP-CAM抗體特異性免疫著色的結(jié)果，該結(jié)果表明OptiPrepTM組分對EP-CAM陽性著色細胞群的總數(shù)沒有明顯的影響(在分離的和未分離的樣品中分別含有3.07％和3.06％的EP-CAM陽性著色細胞群)；圖5顯示了與常規(guī)方法的上清(中圖)及常規(guī)方法的團粒(右圖)相比較的本發(fā)明的細胞分離物中的EP-CAM陽性細胞的相關(guān)群落(左圖)圖，結(jié)果來自九月齡捐贈者；圖6顯示了與常規(guī)方法的上清(中圖)及常規(guī)方法的團粒(右圖)相比較的本發(fā)明的細胞分離物中的EP-CAM陽性細胞的相關(guān)群落(左圖)圖，結(jié)果來自三歲齡捐贈者；圖7顯示的圖證實了在免疫選擇后富含EP-CAM陽性細胞；
圖8顯示的圖證實了在免疫選擇后富含EP-CAM陽性細胞；圖9顯示了在不同著色條件下由單細胞生長形成的克隆的顯微照片，證實了本發(fā)明的方法分離的細胞是肝干/祖細胞；圖10顯示了在不同著色條件下由單細胞生長形成的克隆的顯微照片，證實了本發(fā)明的方法分離的細胞是肝干/祖細胞；圖11顯示了在NOD-SCID鼠中微載體珠上的人肝細胞的顯微照片；圖12顯示了在比圖11的顯微照片功率低的情況下拍得的顯微照片，從中可以看到大的已被宿主脈管化的肝細胞所形成的島，如紅血細胞所證實的那樣；圖13證明了本發(fā)明的肝干/祖細胞能熟化為肝細胞并表現(xiàn)成熟的表型，顯示了它們的細胞質(zhì)對肝糖陽性著色。要注意的是細胞出現(xiàn)了明顯的組織化形成髓；圖14顯示了本發(fā)明獲得的與注射到宿主中的微載體結(jié)合的三種肝細胞。黑框畫于兩種相鄰細胞的交界處。區(qū)域放大圖顯示了結(jié)構(gòu)、微絨毛、膽小管和另一種成熟細胞標(biāo)記。
圖15是顯微照片，證實了本發(fā)明冷藏的人肝細胞嫁接到NOD-SCID鼠的肝中。在移植后兩小時，通過原位雜交在門靜脈和竇狀腺中可清楚地看見人細胞，但是它們?nèi)匀粵]有通過脈管間隙進入到肝實質(zhì)組織中。
圖16是顯微照片，證實了本發(fā)明冷藏的人肝細胞嫁接到NOD-SCID鼠的肝中。在移植后40天，人肝細胞不僅駐留在肝中，還嫁接到肝細胞板中并完全整合到肝實質(zhì)組織中。
本發(fā)明的詳細描述部分地，本發(fā)明涉及獲得富集有活的功能性肝實質(zhì)細胞和肝干/祖細胞的細胞群落的方法。本發(fā)明的另一方面涉及鑒定肝干/祖細胞的方法。本發(fā)明下文所述的的具體實施方案將揭露從成人肝中鑒定和分離肝干/祖細胞的重要優(yōu)點。
鑒定從人胎兒肝中分離的肝干/祖細胞所表達的幾種細胞表面蛋白，發(fā)現(xiàn)在幼年、少年和成年人肝中只有小百分比的細胞表達同樣的抗原。利用磁性細胞分選技術(shù)大量地富集表達一種表面抗原的細胞，用這種方法分離細胞的平均大小比成熟肝細胞要小得多，相反，以前研究的嚙齒動物肝干/祖細胞是大的(比成熟實質(zhì)細胞大的)、嗜酸的肝細胞和肝儲存細胞(美國專利No.5,559,022)。另外，大部分的這種細胞還表達具有肝干/祖細胞特性的另一種抗原。當(dāng)在嚙齒動物肝干/祖細胞能生長，而較成熟肝細胞限制生長的嚴格選擇條件下培養(yǎng)時，該分選的成人細胞表現(xiàn)出生長潛能增強。更明顯地，對該分選群落的單細胞生長克隆進行分析證實表達的蛋白具有肝和膽管細胞系特性，如同雙潛能肝干/祖細胞。
在本發(fā)明中，突出的特點是在肝(來自無心跳的捐贈者)中保留有表達特征表面抗原的細胞，該肝在收集前已經(jīng)受了幾小時的嚴重缺氧。事實上，該肝干/祖細胞比天然肝細胞對缺血具有強得多的抗性。另外，雖然來自心博停止的全肝細胞制品一般含有大量的與細胞損傷和炎性反應(yīng)有關(guān)的細胞，但是仍然可以用本發(fā)明的方法高度富集活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方案中，利用免疫選擇和磁性分選技術(shù)更進一步地從肝中分離或除去選定的細胞類型。
本發(fā)明用來富集活的功能性人肝細胞的方法可以直接用于全肝細胞制品或由肝切片制備的制品。該方法迅速且具有合適的細胞產(chǎn)量和存活率，可以用來制備上千萬的細胞。該分離的細胞可以容易地冷藏且在解凍時仍然存活。
本發(fā)明證實，活的肝細胞可以從不同的肝來源中得到，包括從其肝不能用于全器官移植的無心跳的捐贈者中死后分離得到。由于本發(fā)明的肝細胞群落可以從心博停止的捐贈者中獲得，因此本發(fā)明顯著地擴展了適于進行肝細胞移植或細胞治療的捐贈器官的來源。表1列出了從心跳的和心博停止的捐贈者中分離的產(chǎn)量。
表1有心跳的捐贈者消化后產(chǎn)量細胞總數(shù)(109) 存活率范圍7.7-81.7 25-74平均值32.757處理后產(chǎn)量細胞總數(shù)(109) 存活率范圍1.2-30.7 76-99平均值15.086心博停止的捐贈者消化后產(chǎn)量細胞總數(shù)(109) 存活率范圍01-26.2 11-51平均值10.734處理后產(chǎn)量細胞總數(shù)(109) 存活率范圍0.01-11.0 64-99平均值5.0 86
本發(fā)明的分離方法及與標(biāo)準(zhǔn)(常規(guī))方法的比較通過用LiberaseTM，膠原酶的一種純化形式灌注組織而從全捐贈肝或其切片中分離得到細胞，收集得到的細胞懸液。使用兩種方法檢測以將活細胞與死細胞分開。在本發(fā)明的新方法中，將等份的細胞懸液與等體積的碘克沙醇(OptiPrepTM，60％碘克沙醇水溶液，Axis-Shield，Noway)混合，在Cobe 2991TM細胞洗滌器(可從Blood ComponentTechnology，Lakewood，Co得到)中室溫下2000rpm離心(大約500×g)15分鐘，如下所述。
向500ml無菌瓶中加入208.5ml OptiPrepTM、291.5ml無酚紅RPMI-1640，得到25％的密度為1.12的碘克沙醇溶液。根據(jù)重量計算得出細胞體積，向細胞中加入足量的無酚紅RPMI-1640使最終體積為250ml，總細胞數(shù)為10×109(40×106細胞/ml)。加入250ml25％的碘克沙醇，輕輕搖勻。通過自流將得到的碘克沙醇細胞溶液加到COBE2991TMcell waher-處理包中，在該處理包旋轉(zhuǎn)時，用蠕動泵以20ml/min的速率將100ml的無酚紅RPMI-1640層泵到碘克沙醇細胞溶液的上部，2000rpm(大約500×g)離心15分鐘。得到位于碘克沙醇細胞溶液和無酚紅RPMI-1640界面間的肝細胞帶，分別從團粒材料中分離回收該細胞帶。
在如上所述的條件下進行的單個試驗中，測定起始材料的密度和選定離心帶的密度，所述選定離心帶包括“Umix”帶、“梯度內(nèi)容物”帶和團粒，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)“Umix”帶的密度為1.0607，該密度值小于起始材料(1.0792)、“梯度內(nèi)容物”帶(1.0792)和團粒(1.1061)的密度值。然后測定得到11.59％的碘克沙醇溶液是使目標(biāo)細胞離心后發(fā)生直接分離所需要的梯度。
在制備肝細胞的一常規(guī)方法中，是將等份的肝細胞懸液與等份的Percoll(Sigma，MO)混合得到最終濃度為22.5％的Percoll。接著在Sorvall RC3B離心機中4℃下100×g離心5分鐘，回收團粒。應(yīng)該注意的是根據(jù)該常規(guī)方法的教導(dǎo)，上清夜被丟棄，因為一般認為該上清液含有的細胞具有較低活性且其一般含有較多的細胞碎片。為了進行比較，回收該上清夜，稀釋5倍，4℃下300×g離心5分鐘。另一種制備肝細胞的常規(guī)方法是通過酶消化肝，然后低速離心細胞，一般大約是50×g離心來分離該肝細胞懸液，保留團粒細胞，丟棄上清液中的細胞。
臺盼藍染色排除法(Trypan blue exclusion)顯示100×g團粒中富含有70-90％的活細胞，而Percoll上清中含40-60％。相反，在本發(fā)明的OptiPrepTM梯度中，最上層的細胞帶含有80-90％的活細胞，而團粒材料一般少于20％。用粒子計數(shù)器分析大小顯示在Percoll團粒中具有較大細胞(直徑為18-22uM)，而在Percoll上清中含有的直徑為9-13uM的細胞比團粒中多。OptiPrepTM梯度最上面的帶含有直徑為18-22uM和9-13uM的細胞，對該OptiPrepTM團粒進行的大小分布測試表明該團粒含有大量的碎片。對這些細胞進行熒光活性細胞分選(FACS)分析，接著進行EP-CAM免疫著色，結(jié)果表明通過Percoll沉降會去除EP-CAM陽性著色細胞，這些陽性細胞位于在Percoll上清的下面。OptiPrepTM梯度的最上層帶含有與Percoll上清相似的EP-CAM陽性細胞群。克隆形成分析表明，Percoll團粒中的細胞完全不形成任何克隆，而Percoll上清具有相當(dāng)水平的克隆形成能力，同該OptiPrepTM梯度的最上層帶一樣。該克隆形成能力與EP-CAM陽性著色有關(guān)，因為富集EP-CAM陽性細胞也富集了該細胞制劑的克隆形成能力。
