專利名稱：大環(huán)正鏈分子矩陣的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域從總體上說，本發(fā)明涉及大環(huán)(LC)-正鏈分子作為探針用于矩陣系統(tǒng)的用途。本發(fā)明還涉及以LC-正鏈分子文庫為探針用于矩陣系統(tǒng)中。具體地說，本發(fā)明涉及DNA芯片技術(shù)，該技術(shù)利用了含有單鏈LC-正鏈分子的矩陣。本發(fā)明還描述了制備這種矩陣的方法、利用這種矩陣的方法以及含有這種矩陣的試劑盒及其應(yīng)用。
2.發(fā)明的背景及本領(lǐng)域的發(fā)展?fàn)顩r最近在DNA微矩陣技術(shù)領(lǐng)域所取得的進(jìn)展使我們能夠同時(shí)監(jiān)測大量的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Schena等，Science，270，467-470(1995)，DeRisi等，Science，278，680-686(1997)，Iyer等，Science，283，83-87(1999))。細(xì)胞功能的生理和病理性變化都與基因表達(dá)模式的改變密切相關(guān)。例如，惡性腫瘤的發(fā)生與癌基因的過量表達(dá)及腫瘤抑制基因表達(dá)的下調(diào)相關(guān)。差異表達(dá)基因的鑒定已經(jīng)被作為一種工具用于識別參與疾病過程的基因。
現(xiàn)在已有多種方法可用于檢測差異表達(dá)的基因，其中包括northern印跡分析(Alwine等，Proc.Natl.Acad.Sci.，74，5350-5354(1977))，S1核酸酶保護(hù)分析(Berk等，Cell，12，721-732(1977))，差異顯示(Liang等，Science，257，967-971(1992))，cDNA文庫測序(Adams等，Science，252，1651-1656(1991)，Okubo等，Nature Genet.，2，173-179(1992))，基因表達(dá)系列分析(SAGE)(Velculescu等，Science，270，484-487(1995))，扣除雜交法(Hedrick等，Nature，308，149-153(1984))以及表象差異分析法(RDA)(Hubank等，Nucleic Acids Res.，22，5640-5648(1994)，Lisitsyn等，Science，259，946-951(1993))。但是這些技術(shù)的局限在于從單個(gè)試驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)量有限，實(shí)施起來非常費(fèi)時(shí)。利用cDNA矩陣雜交技術(shù)可以同時(shí)研究數(shù)千到數(shù)萬個(gè)基因。以前的矩陣雜交是將DNA點(diǎn)到尼龍膜上然后與放射性同位素標(biāo)記的cDNA雜交(Augenlicht等，Proc.Natl.Acad.Sci.，88，3286-3289(1991))。最近發(fā)現(xiàn)了一種方法是將cDNA微矩陣點(diǎn)到玻片上，或者是將寡核苷酸點(diǎn)到所謂的基因芯片上，然后與熒光標(biāo)記的探針雜交(Schena等，Science，270，467-470(1995)，Lockhart等，Nature Biotechnol.，14，1675-1680(1996))。
盡管現(xiàn)已有許多矩陣技術(shù)，但仍需要新的矩陣裝置以滿足特殊的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明可以克服前文所述的缺點(diǎn)。本發(fā)明提供了制備LC-正鏈分子的方法，LC-正鏈分子文庫以及建立LC-正鏈矩陣的方法，這些矩陣結(jié)合cDNA雜交技術(shù)可用于檢測不同細(xì)胞之間基因表達(dá)模式的差異。申請人提供了一種以LC-正鏈分子為探針的矩陣。某些噬菌體如M13噬菌體具有單鏈環(huán)狀基因組，常用于DNA測序和誘變。例如，M13噬菌粒是一種可用于構(gòu)建重組噬菌體的質(zhì)粒，經(jīng)改造可產(chǎn)生大量含有靶序列特異性正鏈序列插入片段的環(huán)狀單鏈基因組DNA。這種制備含正鏈DNA插入片段的LC-正鏈分子的方法有很多優(yōu)點(diǎn)，如由于其具有共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)因此對酶的降解有很高的耐受性，與互補(bǔ)核酸有很高的結(jié)合親和能力，很高的序列保真度，不必費(fèi)力地查找靶位點(diǎn)，無需修飾以及可以簡單經(jīng)濟(jì)地大規(guī)模制備。
本發(fā)明涉及含各種不同LC-正鏈分子的文庫。LC-正鏈分子可以含有載體序列和探針序列，其中探針序列處于正向。載體可以是產(chǎn)單鏈核酸的噬菌粒。另外，LC-正鏈分子的長度約1000至20000個(gè)核苷酸。各種不同的LC-正鏈分子可以是彼此分開的或被區(qū)室化。具體地說，載體可以是pSPORT1、pBluescriptII SK(+/-)或pBluescriptII KS(+/-)、pGEM-f、M13mp、pCR2.1、pGL2或pβgal，尤其是M13噬菌體、f1噬菌體或fd噬菌體。
本發(fā)明還涉及含有許多與支持物表面穩(wěn)定結(jié)合的各種不同LC-正鏈分子的矩陣。支持物可以含有氨基-硅烷、聚L賴氨酸或醛涂層。另外，支持物可以是玻片、陶瓷、無機(jī)-有機(jī)合成物、柔性塑料膜、硅、金屬或膜。
本發(fā)明還涉及制備上述矩陣的方法，該方法包括(i)將核酸片段插入到能產(chǎn)生該載體單鏈形式的載體內(nèi)；(ii)通過將含插入片段的載體導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)菌中制備細(xì)菌轉(zhuǎn)化子；(iii)用輔助噬菌體感染轉(zhuǎn)化子以制備LC-正鏈分子；(iv)從轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清液中分離LC-正鏈分子；以及(v)將LC-正鏈分子排列到支持物表面。
在上述方法中，對矩陣或文庫的所有成員來說，核酸片段可以以同一個(gè)方向插入到載體內(nèi)。
另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及利用含許多不同LC-正鏈分子的矩陣檢測樣品內(nèi)DNA的方法，該方法包括(i)標(biāo)記樣品中的DNA；(ii)使含標(biāo)記DNA的樣品與上述矩陣接觸；(iii)使樣品中的標(biāo)記DNA與矩陣中的LC-正鏈分子雜交；以及(iv)檢測DNA與LC-正鏈分子的結(jié)合情況，其中，矩陣上的信號說明存在與矩陣內(nèi)LC-正鏈分子相關(guān)的DNA。
在上述方法中，標(biāo)記物可以是鏈親和素-堿性磷酸酶偶聯(lián)物、化學(xué)熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，例如Cy3或Cy5。
另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及檢測兩種或更多種核酸樣品中DNA的方法，該方法包括標(biāo)記第一樣品中的第一群DNA；用另一種標(biāo)記物標(biāo)記第二樣品中的第二群DNA；使含第一群標(biāo)記DNA的樣品與前述矩陣接觸；使樣品中的第一群標(biāo)記DNA與矩陣中的LC-正鏈分子雜交；使含第二群標(biāo)記DNA的樣品與上述矩陣接觸；使樣品中的第二群標(biāo)記DNA與矩陣中的LC-正鏈分子雜交；以及檢測標(biāo)記DNA與LC-正鏈分子的結(jié)合情況，其中矩陣上的信號說明存在相關(guān)DNA。
至少兩群標(biāo)記DNA可以同時(shí)與同一矩陣接觸，也可以先后與同一矩陣接觸，還可以與不同矩陣接觸，然后比較所得到的結(jié)果。
另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及基因表達(dá)檢測試劑盒，該試劑盒含有上述矩陣和利用該矩陣檢測樣品中DNA的說明書。
上述基因表達(dá)檢測試劑盒還可以含有(i)含有用于制備檢測核酸的引物的容器；(ii)含dNTPs和/或rNTPs的容器；(iii)含DNA合成后標(biāo)記試劑的容器，所述標(biāo)記試劑例如熒光染料的化學(xué)活性衍生物；(iv)含DNA合成酶的容器；(v)含緩沖介質(zhì)的容器；(vi)含信號產(chǎn)生試劑及檢測試劑的容器；以及(vii)用于檢測DNA的說明書。
