專利名稱：確定致病性病毒對蛋白酶抑制劑易感性的組合物和方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及確定致病性病毒對抗病毒化合物易感性的組合物和方法。所述組合物和方法可用于鑒別治療病毒感染的有效藥物治療方案，以及鑒別和確定潛在治療化合物的生物學(xué)有效性。
2.發(fā)明背景自二十世紀八十年代早期以來，感染人免疫缺陷病毒(“HIV”)(獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)的致病因素)的人數(shù)已超過6千萬。參見Lucas，2002，Lepr Rev.73(1)64-71。HIV/AIDS如今在亞撒哈拉非洲是導(dǎo)致死亡的最主要原因，而且其在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的原因中位列第四。在2001年末，全球大約有4千萬HIV攜帶者。參見Norris，2002，Radiol Technol.73(4)339-363。
現(xiàn)代抗-HIV藥的靶點是HIV生命周期的不同階段和HIV復(fù)制和/或生存必需的多種酶。已批準(zhǔn)用于AIDS治療的藥物包括核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿巴卡韋、核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如替諾福韋，非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如奈韋拉平、依法韋侖、地拉韋啶和蛋白酶抑制劑例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。
抗病毒藥作用的一個結(jié)果是其能夠?qū)Σ《緩?fù)制施加足以使其選擇抗藥性突變株的選擇壓力(Herrmann等，1977，Ann NY Acad Sci 284；632-637)。當(dāng)藥物量增加時，復(fù)制病毒種群所受的選擇壓力增加從而促進抗藥性突變株更快速生成。
由于抗藥性的出現(xiàn)不可避免，因此必須設(shè)計在面對抗性病毒種群時能夠最優(yōu)化治療的策略。確定抗藥性對藥物治療失敗的影響是困難的，因為可能產(chǎn)生抗藥性的患者也有可能具有其它能夠使患者易于發(fā)生預(yù)后不良的其它因素(Richman，1994，AIDS Res Hum Retroviruses10901-905)。另外，每個患者通常都含有病毒突變株的不同混合物，所述混合物具有對抗病毒藥不同易感性的不同突變株。
用于評估抗病毒藥抗性的傳統(tǒng)方法是不足夠的；確定HIV對抗病毒劑的抗性的經(jīng)典檢測法復(fù)雜、費時、昂貴、具有潛在危險，且不能針對特定患者的治療進行定制。參見Barre-Sinoussi等，1983，Science220868-871；Popovic等，1984，Science 224497-500)和其變化形式(例如參見，Goedert等，1987，JAMA 257331-334；Allain等，1987，N.Engl.J.Med.3171114-1121；Piatak等，1993，Science2591749-1754；Urdea，1993，Clin.Chem.39725-726；Kellam和Larder，1994，Antimicrobial Agents and Chemo.3823-30)。
目前通常使用兩種方法檢測對抗病毒藥的抗性。第一種方法，稱為表型分析，直接檢測獲自感染者病毒的病毒對特定抗病毒藥的易感性。Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44920-928和Hertogs等，1998，Antimicrob Agents Chemother 42(2)269-76描述了目前廣泛使用的表型分析。Gunthard等，1998，AIDS ResHum Retroviruses 14869-76和Schuurman等，1999，J Clin Microbiol.372291-96描述了目前流行的基因型測定法。Hirsch等，2000，JAMA2832417-26對目前分析藥物易感性的可用檢測法作了一般性分析。
第二種方法，稱為基因型分析，檢測病毒中能夠影響藥物易感性的突變并可將特定基因突變和抗藥性及藥物失敗聯(lián)系起來?；蛐头治鰴z測取自患者的病毒，尋找與對特定藥物抗性相關(guān)的特定基因突變的存在?；蛐头治鲇幸恍﹥?yōu)于表型分析的優(yōu)勢，最顯著的是檢測試驗可以相對簡易和快速地實施。檢測可在短至數(shù)日的時間內(nèi)完成，并且由于其復(fù)雜性較低，因此其在實施上會稍便宜。然而，基因型數(shù)據(jù)的解讀要依賴于先前關(guān)于特定突變和藥物易感性改變間的相關(guān)性的認識。
迄今為止關(guān)于使用降低的易感性的基因型相關(guān)性來預(yù)測抗病毒藥，特別是靶向針對不斷進化的HIV的藥物的有效性的努力充其量也是有缺陷的。能夠更精確的預(yù)測給定抗病毒藥或藥物組合是否在對特定患者的治療中有效的算法通過將不大可能成功的藥物在其施用給該患者前鑒別出來從而節(jié)省時間和費用。更重要地是，其可通過減少在用不會改善他或她的HIV感染的強效毒素治療時給他或她帶來的損害從而提高患者的生活質(zhì)量。因此，迫切需要一種預(yù)測特定藥物是否在對特定患者的治療中有效的更為精確的算法。此外，基于基因型的分析法比表型分析更快速并具有更高的成本效率。
3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于研發(fā)和使用確定抗病毒療法或聯(lián)合療法有效性的算法的方法和組合物。該算法基于由表型臨床臨界值(對治療的抗性開始而敏感性終止的點)指導(dǎo)的配對的表型和基因型數(shù)據(jù)的分析。該算法顯著地改善了患者的生活質(zhì)量，這是因為該算法精確預(yù)測給定的抗病毒藥在治療患者時是否有效，從而減少用不會改善他或她的HIV感染的強效毒素治療時產(chǎn)生的對他或她產(chǎn)生的傷害。
一方面，本發(fā)明提供了能夠向患者提供有效治療方案的算法，該算法通過預(yù)測感染個體能否對抗病毒劑或聯(lián)合劑治療發(fā)生應(yīng)答，從而設(shè)計出不會給患者帶來不需要的副作用的有效治療方案。而且，由于避免了無效藥物的使用，故可以節(jié)省大量的時間和費用。
一方面，本發(fā)明提供了確定病毒對抗病毒療法易感性的方法，包括在病毒基因組或病毒酶中檢測是否存在與對抗病毒療法的易感性降低相關(guān)的突變。
另一方面，本發(fā)明提供了確定抗病毒療法對感染病毒的個體的有效性的方法，該方法包括在來自所述個體的樣品中檢測是否存在與對抗病毒療法的易感性降低相關(guān)的突變。
本發(fā)明還提供了通過如上所述測定相同或不同的抗病毒療法的有效性而監(jiān)測接受抗病毒療法的個體中病毒感染的臨床進展的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括人免疫缺陷病毒(“HIV”)的蛋白酶中與對蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)的突變的核酸和多肽。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。
一方面，本發(fā)明提供了一種確定人免疫缺陷病毒(HIV)對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括檢測所述HIV編碼的蛋白酶是否存在表1中所列的一種或多種HIV蛋白酶突變；并且將表4所提供的一組規(guī)則應(yīng)用于所述突變；其中如果滿足所述一組規(guī)則，則所述HIV對所述蛋白酶抑制劑治療具有抗性的可能性增加。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定人免疫缺陷病毒(HIV)感染個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測是否存在表1中所列的一種或多種HIV蛋白酶突變；并且將表4所提供的一組規(guī)則應(yīng)用于所述突變；其中如果滿足所述一組規(guī)則，則所述個體對所述蛋白酶抑制劑治療具有抗性的可能性增加。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括檢測所述HIV編碼的蛋白酶在所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M或I84V。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定HIV感染個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測HIV蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M或I84V。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括檢測所述HIV編碼的蛋白酶是否存在選自下組的突變V11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V和C95F，其中所述突變與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)，并且所述突變的存在表明HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加。
在一個優(yōu)選實施方案中，蛋白酶抑制劑是安潑那韋。
在另一個優(yōu)選實施方案中，所述人免疫缺陷病毒是1型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。
另一方面，本發(fā)明提供了長度為約10～約40個核苷酸的編碼HIV蛋白酶的一部分的寡核苷酸，該部分包括位于所述人免疫缺陷病毒中所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95的突變，其中所述突變與對所述蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L，I54M或I84V。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的至少10個連續(xù)殘基的分離多肽，其中該多肽包括前面所列的本發(fā)明的至少一個突變，并且其中該突變與對蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)。在一個特定實施方案中，蛋白酶抑制劑是安潑那韋。