如圖1所示，對新的OptiPrepTM分離法用粒子計數(shù)器測定得到的大小曲線圖顯示了2個細胞波峰相對小的(直徑一般為9-13uM)和相對大的(直徑一般為18-22uM)細胞。該小細胞群含有干/祖細胞，這些細胞的大小約為10uM。這兩個細胞群的相關(guān)量根據(jù)捐贈肝的不同而變化，該波峰群落在微米級的平均大小也一樣變化。
圖2顯示了使用標(biāo)準(zhǔn)的Percoll方法在Percoll團粒(100×g)中較大細胞(直徑為18-22uM)的相關(guān)量比相應(yīng)的上清(300×g)中要多。
圖3顯示了用FACS分析和接下來的人EP-CAM抗體特異性免疫著色的結(jié)果，表明Percoll團粒(100×g)含有的EP-CAM陽性著色細胞(左圖，0.12％的EP-CAM群(+))比起始材料(右圖，0.76％的EP-CAM群(+))少5倍。
相反，如圖4所示，OptiPrepTM組分對EP-CAM陽性著色細胞群的總數(shù)沒有明顯的影響(在分離的和未分離的樣品中分別含有3.07％和3.06％的EP-CAM陽性著色細胞群)。
用OptiPrepTM分離的細胞(最上層帶)作為起始原料，在試驗中使用兩種不同的捐贈肝，我們同樣證明了用常規(guī)Percoll方法得到的EP-CAM陽性免疫著色細胞保留在上清中。如圖5和6所示，在上述OptiPrepTM分離的細胞起始原料中和Percoll上清中該EP-CAM陽性細胞群落數(shù)量相當(dāng)，而Percoll團粒中的這些陽性細胞減少了2-5倍。
在OptiPrepTM分離和Percoll密度梯度離心后通過如下步驟對這些細胞制品進行生物學(xué)測試以檢測是否存在干/祖細胞將20,000個細胞/井涂布在STO飼養(yǎng)層上，在激素已知的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2周后計算克隆形成的數(shù)目。為了證實我們的觀點，即EP-CAM免疫反應(yīng)與干/祖細胞的存在相對應(yīng)，我們認為如果增加EP-CAM細胞群落，那么我們就會增加群落中克隆形成的數(shù)目。為了實現(xiàn)這個目標(biāo)，我們通過免疫選擇來富集這些細胞并將它們用于我們的測試中。如圖7和8所示，我們富集了40倍的EP-CAM陽性細胞(0.59％的起始群落是EP-CAM群落，但在免疫選擇后，24.7％的起始群落是該標(biāo)記陽性)。
表2顯示了我們在富集EP-CAM陽性細胞時所真正富集的克隆形成。另外，OptiPrepTM分離的細胞和Percoll上清都含有克隆形成細胞，而Percoll團粒不含這種細胞。
表2組分 總克 平均克 井1 井2 井3 井4 井5 井6隆數(shù) 隆/井OptiPrepTM9 1.5 102222組分EP-CAM+43 7.2 7711 12 51富集Percoll團1 0.2 001000粒Percoll上20 0.3 312275清為了確保這些克隆是來源于單個細胞，對EP-CAM陽性富集的細胞進行有限稀釋，用顯示實質(zhì)細胞的人清蛋白的抗體和與膽管細胞反應(yīng)的CK19的抗體對平均含1個細胞的這些井進行免疫著色。如圖9和10所示，在單個克隆中這兩種細胞型都存在，這證實了該細胞具有產(chǎn)生該克隆的雙潛能，這種雙潛能操作性地定義為干/祖細胞。
這些數(shù)據(jù)清楚地表明本發(fā)明新的OptiPrepTM分離方法能將活細胞與死細胞分開，同時將活的肝干/祖細胞保留在該活的組分中。相反，在本領(lǐng)域的常規(guī)方法中，通過Percoll密度梯度離心除去了團粒中的這些細胞。雖然在使用上述Percoll密度梯度的條件下可以作一些改進，包括縮短離心時間(分鐘)和降低g力(50、70、88×g)，但是很顯然該常規(guī)方法的目標(biāo)是富集較大的、成熟的活肝細胞。由于是將Percoll團粒用于接下來的所有試驗(上清遭丟棄)，因此本領(lǐng)域一直使用的是去除了這種能增生的干/祖細胞的細胞制劑。我們發(fā)現(xiàn)的新方法將必然地大大改變試驗進行的方式、數(shù)據(jù)產(chǎn)生的方式，從而推進該領(lǐng)域的研究。特別是在細胞移植領(lǐng)域，為了使肝功能最高可能性地重建，使移植的細胞具有最高的增生能力十分重要。
免疫富集(免疫選擇)僅是富集本發(fā)明的肝干/祖細胞群落的一種方法。特定地使用單克隆抗體來鑒定與特定細胞系和/或分化階段有關(guān)的標(biāo)記(表面膜蛋白，如受體)。分離目標(biāo)干/祖細胞的方法可以包括利用磁珠包被的抗體的磁分離法、親和層析和利用與固體基質(zhì)，如平板結(jié)合的抗體的“洗脫法”及其它常規(guī)技術(shù)。提供精確分離的技術(shù)包括熒光活性細胞分選系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以包括各種不同的組分，如多個有色通道，小角度和鈍角的光散射檢測通道，阻抗通道等。
還可以從本發(fā)明的活人肝細胞中除去不需要的細胞群落。除了肝細胞和其直接的祖細胞外，肝還還有許多其它的細胞型，包括膽管細胞、內(nèi)皮細胞，組織巨噬細胞(Kupffer細胞)，星狀細胞和淋巴細胞。用灌注的肝制備的細胞懸液還可能含有一些來自循環(huán)系統(tǒng)的殘留血液細胞。在本發(fā)明的活人肝細胞制品中，大部分細胞表達細胞內(nèi)清蛋白，因此是產(chǎn)生肝實質(zhì)細胞的肝實質(zhì)細胞或干/祖細胞。在該制劑的不表達細胞內(nèi)清蛋白的剩余細胞中，大部分對表面標(biāo)記CD45著色，CD45又稱白細胞共同抗原(Leukocyte Common Antigen)，已知在大部分或所有的淋巴細胞、單核細胞/巨噬細胞和粒細胞系上呈遞。成人肝中可能表達CD45的重要細胞包括T淋巴細胞、Kupffer細胞(其構(gòu)成80％的體組織巨噬細胞)和可能的一些粒細胞。
用本領(lǐng)域公知的免疫耗竭法可以將CD45陽性細胞從本發(fā)明的活人肝細胞中除去。例如，可以將CD45特異性單克隆抗體與磁性微球結(jié)合，然后將該微球與活的人肝細胞接觸。該CD45陽性細胞與該微球結(jié)合并通過應(yīng)用磁場而除去。適于除去CD45陽性細胞的一系統(tǒng)可以從Miltenyi Biotec(Miltenyi Biotec GmbH，F(xiàn)redrich-Ebert-Straβe 68，D-51429 Bergisch Gladbach，Germany)買到。在該Miltenyi系統(tǒng)中，CD45微珠用于與磁性柱(在裝置，如AutoMACS或CliniMACS中)結(jié)合并除去CD45陽性細胞。使用這種或等同系統(tǒng)，在一輪去除操作中至少能除去約90-95％的CD45陽性細胞。該CD45去除的細胞群還基本上保留有該肝制品的所有細胞，這些細胞能在適于上皮細胞，包括肝細胞的條件下在培養(yǎng)基中附著和生長。許多這種細胞能附著在裝有無血清培養(yǎng)基的膠原蛋白涂布的培養(yǎng)皿中，并且一些展示出肝細胞形態(tài)。與之相對應(yīng)，用免疫耗竭的方法從本發(fā)明的或肝細胞中除去的所述磁分選的CD45細胞群很少有細胞能附著并展示出肝實質(zhì)細胞的形態(tài)。
可以用本領(lǐng)域公知的方法迅速地挑選其它單克隆抗體以特異性地除去特定的不需要的細胞群。例如，用細胞表面標(biāo)記CD3的抗體可以除去T淋巴細胞。相似地，用細胞表面標(biāo)記CD14可以除去巨噬細胞/單核細胞系，如Kupffer細胞。
通常地，可以將抗體制成結(jié)合的形式以利于細胞分離。用于結(jié)合的材料包括但不限于磁珠，其可以進行直接分離；生物素，其能通過與結(jié)合在支持物上的親和素或抗生素蛋白(streptavidin)結(jié)合來進進行間接分離；熒光染料，其能用于熒光活性細胞分選系統(tǒng)。任何對所述細胞的生存沒有過度危害的方法都可以使用。
本發(fā)明的細胞可以用任何冷凍保藏的方法保藏。通常地，用HypothermosolTM的水溶液(Biolife Solutions，NY)將分離的細胞(如上所述)稀釋到理想濃度，并可控地冷凍到理想的保藏溫度?？梢詫⒈景l(fā)明的冰凍細胞保藏在液態(tài)氮中。
本發(fā)明的細胞的功能一旦本發(fā)明的肝細胞群，包括肝干/祖細胞得到分離和冷凍保藏，通過流式細胞計數(shù)技術(shù)用細胞特異性單克隆抗體或多克隆抗體和與熒光染料結(jié)合的二級抗體對其進行測定以定量檢測存在的細胞型。另外，用一系列的體內(nèi)和體外終點事件來檢測冰凍細胞的功能。