本發(fā)明還涉及檢測肝癌細(xì)胞的方法，該方法包括檢測與正常肝細(xì)胞相比表達(dá)上調(diào)的基因，這些基因選自細(xì)胞色素P450，IIE亞科(乙醇誘導(dǎo)型)(GenBank編號J02843)；轉(zhuǎn)錄延伸因子A(SII)1；ESTs，與KIAA0206略相似[人源](GenBank編號AI193075)；人骨骼肌原肌球蛋白1.3kbmRNA(GenBank編號AI797037)；KIAA0701蛋白(GenBank編號AI797037)；轉(zhuǎn)錄延長因子S-II，hS-II-T1的mRNA(GenBank編號NM_003195)；聾，常染色體顯性基因5(GenBank編號AF073308)；KIAA1037蛋白(GenBank編號AI383628)；KIAA0375基因產(chǎn)物(GenBank編號AB002373)；Prefoldin 5(GenBank編號AA287397)；KIAA0710基因產(chǎn)物(GenBank編號AB014610)；配對樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1(GenBank編號U70370)；視網(wǎng)膜外片段膜蛋白1(GenBank編號L07894)；ESTs(GenBank編號Z39419)；MYC-相關(guān)鋅指蛋白(嘌呤結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子)(GenBank編號M94046)；泛素連接酶E2L 3(GenBank編號AJ000519)；染色體1上新發(fā)現(xiàn)的人基因(GenBank編號AL040438)；人源克隆24421mRNA序列(GenBank編號AF070641)；人mRNA；cDNA DKFZp566J2146(GenBank編號AL050081)；染色體凝集因子1-樣基因(GenBank編號NM_001268)；KIAA0902蛋白(GenBank編號AB020709)；蛋白酪氨酸激酶9-樣基因(A6-相關(guān)蛋白)(GenBank編號AI188660)；ESTs，與ORF YOR150w略相似(S.cerevisiae)(GenBank編號AI129433)；轉(zhuǎn)錄延長因子B(SIII)，多肽2(GenBank編號AW327285)；以及Spl轉(zhuǎn)錄活化所必需的輔因子，亞基9(GenBank編號AA665998)。
本發(fā)明還涉及檢測肝癌細(xì)胞的方法，該方法包括檢測與正常肝細(xì)胞相比表達(dá)下調(diào)的基因，這些基因選自跨膜蛋白酶，絲氨酸2(GenBank編號U75329)；從PAC 272L16，染色體1上分離到的人基因，與鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶相似(GenBank編號AL023754)；含連有死域的銜接子的CASP2和RIPK1區(qū)域(GenBank編號AA811130)；
Ariadne同系物(GenBank編號AL040708)；以及NADH脫氫酶(泛醌)黃素蛋白1(GenBank編號AW250734)。
本發(fā)明的這些目的及其他目的將在本說明書的以下部分、參考附圖及所附的權(quán)利要求中作進(jìn)一步描述。
附圖的簡要描述從本文下面所給出的詳細(xì)描述中可以更全面地理解本發(fā)明，所給出的附圖只是用于說明的目的，因此并不意味著對本發(fā)明的限制，其中；

圖1顯示的是制備單鏈LC-正鏈分子的示意圖。靶基因的cDNA克隆到M13噬菌粒載體的多克隆位點(diǎn)內(nèi)。這個(gè)構(gòu)建體與輔助噬菌體如M13K07共感染時(shí)可以獲得靶基因的單鏈LC-正鏈分子。
圖2顯示的是少量LC-正鏈分子的大規(guī)模制備。在96孔板內(nèi)孵育1152個(gè)含重組pSPORT1噬菌粒的轉(zhuǎn)化，感染以M13輔助噬菌體，由此大量制備LC-正鏈分子。LC-正鏈分子經(jīng)純化后在1％瓊脂糖凝膠上電泳以確定其數(shù)量和質(zhì)量。C無插入序列的LC-正鏈分子對照。
圖3A-3B顯示的是雙鏈質(zhì)粒分子和LC-正鏈分子的解鏈溫度曲線。在溫度從30℃升高到95℃期間每隔3分鐘溫度每升高0.5℃檢測一次吸光度。A.含TNF-α插入片段的雙鏈?zhǔn)删５腡ml/2曲線。B.含TNF-α插入片段的LC-正鏈分子的Tml/2曲線。
圖4A-4B顯示RNA的質(zhì)量鑒定。分別檢測從正常肝組織及肝癌組織中制備的poly(A)+mRNA的完整性。Cy3-dUTP或Cy5-dUTP-標(biāo)記的靶cDNA混合在一起與cDNA芯片上的PCR產(chǎn)物雜交。雜交后洗滌cDNA芯片，以掃描儀掃描，然后用軟件進(jìn)行分析。將數(shù)據(jù)繪制成散布的點(diǎn)圖。AcDNA芯片的掃描圖。B表達(dá)模式的散布點(diǎn)圖。
圖5顯示肝癌組織的LC-正鏈矩陣的掃描圖。Cy3和Cy5的PMT值分別為450和500。與正常組織相比表達(dá)上調(diào)的基因顯示為紅色；表達(dá)下調(diào)的基因顯示為綠色，黃色代表表達(dá)方式無變化的基因。
圖6顯示正常肝組織和肝癌組織之間表達(dá)模式的比較。表達(dá)模式表示為所測LC-正鏈矩陣的雙變量圖。每個(gè)點(diǎn)都是其密度經(jīng)log2轉(zhuǎn)化后的數(shù)值。
圖7顯示大量制備LC-正鏈分子的實(shí)施例。含有重組噬菌粒的轉(zhuǎn)化子接種到100ml2×LB液體培養(yǎng)基中，37℃持續(xù)振蕩孵育14。用特定的半自動純化裝置從100ml含重組噬菌體的培養(yǎng)上清液中分離LC-正鏈分子。純化后的LC-正鏈分子在1％的瓊脂糖凝膠上電泳并在紫外燈下照相以確定其數(shù)量和質(zhì)量。1道，大量制備的LC-正鏈分子(40ng)，2道，大量制備的LC-正鏈分子(30ng)，3道，小量制備的LC-正鏈分子(32ng)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)包含靶特異性正鏈區(qū)的大環(huán)噬菌體基因組分子可作為探針有效地檢測與之互補(bǔ)的靶cDNA，尤其是矩陣方式的檢測。較好的是，所述矩陣是微矩陣系統(tǒng)。尤以LC-正鏈分子點(diǎn)在基片上的高密度微矩陣系統(tǒng)為佳。本發(fā)明系統(tǒng)可以高通量地在大矩陣方法中確定參與不同細(xì)胞生理過程的基因。
本文所用的術(shù)語“矩陣”或“固相支持物上區(qū)域的矩陣”是指具有各區(qū)域的線性或二維矩陣，所述區(qū)域以不連續(xù)為佳，每個(gè)區(qū)域具有確定的面積，位于固相支持物的表面。
本文所用的術(shù)語“矩陣文庫”是在微滴(多孔)盤或微滴板上排列成二維矩陣的各單鏈LC-正鏈一級重組克隆(包含在噬菌體、噬菌粒或其他載體的單鏈基因組內(nèi))。各個(gè)克隆可通過微滴板和克隆在該板上的位置(行和列)來識別?？寺〉木仃囄膸煊卸喾N用途，包括篩選特異性目的基因或基因組區(qū)域，以及制作物理圖譜。
本文所述的“能在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”是指與目的DNA互補(bǔ)的DNA鏈與目的DNA在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下復(fù)性。類似的，“能在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”是指與目的DNA互補(bǔ)的DNA鏈與目的DNA在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下復(fù)性。復(fù)性過程的“高嚴(yán)謹(jǐn)條件”包括例如高溫和/或低鹽濃度等不利于錯(cuò)配堿基對之間氫鍵形成的條件?！暗蛧?yán)謹(jǐn)條件”是指與高嚴(yán)謹(jǐn)條件相比較低的溫度和/或較高的鹽濃度，這種條件下，當(dāng)兩條DNA鏈基本互補(bǔ)，即使不是完全互補(bǔ)，即可復(fù)性，比如編碼同種蛋白質(zhì)但是由于遺傳密碼的簡并性而序列不同的兩條DNA鏈。適度嚴(yán)謹(jǐn)性的條件，例如6×SSC內(nèi)約45℃雜交，然后用2×SSC，50℃洗滌，可促進(jìn)DNA的雜交，這是本領(lǐng)域所熟知的，可見于《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley& Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟的鹽濃度可以從低嚴(yán)謹(jǐn)條件的約2×SSC、50℃到高嚴(yán)謹(jǐn)條件的0.2×SSC、50℃。另外，洗滌步驟的溫度可以從低嚴(yán)謹(jǐn)條件的約22℃到高嚴(yán)謹(jǐn)條件的約75℃。其他條件參數(shù)見Maniatis，T.等的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》387-389頁的描述，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring N，Y.，(1982)；還見Sambrook J.等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(第二版)，卷2，pp8.46-8.47(1989)的描述，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring，N.Y.