在另一個實施方案中，包括所述一個或多個突變的多肽與具有SEQID NO1的氨基酸序列的多肽具有至少70％，但小于100％的同一性；該多肽具有與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有大于80％同一性的氨基酸序列；或該多肽具有與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有大于90％同一性的氨基酸序列；其中該突變與對蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過序列特異性寡核苷酸探針與編碼所述突變的人免疫缺陷病毒的核酸序列雜交檢測蛋白酶中是否存在突變的方法，其中雜交的發(fā)生指示所述突變是否存在。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過確定編碼突變的核酸序列而檢測蛋白酶中是否存在突變的方法。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過擴增核酸而檢測蛋白酶中是否存在突變的方法，所述核酸擴增是通過例如聚合酶鏈反應(yīng)而進行的。
在一個實施方案中，個體正在進行或已經(jīng)進行抗病毒藥物治療。在另一種實施方案中，抗病毒藥物是所述蛋白酶抑制劑或不同的蛋白酶抑制劑。
在一個實施方案中，所述蛋白酶的11位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的11位氨基酸是I或L。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的33位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的33位氨基酸是F。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的34位氨基酸是含有中性、極性或親水性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的34位氨基酸是Q。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的43位氨基酸是含有中性、疏水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的43位氨基酸是T。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的48位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的48位氨基酸是M。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是A。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的54位氨基酸是S或T。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的58位氨基酸是含有酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的58位氨基酸是E。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的71位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的71位氨基酸是L。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的76位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的76位氨基酸是V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是含有酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的79位氨基酸是任何氨基酸，前提是所述氨基酸不是P。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的82位氨基酸是含有中性、疏水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的82位氨基酸是A或F。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的83位氨基酸是含有酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的83位氨基酸是D。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是A。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的84位氨基酸是C。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的91位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的91位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的91位氨基酸是A或V。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的91位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的91位氨基酸是S。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的95位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。在另一個實施方案中，所述蛋白酶的95位氨基酸是F。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了檢測在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個氨基酸位置是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變的方法。
4.附圖簡述

圖1圖解說明HIV-1的基因組結(jié)構(gòu)。
圖2是流程圖，描述了得到仔細分析的最終一組樣品所采用的步驟。
圖3A顯示了NL4-3 HIV(GenBank登錄號AF324493)蛋白酶的氨基酸序列(SEQ.ID.NO1)。
圖3B顯示了NL4-3 HIV(GenBank登錄號AF324493)蛋白酶基因的核酸序列(SEQ.ID.NO2)。
圖4顯示了通過對2499個樣品的CART分析產(chǎn)生的樹狀圖。
圖5是與安潑那韋抗性相關(guān)的突變對的矩陣。
圖6是通過2499個樣品的下一輪CART分析產(chǎn)生的樹狀圖。
圖7表示通過N88S導(dǎo)致的含有I50V的病毒的安潑那韋抗性的重新敏感化。該圖表示含有I50V；I50V和N88S；或I50V和L90M的克隆對蛋白酶抑制劑的表型易感性，示出了每組克隆的平均倍數(shù)改變(誤差柱代表一個標(biāo)準(zhǔn)差)。藥物名稱縮寫如下APV，安潑那韋；IDV，茚地那韋；LPV，洛匹那韋；NFV，奈非那韋；RTV，利托那韋；SQV，沙奎那韋；ATV，阿塔扎那韋(atazanavir)(BMS 232632)。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種確定抗病毒藥有效性的算法的研究方法，所述方法基于表型臨床臨界值指導(dǎo)的配對表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)的綜合分析。本發(fā)明還提供了確定病毒對抗病毒療法易感性的方法，確定抗病毒療法對感染病毒個體有效性的方法，和監(jiān)測接受抗病毒療法的個體中病毒感染的臨床進展的方法。另一方面，本發(fā)明還提供了核酸和多肽，它們包含人免疫缺陷病毒(“HIV”)的蛋白酶中與對蛋白酶抑制劑，如安潑那韋的易感性降低相關(guān)的突變。
5.1縮略語“APV”是蛋白酶抑制劑安潑那韋的縮寫。
“PI”是蛋白酶抑制劑的縮寫。
“PT-R”和“PT-S”分別是“表型抗性”和“表型敏感性”的縮寫。
“GT-R”和“GT-S”分別是“基因型抗性”和“基因型敏感性”的縮寫。
“PCR”是“聚合酶鏈反應(yīng)”的縮寫。
“FC”是“倍數(shù)改變”的縮寫。
本文中使用的20種遺傳編碼的L-氨基酸的氨基酸表示法是常規(guī)的，如下所述
除非另有描述，當(dāng)多肽序列用一串單字母和/或三字母縮寫表示時，該序列是以N→C方向的，這與習(xí)慣作法一致。
在本文中將序列中的各氨基酸表示為AN，其中A是序列中氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記，而N是序列中的位置。在本文中將氨基酸序列中的突變表示為A1，NA2，其中A1，是參照蛋白質(zhì)序列中的氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記，A2是突變的蛋白質(zhì)序列中氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記，而N是氨基酸序列中的位置。例如，G25M突變表示在第25位氨基酸上甘氨酸改變?yōu)榧琢虬彼?。本文中，還可以將突變表示為NA2，其中N是氨基酸序列中的位置而A2是突變的蛋白質(zhì)序列中氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記(例如，25M，是指在第25位氨基酸上野生型氨基酸改變?yōu)榧琢虬彼?。此外，本文中突變還可以表示為A1N，其中A1是參照蛋白質(zhì)序列中的氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母標(biāo)記和N是氨基酸序列中的位置(例如，G25表示在第25位氨基酸上甘氨酸改變?yōu)槿魏伟被?。該表示法通常在當(dāng)突變的蛋白質(zhì)序列中的氨基酸或者是未知的或者(如果突變的蛋白質(zhì)序列中的氨基酸可以是任何氨基酸)是除參照蛋白質(zhì)序列所發(fā)現(xiàn)氨基酸之外的那些時使用。氨基酸位置根據(jù)包含突變的區(qū)域來源的蛋白質(zhì)的全長序列進行計數(shù)。DNA序列中的核苷酸和點突變的表示法是類似的。
本說明書全文所使用的涉及包括特定核酸堿基序列的核酸的縮寫是一般的單字母縮寫。因此，當(dāng)包括于核酸中時，天然存在的編碼核酸堿基縮寫如下腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。除非另有所指，將表示為一串單字母縮寫的單鏈核苷酸序列和雙鏈序列的上鏈以5’-3′的方向表示。
5.2定義如本文所使用的，下述術(shù)語具有如下含義除非另有所指，“主要突變”是指影響酶活性位點，即在酶底物復(fù)合物相關(guān)的、或當(dāng)將病毒置于抗病毒劑的選擇壓力下時在復(fù)制早期重復(fù)出現(xiàn)的，或?qū)︶槍共《緞┑耐蛔兊谋硇鸵赘行跃哂袕娮饔玫哪切┌被嵛恢玫耐蛔儭?br> “次要突變”是指不是主要突變的且促成易感性降低或補償由主要突變所加的總體缺陷的突變。
“表型分析”是檢測病毒(例如HIV)對特定抗病毒劑的易感性的檢測法。
“基因型分析”是確定生物體、生物體的部分、基因或基因部分的基因序列的檢測法。所述檢測法經(jīng)常在HIV中使用以確定是否存在與抗藥性相關(guān)的特定突變。