例如，將本發(fā)明的肝干/祖細胞在冰上與100uL人EP-CAM抗原的與熒光素異硫氰酸酯(FITC)(Serotec Inc，UK)結(jié)合的鼠單克隆IgG多態(tài)抗體反應(yīng)，對照細胞單獨與鼠IgG-FITC反應(yīng)。用EPICS C流式細胞儀(Coulter Electronics，HIALEAH，F(xiàn)la)分析樣品，波長488nm，并校正熒光獲得值以排除98％的對照細胞。利用前散射光(FLS)與側(cè)散射光(SS)兩組參數(shù)柱狀圖在不同細胞群周圍建立窗口，測定陽性熒光事件的百分率。
體外終點時間包括7-乙氧香豆素代謝，其表示微粒體細胞色素P-450依賴型I階段氧化和緊接的II階段結(jié)合反應(yīng)；脲生成，其表示細胞將氨轉(zhuǎn)化為脲的能力(在干衰竭過程中喪失的一個重要參數(shù))和增生潛能。
在體內(nèi)，我們檢測細胞延長時間生存的能力，建立和維持成熟肝細胞表型的能力，嫁接到肝實質(zhì)組織中的能力。
在下面的研究中使用NOD-SCID鼠，其患有嚴重的混合性免疫缺乏癥，不能排斥移植的人細胞。在一研究中，將細胞解凍并在體外與其結(jié)合的微載體一起培養(yǎng)，然后將該微載體注射到鼠的腹膜腔中。一星期后，從腹膜腔收集聚集的微載體細胞，切片并著色以進行光學(xué)顯微觀察。還使用電子顯微鏡。
圖11顯示了在NOD-SCID鼠中微載體珠上的人肝細胞的顯微照片，其中一個清楚地顯示肝細胞附著在微載體上?？梢钥吹剿鼈兊膱A形核及大量的透明細胞質(zhì)。右箭頭顯示了雙核細胞，最右邊的是宿主基質(zhì)細胞，可能是纖維原細胞，來自受體鼠的腹膜襯里。
圖12顯示了在低功率下拍得的顯微照片，從中可以看到大的已被宿主脈管化的肝細胞所形成的島，如紅血細胞所證實的那樣。特別值得注意的是細胞出現(xiàn)明顯的組織化形成髓或肝細胞排列。在肝組織的橫切面上可以容易地觀察到結(jié)構(gòu)性組織化。
圖13證明了本發(fā)明的肝干/祖細胞確實能熟化為肝細胞并表現(xiàn)成熟的表型，顯示了它們的細胞質(zhì)對肝糖陽性著色。另外，要注意的是細胞出現(xiàn)了明顯的組織化形成髓。
在電子顯微水平，圖14顯示了三種與這種微載體結(jié)合的肝細胞。黑框畫于兩種相鄰細胞的交界處。區(qū)域放大圖顯示結(jié)構(gòu)、微絨毛、膽小管和另一種成熟細胞標(biāo)記。
圖15和16顯示了兩個顯微照片，證實了本發(fā)明的人肝細胞在NOD-SCID鼠肝中的嫁接。在該研究中，將1,000,000個冷凍的細胞注入到該鼠的脾中。在移植后的不同時間點，對動物實施安樂死，用針對人著絲點的DNA探針原位雜交和PCR分析來測定人細胞的存在。在移植后兩小時(圖15)，通過原位雜交在門靜脈和竇狀腺中可清楚地看見人細胞，但是它們?nèi)匀粵]有通過脈管間隙進入到肝實質(zhì)組織中。
在移植后40天(圖16)，人肝細胞不僅駐留在肝中，還嫁接到肝細胞板中并完全整合到肝實質(zhì)組織中。
肝細胞移植適于用本發(fā)明的細胞和方法治療的目標(biāo)人群是由于不同原因而患有硬化和晚期肝病(ESLD)的不同患者。不進行肝移植的患者的剩余壽命大于六個月但小于兩年，因此，大多數(shù)患者考慮等候同位肝移植(如移植完整的捐贈器官)。這些患者已發(fā)生了一種或多種其疾病的并發(fā)癥，如腹水、出血、紊亂(肝腦病)、感染和其它問題。為了防止其對移植的肝細胞發(fā)生與移植完整肝一樣的排斥，預(yù)期對所有的目標(biāo)患者進行免疫移植處理。本治療的目標(biāo)是延遲或消除全肝移植的需要，以減少肝病并發(fā)癥的住院治療并改善病人的生活質(zhì)量。
為了除去毒素、新陳代謝藥物和合成蛋白，基礎(chǔ)的和隨后的測試包括常規(guī)的實驗室和臨床肝功能測試及特定的肝功能損傷的定量生化測試。因為希望移植的肝細胞在肝和脾中都能生長，所以周期性地對脾進行肝細胞特異性檢查以監(jiān)測移植的肝細胞的嫁接和增生情況。移植的細胞釋放贈體細胞特異性的可溶性抗原，這些可溶性抗原能在血液中檢測到，監(jiān)測這些抗原以進一步測定移植細胞的存活和功能。
在入院進行細胞移植前兩個星期，由調(diào)查者看護臨床患者。該調(diào)查者獲得明確的同意并開始進行基本檢測，包括ABO血型檢測。在固定肝或肝細胞移植中，患者的血型與捐贈者的血液細胞必須相容。在入院前兩天，開始進行免疫抑制，將冷凍細胞運到醫(yī)院，保持冷凍狀態(tài)直到移植前。
在細胞移植前夜，患者入院。在第二天早晨，將患者轉(zhuǎn)到介入性放射間，進行清醒鎮(zhèn)定。將導(dǎo)管放入到患者的股動脈(在腹股溝處)處，并深入到脾動脈中。解凍捐贈的肝細胞，稀釋并運輸，優(yōu)選通過注射器注入到該脾動脈導(dǎo)管中。根據(jù)劑量，給藥的時間從約5到30分鐘。移開該導(dǎo)管，將患者移回到他的/她的護理房間。在該過程后8小時，該患者出院。
可以將本發(fā)明的肝細胞和肝干/祖細胞移植用來實現(xiàn)肝功能的恢復(fù)。將一定量活的功能性肝細胞，包括肝實質(zhì)細胞和/或肝干/祖細胞(包含在移植介質(zhì)，如生理鹽水中)注入到合適的解剖學(xué)位點，在該位點該肝細胞，包括肝實質(zhì)細胞和/或肝干/祖細胞能植入到靶位點，如肝實質(zhì)組織和/或脾中并表現(xiàn)出不同的肝功能，包括肝細胞功能。根據(jù)移植的肝細胞，包括肝實質(zhì)細胞和/或肝干/祖細胞的數(shù)量，肝功能缺陷通過利用細胞移植恢復(fù)肝功能而能得到不同程度的校正。然而，在治療由于遺傳缺陷導(dǎo)致單個酶或其它蛋白產(chǎn)品的功能降低或缺乏所產(chǎn)生的肝疾病方面，肝實質(zhì)細胞和/或肝干/祖細胞的細胞移植最為有利。這種疾病的例子包括高血脂和α-抗胰蛋白酶缺乏癥?？梢杂帽景l(fā)明治療的其它肝疾病包括肝炎、肝硬化、先天的代謝錯誤、急性肝衰竭、急性肝感染、急性化學(xué)毒性、慢性肝衰竭、cholangiocitis、膽管硬化、Alagille綜合癥、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥、自免疫性肝炎、膽管閉鎖、肝癌、肝被膜疾病、脂肪肝、半乳糖血癥、膽石、吉爾伯特氏癥候群(Gilbert′sSyndrome)、血色沉著病、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、poryphyria、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷伊氏綜合癥(Reye′s Syndrome)、肉狀瘤病、酪氨酸血癥、I型糖原過多癥、威爾森氏癥(Wilson′s disease)。
為了實施移植步驟，選擇一個注射位點來將肝細胞移植到肝實質(zhì)組織中。在實施該步驟的一技術(shù)中，該注射位點是患者的脾。在計算好脾的位置坐標(biāo)后，放置注射器以將含有肝細胞，包括肝實質(zhì)細胞和/或肝干/祖細胞的移植介質(zhì)注射到脾中。然后該移植的細胞通過脾靜脈轉(zhuǎn)移到肝實質(zhì)組織中(見Gupta等，Seminars in Liver Disease 12，321(1992)]。在另一技術(shù)中，在注入放射不透過性造影劑后用如CAT掃描腹部，對門靜脈的支線照相。然后利用向肝的單個突起提供養(yǎng)料的門靜脈支線的位置坐標(biāo)來將移植介質(zhì)注入到門靜脈支線中，于是將肝細胞灌輸?shù)搅颂囟ǖ母瓮黄稹＿@種選擇性灌輸可以使門靜脈血液不斷地流過其它的肝。
可選擇地，本發(fā)明的肝細胞，包括肝實質(zhì)細胞、膽管細胞和/或肝干/祖細胞可以通過脾靜脈或門靜脈或肝包膜的下面直接注射或灌輸?shù)礁嗡柚小?br> 將本發(fā)明的細胞給藥到個體，特別是人個體的合適方法在此處將作詳細的說明。這些方法包括將細胞注射或植入到個體的靶位點或?qū)⒓毎迦氲接欣趯⒓毎⑸浠蛑踩氲絺€體中的運輸裝置中。這種運輸裝置包括管子，如導(dǎo)管，用于將本發(fā)明的細胞和液體注射到受體中。在優(yōu)選具體實施方案中，該管子還額外地含有針，如注射器，通過其可以將本發(fā)明的細胞導(dǎo)入到個體的目的位點。本發(fā)明的這些肝細胞，包括肝干/祖細胞可以以不同形式附著在這種運輸系統(tǒng)，如注射器中，例如，當(dāng)細胞裝在該運輸系統(tǒng)中時，可以將這些細胞懸浮在溶液中或植入到支持基質(zhì)中。如本發(fā)明所述，術(shù)語“溶液”包括藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，在其中本發(fā)明的細胞能存活。藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑包括生理鹽水、水緩沖溶液、溶劑和/或分散介質(zhì)。這些載體和稀釋劑的使用是本領(lǐng)域公知的。該溶液優(yōu)選具有一定程度的惰性和流動性而使其能容易地以注射液的形式存在。優(yōu)選地，該溶液在制備和貯藏條件下保持穩(wěn)定，并在通過苯甲酸酯類(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞(Thimerosal)等使用時保留有對微生物，如細菌、真菌的抗污染作用?？梢詫⒈景l(fā)明所述的活的功能性肝細胞與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑及在需要時與上述列舉的其它成分混合，然后在無菌條件下進行過濾來制備本發(fā)明的溶液。