本文涉及基片上正鏈探針文庫的“cDNA文庫”指由靶信使RNA的特異性LC-正鏈分子組成的文庫。
本文涉及靶文庫的“靶cDNA文庫”指細(xì)胞或生物體內(nèi)所有mRNA分子由逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化成cDNA構(gòu)成的集合，因此可在這樣的文庫中查找特定的目標(biāo)cDNA(及其mRNA)。
本文所用的術(shù)語“區(qū)室”是對LC-正鏈分子文庫內(nèi)每個(gè)成員克隆的物理位置描述。這樣的物理位置可以是例如多孔板內(nèi)的孔，常用的有96孔板或96孔深孔板。物理隔屏還可以是空氣，例如各自點(diǎn)在平板、玻片或膜上。在這方面，巨陣列或微矩陣都可采用。區(qū)域化可以理解為將每個(gè)克隆成員彼此分開。還可以通過以膜材料包裹單個(gè)克隆等方式來形成隔屏。
本文所用的術(shù)語“不同的LC-正鏈分子”用于描述形成微矩陣的LC-正鏈分子時(shí)意味著矩陣成員具有不同的LC-正鏈DNA序列，和/或同一或不同LC-正鏈分子的具有不同濃度，和/或不同序列的LC-正鏈分子或不同濃度的LC-正鏈分子的不同混合物。因此，“不同LC-正鏈分子”的矩陣是指含如下成員的矩陣(i)不同的LC-正鏈分子，每個(gè)分子都有確定的量，(ii)不同分級濃度的具有給定序列的LC-正鏈分子，和/或(iii)兩種或更多種不同LC-正鏈分子的不同組合物。
本文所用的術(shù)語“絲狀噬菌體”是指能產(chǎn)生本發(fā)明LC-正鏈分子的載體?？梢杂檬删w或噬菌粒。在這種情況下，將目的序列插入或克隆到載體內(nèi)，這樣當(dāng)噬菌體或噬菌粒產(chǎn)生單鏈分子時(shí)就產(chǎn)生出了LC-正鏈分子。DNA或RNA噬菌體都可用于此目的，例如可采用絲狀噬菌體。絲狀噬菌體如M13、fd和f1是具有環(huán)狀ssDNA分子和絲狀殼體。其生命周期包括細(xì)胞內(nèi)可復(fù)制dsDNA中間體形式，該中間體形式在包裝前又轉(zhuǎn)化成ssDNA分子的形式。這種轉(zhuǎn)化提供了一種制備ssDNA的方法。目前將噬菌體M13用作克隆載體。
噬菌粒載體也有絲狀噬菌體f1復(fù)制起始區(qū)。例如pBluescript(Stratagene，USA)、pGEM-f(Promega，USA)、M13mp、pCR2.1、pGL2、pβgal和pSPORT載體及其衍生物。優(yōu)選的是基于M13噬菌體的噬菌粒載體，如pBluescript SK(+/-)。采用基于M13噬菌體的重組病毒載體的優(yōu)點(diǎn)之一在于該載體可插入各種尺寸的目的片段。由于pBluescriptII KS(+/-)噬菌粒載體具有f1(-/+)復(fù)制起點(diǎn)，可以按照需要的方向插入靶特異性的DNA片段從而形成正向的DNA插入片段。
另一個(gè)可用的含有單鏈環(huán)狀基因組的二十面體形狀噬菌體是FX174。但是這個(gè)克隆載體對插入片段的大小有限制。
本文所用的術(shù)語“大環(huán)正鏈分子(LC-正鏈分子或LC-正鏈DNA)”以及“噬菌體基因組正鏈分子”指單鏈環(huán)狀DNA分子，至少具有一個(gè)與靶cDNA序列基本互補(bǔ)并能與之結(jié)合的正鏈區(qū)，無論靶cDNA是什么來源的。
LC-正鏈分子可用各種方法合成。但是通常利用絲狀噬菌體系統(tǒng)制備，例如M13和噬菌粒。當(dāng)大環(huán)核酸分子是由噬菌體制得時(shí)，也可以被稱為“噬菌體基因組正鏈化合物”。
在本發(fā)明的另外一個(gè)方面，LC-正鏈分子要比具有約15到100個(gè)核苷酸的典型寡核苷酸長。LC-正鏈分子可至少含有約3000個(gè)核苷酸，其中，該DNA分子主要是由外源載體序列組成。一般來說，根據(jù)插入片段的大小及外源載體序列的大小，長度范圍約為1000到8000個(gè)核苷酸。雖然長度約為3000到7000個(gè)核苷酸的片段也可用于本發(fā)明，但是優(yōu)選的長度為約3300到6000堿基。應(yīng)當(dāng)清楚，無需過多試驗(yàn)即可改變和優(yōu)化LC-正鏈分子的長度，只要LC-正鏈分子可選擇性且特異性地與其互補(bǔ)cDNA結(jié)合。
或者，不一定要限定大環(huán)核酸分子長度的上限或下限，特別是當(dāng)利用載體制備大環(huán)核酸分子時(shí)，此時(shí)，載體序列的長度和編碼至少部分靶基因的插入序列的長度共同決定了所產(chǎn)生的單鏈核酸分子的長度。因此，實(shí)施方式之一中，核酸分子的長度等于載體的載量。
大環(huán)核酸分子可同時(shí)包含靶特異性的正鏈序列和外源序列如噬菌體序列。外源序列可包括其他基因的正義鏈和反義鏈。如果用載體來制備核酸分子，外源序列可以是載體序列。大環(huán)核酸分子內(nèi)靶特異性正鏈區(qū)的長度沒有限制，可以是約100個(gè)核苷酸到約5000個(gè)堿基以上。一般來說，長度在約200到約3000之間，尤其是約400到約2000之間。實(shí)施方式之一中，靶特異性正鏈區(qū)編碼完整的基因。
另一實(shí)施方式中，LC-正鏈分子可從作為噬菌體或噬菌粒自然生命周期某階段的基因組制備。
本文所用的“文庫”是指特定生物體來源的克隆的DNA的無序集合，其相互關(guān)系可用物理圖譜來建立。這種文庫可包含約10個(gè)以上的不同克隆，以50個(gè)以上為佳，更優(yōu)選的是在一個(gè)文庫中包含100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1500、2000、2500、3000、4000、5000、7000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000或50000個(gè)以上不同LC-正鏈分子。
本文所用的術(shù)語“微矩陣”是指多個(gè)區(qū)域的排列，這些區(qū)域是不連續(xù)的，排列密度為至少約100/cm2，約1000/cm2為佳。微矩陣內(nèi)區(qū)域具有經(jīng)典維度，例如直徑約10-250μm，并可彼此等距。微矩陣包含選定的一組LC-正鏈分子，這些分子可用來檢測一組細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的情況。
本文的“探針”用于矩陣系統(tǒng)是指已知序列的固定核酸，尤其是固定于基片如玻片的探針。
本文所用的術(shù)語“特異性結(jié)合”是指兩個(gè)分子之間的非隨機(jī)結(jié)合，例如LC-正鏈分子與其互補(bǔ)序列之間的雜交。
本文所用的“基本互補(bǔ)”意味著一個(gè)核酸序列與另一個(gè)核酸序列具有約80％、85％、90％、96％、97％、98％、99％或100％相似度。一般情況下，兩個(gè)核酸分子之間發(fā)生特異性結(jié)合并不要求完全互補(bǔ)。具有足夠的互補(bǔ)性因而能與靶cDNA形成穩(wěn)定雙螺旋的任何LC-正鏈分子都被認(rèn)為具有合適的結(jié)合特異性，因?yàn)榉€(wěn)定雙螺旋的形成依賴于雜交的LC-正鏈分子的序列和長度以及LC-正鏈分子和靶序列之間的互補(bǔ)程度。
本文所用的術(shù)語“靶”或“靶向”用于描述矩陣系統(tǒng)時(shí)是指有待用LC-正鏈探針鑒定其身份和豐度的游離核酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其cDNA，尤指為其制備LC-正鏈分子的基因。在某些情況下，“靶向”意味著使LC-正鏈分子去結(jié)合內(nèi)源性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其cDNA，或被后者結(jié)合。靶核酸序列可以選自任何基因，尤其是那些與惡性腫瘤相關(guān)的基因，其中包括與癌癥及各種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的基因，如免疫疾病、感染性疾病、代謝疾病和遺傳疾病，以及基因表達(dá)異常引起的其他疾病。
本文所用的術(shù)語“單向”或“隨機(jī)基因單向”正鏈文庫是指文庫中每個(gè)克隆的插入基因方向都相同。術(shù)語“隨機(jī)的”是指含有未知序列基因的文庫。
本文所用的術(shù)語“單向扣除文庫”是指選擇性地富集了某些基因的文庫，對照組織或細(xì)胞系相比這些基因在特定組織或細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)或過量表達(dá)。
本文所用的術(shù)語“單基因”正鏈文庫是指已知序列核酸片段的集合，這些核酸片段可以是插入在正鏈核酸產(chǎn)生載體內(nèi)的。