如本文所使用的，“基因型數(shù)據(jù)”是關(guān)于例如病毒基因型的數(shù)據(jù)?；蛐蛿?shù)據(jù)的實例包括，但不限于，病毒、病毒部分、病毒基因、病毒基因部分、或與病毒核酸或蛋白質(zhì)中一個或多個核苷酸或氨基酸殘基具有同一性的核苷酸或氨基酸序列。
“易感性”是指病毒對特定藥物的反應(yīng)。對藥物易感性減少或降低的病毒對藥物的抗性增高或敏感性降低。對藥物易感性增加或增強或更大的病毒對藥物的敏感性增高或抗性降低。
病毒對特定藥物的表型易感性是連續(xù)統(tǒng)一體。然而，其事實上可用于劃定一個閾值或多個閾值用于簡化對特定倍數(shù)改變結(jié)果的解讀。對于已經(jīng)收集了充分臨床結(jié)果數(shù)據(jù)的藥物，能夠確定“臨床臨界值”，如下文所述。
“臨床臨界值”是指一個具體的點，在這個點抗性開始而敏感性性終止。其可通過患者用特定藥物治療失敗可能性顯著增加的藥物易感性水平進行確定。如臨床研究中所確定的，對于不同的抗病毒劑來說臨界值不同。通過評估抗性和結(jié)果數(shù)據(jù)可在臨床試驗中確定臨床臨界值。治療開始時檢測藥物易感性(表型)?？稍谥委熯^程的每個預(yù)定的時間點監(jiān)測治療應(yīng)答，例如病毒負荷的改變。藥物易感性與治療應(yīng)答相關(guān)聯(lián)并通過與治療失敗相關(guān)的抗性水平可確定臨床臨界值(總體實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析)。
“ICn”是指抑制濃度。其是在患者的血液或體外抑制致病性微生物(例如HIV)復(fù)制n％所需的藥物濃度。因此，“IC50”是指將病毒復(fù)制抑制了不存在藥物時觀測的水平的50％的抗病毒劑濃度?！盎颊逫C50”是指抑制來自患者的病毒的復(fù)制50％所需的藥物濃度，“參照IC50”是指抑制參照或野生型病毒復(fù)制50％所需的藥物濃度。類似地，“IC90”是指抑制病毒復(fù)制90％的抗病毒劑濃度。
“倍數(shù)改變”是患者病毒和藥物敏感的參照病毒的藥物易感性的數(shù)值對比。其是患者IC50與藥物敏感的參照IC50的比值，即，患者IC50/參照IC50＝倍數(shù)改變(“FC”)。倍數(shù)改變?yōu)?.0提示患者病毒表現(xiàn)出與藥物敏感的參照病毒一樣的藥物易感性程度。倍數(shù)改變低于1提示患者病毒比藥物敏感的參照病毒更敏感。倍數(shù)改變高于1提示患者病毒的易感度低于藥物敏感的參照病毒。倍數(shù)改變等于或高于臨床臨界值是指患者病毒具有對藥物應(yīng)答的較低的可能性。倍數(shù)改變低于臨床臨界值是指患者病毒對該藥物敏感。
“安潑那韋倍數(shù)改變”是指安潑那韋抗來自患者血漿樣品的IC50與安潑那韋抗NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的IC50的比值。
如果病毒的APV倍數(shù)改變低于2.5，則該病毒對APV“敏感”。
如果病毒的APV倍數(shù)改變?yōu)?.5或高于2.5，則該病毒對APV有“抗性”。
如果病毒具有一種特性，例如與對抗病毒療法的易感性降低相關(guān)的突變，則該病毒具有對抗病毒療法“易感性降低的可能性增加”。如果具有該特性的病毒種群，平均來說，與其它不具有所述特性的相似病毒種群相比對抗病毒療法更易感，則該病毒的特性與易感性降低相關(guān)。因此，特性存在和易感性降低間的相關(guān)性既不必絕對化，也不需要該特性對于賦予易感性降低是必要的(即，該特性在降低易感性方面發(fā)揮誘發(fā)性的作用)或充分的(即，特性單獨存在即為充分的)。
本文中術(shù)語“％序列同源性”與術(shù)語“％同源性”、“％序列同一性”和“％同一性”互換使用并是指當(dāng)用序列比對程序進行比對時，2個或多個肽序列間氨基酸序列同一性的水平。例如，如本文所用的，80％同源性是指由確定的算法所確定的80％序列同一性的相同事物，并相應(yīng)地與具有在給定序列長度上的高于80％序列同一性的給定序列同源。序列同一性的示例性水平包括，但不限于，具有與給定序列60、70、80、85、90、95、98％或更高的序列同一性。
可用于確定兩個序列間同一性的示例性計算機程序包括，但不限于，BLAST程序包，例如，BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，其已經(jīng)公開于互聯(lián)網(wǎng)上，其網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。還可參見Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10(特別參考公開的缺省分配，即，參數(shù)w＝4，t＝17)和Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402。當(dāng)評估給定氨基酸序列相對于GenBank蛋白質(zhì)序列和其它公開數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列時，通常采用BLASTP程序?qū)嵤┬蛄袡z索。優(yōu)選使用BLASTX程序在GenBank蛋白質(zhì)序列庫及其他公共數(shù)據(jù)庫中檢索在全部可讀框中翻譯為氨基酸序列的核酸序列。BLASTP和BLASTX均使用開放空位罰分為11.0和延伸空位罰分為1.0的缺省參數(shù)以及用BLOSUM-62矩陣運行。參見Altschul等，1997。
為了確定2個或多個序列間的“％同一性”，使用例如，MacVector6.5版中的CLUSTAL-W程序?qū)嵤﹥?yōu)選的所選序列的比對，所述程序以缺省參數(shù)，開放空位罰分為10.0，延伸空位罰分為0.1，和BLOSUM 30相似性矩陣運行。
“極性氨基酸”是指含有在生理pH下不帶電荷的側(cè)鏈，但含有至少一個其中由雙原子共享的電子對且靠一個原子保持得更近的鍵的親水性氨基酸。遺傳編碼的極性氨基酸包括Asn(N)、GLN(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“非極性氨基酸”是指含有在生理pH下不帶電荷的側(cè)鏈并含有其中由雙原子共享的電子對且由雙原子的每個原子同等保持的鍵(即，側(cè)鏈?zhǔn)欠菢O性的)的疏水性氨基酸。遺傳編碼的非極性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(1)、Leu(L)、Met(M)和Val(V)。
“親水性氨基酸”是指表現(xiàn)為根據(jù)Eisenberg等(1984，J.Mol.Biol.179125-142)的標(biāo)準(zhǔn)化一致疏水性尺度低于0的疏水性的氨基酸。遺傳編碼的親水性氨基酸包括Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水性氨基酸”是指表現(xiàn)為根據(jù)Eisenberg等(1984，J.Mol.Biol.179125-142)的標(biāo)準(zhǔn)化一致疏水性尺度高于0的疏水性的氨基酸。遺傳編碼的疏水性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)，Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)。
“酸性氨基酸”是指含有pK值低于7的側(cè)鏈的親水性氨基酸。酸性氨基酸通常具有由于缺失氫離子而在生理pH下帶負電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括Asp(D)和Glu(E)。
“堿性氨基酸”是指含有pK值高于7的側(cè)鏈的親水性氨基酸。堿性氨基酸通常具有由于水合氫離子的聯(lián)合而在生理pH下帶正電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包括Arg(R)，His(H)和Lys(K)。
“突變”是與參照核酸或多肽相比，氨基酸序列或相應(yīng)核酸序列中存在的變化。對于本發(fā)明包括HIV蛋白酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的實施方案，編碼蛋白酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的參考核酸是分別存在于NL4-3 HIV(GenBank登錄號AF324493)中的蛋白酶或逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列。雖然肽的氨基酸序列可直接用，例如，埃德曼降解或質(zhì)譜分析法進行確定，更典型地，肽的氨基酸序列可由編碼該肽的核酸的核苷酸序列推導(dǎo)得出。任何本領(lǐng)域已知的用于確定核酸序列的方法都是可用的，例如，Maxam-Gilbert測序(Maxam等，1980，Method in Enzymology 65499)，雙脫氧法測序(Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)或基于雜交的方法(例如參見，Maniatis等，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates和Wiley InterScience，NY)。
病毒中的“抗性相關(guān)突變”(“RAM”)是與病毒對抗病毒劑易感性的降低相關(guān)的突變。RAM可在一些病毒，包括，但不限于人免疫缺陷病毒(“HIV”)的任意一種中發(fā)現(xiàn)。所述突變可在一種或多種病毒蛋白質(zhì)，例如，HIV的蛋白酶、整合酶、包膜或逆轉(zhuǎn)錄酶中發(fā)現(xiàn)。RAM可相對于參照株進行確定。對于本發(fā)明包括HIV蛋白酶的實施方案，所述參照蛋白酶是由NL4-3 HIV(GenBank登錄號AF324493)編碼的蛋白酶。
“突變體”是含有相對于參照病毒、基因或蛋白質(zhì)的一個或多個改變的序列的病毒、基因或蛋白質(zhì)。
本文通篇所使用的術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可彼此互換。
術(shù)語“參照”和“野生型”在本文全文中可互換使用。
本文通篇所使用的術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可彼此互換。
5.3抗性相關(guān)突變一方面，本發(fā)明提供了包括HIV蛋白酶中突變的核酸和多肽。優(yōu)選地，HIV是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。在一個實施方案中，所述突變與對蛋白酶抑制劑的易感性增加相關(guān)。蛋白酶抑制劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是安潑那韋。