能結(jié)合或植入上述活的功能性細胞的支持基質(zhì)包括受體相容的且其降解產(chǎn)品對該受體無害的基質(zhì)。這種基質(zhì)的例子如天然的和/或合成的生物可降解基質(zhì)。天然的生物可降解基質(zhì)包括血液凝塊，如來源于哺乳動物的血液凝塊和膠原質(zhì)基質(zhì)。合成的生物可降解基質(zhì)包括合成的聚合物，如聚酐、聚原磷酯和聚乳酸。合成的聚合物和用于將細胞結(jié)合或植入到這些基質(zhì)中的方法的其它例子是本領(lǐng)域公知的，參見如美國專利No.4,298,002和No.5,308,701。這些基質(zhì)為體內(nèi)的肝細胞提供支持和保護，因此其是將該肝細胞導(dǎo)入到受體中的優(yōu)選形式。
本發(fā)明的基因療法由于靶基因經(jīng)常不能進行持續(xù)的基因表達，因此基因療法的臨床試驗一般都令醫(yī)生和病人失望。由于具有廣泛的擴增潛能，因此肝細胞群落，如本發(fā)明的包括干/祖細胞的肝細胞群落，代表了有希望在其中獲得并維持有效基因表達的細胞群。在一具體實施方案中，本發(fā)明的基因治療通過如下方式來實現(xiàn)將外源基因插入到該細胞中，并將這些細胞移植到患者中。通常的靶失調(diào)是因為患者的肝不能正確產(chǎn)生重要蛋白，如在血膽脂醇過多癥中缺乏LDL受體，在血友病中缺乏凝血因子。
在上述嘗試中，為了將外源基因穩(wěn)定整合到真核宿主的不同器官的細胞中，最大的困難是大多數(shù)這些細胞不能在體外擴增，特別是在將外源基因插入到肝細胞中時，因為成熟的肝細胞在體外并不能發(fā)生完全的細胞分裂，或者最好的情況僅1-2次分裂。最近，利用肝細胞進行了基因轉(zhuǎn)化研究，該肝細胞從Watanabe遺傳性高脂血癥兔，一種廣泛地用來研究人家族性血膽脂醇過多癥的動物模型中分離得到。如它們在人中的副本相似，該Watanabe兔細胞遺傳缺乏低密度脂蛋白(LDL)受體，在循環(huán)系統(tǒng)中導(dǎo)致產(chǎn)生高水平的膽固醇，從而增加了早期冠心病的發(fā)生率(Wilson等，1990，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 878437)。用攜帶有功能性LDL受體基因的重組病毒感染兔肝細胞，在移植后，遺傳缺陷兔表現(xiàn)出高血脂的短時間改善。如果目的基因能更穩(wěn)定地整合到穩(wěn)定分裂的受體細胞群中，相信這種療法的成功率會進一步提高。因為本發(fā)明的肝干/祖細胞能在體外擴增，特別是能在共培養(yǎng)了實質(zhì)細胞與胚基質(zhì)細胞的本發(fā)明所述系統(tǒng)中長時間擴增，因此這些細胞是在培養(yǎng)基中導(dǎo)入外源基因的理想受體候選。
肝細胞的遺傳性基因缺陷導(dǎo)致各種先天性代謝錯誤，這些疾病可以通過移植攜帶有正確基因的功能性拷貝的本發(fā)明的肝細胞來治療。簡要地，該方法包括從具有特定缺陷的患者中分離本發(fā)明的肝細胞，包括肝干/祖細胞，通過常規(guī)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將功能性基因轉(zhuǎn)化到這些細胞中以糾正該基因缺陷，確認目的基因產(chǎn)品的穩(wěn)定整合和表達，和將該細胞移植到同一或其它患者肝中進行重建。該方法特別適于疾病是由單個基因缺陷所導(dǎo)致，且該缺陷基因已經(jīng)得到鑒定和分子克隆的情形，但是，并不僅限于這些情形。除了能在自體同源個體中進行基因治療外，本發(fā)明的攜帶有功能基因的肝干/祖細胞還可以移植到異源的HLA匹配個體中。適于這種形式的基因治療的靶基因及其相關(guān)肝疾病的例子包括但不限于家族性血膽脂醇過多癥中的LDL受體基因，血友病中的凝血因子VIII和IX的基因，肺氣腫中的α1-抗胰島素基因，苯丙酮尿癥中的苯丙氨酸羥化酶基因，高血氨癥中的鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因和不同形式的互補性缺陷中的互補蛋白基因。
肝是產(chǎn)生許多分泌蛋白的中心，其將各種蛋白有效釋放到血液中，從而通過這種方式在解剖學(xué)上與循環(huán)系統(tǒng)相聯(lián)系。因此，可以將編碼具有系統(tǒng)效果蛋白的基因插入到本發(fā)明的肝細胞中，而不是插入到正常表達該蛋白的特定細胞型中，特別是在將基因整合到這些細胞中是很困難的情況下。例如，可以將各種激素基因或特定的抗原基因插入到本發(fā)明的肝細胞中從而使它們的基因產(chǎn)物分泌的到循環(huán)系統(tǒng)中。
為了實施本發(fā)明，將用如上所述的方法分離得到的本發(fā)明的肝細胞用作基因轉(zhuǎn)化試驗的受體。在導(dǎo)入外源基因之前、過程中或之后在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細胞。通過加入細胞因子使這些細胞的體外分化最小化，加入的方式如同在造血干細胞培養(yǎng)基中使用白血病抑制因子一樣。
為了將外源基因?qū)氲奖景l(fā)明的培養(yǎng)細胞中，可以用常規(guī)技術(shù)，包括但不限于微注射、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)來轉(zhuǎn)化任何克隆基因。另外，如果該肝細胞表達去唾液酸糖蛋白受體，那么就可以將含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒與去唾液酸糖蛋白結(jié)合并加入到細胞中以誘導(dǎo)吸收和表達(Wu等，1991，Journal of Biological Chemistry 26614338)。這種方法對于受體細胞來說更溫和。
基因轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法是使用重組病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒。例如當(dāng)使用腺病毒表達載體時，可以將克隆序列與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體，如后期啟動子和三連體引導(dǎo)序列連接。然后通過體外或體內(nèi)重組將這種嵌合基因插入到腺病毒基因組中。在該病毒基因組的非必需區(qū)域(如E1或E3區(qū))進行插入會產(chǎn)生活的且能在感染肝的儲備細胞中表達基因產(chǎn)物的重組病毒(例如，見Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659)。可選擇地，可以使用牛痘病毒7.5K啟動子(如見Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA797415-7419；Mackett等，1984，J.Virol.49857-864；Panicali等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 794927-4931)。基于牛乳頭狀瘤病毒的載體是特別有利的，其作為染色體外元件具有復(fù)制的能力(Sarver等，1981，Mol.Cell.BIOL.1486)。在這種DNA進入細胞后不久，在每個細胞中該質(zhì)粒復(fù)制約100到200個拷貝。所述插入cDNA的轉(zhuǎn)錄不需要該質(zhì)粒整合到宿主的染色體上，因此高水平表達。在質(zhì)粒中包括一選擇性標(biāo)記，如neo基因，可以穩(wěn)定表達這些載體?？蛇x擇地，可以修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組以用作可導(dǎo)入或指導(dǎo)任何目標(biāo)基因在本發(fā)明的肝干/組細胞中表達的載體(Cone & Mulligan，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816349-6353)。使用可誘導(dǎo)型啟動子還可以實現(xiàn)高水平表達，這些啟動子包括但不限于金屬硫蛋白(metallothionine)ILA啟動子和熱休克啟動子。