大環(huán)(LC)正鏈分子本發(fā)明提供了耐核酸酶穩(wěn)定性更高和特異性更高的LC-正鏈化合物，以及用具有單鏈環(huán)狀基因組的重組噬菌體制備LC-正鏈化合物的方法。本發(fā)明還提供了作為探針DNA制備矩陣的LC-正鏈DNA文庫?？蓮暮亟M噬菌體的細(xì)菌培養(yǎng)物中同時(shí)小量或大量制備多種基因的特異性的LC-正鏈分子。本發(fā)明實(shí)施例之一中，從3ml培養(yǎng)上清中獲得了1152個(gè)不同LC-正鏈克隆的小量樣品，然后點(diǎn)到硅烷化玻片的表面。從1ml培養(yǎng)上清中一般可獲得1～3μgLC-正鏈DNA。
另一實(shí)施例中，申請人設(shè)計(jì)出一種半自動裝置用于大量制備LC-正鏈DNA文庫，這種裝置主要配備了純化柱、分樣器和真空歧管(vaccum manifold)。利用這種裝置可從100ml培養(yǎng)上清中純化出200μgLC-正鏈分子。利用發(fā)酵罐系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)可將制備規(guī)模放大以升計(jì)。
另外，本發(fā)明實(shí)施例之一中，通過本發(fā)明的噬菌體基因組正鏈方法，矩陣系統(tǒng)高通量檢測基因表達(dá)的效率要高于利用寡核苷酸探針或PCR擴(kuò)增的長核苷酸探針的常規(guī)方法。
現(xiàn)在已有多種方法可用于制備DNA探針的矩陣。LC-正鏈分子可用在這種系統(tǒng)中作為結(jié)合于膜上的探針，例如用在核酸分子矩陣中。在多孔膜上制備有序DNA矩陣的方法就之一是“點(diǎn)印跡”方法。在該方法中，用一真空歧管將多達(dá)例如96份DNA水性樣品從3mm直徑的孔轉(zhuǎn)移到多孔膜上。這種方法的一種常見的變形是“槽印跡”，該方法中的孔是大大拉長的卵圓形。多孔膜經(jīng)烘烤或紫外線照射而使DNA固定于其上。這是適合于一次制備一個(gè)矩陣的手工方法，且通常限于每個(gè)矩陣96個(gè)樣品。
制備基因組片段的有序矩陣的更高效的技術(shù)是將配成矩陣的針頭浸到例如微滴定板的96個(gè)孔內(nèi)，以便將樣品矩陣轉(zhuǎn)移到基片例如多孔膜上。一個(gè)矩陣所包含的針頭被涉及成以以錯(cuò)落的方式在膜上點(diǎn)樣以形成在22×22cm2的面積內(nèi)含9216個(gè)點(diǎn)的矩陣。
最近，已有將矩陣系統(tǒng)設(shè)計(jì)成可大量制造多個(gè)微矩陣，這些微矩陣特征是(i)大量的微小矩陣區(qū)彼此間隔50-200微米或更小，以及(ii)結(jié)合于矩陣各區(qū)域的精確定量，一般為pmol級的LC-正鏈分子(美國專利No.5,807,522，本文已完整納入作為參考，特別是與微矩陣有關(guān)的部分)。
根據(jù)本

發(fā)明內(nèi)容
之一，本發(fā)明的LC-正鏈化合物可如下制備1)制備包含靶核苷酸序列的cDNA片段；2)將cDNA片段克隆到能產(chǎn)生LC-正鏈化合物的噬菌粒載體內(nèi)制成重組噬菌體；以及3)大規(guī)模制備含靶正鏈序列的單鏈環(huán)狀噬菌體基因組?？梢灾苽溆蛇@種LC-正鏈分子構(gòu)成的文庫。
因此，本發(fā)明內(nèi)容之一中，LC-正鏈化合物可以包含靶序列片段，也可以包含完整的基因序列。而且，可以將針對多個(gè)不同基因的多個(gè)靶特異性正鏈序列插入到同一單鏈?zhǔn)删w基因組內(nèi)。這樣，LC-正鏈分子就可以包含一個(gè)以上靶特異性正鏈序列區(qū)。
LC-正鏈化合物具有很高的復(fù)制保真度，因?yàn)樗窃诩?xì)菌內(nèi)由DNA聚合酶復(fù)制的。由于DNA聚合酶具有閱讀校正功能，因此LC-正鏈化合物的保真度高于化學(xué)合成的寡核苷酸。而且，本發(fā)明的LC-正鏈化合物的制備成本低于化學(xué)合成的寡核苷酸或擴(kuò)增的cDNA片段。
在本發(fā)明另一內(nèi)容中，矩陣上的各區(qū)室可以只包含LC-正鏈分子。另一方面，區(qū)室內(nèi)可以同時(shí)包含LC-正鏈分子及其互補(bǔ)鏈，比如雙鏈?zhǔn)删Ｗ冃援a(chǎn)生LC-正鏈分子及其互補(bǔ)鏈的情形。較好的是，矩陣各區(qū)域內(nèi)的LC-正鏈分子與可能存在的各種其互補(bǔ)鏈之比大于1∶1。更好的是，矩陣各區(qū)域內(nèi)的組合物含至少95％的LC-正鏈分子。還要好的是，所述組合物包含的LC-正鏈分子是噬菌體生命周期中產(chǎn)生的含有插入片段的單鏈DNA，此時(shí)，所述區(qū)域內(nèi)只存在該單鏈LC-正鏈分子。
高通量的微矩陣系統(tǒng)利用矩陣進(jìn)行的大規(guī)模表達(dá)模式分析已開始成為細(xì)胞生理學(xué)系統(tǒng)性分析中的主導(dǎo)技術(shù)(Young等，Cell，102，9-15(2000))。這些矩陣現(xiàn)在已被用于多個(gè)方面，其中包括基因開發(fā)(Kati等，J.Pathol.，193，73-79(2001))，疾病診斷(Alizadeh等，Nature，403，503-511(2000))，藥物開發(fā)(Leming等，J.Chem.Inf.Comput.Sci.，40，367-379(2000))，毒物學(xué)研究(Nuwaysir等，Molecular Carcinogenesis，24，153-159(1999))等。制備微矩陣的方法可以利用這樣一些技術(shù)，如直接在玻璃表面合成寡核苷酸探針(長度通常為15-100個(gè)核苷酸)(Lipshutz等，Biotechniques，19，442-447(1995)，Lipshutz等，Nat.Genet.，21，20-24(1999)，Singh-Gasson等，Nat.Biotechnol.，17，974-978(1999))，或?qū)腸DNA克隆簇或cDNA文庫中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物點(diǎn)到基片上(Duggan等，Nat.Genet.，21，10-14(1999))。但是，利用寡核苷酸或PCR產(chǎn)物制備矩陣有一些缺點(diǎn)。例如，要制備數(shù)萬個(gè)經(jīng)修飾的寡核苷酸必需了解序列信息，生產(chǎn)成本高，而且步驟多而費(fèi)時(shí)，包括繁瑣的檢索每個(gè)基因的靶序列、合成、脫鹽、柱純化、濃縮、修飾等。利用PCR產(chǎn)物制備矩陣必需純化質(zhì)粒、用Taq聚合酶擴(kuò)增cDNA和DNA純化，這些都需要大量的成本。本發(fā)明中，我們設(shè)計(jì)了一種LC-正鏈分子矩陣，并證明其可以作為結(jié)合探針用于研究基因表達(dá)模式。
M13噬菌粒作為用于構(gòu)建重組噬菌體的質(zhì)粒經(jīng)改造可產(chǎn)生大量的含正鏈序列的單鏈基因組DNA，因?yàn)槠浜衒1復(fù)制起點(diǎn)?？赏ㄟ^以輔助噬菌體共轉(zhuǎn)染含重組M13噬菌粒的感受態(tài)細(xì)菌從而由培養(yǎng)物中大量制得LC-正鏈分子。
在這方面，能夠產(chǎn)生用于矩陣的大量LC-正鏈分子具有降低矩陣制造成本的優(yōu)勢，相比之下，常規(guī)方法無法方便地制備大量的寡核苷酸和PCRcDAN大片段產(chǎn)物導(dǎo)致難以獲得便宜的矩陣芯片。
本發(fā)明還提供了一個(gè)利用上述LC-正鏈分子文庫進(jìn)行功能基因組研究的高通量系統(tǒng)。本發(fā)明的功能基因組研究系統(tǒng)可快速而集中地研究基因的功能。因此，LC-正鏈文庫可用于確定不同基因產(chǎn)物之間的相互關(guān)系。
本發(fā)明提供了含LC-正鏈分子的各種類型的特異性矩陣以用于鑒定各種動物、植物和微生物細(xì)胞或組織內(nèi)基因的差異表達(dá)。這些矩陣的類型包括而不限于發(fā)育矩陣；腫瘤矩陣；調(diào)亡矩陣；癌基因和腫瘤抑制基因矩陣；細(xì)胞周期基因矩陣；細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體矩陣；生長因子和生長因子受體矩陣；神經(jīng)矩陣等。
本發(fā)明的矩陣可用于基因差異表達(dá)分析等用途。例如，本發(fā)明矩陣可用于以下情形的差異表達(dá)分析(a)疾病狀態(tài)，如腫瘤或正常；(b)不同的組織類型；(c)發(fā)育階段；(d)對外部或內(nèi)部刺激的反應(yīng)；(e)對治療的反應(yīng)；等等。本發(fā)明矩陣還可用于藥物研發(fā)中的大規(guī)模表達(dá)篩選。另外，通過研究某活性組分對特定類型細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的影響可以獲有關(guān)藥物毒性、致癌性、環(huán)境監(jiān)測等的信息。
本

發(fā)明內(nèi)容
之一包括表面具有微矩陣的基片，該矩陣在小于約1cm2的保密局內(nèi)具有至少103個(gè)不同LC-正鏈分子。每個(gè)LC-正鏈分子(i)彼此分開，在矩陣內(nèi)有明確的位置，(ii)長度至少約3000個(gè)堿基，以及(iii)具有確定的量，約0.1fmol到100nmol。