一方面，本發(fā)明提供了包括HIV蛋白酶中與對蛋白酶抑制劑，如安潑那韋的易感性降低或增加相關(guān)的突變的肽、多肽或蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了源自HIV蛋白酶的并包括與對蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)的突變的多肽。在另一個實施方案中，所述多肽包括超過一個與對蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)的突變。在另一個實施方案中，所述多肽包括一個與對蛋白酶抑制劑的易感性增加相關(guān)的突變。在另一個實施方案中，所述多肽包括超過一個與對蛋白酶抑制劑的易感性增加相關(guān)的突變。本發(fā)明的多肽包括由這些多肽修飾或來源自這些多肽的肽、多肽和蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述多肽包括翻譯后修飾。在另一個實施方案中，所述多肽包括一個或多個氨基酸類似物。
在優(yōu)選實施方案中，所述多肽包括一個或多個與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)的突變。表1提供了與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)的突變的列表。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了源于HIV蛋白酶并且包含選自下組突變的至少一個突變的多肽V11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V和C95F，其中所述突變與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)。
在另一個優(yōu)選實施方案中，包含所述突變的該多肽包含SEQ IDNO1的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、85、90或95個連續(xù)的氨基酸，所述序列可以存在所述一個或多個突變。
在另一個實施方案中，所述多肽與含有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽具有至少70％，但低于100％的同一性；所述多肽含有與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有高于80％同一性的氨基酸序列；或所述多肽含有與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有高于90％同一性的氨基酸序列；其中所述突變與對蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)。
在一個實施方案中，所述多肽是天然存在的。在另一個實施方案中，所述多肽是人工設(shè)計的。
為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的同一性百分數(shù)，將序列比對以便實現(xiàn)最佳比較目的(例如，可將空位引入第一個氨基酸或核酸序列中以便與第二個氨基酸或核酸序列進行最佳對比)。然后比較位于相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的位置被第二個序列中相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸所占據(jù)，則該分子在這一位置是同一的。兩個序列間的同一性百分比是序列間共有相同位置數(shù)的函數(shù)(％同一性＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)(例如，重疊位置)×100)。在一個實施方案中，兩個序列長度相同。
兩個序列間同一性百分數(shù)的測定可采用數(shù)學(xué)算法完成。用于兩個序列比較的數(shù)學(xué)算法的一個優(yōu)選的，非限制性的實例是按Karlin和Altschul修改的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，(1993))Karlin和Altschul算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，(1990))。所述算法已引入Altschul等((1990)J.Mol.Biol.215403-410)的NBLAST和XBLAST程序中?？刹捎肗BLAST程序，得分＝100，字長＝12實施BLAST核苷酸檢索以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？刹捎肵BLAST程序，得分＝50，字長＝3實施BLAST蛋白質(zhì)檢索以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為獲得為了用于比較目的的有空位的比對，可使用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402所描述的Gapped BLAST?；蛘撸墒褂肞SI-Blast來實施多重檢索來檢測分子間的距離關(guān)系。同前。當(dāng)使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序時，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選的，非限制性的實例是Myers和Miller的算法(CABIOS(1989))。所述算法已引入ALIGN程序(2.0版)中，該程序是CGC序列比對軟件包的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序來比較氨基酸序列時，可使用PAM120加權(quán)余數(shù)表、空位長度罰分12和空位罰分4。用于序列分析的其它算法是本領(lǐng)域已知的，并包括如描述于Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.，103-5中的ADVANCE和ADAM和描述于Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-8的FASTA。在FASTA中，ktup是分配檢索靈敏度和速度的控制性選擇。如果ktup＝2，可通過尋找比對的殘基對發(fā)現(xiàn)所比較的兩個序列中的相似區(qū)；如果ktup＝1，可檢測單個比對的氨基酸。對于蛋白質(zhì)序列可將ktup設(shè)為2或1，或?qū)τ贒NA序列設(shè)為1～6。如果ktup不是特別指定的，則其缺省值對于蛋白質(zhì)是2而對于DNA是6。
兩個序列間的同一性百分數(shù)可使用與上述方法相似的技術(shù)進行確定，含有或不含有允許的空位。在計算同一性百分數(shù)時，通常計算精確匹配。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼或與本發(fā)明的多肽或其生物活性部分相關(guān)的多核苷酸、寡核苷酸或核酸，包括，例如，足以用作鑒別、分析、突變或擴增本發(fā)明的核酸的雜交探針、PCR引物或測序引物的核酸分子。
在一個實施方案中，所述核酸編碼包括對HIV蛋白酶中與對蛋白酶抑制劑例如安潑那韋的易感性降低或增加相關(guān)的突變的多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼多肽的核酸，所述多肽源自HIV蛋白酶并包括一個或多個與對蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)的突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了編碼多肽的核酸，所述多肽包括一個或多個與對蛋白酶抑制劑的易感性增加相關(guān)的突變。本發(fā)明的核酸包括由這些核酸序列修飾或衍生的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。在一個實施方案中，核酸包括核苷酸類似物。在一個實施方案中，核酸是天然存在的。在另一個實施方案中，核酸是人工設(shè)計的。
核酸可以是任何長度。例如，核酸的長度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375、400、425、450，475或500個核苷酸。核酸的長度可以是，例如，小于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500或9000個核苷酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸具有適于檢測本文所描述的突變，例如作為探針或引物的長度和序列。
在一個實施方案中，所述核酸編碼包括一個或多個與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)的突變的多肽。表1提供了與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)的突變的列表。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸，它編碼源于HIV蛋白酶并且包含選自下組突變的至少一個突變的多肽V11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V和C95F。
在另一個優(yōu)選實施方案中，包含所述突變的所述寡核苷酸包含SEQID NO2的15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、180、210、240、255、270或285個連續(xù)的核酸，所述序列可以存在所述一個或多個突變。
在另一個實施方案中，包含所述一個或多個突變的寡核苷酸與含有SEQ ID NO2的核酸序列的寡核苷酸具有至少60％，但低于100％的同一性；所述寡核苷酸含有與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有高于70％的同一性的核苷酸序列；所述寡核苷酸含有與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有高于80％的同一性的核苷酸序列；或所述寡核苷酸含有與SEQ ID NO2的核苷酸序列具有高于90％的同一性的核苷酸序列。兩個核苷酸序列的同一性百分數(shù)可按前面所述進行確定。
除SEQ ID NO2的核苷酸序列外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到導(dǎo)致氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性可存在于種群中(例如，人群)。由于天然等位基因變異，所述遺傳多態(tài)性可存在于種群中的個體中。天然等位基因變異通常能導(dǎo)致特定基因的核苷酸序列中1-5％的變異。作為天然等位基因變異結(jié)果的并且不改變功能活性的任何和全部所述核苷酸變異和得到的氨基酸變異或多態(tài)性均包含在本發(fā)明的范圍中。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了適于用作檢測本發(fā)明的核酸序列的引物或雜交探針的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可僅包括編碼全長的本發(fā)明多肽的核酸序列的部分例如，可用作探針或引物的片段或編碼本發(fā)明的多肽的生物活性部分的片段。該探針可包括與其連接的標(biāo)記基團，例如，放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。在各實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈上進行修飾。