為了長期高產(chǎn)地生產(chǎn)重組蛋白，穩(wěn)定表達是優(yōu)選的。與使用含有病毒復(fù)制起點的表達載體相比，最好使用在合適表達調(diào)控元件(如啟動子、增強子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸位點等)調(diào)控下的cDNA和選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化本發(fā)明活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞。重組質(zhì)粒中的該選擇性標(biāo)記對該選擇具有抗性，允許細胞將該質(zhì)粒穩(wěn)定整合到其染色體中，并生長形成集落，接著該集落能克隆和擴增形成細胞系。例如，在導(dǎo)入外源DNA后，將構(gòu)建的肝細胞在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)到選擇性培養(yǎng)基中。可以使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11223)，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，Cell 22817)的基因。另外，可以用抗代謝物抗性來選擇dhfr，對氨甲蝶呤具有抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，對霉酚酸具有抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；neo，對氨基糖苷G-418具有抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)和hygro，對潮霉素具有抗性(Santene等，1984，Gene 30147)的基因的基礎(chǔ)。最近，公開了其它的可選擇性基因，名為TRPB，其允許細胞利用吲哚代替色氨酸；HISD，其允許細胞利用組氨醇(Histinol)代替組氨酸(Hartman & Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858047)和ODC(鳥氨酸脫羧酶)，其對鳥氨酸脫羧酶抑制劑、2-二氟甲基-DL-鳥氨酸、DFMO具有抗性(McConlogue L.，1987，Current Communications inMolecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory編)。
如上所述，可以將整合了特定基因的本發(fā)明的肝細胞移植到細胞最初來源的患者中或整合到HLA匹配的個體中，該整合可以用Northern印跡和ELISA等技術(shù)測定該基因的表達來證實。對于HLA匹配的異源移植，肝儲備細胞在移植前可以不需要基因轉(zhuǎn)化。例如，通過移植可以將從擁有凝血因子VIII功能性編碼基因的捐贈者中獲得的肝細胞直接用于HLA匹配的血友病患者中。該移植的細胞將可能會增殖并產(chǎn)生成熟PC以執(zhí)行正常的肝功能，包括產(chǎn)生凝血因子VIII。
除了使用本發(fā)明的肝細胞來糾正肝基因缺陷外，這些細胞還可以用來補充肝硬化中的肝實質(zhì)組織，如上文所述，或?qū)⑺鼈冊O(shè)計來對抗肝特異性傳染病。例如，可以從早期肝炎患者中獲得未經(jīng)感染的肝干/祖細胞并用作反義RNA編碼基因的受體，該反義RNA與關(guān)鍵的肝炎病毒復(fù)制相關(guān)基因元件互補。然后可以將這些細胞移植到患者中來控制病毒的擴散并恢復(fù)正常的肝功能。
基因組和研究性應(yīng)用本發(fā)明的肝細胞技術(shù)可以用作鑒定新藥的工具和藥物研究與試驗工藝中的工具，該肝干/祖細胞可以制備來生長和分化成成熟肝細胞。檢測該肝細胞系不同階段的基因的表達方式，提供了發(fā)現(xiàn)藥物的基因組信息。例如，可以將該信息用于鑒定發(fā)現(xiàn)藥物計劃的新靶，以鑒定具有可應(yīng)用于治療的生物學(xué)功能的蛋白。
作為藥物試驗和研究工藝的工具，可以用上述肝細胞和其后代來檢測由需研究藥物導(dǎo)致的基因表達方式的改變。將潛在藥物導(dǎo)致的基因表達方式的改變與對肝有影響的已知藥物導(dǎo)致的改變相比較，這就使制藥公司能在研究工藝的早期階段對化合物對肝所產(chǎn)生的影響進行監(jiān)測，節(jié)省時間和金錢。肝細胞的所有細胞系，從祖細胞到成熟細胞還可以用來測試藥物對肝的毒性和研究該藥物怎樣代謝。如今，制藥公司很難獲得穩(wěn)定供給的肝細胞來進行毒性測試。本發(fā)明的方法滿足了這一需要。
肝輔助裝置本發(fā)明的肝干/組細胞技術(shù)可以用于制備肝輔助裝置(“LAD”)，LAD是設(shè)計來短時間(7到30天)維持肝功能以使患者自己的肝具有足夠的時間從衰竭中恢復(fù)或提供移植的橋梁，從而治療患有急性肝衰竭的患者。
在臨床有用的LAD中，有人嘗試將豬肝細胞或來自于人腫瘤的弱分化肝細胞廣泛用于各種生物反應(yīng)器類型。已經(jīng)表明這些裝置是有作用的，但是它們都使用有局限的細胞，這些局限用本發(fā)明的細胞都可以克服。豬肝細胞雖然容易獲得，但是具有幾個缺陷，如對分泌的豬蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這些缺陷對壽命和非人病毒產(chǎn)生限制。雖然該肝細胞容易培養(yǎng)，但是它們只保留有正常肝細胞的部分功能且還有安全性問題。由于缺乏捐贈肝，因此不再選擇使用來源于捐贈者器官的功能性人肝細胞。使用本發(fā)明人肝祖細胞的LAD克服了目前的這些問題。因為這些細胞分泌的蛋白是人源的，因此免疫反應(yīng)會最小化。在培養(yǎng)基中該祖細胞廣泛地分裂，于是來源于捐贈肝的細胞可以產(chǎn)生許多LAD。更重要的是，這些肝細胞表現(xiàn)出臨床應(yīng)用所需的各種肝功能。
適于本發(fā)明的細胞的LAD的例子在國際專利PCT/US00/15524中有描述。
本發(fā)明的疫苗制備本發(fā)明的肝細胞還可以用來制備疫苗。例如，可以用復(fù)制缺陷病毒(如慢病毒(lentivirus)，參見Naldini等.Science 272263-267，1996)來感染人肝細胞，其中該病毒已經(jīng)作了進一步修飾而含有一個或多個特定蛋白抗原的編碼基因。根據(jù)需要的免疫反應(yīng)的類型來選擇該特定蛋白抗原。基本上，本發(fā)明的肝細胞是用重組病毒感染，然后該感染細胞表達蛋白抗原從而引起對抗該抗原的免疫反應(yīng)?？梢灾笇?dǎo)該免疫反應(yīng)來對抗傳染病，如C型肝炎，然后暴露于該傳染病的個體得到保護而對抗該傳染病。使用編碼C型肝炎非結(jié)構(gòu)性蛋白的塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)來誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞性免疫反應(yīng)的描述可參考Blister等(見J.Gen.Virol.83(Pt.2)369-381，2002)。
實施例工藝概述所述肝的所有工藝都在放置于Class 10,000房間中的Class 100排風(fēng)罩中進行，接著進行消毒并進行優(yōu)良的制造工藝。所有與該肝接觸的組分都是以無菌形式買得或組合后經(jīng)過氣體滅菌或高壓滅菌。
初期工藝將肝浸在VIASPANTM(見http//www.viaspan.com/viaspan/pdf)中，三個一組地放置在冷卻器中的冰水上。在生物學(xué)安全室(BSC)中稱量該肝并記錄其毛重。吸取VIASPANTM樣品進行無菌測試(VIASPANTM用作器官沖洗和保存的低體溫溶液)。將該肝移到無菌箱并浸泡在抗生素洗液(0.1mg/mL慶大霉素和5mg/mL Cefazolin)中。在該過程中從頂部到底部翻轉(zhuǎn)該肝，確保其兩邊都得到浸泡。
拿出上述肝，在一箱中用2L無菌生理鹽水漂洗兩次，然后將該肝轉(zhuǎn)到另一無菌箱中。用兩個無菌的、方便使用的塑料臍帶夾夾住腔靜脈，將已滅菌的由不同大小的塑料漸縮管/連接器組成的導(dǎo)管插入到門靜脈和/或肝動脈中。制備小的組織切片(從肝葉的邊緣)用于組織學(xué)觀察。將該肝轉(zhuǎn)移到灌輸罐中，用溫的(≤37℃)鰲合緩沖液灌輸15分鐘，其速率使該肝最大化膨脹(一般120-240mL/min)。在灌輸最后，通過位于該灌輸罐底部的排出口將該緩沖液排出。
灌輸和消化然后在28℃-37℃下用含有LIBERASETMCI(一種含有膠原酶和彈性蛋白酶的酶制劑)的灌輸液消化肝30分鐘，在消化的最后，將含有LIBERASETM的該緩沖液排出，然后用冷的含有血清的收集緩沖液灌輸該肝來阻斷所述酶的消化。在最后的灌輸之后，將緩沖液排出到廢水容器中，向上述罐中補充新的含有血清的收集緩沖液。用不銹鋼外科手術(shù)刀將該肝被膜切開，對該組織進行按摩(超過20分鐘)以使細胞分離。當(dāng)該消化組織中的所有細胞都分離到上述緩沖液中時，使得到的細胞緩沖液通過預(yù)過濾器，1000、500、250和150um的一系列消毒過的不銹鋼篩，然后收集到4升的血液包中置于冰上冷卻。對該粗細胞懸液取樣進行存活率、濃度、總細胞數(shù)、每克組織的產(chǎn)量和無菌性的工藝測試。