實(shí)施方式之一中，無論何種基片或何種矩陣系統(tǒng)，其表面都可以是包被了聚陽離子聚合物如聚賴氨酸涂層的玻片表面，構(gòu)成矩陣的不同LC-正鏈分子可以通過靜電而非共價(jià)結(jié)合在涂層上，其中每個(gè)LC-正鏈分子都彼此分開地位于表面矩陣中的確定位置。
本發(fā)明還包括檢測一組基因中各基因在第一種細(xì)胞內(nèi)與其在第二種細(xì)胞內(nèi)相比差異表達(dá)的方法。在實(shí)施該方法時(shí)，首先從兩種細(xì)胞內(nèi)分離出mRNA并由mRNA制備熒光標(biāo)記的cDNA，其中第一種細(xì)胞和第二種細(xì)胞的cDNA分別以不同的熒光報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記。
將兩種細(xì)胞來源的標(biāo)記cDNA的混合物加到LC-正鏈分子矩陣內(nèi)，這些LC-正鏈分子代表這兩種細(xì)胞的已知基因，在能使cDNA與矩陣內(nèi)互補(bǔ)LC-正鏈分子雜交的條件下反應(yīng)。然后在熒光激發(fā)條件下檢測矩陣所發(fā)出的熒光信號，所述的條件可使(i)矩陣上優(yōu)先與第一種細(xì)胞或第二種細(xì)胞來源的cDNA雜交的LC-正鏈分子分別激發(fā)出不同顏色的第一種熒光或第二種熒光，以及(ii)矩陣內(nèi)與第一種細(xì)胞和第二種細(xì)胞來源的cDNA雜交數(shù)目基本相同的聚核苷酸分別激發(fā)出獨(dú)特的混合熒光色。然后根據(jù)每個(gè)點(diǎn)上所觀察到的熒光顏色來確定兩種細(xì)胞內(nèi)已知基因的相對表達(dá)水平。
一種代表性的功能基因組集中分析方法如下所述，但這樣的特定實(shí)施方式和實(shí)施例并不意味著以任何方式對本發(fā)明作出限制(1)利用具有單鏈基因組的重組噬菌體載體構(gòu)建cDNA文庫；(2)根據(jù)插入片段大小鑒定和篩選cDNA克隆。插入片段的大小至少約100、200、300、400個(gè)堿基，優(yōu)選至少500到2000、3000、4000、5000或更多個(gè)堿基。cDNA克隆可通過多次小規(guī)模質(zhì)粒制備來分離；(3)擴(kuò)增篩選出的克隆并構(gòu)建LC-正鏈文庫。選出的噬菌粒轉(zhuǎn)化子用輔助噬菌體感染。然后從培養(yǎng)上清中收獲單鏈?zhǔn)删w基因組正鏈化合物；(4)將不同的LC-正鏈分子在玻璃、膜或?yàn)V膜等基片上點(diǎn)成矩陣。該點(diǎn)樣步驟可手工進(jìn)行也可以用點(diǎn)樣器自動進(jìn)行。
靶cDNA的源細(xì)胞可以選自感興趣的細(xì)胞，如正常細(xì)胞，也可以選自各種癌細(xì)胞，如肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、直腸癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胸腺癌和皮膚癌，以及肥胖癥、毛囊病、自身免疫失調(diào)及代謝疾病細(xì)胞。
LC-正鏈分子文庫可以象改進(jìn)的鳥槍法那樣隨機(jī)和單向地插入一組cDNA插入片段來制備，也可以先分別鑒定各插入片段的序列然后將其插入噬菌體載體從而制得目標(biāo)克隆的無豐余克隆文庫。應(yīng)該清楚的是隨機(jī)基因單向LC-正鏈文庫、單基因單向LC-正鏈文庫或待檢宿主細(xì)胞的來源都不一定要是人。根據(jù)本發(fā)明的原理，任何生物體來源的都可以使用，其中包括而不限于哺乳動物、植物和真菌。宿主細(xì)胞可以是任何生物體來源的，只要LC-正鏈化合物能穿過其細(xì)胞膜或細(xì)胞壁。
為了確證LC-正鏈分子具有矩陣結(jié)合劑的功能，我們首先將1152個(gè)非豐余克隆的重組pSPORT噬菌粒和輔助噬菌體M13K07一起轉(zhuǎn)染到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。然后大規(guī)模地從培養(yǎng)上清中純化每個(gè)克隆的LC-正鏈分子并濃縮到0.2-0.5mg/ml的濃度。利用這種方法我們獲得了1152個(gè)樣品。作為結(jié)合劑所在的基片，將聚L賴氨酸或氨基硅烷涂在玻璃表面以增強(qiáng)核酸在玻璃表面的固定化強(qiáng)度(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，10614-19(1996))。在用瓊脂糖凝膠電泳確定了LC-正鏈分子的質(zhì)和量之后，將這些分子用微矩陣點(diǎn)樣儀點(diǎn)到硅烷化的玻片上形成LC-正鏈矩陣。確定自正常肝組織和肝癌組織純化的poly(A+)RNA的質(zhì)量，然后將標(biāo)記的cDNA探針混合并與含1152個(gè)非豐余樣品的LC-正鏈矩陣雜交。
在放射性標(biāo)記或帶有熒光標(biāo)簽的核苷酸存在下將正常肝細(xì)胞和肝癌組織的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Cy3-dNTP和Cy5-dNTP染料是最常用的熒光團(tuán)標(biāo)記試劑。靶序列與含寡核苷酸或擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)物的常規(guī)微矩陣在水性雜交緩沖液中的共孵育分別按經(jīng)典在45℃或65℃進(jìn)行。然而，我們根據(jù)單鏈LC-分子的解鏈溫度優(yōu)選的雜交溫度為60℃。這種最佳雜交溫度的差別反映了LC-正鏈分子探針與常規(guī)的寡核苷酸探針或PCR產(chǎn)物之間的結(jié)構(gòu)差異。雜交后，多次洗滌LC-正鏈矩陣以去掉未結(jié)合的和非特異性信號。計(jì)算機(jī)掃描分析顯示與正常組織相比，1152個(gè)基因中有29個(gè)在肝癌組織表達(dá)上調(diào)，6個(gè)表達(dá)下調(diào)。由此可確認(rèn)LC-正鏈分子作為玻片矩陣上的探針性能優(yōu)良。
對于研究基因的表達(dá)模式來說，LC-正鏈矩陣具有多項(xiàng)優(yōu)勢。第一，LC-正鏈分子可從細(xì)菌轉(zhuǎn)化子如大腸桿菌中快速、準(zhǔn)確而經(jīng)濟(jì)地大規(guī)模制備。第二，噬菌粒載體可插入各種尺寸的正鏈插入片段。由此可利用長序列顯著提高結(jié)合特異性。第三，用LC-正鏈分子制備矩陣不需要耗費(fèi)大量的時(shí)間來檢索靶結(jié)合序列。第四，由于LC-正鏈分子是在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)由DNA聚合酶復(fù)制的因此具有很高的復(fù)制保真度。由于DNA聚合酶具有閱讀校正功能，LC-正鏈分子的保真度要高于化學(xué)合成的寡核苷酸或在試管中擴(kuò)增的cDNA。第五，LC-正鏈分子的制備成本比化學(xué)合成的寡核苷酸或擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物低。最后，由于采用了基于載體的方法，含多種克隆的LC-正鏈分子文庫的構(gòu)建容易并且快速。可以很容易地用疾病細(xì)胞或異常細(xì)胞或組織構(gòu)建出針對特定疾病的特異性文庫。利用這樣的文庫，我們可以很容易地大規(guī)模制備LC-正鏈分子并發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因組群，其中可能包括那些功能未知的基因。另外，如本文所描述，利用人源或其他生物的全基因低豐余或無豐余文庫可以獲知各種疾病的差異表達(dá)模式。為了更有效地發(fā)現(xiàn)抗癌藥物，還可以進(jìn)一步將抑制扣除雜交法(SSH)和cDNA矩陣雜交方法(Kati等，J.Pathol.，193，73-79(2001))聯(lián)用。用含f1復(fù)制起點(diǎn)的噬菌粒載體構(gòu)建扣除cDNA文庫可使特定細(xì)胞或組織內(nèi)過表達(dá)隨機(jī)基因的單向文庫的制備更加簡便。用LC-正鏈矩陣測得的基因表達(dá)模式已得到了如實(shí)時(shí)PCR和Northen印跡等方法的進(jìn)一步確認(rèn)。
在一個(gè)通用的實(shí)施方式中，基片表面是相對親水即可濕潤的表面，如天然具有，結(jié)合了或共價(jià)連接了帶電基團(tuán)的表面。后文所述此類表面之一是吸附有聚陽離子聚合物如聚L賴氨酸層的玻璃表面。
另一實(shí)施方式中，所述表面具有或被制成相對疏水即能使水性介質(zhì)在該表面形成小珠。各種已知的疏水性聚合物，如聚苯乙烯、聚丙稀、聚乙烯都具有理想的疏水特性，就象玻璃和各種可涂于支持物表面的潤滑劑或其他疏水膜一樣。
玻片的涂覆可以是將一層厚度均勻的聚陽離子聚合物如聚賴氨酸置于玻片表面，然后將膜干燥成千涂層。添加的聚陽離子聚合物的量可以是在玻璃表面形成至少單層聚合物所需的足量。聚合物膜可以通過玻璃表面帶負(fù)電荷的甲硅烷基-羥基與聚合物內(nèi)帶正電荷的氨基之間的靜電結(jié)合力而結(jié)合到玻璃表面上。聚L賴氨酸包被的玻片可以購買到，如從Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)。