5.4 發(fā)現(xiàn)藥物抗性相關(guān)的病毒突變另一方面，本發(fā)明提供了在病毒或病毒衍生物中發(fā)現(xiàn)抗性相關(guān)的突變的方法。
5.4.1 病毒和病毒樣品根據(jù)本發(fā)明的抗性相關(guān)的突變(“RAM”)可存在于任何類型的病毒，例如在動物中發(fā)現(xiàn)的任何病毒中。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述病毒包括已知感染哺乳動物的病毒，所述哺乳動物包括狗、貓、馬、羊、牛等。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述病毒是已知感染靈長類動物的病毒。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述病毒是已知感染人類的病毒。感染人類病毒的實例包括，但不限于，人免疫缺陷病毒(“HIV”)、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、其它人皰疹病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲、乙和丙型肝炎病毒、鼻病毒和人乳頭狀瘤病毒。在本發(fā)明的一個實施方案中，病毒是HIV。優(yōu)選地，病毒是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。上述是目前存在對其有效抗病毒化療的特定病毒的代表并表示逆轉(zhuǎn)錄病毒科、皰疹病毒科、正粘病毒科、副粘病毒、微小RNA病毒、黃病毒、肺病毒和肝DNA病毒科。本發(fā)明可用于由這些科內(nèi)的其它病毒所產(chǎn)生的其它病毒感染以及從其它病毒科中的目前是否存在有效治療的病毒引起的病毒感染。
根據(jù)本發(fā)明的RAM可在用本領(lǐng)域任何已知的獲取病毒樣品的方法獲得的病毒樣品中發(fā)現(xiàn)。所述方法包括，但不限于，從病毒感染的人或動物獲取病毒樣品或從病毒培養(yǎng)物中獲取病毒樣品。在一個實施方案中，所述病毒樣品獲自病毒感染的人類個體。所述病毒樣品可獲自感染個體的身體的任何部分或任何預(yù)期含有病毒的分泌物。所述部分的實例包括，但不限于血液、血清、血漿、唾液、淋巴液、精液、陰道粘液和其它體液的樣品。在一個實施方案中，所述樣品是血液、血清或血漿樣品。
在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的RAM存在于獲自培養(yǎng)物的病毒中。在某些實施方案中，所述培養(yǎng)物可獲自實驗室。在其它實施方案中，所述培養(yǎng)物可獲自保藏中心，例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心。
在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的RAM存在于病毒衍生物中。在一個實施方案中，病毒衍生物自身不具有病原性。在另一個實施方案中，病毒的衍生物是基于質(zhì)粒的系統(tǒng)，其中質(zhì)粒的復(fù)制或用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞的復(fù)制受選擇壓力的是否存在的影響，從而選擇增加對選擇壓力抗性的突變。在某些實施方案中，病毒衍生物包括感興趣的核酸或蛋白質(zhì)，例如作為抗病毒療法靶位的那些核酸或蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，可將感興趣的基因摻入載體中。例如參見，美國專利號5,837,464和6,242,187以及PCT公開WO99/67427，上述各專利引入本文作為參考。在一個優(yōu)選的實施方案中，基因可以是編碼蛋白酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的基因。
在另一個實施方案中，無須使用完整病毒。代替地，可使用摻入載體的病毒部分。優(yōu)選地，抗病毒藥靶向于所使用的該病毒部分。
在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的RAM存在于遺傳修飾的病毒中。可使用本領(lǐng)域中已知任何用于遺傳修飾病毒的方法對病毒進行遺傳修飾。例如，可將病毒在實驗室培養(yǎng)物中按需要的次數(shù)培養(yǎng)傳代。在一個實施方案中，不施加選擇壓力(即，不對病毒施加適于具有特定特征的病毒的復(fù)制的處理)，經(jīng)過隨機遺傳漂移(drift)而累積新的突變。在另一個實施方案中，病毒在培養(yǎng)物中生長時(即，該病毒在適于具有一個或多個特性的病毒的復(fù)制的條件下培養(yǎng))，將選擇壓力施加于該病毒。在一個實施方案中，選擇壓力是抗病毒療法。任何已知的抗病毒療法均可用作選擇壓力。在一個實施方案中，所述病毒是HIV而所述選擇壓力是蛋白酶抑制劑。在另一個實施方案中，所述病毒是HIV-1而所述選擇壓力是蛋白酶抑制劑。任何蛋白酶抑制劑均可用于施加選擇壓力。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑選自沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在另一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑是安潑那韋。通過用蛋白酶抑制劑，例如，安潑那韋處理體外培養(yǎng)的HIV，技術(shù)人員可選擇具有對所述蛋白酶抑制劑，如安潑那韋抗性增加的HIV的突變株?？烧{(diào)整所述選擇壓力的嚴緊性以便增加或降低不具有所選特性的病毒的存活。
另一方面，根據(jù)本發(fā)明的RAM可通過誘變處理病毒、病毒基因組或病毒基因組的部分進行制備。本領(lǐng)域中已知的任何誘變方法均可用于該目的。在一個實施方案中，所述誘變基本上是隨機的。在另一個實施方案中，基本上隨機的誘變通過對病毒、病毒基因組或病毒基因組的部分進行誘變處理進行實施。在另一個實施方案中，對編碼作為抗病毒療法的靶位的病毒蛋白的基因進行誘變處理。基本隨機的誘變處理的實例包括，例如，暴露于誘變劑(例如，溴乙錠、乙基甲烷磺酯、乙基亞硝基脲(ENU)等)、放射(例如，紫外線)、插入和/或除去可轉(zhuǎn)座元件(例如，Tn5、Tn10)或在細胞、細胞提取物或在具有增高的誘變率的體外復(fù)制系統(tǒng)中的復(fù)制。例如參見，Russell等，1979，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 765918-5922；Russell，W.，1982，Environmental Mutagens and CarcinogensProceedings of the ThirdInternational Conference on Environmental Mutagens。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能認識到雖然每一個這些誘變方法基本上在分子水平是隨機的，每個都具有其自身優(yōu)選的靶位。
另一方面，可能影響病毒對抗病毒治療的敏感性的突變采用定點誘變進行制備?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何定點誘變方法(例如參見，Maniatis等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterScience，NY)?？蓪⑺龆c誘變實施于，例如，特定的基因或基因組區(qū)、基因或基因組區(qū)的特定部分、或基因或基因組區(qū)中的一個或幾個特定核苷酸。在一個實施方案中，將所述定點誘變實施于病毒基因組區(qū)、基因、基因片段或基于一個或多個標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸。在一個實施方案中，對基因或基因的部分實施定點誘變，因為其編碼已知為或疑為抗病毒療法靶位的蛋白質(zhì)，例如，編碼HIV蛋白酶的基因。在另一個實施方案中，選擇基因的部分或基因中的一個或少數(shù)幾個核苷酸進行定點誘變。在一個實施方案中，將要進行誘變處理的核苷酸編碼已知或疑為與抗病毒化合物相互作用的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，將要誘變處理的核苷酸編碼已知或疑為在具有針對抗病毒治療易感性降低的病毒株中突變的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，所述誘變處理的核苷酸編碼的氨基酸殘基毗鄰或靠近已知或疑為與抗病毒化合物相互作用的或已知或疑為在具有針對抗病毒療法易感性降低的病毒株中突變的蛋白質(zhì)殘基一級序列。在另一個實施方案中，誘變處理的核苷酸編碼毗鄰或靠近已知為或疑為與抗病毒化合物發(fā)生相互作用或已知為或疑為在具有對抗病毒療法增高的易感性的病毒株中突變的蛋白質(zhì)殘基的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)氨基酸殘基。在另一個實施方案中，所述誘變處理的核苷酸編碼氨基酸殘基位于或靠近已知為或疑為與抗病毒化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)的活性位點。例如參見，Sarkar和Sommer，1990，Biotechniques，8404-407。
5.4.2 檢測病毒中是否存在突變可通過本領(lǐng)域中已知的任何用于檢測突變的方法檢測病毒中是否存在根據(jù)本發(fā)明的RAM?？稍诰幋a特定蛋白質(zhì)的病毒基因中或在該蛋白質(zhì)自身，即在該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中檢測突變。
在一個實施方案中，所述突變位于病毒基因組中。所述突變可位于，例如，編碼病毒蛋白質(zhì)的基因中，在編碼病毒蛋白的基因的順式或反式作用調(diào)控序列、基因間序列或內(nèi)含子序列內(nèi)。突變能夠影響改變病毒針對抗病毒療法的易感性的病毒結(jié)構(gòu)、功能、復(fù)制或環(huán)境的任何方面。在一個實施方案中，突變位于是抗病毒療法靶位的編碼病毒蛋白質(zhì)的基因內(nèi)。
可使用多種技術(shù)檢測病毒基因中的突變。病毒DNA或RNA可用作所述試驗技術(shù)的起點，并可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法進行分離。