下游工藝將上述粗細胞懸液無菌地轉(zhuǎn)移到合適數(shù)量的600mL血液包中，800×g離心。將等體積的細胞濃縮液與OPTIPREPTM溶液(25％碘克沙醇)混合，然后用COBE2991 cell washer離心以而使該濃縮的細胞懸液富含活細胞。2000rmp離心15分鐘后，目標(biāo)細胞群轉(zhuǎn)移到上部并形成帶。無菌條件下收集該帶并分配到合適數(shù)量的600mL血液包中，體積優(yōu)選不超過200mL/包。用RPMI 1640將該包中的體積稀釋到500mL。800×g離心該包10分鐘并除去上清。稱量得到的團粒，加入足量的RPMI 1640使最后體積為500mL，800×g離心10分鐘。除去上清后，稱量沖洗過的團粒，取樣進行細胞級數(shù)和存活率測試，在HTS中重懸浮使其濃度為6×107個細胞/mL。如果由于細胞的數(shù)量很大而具有多個COBE轉(zhuǎn)子，就匯集從各個轉(zhuǎn)子中收集的帶。
注入和保存將上述細胞人工注入(以1.5mL的注入體積)到貼有標(biāo)簽的、33mL氟塑料冷藏包中，然后與等體積的冷凍緩沖液(HTS∶DMSO∶人血清為60∶20∶20)混合使其最終濃度為3×107個細胞/mL，10％DMSO和10％人血清。用低溫可設(shè)計冷凍裝置冷凍該包并在液氮中保存該冷凍的細胞。在冷凍后至少24小時，從冷凍裝置中取出樣品并放置到指定的測試儀器中進行釋放測試。
工藝流程下文描述了所用制備工藝的流程。
臨床位點的管理用溫度維持在-120℃或以下的合格液態(tài)氮運載器將臨床供體運輸?shù)脚R床位點，將包含有上述細胞懸液的冷藏包留在運載器中直到患者準(zhǔn)備就緒。在使用之前，將所述產(chǎn)品從該運載器中移出并在37℃下迅速解凍，并放在冰上。然后除去外包裝，利用標(biāo)準(zhǔn)的無菌醫(yī)療方法用冷的Plasm-Lyte@A將細胞懸液稀釋10倍，然后向患者給藥。這個程序避免了在灌輸之前清洗細胞的需要并使染菌的危險最小化。本發(fā)明的給予患者的一個具體實施方案中，包含3×106個細胞/mL，含包含DMSO(1％)、人血清AB(1％)、HypoThermosol(4％-8％)和不含酚紅的RPMI(0％-4％)，這些物質(zhì)都溶解在Plasma-Lyte中。
豬肝細胞的分離對豬的肝樣品進行如上所述的細胞懸液過濾和收集步驟。
測試樣品的存活率、密度和產(chǎn)量。在進行計算之后，移出10,000,000個細胞。如果密度低于25,000,000個細胞/mL，那么就用Sorval RC3B離心機、Sorval centritech或COBE 2991細胞處理器對細胞進行濃縮。將團粒重懸浮在250mL不含酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基中。將該細胞懸液轉(zhuǎn)移到600mL血液包中，加入用RPMI 1640w/o酚紅稀釋的25％的碘克沙醇(Opti-prepTM，見http//www.nycomed-diagnostics.com/gradmed/optiprep/optil.html)，完全混合這兩種溶液并低溫保存。
用單一處理組合(set)設(shè)置上述COBE 2991細胞處理器，用該組合的紅色管道使該細胞懸液自流。一旦環(huán)形室充滿，就以2000rpm開始離心15分鐘。在離心開始時，用蠕動泵以20mL/min的速度在所述梯度的頂部加入100mL的RPMI 1640培養(yǎng)基層作為緩沖液來混合帶。15分鐘后，將該頂部緩沖液以100mL/min的速度輕倒入到沸水包中，并將頂部細胞帶收集到收集包中。如果需要也收集團粒用于進一步的分析。將該頂部細胞帶放置在冰上，取樣用于檢測存活率和產(chǎn)量。重復(fù)該過程直到所有的未分離的豬肝細胞都得到處理。一旦收集了所有的帶并將其匯集到一起，然后就用收集緩沖液稀釋來清洗該混合的收集細胞帶，并用SorvalRC3B 3000rpm離心10分鐘。將得到的團粒重懸浮在冷凍保存緩沖液中，密度為3×107/mL。如果需要，等份置于包和/或瓶中。最終得到的豬細胞制劑貯存于液態(tài)環(huán)境下的速率可控的冷凍裝置中。
本發(fā)明的實施例僅用來闡述本發(fā)明的單個方面，并不對限定本發(fā)明的范圍。事實上，根據(jù)前述說明和附圖，除了本說明書的公開和描述外，對本發(fā)明所進行的不同改進對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些改進均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
藥物產(chǎn)品制備流程圖工藝中的測試 建議

藥物產(chǎn)品制備流程圖(繼續(xù))工藝中的測試 建議

權(quán)利要求
1.獲得富集有活的人肝細胞，包括肝干/祖細胞的細胞群落的方法，該方法包括(a)用蛋白水解酶制劑消化整個人肝或其切片以得到消化了的整個人肝或其切片；(b)離解該消化了的整個人肝或其切片以得到細胞懸液；(c)調(diào)整該細胞懸浮的介質(zhì)的密度以在離心時在密度屏障的作用下產(chǎn)生至少兩條分離的細胞帶，該至少兩條帶中至少有一條帶的密度低于該至少兩條帶中的另一條帶的密度；和(d)收集該至少一條較低密度帶以獲得富集有活的人肝細胞，包括肝干/祖細胞的細胞群落。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的富集有活的人肝細胞的細胞群落還含有功能性肝實質(zhì)細胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的富集有活的人肝細胞的細胞群落還含有功能性膽管細胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的富集有活的人肝細胞的細胞群落還含有功能性造血細胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)包括(e)用鰲合緩沖液在約37℃下灌輸整個人肝或其切片約15分鐘；(f)在約37℃下用含有膠原酶和至少另一種蛋白水解酶的酶制劑消化該整個人肝或其切片不長于30分鐘，以產(chǎn)生消化了的肝；和(g)用溫度為4-15℃的收集緩沖液灌輸該消化了的肝。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的酶制劑包括至少一種中性蛋白酶。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的酶制劑包括彈性蛋白酶。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的酶制劑包括LIBERASETM。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的離解包括機械離解。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的離解包括通過切、篩、梳或摩擦肝而進行的機械離解。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)包括(h)過濾細胞懸液以除去碎片和細胞凝聚體；(i)將得到的過濾過的細胞懸液收集到第一包中；(j)任選地測定過濾過的細胞懸液中的細胞濃度；(k)如果需要，校正細胞的濃度以提供起始細胞懸液；(l)將等份的該起始細胞懸液與等體積溶于液態(tài)培養(yǎng)基的25％碘克沙醇混合得到混合物；和(m)將至少部分該混合物與鋪于其上的預(yù)定體積的液態(tài)培養(yǎng)基離心，得到至少一條富集有活的人肝細胞的帶。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(d)包括(n)收集至少一條帶到置于冰上的容器中；(o)任選地測定細胞的存活率和濃度；(p)通過離心和在冷凍緩沖液中重懸浮來清洗該細胞以得到最終細胞懸液；(q)將該最終細胞懸液進行可控速率的冷凍，得到冰凍的細胞懸液；和(r)將該冰凍的細胞懸液貯藏在液氮冷凍裝置中。