將一定體積的各種LC-正鏈分子點(diǎn)到聚合物包被的玻片上以形成微矩陣。由于基片的重要特性，當(dāng)水性DNA樣品加到基片上并在報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記的樣品cDNA與基片上矩陣內(nèi)LC-正鏈DNA探針的雜交的條件下，點(diǎn)上的LC-正鏈分子保持著與帶涂層薄片表面的非共價(jià)結(jié)合。
在一優(yōu)選實(shí)施方式中，每個(gè)微矩陣上約1cm2以下的面積上至少含有103個(gè)不同的LC-正鏈分子。在約16mm2的區(qū)域內(nèi)可含有至少400個(gè)區(qū)，或每平方厘米含2.5×103個(gè)區(qū)。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，每個(gè)區(qū)上LC-正鏈分子的量是確定的，以聚核苷酸為例，約0.1fmol到100nmol之間。
在一優(yōu)選實(shí)施方式中，聚核苷酸的長度至少約3000bp，即顯著長于各種原位合成法所制的高密度矩陣內(nèi)寡核苷酸。
標(biāo)記適宜的酶標(biāo)記包括那些氧化酶基團(tuán)來源的標(biāo)記物，這些酶標(biāo)記物通過與底物反應(yīng)催化過氧化氫的生成。特別優(yōu)選的是葡萄糖氧化酶，因?yàn)樗貏e穩(wěn)定，并且其底物(葡萄糖)易于獲得。氧化酶標(biāo)記的活性可通過測定酶標(biāo)記抗體/底物反應(yīng)所產(chǎn)生的過氧化氫的濃度來確定。除了酶以外，其他適宜的標(biāo)記物包括放射性同位素，如碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)，銦(112In)和锝(99mTc)，熒光素和羅丹明等熒光標(biāo)記，還有生物素。
適宜的放射性同位素標(biāo)記包括3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。適宜的非放射性同位素標(biāo)記包括157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
適宜的熒光標(biāo)記包括152Eu標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、異硫氰酸鹽標(biāo)記、羅丹明標(biāo)記、藻紅蛋白標(biāo)記、藻青蛋白標(biāo)記物、別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記、鄰苯二醛標(biāo)記、熒光胺標(biāo)記物、酞菁(Cy3TM)和吲哚羰花青(Cy5TM)。
化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的例子包括魯米那標(biāo)記、異巴比妥標(biāo)記、芳香吖啶酯標(biāo)記、咪唑標(biāo)記、吖啶鹽標(biāo)記、草酸酯標(biāo)記、蟲熒光素標(biāo)記、蟲熒光素酶標(biāo)記和水母發(fā)光蛋白標(biāo)記。
核磁共振對照試劑包括重金屬核，如Gd、Mn和Fe。氘也可以使用。還有用于EPR、PET或其他成像技術(shù)的對照試劑，這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
試劑盒本發(fā)明還包括用于檢測樣品中cDNA的試劑盒。試劑盒一般包括LC-正鏈分子所在的基片，所述LC-正鏈分子在一個(gè)或多個(gè)容器內(nèi)。在一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的試劑盒可以包含試劑、NTPs、酶、純化柱、和與矩陣發(fā)生特異反應(yīng)的檢測核酸。本發(fā)明的試劑盒最好還包含與微矩陣反應(yīng)或不反應(yīng)的核酸。試劑盒還可以包含使用說明及標(biāo)簽。
本發(fā)明并不局限于本文所描述的特殊實(shí)施方式所界定的范圍。除了本文所描述的之外，根據(jù)上面的描述和附圖本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以清楚地理解對本發(fā)明作出的各種修改。這種修改應(yīng)置于本文所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。下面的實(shí)施例只是以說明的方式提供，并不意味著對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1-LC-正鏈矩陣以重組pSPORT1噬菌粒轉(zhuǎn)化已經(jīng)感染了輔助噬菌體M13K07(NEB NucleicAcids，USA)的感受態(tài)細(xì)菌(XL-10 Gold，Stratagene，USA)，然后在含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂板上37℃孵育過夜。將仔細(xì)分離出的轉(zhuǎn)化子接種到96孔深孔板的每個(gè)孔內(nèi)，每孔含有1.4ml含50μg/ml氨芐青霉素和70μg/ml卡那霉素的2×YT液體培養(yǎng)基(含胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl 10g/1000ml)，37℃劇烈振蕩孵育14小時(shí)。每個(gè)克隆的培養(yǎng)一式三份，以求盡可能提高單次純化的LC-正鏈分子得率。為了小量制備LC-正鏈分子，向3ml培養(yǎng)上清內(nèi)加入1/5體積的20％聚乙二醇(PEG 8000)和2.5M NaCl，然后轉(zhuǎn)移到QIAprep 96 M13 Kit(Qiagen，German)內(nèi)。純化步驟按照廠家的說明書用QIAVAC真空歧管(VacuumManifold)(Qiagen，German)完成。制得的LC-正鏈分子在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以檢驗(yàn)其質(zhì)和量。然后干燥洗脫物，重新溶解在10μl3×SSC內(nèi)以調(diào)節(jié)LC-正鏈分子的濃度，再用OmniGrid Microarrayer(GeneMachines，Inc.，USA)點(diǎn)到硅烷化玻片表面(CMT-GAPS，Corning，USA)形成矩陣。每個(gè)玻片都用300mJ的短波UV(Stratalinker，Stratagene，USA)照射引發(fā)交聯(lián)，儲存在干燥器內(nèi)備用。
實(shí)施例2-制備大鼠TNF-α的LC-正鏈分子大鼠TNF-α的cDNA克隆到噬菌粒載體pBluescript(pBS)-KS(+)的多克隆位點(diǎn)內(nèi)。通過M13K07輔助噬菌體感染已經(jīng)轉(zhuǎn)化pBS KS(+)噬菌粒的細(xì)菌制備重組M13噬菌體。利用噬菌粒的F1復(fù)制起點(diǎn)來制備靶基因的LC-正鏈分子。將20％聚乙二醇(PEG 8000)加到過夜培養(yǎng)的感染了輔助噬菌體的細(xì)胞上清中。將噬菌體沉淀物重懸于TE(pH 8.0)中，然后通過酚提取和乙醇沉淀分離噬菌體基因組DNA。從輔助噬菌體和宿主菌的其余基因組DNA中純化LC-正鏈分子，小規(guī)模純化用0.8％低熔點(diǎn)(LMP)瓊脂糖凝膠，大規(guī)模純化用凝膠過濾柱層析(1.0×50cm)。凝膠過濾層析柱內(nèi)的樹脂是超細(xì)的Sephacryl TM S-1000(分子截留值(molecular cutoff)20,000bp)(Amersham Pharmacia Biotech AB，Sweden)，用含0.2 M NaCl(pH 8.3)的50mM Tris-HCl緩沖液裝柱和平衡。LC-分子的起始量調(diào)整為凝膠空隙體積的5％，用平衡樹脂所用的緩沖液洗脫DNA(流速0.3ml/min)。洗脫期間，用雙紫外檢測系統(tǒng)在260/280nm對樣品進(jìn)行UV掃描，每5分鐘收集一次樣品。洗滌樣品組分，用70％冷乙醇沉淀，然后重懸到超純的蒸餾水和PBS(磷酸鹽緩沖液)內(nèi)用于下一步的試驗(yàn)。以1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測純化的LC-分子的量和純度。
實(shí)施例3-Tm分析大鼠TNF-α的單鏈LC-分子和含TNF-α插入片段的雙鏈質(zhì)粒DNA(pBS)-KS(+)噬菌粒的熱變性在100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM PIPES鈉(Sigma，USA)溶液內(nèi)進(jìn)行。在變性試驗(yàn)前，將10μg/ml DNA(10nM)加熱到95℃然后緩慢冷卻到室溫。溫度上升的速度為0.5℃/3min。用配備Peltier溫控器(HewlettPackard，USA)的二極管陣列分光光度計(jì)進(jìn)行測定解鏈溫度。