可以通過多種方法檢測特定核酸序列中的突變，如病毒基因特定區(qū)域中的突變，所述方法包括，但不限于基于等位基因特異性限制內(nèi)切酶切割的限制片段長度多態(tài)性檢測(Kan和Dozy，1978，Lancetii910-912)，錯配修復(fù)檢測(Faham和Cox，1995，Genome Res 5474-482)、MutS蛋白的結(jié)合(Wagner et al.，1995，Nucl Acids Res 233944-3948)、變性梯度凝膠電泳(Fisher et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.801579-83)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(Orita etal.，1983，Genomics 5874-879)、在錯配堿基對的RNA酶切割(Myerset al.，1985，Science 2301242)、異雙鏈體DNA的化學(xué)(Cotton etal.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.854397-4401)或酶促(Youil et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9287-91)切割、基于寡核苷酸特異性引物延伸的方法(Syv_nen et al.，1990，Genomics 8684-692)，遺傳位分析(Nikiforov et al.，1994，NuclAcids Res 224167-4175)、寡核苷酸連接分析(Landegren et al.，1988，Science 2411077)、寡核苷酸特異性連接鏈反應(yīng)(″LCR″)(Barrany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88189-193)、空位-LCR(Abravaya et al.，1995，Nucl Acids Res 23675-682)、用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)程序進行的放射性或熒光DNA測序、和肽核酸(PNA)分析(Orum et al.，1993，Nucl.Acids Res.215332-5356；Thiedeetal.，1996，Nucl.Acids Res.24983-984)。
此外，病毒DNA或RNA可用于雜交或擴增試驗中，從而檢測涉及基因結(jié)構(gòu)異常情況，包括點突變、插入、缺失和基因組重排。所述試驗可包括，但不限于，Soutbern分析(Southern，1975，J.Mol.Biol.98503-517)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)(Orita等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862766-2770)，和PCR分析(美國專利號4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188；PCR Strategies，1995 Innis等(eds.)，Academic Press，Inc.)。
用于檢測基因特異性突變的所述診斷方法可包括例如，將所述病毒核酸與一個或多個標(biāo)記的核酸試劑，包括重組DNA分子、克隆的基因或其簡并變體，在適于這些試劑與其互補序列特異性退火的條件下進行接觸和孵育。優(yōu)選地，這些核酸試劑的長度是至少15～30個核苷酸。在孵育后，從所述核苷酸分子雜交體中除去所有非退火的核酸。如果存在任何所述分子，則可檢測到發(fā)生雜交的核酸的存在。使用所述檢測方案，可將來自所述病毒的核酸固定于，例如，固體載體例如膜，或塑料表面例如微量滴定板或聚苯乙烯珠上。在該情況下，在孵育后，非退火的，標(biāo)記的上述類型的核酸試劑可被很容易的去除。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實施對剩下的，退火的，標(biāo)記的核酸試劑的檢測?？蓪⒑塑账嵩噭┩嘶鹚鶎Φ幕蛐蛄信c從正常基因序列中推測的退火模式相比較從而確定基因突變是否存在。
檢測基因特異性核酸分子的選擇性診斷方法可包括核酸分子的擴增，例如通過PCR(美國專利號4,683,202；4,683,195；4,800,159；和4,965,188；PCR Strategies，1995 Innis等(eds.)，AcademicPress，Inc.)，隨后用本領(lǐng)域技術(shù)人員所眾所周知的技術(shù)檢測擴增的分子?？蓪⒌玫降臄U增的序列與如果擴增的核酸僅含有各基因的正常拷貝時所期望的那些序列相比較以便測定基因突變是否存在。
此外，可采用本領(lǐng)域中任何已知測序方法對所述核苷酸測序。例如，所述病毒DNA可通過描述于Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463，進一步描述于Messing等，1981，Nuc.Acids Res.9309的雙脫氧法，或通過描述于Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65499的方法進行測序。還可參見Maniatis等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates和WileyInterScience，NY所描述的技術(shù)。
針對所述病毒基因產(chǎn)物，即，病毒蛋白質(zhì)或病毒肽片段的抗體也可用于在病毒蛋白質(zhì)中檢測突變。或者，所述病毒蛋白質(zhì)或肽片段可采用本領(lǐng)域中任何已知的為了產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的測序方法測序。所述方法的一個實例是可用于小蛋白質(zhì)或多肽測序的埃德曼降解法。較大蛋白質(zhì)可最初用本領(lǐng)域中已知的化學(xué)或酶試劑，例如，溴化氰、羥胺、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶剪切，然后通過埃德曼降解法進行測序。
5.5 檢測突變病毒的表型易感性本領(lǐng)域中任何已知方法均可用于測定突變病毒或病毒種群對抗病毒療法的表型易感性。例如參見美國專利號5,837,464和6,242,187，將其全文引入此處作為參考。在某些實施方案中，實施表型分析，即病毒對給定抗病毒劑的易感性可針對無所述突變的參照病毒的易感性進行檢測。該檢測是藥物易感性的直接、定量的檢測并可通過本領(lǐng)域中確定病毒針對抗病毒劑的易感性的任何已知方法進行實施。所述方法的實例包括，但不限于，針對參照病毒確定IC50值的倍數(shù)改變。表型分析檢測了特定病毒株在存在藥物抑制劑時在體外的生長能力。當(dāng)與抑制所述參照病毒所需藥物量相比，抑制病毒活性需要更少藥物時，該病毒具有對特定藥物更高的易感性。
在一個實施方案中，對病毒株實施表型分析并用于計算藥物的IC50或IC90。也可將分析的結(jié)果表示為每個病毒株的與藥物易感性對照株或來自同一患者的先前的病毒株相比的IC50或IC90的倍數(shù)改變。因為將所述病毒直接暴露于每個可獲得的抗病毒藥物治療，故可將結(jié)果直接與治療反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。例如，如果該患者病毒顯示了對特定藥物的抗性，則將該藥物從該患者的治療方案中除去或省略，這可使得醫(yī)師可以設(shè)計在較長期更可能有效的的治療方案。
在另一個實施方案中，采用重組病毒試驗(“RVAs”)實施所述表型分析。RVAs使用通過病毒載體和擴增自患者病毒的病毒基因序列間的同源重組產(chǎn)生的病毒原種。在某些實施方案中，所述病毒載體是HIV載體而所述病毒基因序列是蛋白酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶序列。
在一個優(yōu)選實施方案中，使用PHENOSENSETM(ViroLogic Inc.，South San Francisco，CA)實施所述表型分析。參見Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44920-928；美國專利號5,837,464和6,242,187。PHENOSENSETM是實現(xiàn)表型分析優(yōu)勢并克服先前分析法的缺陷的表型分析法。因為該分析法已經(jīng)實現(xiàn)自動化，PHENOSENSETM在受控的條件下能夠提供較高通量。結(jié)果得到能夠準(zhǔn)確確定患者的HIV分離物對目前所有可獲得的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥的易感性圖譜的檢測，并將結(jié)果在收到樣品后約10～約15日內(nèi)直接傳送給醫(yī)師。PHENOSENSETM是準(zhǔn)確的并能在僅一個病毒復(fù)制周期內(nèi)即可獲得結(jié)果，從而避免選擇病毒亞群。該結(jié)果是定量的，用于衡量藥物易感性的不同程度，同時也是靈敏的，該檢測可實施于病毒負荷約500拷貝/ml的樣品并能檢測濃度為總病毒種群的濃度的10％或更低的某些藥物抗性病毒的少數(shù)種群。而且，所述結(jié)果為可重復(fù)的且在所實施的約95％的試驗中的改變(依賴于藥物)低于約1.4-2.5倍。
PHENOSENSETM可使用來自擴增的病毒基因序列的核酸。如5.4.1節(jié)中所述，包含病毒的樣品可以是來自所述病毒感染的人或動物的樣品或來自病毒細胞培養(yǎng)物的樣品。在一個實施方案中，所述病毒樣品包括遺傳修飾的實驗室株。
然后可采用本領(lǐng)域中任何已知的將基因序列摻入至載體的方法將擴增的病毒基因序列摻入復(fù)制缺陷型病毒載體，從而構(gòu)建抗性測試載體(“RTV”)。在一個實施方案中，使用限制性內(nèi)切酶和常規(guī)克隆方法。參見Maniatis等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates andWiley InterScience，NY。在某些實施方案中，使用限制性內(nèi)切酶ApaI和PinAI。優(yōu)選地，復(fù)制缺陷型病毒載體是指示基因病毒載體(“IGVV”)。在某些實施方案中，所述病毒載體包含檢測RTV復(fù)制的元件。優(yōu)選地，病毒載體包含熒光素酶表達盒。
所述測定可通過首先用RTV DNA和表達另一逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，雙嗜性鼠白血病病毒(MLV)的包膜蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細胞進行實施。轉(zhuǎn)染后，收集病毒顆粒并用于感染新鮮靶細胞。單個病毒復(fù)制周期的完成可通過用于檢測載體中復(fù)制的方法進行檢測。在一個實施方案中，單個病毒復(fù)制周期的完成導(dǎo)致熒光素酶的生成?？稍谵D(zhuǎn)染步驟或感染步驟以一系列濃度加入抗病毒劑。
對抗病毒劑的易感性可通過比較載體在存在和不存在抗病毒劑時的復(fù)制進行檢測。例如，對抗病毒劑的易感性可通過比較在存在和不存在抗病毒劑時熒光素酶活性進行檢測。易感性病毒在存在抗病毒劑時將產(chǎn)生低水平的熒光素酶活性，而具有降低的易感性的病毒將產(chǎn)生較高水平的熒光素酶活性。
在一個優(yōu)選方案中，將PHENOSENSETM用于評價HIV-1對抗病毒藥的表型易感性。優(yōu)選地，所述抗病毒藥是蛋白酶抑制劑。更優(yōu)選地，它是安潑那韋。在優(yōu)選實施方案中，參照病毒株是HIV株NL4-3或HXB-2.