13.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的收集緩沖液含有RPMI1640培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含10％人或牛血清。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的過濾步驟包括使所述的細胞緩沖液通過過濾芯。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的液態(tài)培養(yǎng)基包括不含酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的離心以約500×g進行約15分鐘。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的容器包括收集袋。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的冷凍緩沖液包括含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、H2PO4-、HCO3-、HEPES、乳糖酸鹽、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、右旋糖酐-40、腺苷、谷胱苷肽或其組合的混合物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的冷凍緩沖液還包括血清和二甲亞砜。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的混合、血清和二甲亞砜存在的比例約為80∶10∶10v/v/v。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的血清包括人血清、牛血清或其組合。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的培養(yǎng)基的密度用碘克沙醇或碘海醇的水溶液來調(diào)節(jié)。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的碘克沙醇或碘海醇的水溶液含有無菌的60％(w/v)的溶于水的碘克沙醇和等密度的溶于水的碘海醇或其組合。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的培養(yǎng)基的密度用蔗糖的親水性聚合物水溶液來調(diào)節(jié)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的蔗糖的親水性聚合物水溶液含有ficoll、ficoll加帶有EDTA鈣的泛影酸(diatrizoate)或其組合。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的富集的細胞群包括直徑為9-13微米并陽性表達EP-CAM、CD13或兩者的肝祖/干細胞。
27.獲得富集有活的人肝細胞的群落的方法，該細胞群落包括功能性肝實質(zhì)細胞和肝干/祖細胞，該方法包括(a)從新生兒、幼年、少年、成年或死人捐贈者中得到整個人肝或其切片；(b)在37℃下用鰲合緩沖液灌輸該整個人肝或其切片約15分鐘；(c)在37℃下用含有膠原酶和彈性蛋白酶的酶制劑消化該整個人肝或其切片不長于30分鐘，以產(chǎn)生消化肝；(d)用冷的鰲合緩沖液灌輸該消化肝；(e)機械離散該消化肝，得到細胞懸液；(f)使細胞懸液通過過濾芯以除去碎片和細胞凝聚體；(g)將得到的過濾過的細胞懸液收集到第一包中；(h)任選地測定過濾過的細胞懸液中的細胞的存活率和濃度；(i)將濃度調(diào)整為2.5×107個細胞/mL，得到起始細胞懸液；(j)在第二包中將等份的(250mL)該起始細胞懸液與等體積溶于不含酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基的25％碘克沙醇(OptiPrepTM)溶液混合；(k)將得到的混合物(500mL)與鋪于其上的預(yù)定體積的(60mL)不含酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基在COBETM 2991細胞處理器中離心(2000rpm，ca.500×g，15分鐘)，得到至少一條富集有活的人肝細胞的帶。(l)將至少一條帶收集到置于冰上的第三包中；(m)任選地測定第三包中的細胞的存活率和濃度；(n)通過離心和在冷凍緩沖液中重懸浮來清洗第三包中的該細胞以得到最終細胞懸液；(o)將該最終細胞懸液進行可控速率的冷凍，得到冰凍的細胞懸液；(r)將該冰凍的細胞懸液貯藏在液氮冷凍裝置中。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的富集的細胞群富集有直徑為9-13微米并陽性表達EP-CAM、CD13或兩者的肝祖/干細胞。
29.含有富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的細胞群的組合物。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述肝細胞是人肝細胞和哺乳動物肝細胞。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，該組合物還包括肝實質(zhì)細胞、膽管細胞、造血細胞或其組合。
32.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述的肝細胞包括陽性表達EP-CAM、CD13或兩者的細胞。
33.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述的肝細胞包括直徑約為9-13微米的干/祖細胞。
34.含有肝細胞群落的組合物，相對于從肝中獲得的粗細胞懸浮物，該肝細胞群落富集有活的功能性肝實質(zhì)細胞和肝干/祖細胞。
35.如權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述的肝細胞是人肝細胞。
36.如權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述的肝細胞群落還包括陽性表達細胞角蛋白19(CK19)并陰性表達清蛋白的膽管細胞。
37.如權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述的干/祖細胞陽性表達EP-CAM、CD13或兩者。
38.如權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述的群落還包括單核細胞/巨噬細胞系細胞(如Kupffer細胞)、淋巴細胞(如T淋巴細胞)、內(nèi)皮細胞或其組合。
39.如權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述的肝細胞群落去除了免疫系統(tǒng)的細胞。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述的肝細胞群落是用陰性免疫篩選來去除免疫系統(tǒng)的細胞。
41.如權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述的陰性免疫篩選是使用CD45、CD3、CD11b、CD40去除法或其組合來除去造血細胞。
42.如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述的被除去的免疫系統(tǒng)細胞包括單核細胞/巨噬細胞系細胞(如Kupffer細胞)、淋巴細胞(如T淋巴細胞)或兩者。
43.如權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述的捐贈肝經(jīng)歷過一段時間的熱缺血。
44.如權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述的肝細胞從心博停止的捐贈者中獲得。
45.如權(quán)利要求34所述的組合物，其中至少75％的所述肝細胞群落是肝實質(zhì)細胞和肝祖/干細胞。
46.含有富集有活的功能性膽管細胞和肝干/祖細胞的肝細胞群落的組合物。
47.如權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的肝細胞是人肝細胞、豬肝細胞或其混合。
48.如權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的肝細胞獲自心博停止的捐贈者或經(jīng)歷過一段時間的溫缺血。
49.如權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的膽管細胞陽性表達CK19并陰性表達清蛋白。
50.治療肝疾病的方法，該方法包括用有效量的富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的細胞群落給藥。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中的給藥是通過脾動脈或門靜脈導(dǎo)入來實現(xiàn)。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其中的給藥是通過直接導(dǎo)入到肝髓中來實現(xiàn)。