實(shí)施例4-RNA制備按照廠家建議的方案用Tri試劑(MRC，USA)制備正常肝組織和肝癌組織的總RNA。用磷酸鹽緩沖液洗滌組織，剪切成小碎塊。然后用適量的Tri試劑勻漿10分鐘。用poly(A)Quick mRNA分離試劑盒(Stratagene，USA)按照廠家的說明書純化Poly(A)+mRNA。純化出的poly(A)+mRNA用作制備靶DNA的模板。
實(shí)施例5-靶cDNA的制備和雜交雜交過程總體上按照Dr.Patrick O.Brown的實(shí)驗(yàn)室手冊(http//CMGM.stanford.edu/pbrown)進(jìn)行。簡言之，2μg正常肝組織和肝癌組織來源的poly(A)+mRNA各自在Cy3-dUTP或Cy5-dUTP存在的條件下以oligo-dT為引物反轉(zhuǎn)錄。然后通過一個(gè)microcon-30柱子純化標(biāo)記的cDNA。純化出的靶cDNA重懸于80μl雜交液(3×SSC和0.3％SDS)中，然后在100℃變性2分鐘，加到LC-正鏈分子矩陣上。雜交在濕潤的雜交盒內(nèi)60℃進(jìn)行16小時(shí)。最后，雜交玻片在2×SSC洗滌2分鐘，在0.1×SSC、0.1％SDS洗滌5分鐘，在0.1×SSC洗滌5分鐘，然后旋轉(zhuǎn)干燥，再于室溫下掃描。
實(shí)施例6-數(shù)據(jù)采集及分析
GenePix 4000B掃描儀(Axon instruments，USA)掃描玻片以檢測與cDNA微矩陣雜交的發(fā)熒光靶cDNA通過。Cy3和Cy5的PMT(光電倍增管)值分別為450和500。然后用GenePix Pro 3.0軟件包分析掃描的圖像。每個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度中值減去背景中值就得到信號強(qiáng)度值。表達(dá)值用單乘標(biāo)準(zhǔn)化因子標(biāo)準(zhǔn)化后用于所有的Cy3/Cy5比值，這樣標(biāo)準(zhǔn)化Cy3/Cy5比值的中值為1.0。
實(shí)施例7-大量制備LC-正鏈分子將重組噬菌粒轉(zhuǎn)化到已感染了輔助噬菌體M13K07的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂板上37℃孵育過夜。仔細(xì)挑出單克隆接種到100mlLB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g/1000ml，50μg/ml氨芐青霉素、70μg/ml卡那霉素)內(nèi)。細(xì)胞在37℃持續(xù)振蕩孵育14小時(shí)。細(xì)菌在室溫下6,000rpm離心10分鐘，收集100ml培養(yǎng)上清與20ml溶液I(20％PEG 8000+2.5M NaCl)混合，室溫下孵育10分鐘。然后通過抽真空10分鐘將樣品上到含硼硅酸鹽過濾介質(zhì)的柱子上。然后將50ml溶液II(4M NaClO4，50mM Tris-HCl，pH 8.5)加到柱子內(nèi)使M13裂解和結(jié)合，在室溫下孵育10分鐘使噬菌體完全裂解。抽真空10分鐘使LC-正鏈分子吸附到過濾介質(zhì)上，然后在柱子內(nèi)加入10ml溶液III(80％EtOH，20mM NaCl，2mM Tris-HCl，pH 7.5)，抽真空10分鐘。再此用溶液III洗滌，然后通過再抽真空15分鐘去除緩沖液。LC-正鏈分子用10ml無菌水洗脫。LC-正鏈分子在1％瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下拍照以確定其質(zhì)和量。
實(shí)施例8-結(jié)果實(shí)施例8.1-LC-正鏈矩陣的制備我們制備了LC-正鏈分子微矩陣(圖1)以檢驗(yàn)其可否用于研究不同基因總體表達(dá)模式。用1152個(gè)低豐度克隆的重組pSPORT1噬菌粒轉(zhuǎn)化含輔助噬菌體M13K07的感受態(tài)大腸桿菌以制備LC-正鏈分子。在96孔板上高通量地制備LC-正鏈分子。純化出的LC-正鏈分子用1％瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下照相(圖2)。用微矩陣儀將LC-正鏈分子的單鏈DNA樣品在硅烷化的玻片上排成矩陣。
實(shí)施例8.2-LC-正鏈分子的解鏈溫度單鏈LC-正鏈分子與含TNF-α插入片段的雙鏈?zhǔn)删NA之間的結(jié)構(gòu)差異通過測定其解鏈溫度(Tml/2)來確定。在260nm處監(jiān)測雙鏈?zhǔn)删NA的吸光度值，隨著溫度的不斷升高在87℃左右時(shí)出現(xiàn)一個(gè)典型的色值變化(圖3A)。但是，單鏈LC-正鏈分子解鏈溫度的監(jiān)測中，54℃左右出現(xiàn)一個(gè)小斜率的色值變化，表明分子內(nèi)一些短雙螺旋發(fā)生變性(圖3B)。以上結(jié)果表明LC-正鏈分子是單鏈分子。另外，可以根據(jù)以上結(jié)果確定適宜的雜交溫度。
實(shí)施例8.3-RNA質(zhì)量驗(yàn)證RNA的質(zhì)量通常會決定微矩陣試驗(yàn)的結(jié)果。分別用正常肝組織和肝癌組織來源的poly(A)+mRNA合成Cy3-dUTP或Cy5-dUTP標(biāo)記的cDNA。標(biāo)記的cDNA混合后與DNA芯片上的cDNA探針在65℃雜交。洗滌LC-正鏈微矩陣并用掃描儀掃描(圖4A)，然后用軟件分析。數(shù)據(jù)經(jīng)log2轉(zhuǎn)化后繪制成散布圖(圖4B)。掃描圖像顯示RNA的純度足可用于下一步的標(biāo)記和與LC-正鏈矩陣的雜交。
實(shí)施例8.4-鑒定肝癌組織內(nèi)差異表達(dá)的基因用前文所述的方法用如實(shí)施例8.3所述制備并確定完整的poly(A)+mRNA檢測肝癌組織內(nèi)基因的表達(dá)模式，所不同的是將標(biāo)記的靶cDNA加到LC-正鏈微芯片上且雜交在60℃進(jìn)行。然后掃描LC-正鏈微芯片，分析其表達(dá)模式(圖5)。數(shù)據(jù)經(jīng)log2轉(zhuǎn)化后繪制成散布圖(圖6)。剔除中值的總和低于200的基因。從試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)肝癌組織內(nèi)1152個(gè)基因中有29個(gè)(～2.5％)的表達(dá)上調(diào)(表1)。在這29個(gè)基因中，有幾個(gè)是以前已被證實(shí)與肝癌的進(jìn)展相關(guān)，如CD44抗原(Endo K.等，J.Hepatology，32(1)78-84，2000)、肌苷一磷酸脫氫酶(Jackson R.C.等，Nature256(5515)331-333，1975)，多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病1(Nakajima K.等，Intern.Med.30(1)20-24，2000)以及鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶2(Arizono K.等，Life Sci.53(12)1031-1037，1993)。另一方面，1152個(gè)基因中有6個(gè)在肝癌組織內(nèi)的表達(dá)下調(diào)(表2)。在這6個(gè)基因(～0.5％)中，纖維蛋白原樣因子1(Kohno T.等Jpn.J.Cancer Res.91(11)1103-1110，2000)此前曾被報(bào)道在成人T細(xì)胞行白血病中其表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果說明LC-正鏈分子可作為結(jié)合試劑用于微芯片中來檢測基因的差異表達(dá)。
實(shí)施例8.5-大量制備LC-正鏈DNA制備大量質(zhì)量穩(wěn)定且可靠的DNA微芯片需要大規(guī)模制備LC-正鏈分子。大規(guī)模制備LC-正鏈分子已經(jīng)可用半自動″prototypical″儀器來完成。該裝置具有96個(gè)內(nèi)徑為37mm的純化柱，兩個(gè)泵送容量分別為30ml和100ml的8孔分樣器，以及一個(gè)真空歧管(vacuum manifold)(60W×42L×60H)。重組噬菌粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的含輔助噬菌粒M13K07大腸桿菌內(nèi)。挑取單克隆接種到100m1LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃持續(xù)振蕩培養(yǎng)14小時(shí)。用半自動純化裝置從100ml培養(yǎng)上清中純化LC-正鏈分子。用1％瓊脂糖電泳檢測大規(guī)模制備的LC-分子的質(zhì)和量(圖7)。用該裝置從100ml培養(yǎng)上清中大約可以純化出200μgLC-正鏈分子。