在一個實施方案中，病毒核酸，例如，HIV-1 RNA可提取自血漿樣品，完整病毒基因或其片段可采用例如(但不限于)PCR的方法進行擴增。參見例如，Hertogs等，1998，Antimicrob Agents Chemother42(2)269-76。在一個實例中，包含全部HIV-1 PR-和RT-編碼序列的2.2-kb片段可采用巢式逆轉(zhuǎn)錄-PCR進行擴增。然后可將擴增的核酸合并物，例如，PR-RT-編碼序列，與pGEMT3deltaPRT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至宿主細胞例如CD4+T淋巴細胞(MT4)中，所述質(zhì)粒中去除了大部分PR(密碼子10～99)和RT(密碼子1～482)序列。同源重組導(dǎo)致含有病毒編碼序列，例如源自血漿中HIV-1 RNA的PR-和RT-編碼序列的嵌合病毒產(chǎn)生。嵌合病毒針對目前所有靶向轉(zhuǎn)染基因的產(chǎn)物的有效抗病毒劑(例如proRT和/或PR抑制劑)的易感性，可通過本領(lǐng)域已知的任何細胞存活試驗進行測定。例如，可以在能夠?qū)崿F(xiàn)高樣品通量的自動化系統(tǒng)中使用基于MT4細胞-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑的細胞存活試驗。對所有抗病毒劑例如RT和PR抑制劑的抗性圖譜可用單PR-RT-抗病毒圖(Antivirogram)進行圖解顯示。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它用于評價病毒對抗病毒藥的表型易感性的實驗也可使用。例如參見，Shi和Mellors，1997，AntimicrobAgents Chemother.41(12)2781-85；Gervaix等，1997，Proc NatlAcad Sci U.S.A.94(9)4653-8，這些文件全文引入此處作為參考。
在另一個實施方案中，病毒對用抗病毒療法治療的易感性通過檢測在存在所述抗病毒療法時，該抗病毒療法的靶位的活性進行測定。在一個實施方案中，所述病毒是HIV，所述抗病毒療法是蛋白酶抑制劑，而抗病毒療法的靶點是HIV蛋白酶。例如參見，美國專利號5,436,131；6,103,462，這些文件全文引入此處作為參考。
5.6 將表型易感性和基因型易感性相關(guān)聯(lián)可將本領(lǐng)域中任何已知方法用于確定突變是否與病毒對抗病毒療法的易感性的降低相關(guān)聯(lián)并因此是根據(jù)本發(fā)明的RAM。在一個實施方案中，P值用于確定相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)顯著性，這樣P值越小，檢測值的顯著性越高。優(yōu)選地，P值低于0.05。更優(yōu)選地，P值低于0.01。P值可按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行計算。在一個實施方案中，采用Fisher′s精確檢驗計算P值。例如參見，David Freedman，Robert Pisani & Roger Purves，1980，STATISTICS，W.W.Norton，New York。
在一個優(yōu)選實施方案中，將一些含有被分析的、IC50倍數(shù)改變低于或高于2.5倍的樣品與沒有突變的一些樣品相比較?？蓸?gòu)建2×2表并且可使用Fisher′s精確檢驗計算P值(參見實施例1)。將小于0.05或0.01的P值歸為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
5.7 確定對抗病毒療法的易感性另一方面，本發(fā)明提供了一種確定病毒對抗病毒療法的易感性的方法。抗性相關(guān)突變(RAMs)可被鑒定并將其與病毒對抗病毒療法的易感性降低相關(guān)聯(lián)，如上述5.3-5.6節(jié)中所述?？刹捎帽绢I(lǐng)域的任何已知方法例如上述5.4.2節(jié)中所述檢測病毒中RAM的存在。病毒中RAM的存在可指示該病毒對所述抗病毒療法易感性降低的可能性增加。在一個實施方案中，所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。在另一個實施方案中，所述病毒是I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)。在另一個實施方案中，所述抗病毒療法是蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑選自沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中檢測所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M或I84V。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中檢測是否存在選自下組的突變V11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V和C95F，其中所述突變與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)，并且所述突變的存在表明與沒有所述突變的HIV，如野生型或參照HIV相比，HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加。
另一方面，本發(fā)明提供了一種確定病毒感染個體對抗病毒療法的易感性的方法?？设b定抗性相關(guān)突變(RAMs)并將其與病毒對抗病毒療法的易感性降低相關(guān)聯(lián)，如上述5.3-5.6節(jié)所述?？刹捎帽绢I(lǐng)域的任何已知方法例如上述5.4.2節(jié)中所述檢測存在于來自所述個體的樣品中的病毒中RAM的存在。病毒中RAM的存在可指示該個體對所述抗病毒療法的易感性降低的可能性增加。在一個實施方案中，所述病毒是HIV。在另一個實施方案中，病毒是HIV-1。在另一個實施方案中，所述抗病毒療法是蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個實施方案中，所述蛋白酶抑制劑選自沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在另一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是安潑那韋。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定HIV感染個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測HIV蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M或I84V。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定HIV感染個體的蛋白酶抑制劑治療的有效性的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測HIV蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M或I84V。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種確定HIV感染個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括在所述HIV的蛋白酶中檢測是否存在選自下組的與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變V11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V和C95F，其中所述突變的存在表明與沒有所述突變的HIV，如野生型或參照HIV感染的個體相比，該個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加。
5.8 構(gòu)建算法一方面，本發(fā)明提供了一種將病毒的基因型數(shù)據(jù)與所述病毒的表型數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的算法的構(gòu)建方法。在一個實施方案中，該表型數(shù)據(jù)涉及病毒對抗病毒療法的易感性。在另一個實施方案中，所述抗病毒療法是抗病毒化合物。在另一個實施方案中，抗病毒化合物是蛋白酶抑制劑。在另一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是安潑那韋。
在一個實施方案中，構(gòu)建所述算法的方法包括建立將關(guān)于病毒組的基因型數(shù)據(jù)與關(guān)于病毒組的表型數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的一個規(guī)則或多個規(guī)則。
在一個實施方案中，建立包括病毒組中每一病毒的基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)組。可使用本領(lǐng)域中任何已知方法來收集關(guān)于病毒的基因型數(shù)據(jù)。上面已經(jīng)提供了收集所述數(shù)據(jù)的方法的實例。可使用本領(lǐng)域中任何已知方法收集關(guān)于病毒的表型數(shù)據(jù)。所述方法的實例如上文所述。在優(yōu)選實施方案中，數(shù)據(jù)組包括一個或多個上述RAMs。在一個實施方案中，每一基因型數(shù)據(jù)均為病毒組中病毒的病毒蛋白質(zhì)的全部或部分序列。在另一個實施方案中，數(shù)據(jù)組中的每一基因型數(shù)據(jù)均為由病毒編碼的蛋白質(zhì)中相對參照病毒中的參照蛋白質(zhì)的單氨基酸改變。在其它實施方案中，所述基因型包括所述病毒蛋白質(zhì)中2、3、4、5、6或更多個氨基酸改變。在另一個實施方案中，病毒是HIV，而蛋白質(zhì)是HIV蛋白酶。在一個實施方案中，病毒是HIV-1。在另一個實施方案中，所述參照蛋白質(zhì)是來自NL4-3 HIV的蛋白酶。
在一個實施方案中，數(shù)據(jù)組中的每一表型數(shù)據(jù)均為病毒組中病毒對抗病毒療法的易感性。在一個實施方案中，抗病毒療法是抗病毒化合物。在另一個實施方案中，抗病毒化合物是安潑那韋。在一個實施方案中，所述易感性按病毒相對參照病毒的易感性的改變進行檢測。在另一個實施方案中，所述易感性按病毒IC50相對參照病毒的改變進行檢測。在另一個實施方案中，將IC50的改變表示為IC50的倍數(shù)改變。在一個實施方案中，所述病毒是HIV。在另一個實施方案中，所述病毒是HIV-1。在另一個實施方案中，所述參照HIV是NL4-3 HIV。
數(shù)據(jù)組中的基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)可用本領(lǐng)域任何已知方法進行表示或組織。在一個實施方案中，用圖表的方式顯示所述數(shù)據(jù)。在這類表示方法中，Y軸表示該數(shù)據(jù)組中病毒的IC50相對參照病毒的倍數(shù)改變。圖表中的每個點均與該數(shù)據(jù)組中的一個病毒相對應(yīng)。X軸表示該數(shù)據(jù)組中病毒所含有的突變數(shù)量。點的位置同時表示突變的數(shù)量和抗病毒治療中病毒所具有的倍數(shù)改變，上述二者均相對參照株進行檢測。在另一個實施方案中，用圖解的形式顯示數(shù)據(jù)組中的基因型和表型數(shù)據(jù)。