53.如權(quán)利要求50所述的方法，其中的給藥是通過導(dǎo)入到肝被膜下來實現(xiàn)。
54.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的給藥是通過直接導(dǎo)入到脾中來實現(xiàn)。
55.如權(quán)利要求50所述的方法，其中的導(dǎo)入是灌輸或注射。
56.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的肝疾病包括肝炎、肝硬化、先天的代謝錯誤、急性肝衰竭、急性肝感染、急性化學(xué)毒性、慢性肝衰竭、cholangiocitis、膽管硬化、Alagille綜合癥、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥、自免疫性肝炎、膽管閉鎖、肝癌、肝被膜疾病、脂肪肝、半乳糖血癥、膽石、吉爾伯特氏癥候群(Gilbert′s Syndrome)、血色沉著病、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、poryphyria、原發(fā)性硬化性膽管炎、雷伊氏綜合癥(Reye′s Syndrome)、肉狀瘤病、酪氨酸血癥、I型糖原過多癥、威爾森氏癥(Wilson′s disease)。
57.藥物組合物，該組合物含有富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的肝細胞群和藥學(xué)上可接受的載體。
58.如權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的肝細胞是人肝細胞、豬肝細胞或其混合。
59.如權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的肝細胞獲自心博停止的捐贈者或經(jīng)歷過一段時間的溫缺血。
60.如權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的干/祖細胞陽性表達EP-CAM、CD133或兩者。
61.如權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的干/祖細胞直徑大約為9-13微米。
62.如權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的藥學(xué)上可接受的載體包括HYPOTHERMOSOLTM。
63.如權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述的藥學(xué)上可接受的載體還包括人血清和二甲亞砜。
64.進行體外毒性檢測的方法，該方法包括(i)將富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的肝細胞群落暴露于測試試劑；和(ii)觀察該測試試劑對肝細胞群落可能產(chǎn)生的至少一種效果。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的至少一種效果包括對細胞存活率、細胞功能或兩者的效果。
66.進行體內(nèi)藥物代謝研究的方法，該方法包括(i)將富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的肝細胞群暴露于測試試劑；和(ii)在預(yù)定的測試時間后觀察該測試試劑可能產(chǎn)生的至少一種改變。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中所述的至少一種改變包括測試試劑的結(jié)構(gòu)、濃度或兩者發(fā)生變化。
68.肝輔助裝置，該裝置包括裝有富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的肝細胞群落的小室。
69.如權(quán)利要求68所述的裝置，其中所述的肝細胞去除了免疫系統(tǒng)細胞。
70.治療基因表達錯誤的方法，該方法包括(i)將功能性基因拷貝導(dǎo)入到包含有活的功能性肝干/祖細胞的人肝細胞群中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化群落；和(ii)將該轉(zhuǎn)化群落的至少一部分導(dǎo)入到需要該功能性基因拷貝的患者的肝中。
71.治療基因表達錯誤的組合物，該組合物包括轉(zhuǎn)化了的人肝細胞群落，所述群落含有其中導(dǎo)入了功能性基因拷貝的活的功能性肝干/祖細胞。
72.治療基因表達錯誤的藥物組合物，該組合物包括人肝細胞群落和藥學(xué)上可接受的載體，所述的群落包括其中導(dǎo)入了功能性基因拷貝的活的功能性肝干/祖細胞。
73.如權(quán)利要求72所述的組合物，其中所述的藥物學(xué)上可接受的載體包括含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、H2PO4-、HCO3-、HEPES、乳糖酸鹽、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、右旋糖酐-40、腺苷、谷胱苷肽或其組合的混合物。
74.促進受傷或疾病肝的再生的方法，該方法包括用有效量的富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的人肝細胞群落給藥。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中的給藥是通過脾動脈或門靜脈導(dǎo)入、直接導(dǎo)入到肝髓中、導(dǎo)入到肝被膜下或其組合來實現(xiàn)。
76.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的給藥是通過直接導(dǎo)入到脾中來實現(xiàn)。
77.、如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述的導(dǎo)入是灌輸或注射。
78.測試治療肝感染的有效試劑的方法，該方法包括(i)用目標(biāo)感染試劑感染富集有活的功能性肝細胞，包括肝干/祖細胞的人肝細胞群落；(ii)將該受感染的群落暴露于預(yù)定量的測試試劑；(iii)觀察該暴露對受感染的群落可能產(chǎn)生的影響。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的感染試劑包括微生物。
80.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的感染試劑包括一種或多種病毒、細菌、真菌或其組合。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中所述觀察到的效果包括對病毒感染試劑的病毒復(fù)制的效果。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中所述的病毒感染試劑包括肝炎病毒。
83.制備有益蛋白的方法，該方法包括向包含有肝干/祖細胞的肝細胞群落中導(dǎo)入有益蛋白的功能性編碼基因，在有效條件下培養(yǎng)該細胞群落以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄、翻譯和任選的翻譯后修飾，收集該有益蛋白。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中所述的肝細胞是人肝細胞。
85.如權(quán)利要求83所述的方法，其中所述的有益蛋白包括疫苗抗原。
86.制備疫苗的方法，將重組病毒或病毒粒子導(dǎo)入到含有肝干/祖細胞的細胞群落中，該病毒或病毒粒子至少能感染該細胞群落的一些成員而使該受感染的成員表達抗原，于是在向個體導(dǎo)入該群落的受感染成員時產(chǎn)生免疫反應(yīng)，該個體需要免疫來對抗向與該抗原有關(guān)的感染性試劑的進一步暴露。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其中產(chǎn)生基于細胞的免疫反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及從全肝或其切片中獲得含有活的功能性肝細胞的細胞群落的方法、其組合物和用途，該群落富集有肝實質(zhì)細胞和肝干/祖細胞。組合物包括富集有肝實質(zhì)細胞和肝干/祖細胞的肝細胞的組合物和其藥物組合物。用途包括肝疾病治療、肝再生、毒性測試和肝輔助裝置。
文檔編號C12P1/00GK1728946SQ03821174
公開日2006年2月1日 申請日期2003年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者約翰·W·勒德洛, 馬克·E·弗思, 安德魯·T·布魯斯, 洛拉·M·里德, 羅貝特·L·小蘇希奇 申請人:維斯塔治療公司