本文所引用的所有文獻(xiàn)都已完整納入本文作為參考。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員只需要利用常規(guī)的試驗(yàn)就可以知道或能夠確定本文所描述的本發(fā)明的特定實(shí)施方式的等效實(shí)施方式。這些等效實(shí)施方式都包含在權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
表1.肝癌組織內(nèi)表達(dá)上調(diào)(＞2×)的基因列表


表2.肝癌組織內(nèi)表達(dá)下調(diào)(＞2×)的基因列表

權(quán)利要求
1.含不同LC-正鏈分子的文庫。
2.如權(quán)利要求1所述的文庫，其中所述的LC-正鏈分子含載體序列和探針序列，所述探針序列處于正向。
3.如權(quán)利要求2所述的文庫，其中所述的載體是能產(chǎn)生單鏈的噬菌粒。
4.如權(quán)利要求1所述的文庫，其中所述的LC-正鏈分子的長度約為1000到20000個(gè)核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的文庫，其中的不同LC-正鏈分子彼此分開。
6.如權(quán)利要求2所述的文庫，其中所述的載體是pSPORT1、pBluescriptII SK(+/-)或KS(+/-)、pGEM-f、M13mp、pCR2.1、pGL2或pβgal。
7.如權(quán)利要求2所述的文庫，其中所述的載體是M13噬菌體、fl噬菌體或fd噬菌體。
8.矩陣，含有與支持物表面穩(wěn)定結(jié)合的多種不同LC-正鏈分子。
9.如權(quán)利要求8所述的矩陣，其中所述的支持物具有氨基硅烷、聚L賴氨酸或醛涂層。
10.如權(quán)利要求8所述的矩陣，其中所述的支持物是玻片、陶瓷、無機(jī)或有機(jī)合成物、柔性塑料膜、硅、金屬或膜。
11.制備權(quán)利要求8所述矩陣的方法，該方法包括(i)將核酸片段插入到能生成自身單鏈形式的載體內(nèi)；(ii)通過將含插入片段的載體導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)菌中制備細(xì)菌轉(zhuǎn)化子；(iii)用輔助噬菌體感染轉(zhuǎn)化子以制備LC-正鏈分子；(iv)從轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清液中分離LC-正鏈分子；以及(v)將LC-正鏈分子排列到支持物表面。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，核酸片段按同一方向插入到載體內(nèi)。
13.檢測樣品中與矩陣中一群不同LC-正鏈分子相關(guān)的DNA的方法，該方法包括(i)標(biāo)記樣品中的DNA；(ii)將含標(biāo)記DNA的樣品與權(quán)利要求8所述的矩陣接觸；(iii)使樣品中的標(biāo)記DNA與矩陣中的LC-正鏈分子雜交；以及(iv)檢測DNA與LC-正鏈分子的結(jié)合情況，其中矩陣上的信號說明存在與矩陣內(nèi)LC-正鏈分子相關(guān)的DNA。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中的標(biāo)記物是鏈親和素-堿性磷酸酶偶聯(lián)物、化學(xué)熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中的標(biāo)記物是Cy3或Cy5。
16.檢測兩種或更多種核酸樣品中DNA的方法，該方法包括(i)標(biāo)記第一樣品中的第一群DNA；(ii)用另一種標(biāo)記物標(biāo)記第二樣品中的第二群DNA；(iii)使含第一群標(biāo)記DNA的樣品與權(quán)利要求8所述的矩陣接觸；(iv)使樣品中的第一群標(biāo)記DNA與矩陣中的LC-正鏈分子雜交；(v)使含第二群標(biāo)記DNA的樣品與權(quán)利要求8所述的矩陣接觸；(vi)使樣品中的第二群標(biāo)記DNA與矩陣中的LC-正鏈分子雜交；以及(vii)檢測標(biāo)記DNA與LC-正鏈分子的結(jié)合情況，其中矩陣上的信號說明存在DNA。
17.基因表達(dá)分析試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求8所述的矩陣和如何使用該矩陣檢測樣品中DNA的說明書。
18.如權(quán)利要求17所述的基因表達(dá)分析試劑盒，該試劑盒包含(i)含有用于制備檢測核酸的引物的容器；(ii)含dNTPs和/或rNTPs的容器；(iii)含DNA合成后標(biāo)記試劑的容器，如熒光染料的化學(xué)活性衍生物；(iv)含DNA合成酶的容器；(v)含緩沖介質(zhì)的容器；(vi)含信號產(chǎn)生試劑及檢測試劑的容器；以及(vii)檢測DNA的使用說明書。
19.檢測肝癌細(xì)胞的方法，該方法包括檢測與正常肝細(xì)胞相比表達(dá)上調(diào)的基因，所述基因選自細(xì)胞色素P450，IIE亞群(乙醇誘導(dǎo)的)(GenBank編號J02843)；轉(zhuǎn)錄延伸因子A(SII)1；ESTs，與KIAA0206略些相似[人源](GenBank編號AI193075)；人骨骼肌原肌球蛋白1.3kb mRNA(GenBank編號AI797037)；KIAA0701蛋白(GenBank編號AI797037)；轉(zhuǎn)錄延長因子S-II，hS-II-T1的mRNA(GenBank編號NM_003195)；聾，常染色體顯性基因5(GenBank編號AF073308)；KIAA1037蛋白(GenBank編號AI383628)；KIAA0375基因產(chǎn)物(GenBank編號AB002373)；Prefoldin 5(GenBank編號AA287397)；KIAA0710基因產(chǎn)物(GenBank編號AB014610)；配對樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1(GenBank編號U70370)；視網(wǎng)膜外片段膜蛋白1(GenBank編號L07894)；ESTs(GenBank編號Z39419)；MYC-相關(guān)鋅指蛋白(嘌呤結(jié)合性轉(zhuǎn)錄因子)(GenBank編號M94046)；泛素偶聯(lián)酶E2L 3(GenBank編號AJ000519)；染色體1上的新的人基因(GenBank編號AL040438)；人源克隆24421 mRNA序列(GenBank編號AF070641)；人mRNA；cDNA DKFZp566J2146(GenBank編號AL050081)；染色體凝集因子1-樣基因(GenBank編號NM_001268)；KIAA0902蛋白(GenBank編號AB020709)；蛋白酪氨酸激酶9-樣基因(A6-相關(guān)蛋白)(GenBank編號AI188660)；ESTs，與ORF YOR150w略相似(S.cerevisiae)(GenBank編號AI129433)；轉(zhuǎn)錄延長因子B(SIII)，多肽2(GenBank編號AW327285)；以及Spl轉(zhuǎn)錄活化所必需的輔因子，亞基9(GenBank編號AA665998)。
20.檢測肝癌細(xì)胞的方法，該方法包括檢測與正常肝細(xì)胞相比表達(dá)下調(diào)的基因，所述基因選自跨膜蛋白酶，絲氨酸2(GenBank編號U75329)；從PAC 272L16，染色體1上分離到的人基因，與鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶相似(GenBank編號AL023754)；含連有死域的銜接子的CASP2和RIPK1結(jié)構(gòu)域(GenBank編號AA811130)；Ariadne同系物(GenBank編號AL040708)；以及NADH脫氫酶(泛醌)黃素蛋白1(GenBank編號AW250734)。
全文摘要
本發(fā)明描述了矩陣中的大環(huán)(LC)－正鏈分子。LC－正鏈分子矩陣結(jié)合cDNA雜交技術(shù)以檢測不同細(xì)胞之間表達(dá)模式的差異。LC－正鏈分子用重組噬菌粒從非豐余克隆中純化，然后排列到硅烷化玻片上。通過LC－正鏈矩陣與Cy3－或Cy5－標(biāo)記的cDNA制備物在60℃雜交，在肝癌組織內(nèi)檢測到29個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因和6個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。
文檔編號C12Q1/68GK1678758SQ03820929
公開日2005年10月5日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月27日
發(fā)明者樸鐘九, 李潤漢 申請人:維爾精股份有限公司