一方面，按將數(shù)據(jù)組中的基因型數(shù)據(jù)與表型數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的方式建立算法。在一個實施方案中，確定表型臨界點。在另一個實施方案中，該表型是對抗病毒療法的易感性。在另一個實施方案中，所述表型是對抗病毒療法的易感性相對參照病毒的改變，而臨界點是如下的值，即在高于該值的病毒或病毒種群被確定為具有對抗病毒療法的表型抗性(“PT-R”)而低于該值的病毒或病毒種群被確定為具有對抗病毒療法的表型易感性(“PT-S”)。在一些實施方案中，所述臨界點高于參照病毒的IC50的2倍、2.5倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍。在一些實施方案中，所述表型臨界點是如上述的臨床臨界值。在優(yōu)選實施方案中，病毒是HIV而抗病毒療法是用蛋白酶抑制劑的治療。在另一個實施方案中，蛋白酶抑制劑是安潑那韋。
在另一個實施方案中，將所述表型臨界點用于確定基因型臨界點。在一個實施方案中，其通過將數(shù)據(jù)組的病毒中突變的數(shù)量與病毒的表型易感性相關(guān)聯(lián)來實施。其可通過，例如，使用與上述討論的相似的圖來完成。選擇基因型臨界點以便使得具有超過所述數(shù)據(jù)組中的突變數(shù)量的大多數(shù)病毒具有表型抗性(“PT-R”)，而且使得具有少于所述數(shù)據(jù)組中的突變數(shù)量的大多數(shù)病毒具有表型易感性(“PT-S”)。經(jīng)過確定，數(shù)據(jù)組中具有等于或高于所述基因型臨界值的突變數(shù)量的病毒具有對抗病毒療法的基因型抗性(“GT-R”)，而數(shù)據(jù)組中具有低于所述基因型臨界值的突變數(shù)量的病毒具有對抗病毒療法的基因型易感性(“GT-S”)。因此，在一個實施方案中，選擇能使數(shù)據(jù)組中最大百分比的病毒或者具有表型抗性和基因型抗性(“PT-R，GT-R”)或者具有表型敏感性和基因型敏感性(“PT-S，GT-S”)的基因型臨界點。
雖然該算法能夠提供數(shù)據(jù)組中基因型和表型數(shù)據(jù)間相關(guān)性的有用近似值，但在大多數(shù)情況下存在顯著數(shù)量的具有基因型敏感性但具有表型抗性(“GT-S，PT-R”)或具有基因型抗性但具有表型敏感性(“GT-R，PT-S”)的菌株。因此，在某些優(yōu)選實施方案中，還要修改所述算法以便降低數(shù)據(jù)組中不一致結(jié)果的百分比。例如，其通過在由測試算法所考慮的單個位置，從數(shù)據(jù)組中除去對應(yīng)于包括含有包括野生型的突變混合的病毒種群的每個數(shù)據(jù)點來實施。其具有降低PT-S，GT-R結(jié)果的數(shù)量的作用，由此降低了不一致的結(jié)果的總百分比并因此改善了算法對數(shù)據(jù)組的適合度。
在另一個實施方案中，給在數(shù)據(jù)組中觀測到的一個或多個突變分配不同的加權(quán)值。不包括該步驟的算法假定數(shù)據(jù)組中的每個突變對病毒或病毒種群對抗病毒治療總抗性的貢獻相等。例如，數(shù)據(jù)組中可以存在幾乎總與對抗病毒療法的表型抗性相關(guān)的突變。即，大多數(shù)含有該突變的病毒，即使是那些僅含有全部突變的一個或兩個的病毒也均具有對抗病毒療法的表型抗性。在一個實施方案中，一些突變是“被加權(quán)的”即，被分配了增高的突變評分。突變可被分配如下權(quán)重，例如，2、3、4、5、6、7、8或更高。例如，被分配權(quán)重2的突變將作為病毒中的2個突變進行計數(shù)。還可分配分數(shù)加權(quán)值。在另一個實施方案中，可分配低于1和低于0的值，其中突變與病毒對抗病毒療法敏感性增加相關(guān)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到存在給某些突變分配增高的權(quán)重時有關(guān)的交替。隨著突變的權(quán)重增高，GT-R，PT-S不一致結(jié)果的數(shù)量可增加。因此，如果分配給某突變的權(quán)重值過高，可使算法總體不一致性升高。因此，在一個實施方案中，分配給突變一個權(quán)重，該權(quán)重能夠平衡GT-S，PT-R不一致結(jié)果的減少與GT-R，PT-S不一致結(jié)果的增加。
在另一個實施方案中，數(shù)據(jù)組中不同突變間的相互作用也作為因子納入算法中。例如，可發(fā)現(xiàn)2個或多個突變以協(xié)同方式發(fā)揮作用，即，病毒中的突變同時發(fā)揮作用時對病毒抗性的促成作用要顯著高于根據(jù)各突變彼此獨立時的作用所預(yù)測的促成作用?；蛘?，可能會發(fā)現(xiàn)病毒中2個或多個突變同時發(fā)揮作用時對病毒抗性的促成作用相對于根據(jù)各突變獨立存在時所預(yù)期的對病毒抗性的促成作用較不顯著。而且，可發(fā)現(xiàn)2個或多個突變一起存在要比突變獨立存在頻繁得多。因此，在一個實施方案中，給一起存在的突變一起加權(quán)。例如，為了避免GT-R，PT-S不一致結(jié)果數(shù)量的增加，僅給一個突變分配權(quán)重1或更大，而給其它一個突變或多個突變分配權(quán)重0。
另一方面，通過將數(shù)據(jù)組的病毒中的突變的數(shù)量和類型與病毒的表型易感性相關(guān)聯(lián)可將表型臨界點用于確定基因型臨界點。突變類型的實例包括，但不限于，主要氨基酸突變、次要氨基酸突變、多肽上為保留凈電荷的突變和不會改變特定位置氨基酸的極性、疏水性或親水性的突變。根據(jù)本說明的技術(shù)，本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括其它類型的突變是本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的。
在一個實施方案中，構(gòu)建將一個或多類突變所需條件因子化的算法。在另一個實施方案中，算法將一個或多個突變類型的最小數(shù)量所需條件因子化。在另一個實施方案中，算法將主要或次要突變的最低數(shù)量所需條件因子化。在另一個實施方案中，主要或次要突變聯(lián)合其它突變的所需條件也作為因子而納入算法中。例如，可發(fā)現(xiàn)具有特定突變組合的病毒具有對抗病毒療法的抗性，而當(dāng)該組合中任一突變單獨或與不是該組合部分的其它突變聯(lián)合而存在于病毒中時，該病毒不具有對抗病毒療法的抗性。
通過使用，例如，上述方法，可設(shè)計所述算法以便獲得任何需要的結(jié)果。在一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將總一致性(PT-R，GT-R和PT-S、GT-S組的百分數(shù)之和或100-(PT-S，GT-R+PT-R，GT-S組的百分數(shù))最大化。在優(yōu)選實施方案中，總一致性高于約75％、80％、85％、90％或95％。在另一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將PT-R，GT-S結(jié)果的百分數(shù)最小化。在另一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將非PT-S、GT-R結(jié)果的百分數(shù)最小化。在另一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將PT-S、GT-S結(jié)果的百分數(shù)最大化。在另一個實施方案中，設(shè)計所述算法以便將PT-R、GT-R結(jié)果的百分數(shù)最大化。
在算法構(gòu)建期間或其構(gòu)建后的任何時間點，其還可以在第二數(shù)據(jù)組中進行測試。在一個實施方案中，所述第二數(shù)據(jù)組由不包含于數(shù)據(jù)組中的病毒組成，即，第二數(shù)據(jù)組是原始(naive)數(shù)據(jù)組。在另一個實施方案中，所述第二數(shù)據(jù)組包括存在于數(shù)據(jù)組中的一個或多個病毒和不存在于數(shù)據(jù)組中的一個或多個病毒。將所述算法用于第二數(shù)據(jù)組，特別是原始數(shù)據(jù)組，能夠評估所述算法的預(yù)測能力。因此，在一個實施方案中，使用第二數(shù)據(jù)組評估算法的精確度，然后如上述修改所述算法的規(guī)則以便提供其精確度。在另一個優(yōu)選實施方案中，將迭代法用于建立所述算法，由此檢測算法并隨后對其重復(fù)修改直至達到需要的精確度水平。
一方面，算法的構(gòu)建或?qū)嵤┛梢杂蓭讉€“起始突變”開始，并且進行幾個步驟，在這些步驟中，該算法將某些突變或某些類型的突變作為因數(shù)。在一個實施方案中，該算法將I50V自身的存在，或V32I、I54L或M、I84A或V中的任意一個或多個，加上兩個次要突變作為因數(shù)?？梢允褂帽?中所列的任意次要突變。隨后，該算法將其它突變以及起始突變作為因數(shù)。其它突變可以包括，例如82F和I84C以及54A、54S或54T中的任意一個或多個。在一個實施方案中，該算法在后面的階段將次要突變的最小數(shù)目作為因數(shù)。在一個更特定的實施方案中，該算法在所有后面的階段中將至少2個次要突變作為因數(shù)。該算法然后可以將其它突變，如33F和82A的組合的存在作為因數(shù)。當(dāng)將2個或多個突變的組合作為因數(shù)時，通常理解兩個突變，如33F和82A都存在于相同的病毒(或樣品)中。最后，該算法可以將其它組合，例如，46I或46L以及47V，54V，71L，76V或82A中的任意一個或多個的組合作為因數(shù)。在構(gòu)建或?qū)崿F(xiàn)上文所述的算法時，總體不一致性的減少以及隨著算法每個步驟減少的PT-R，GT-S組中數(shù)據(jù)的百分比表明，該算法每次都得到改進，可以正確預(yù)測導(dǎo)致表型抗性的突變和突變組合。
5.9 采用算法預(yù)測病毒的易感性另一方面，本發(fā)明還提供了采用本發(fā)明的算法預(yù)測病毒或病毒衍生物對基于病毒的基因型的抗病毒療法的表型易感性的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中檢測，是否存在一個或多個RAMs，將該算法規(guī)則用于檢測到的RAMs，其中滿足所述算法規(guī)則的病毒具有針對抗病毒治療的基因型抗性，而不滿足所述算法規(guī)則的病毒具有對抗病毒療法的基因型敏感性。在另一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中檢測是否存在一個或多個RAMs，將該算法規(guī)則用于檢測到的RAMs，其中得分等于或大于基因型臨界值則提示該病毒具有對抗病毒療法的基因型抗性，而得分低于基因型臨界值，則提示該病毒具有對抗病毒療法的基因型敏感性。
本發(fā)明的算法可用于任何抗病毒藥易感性是關(guān)注因素的病毒病，如5.4.1節(jié)中所述。在特定的實施方案中，本發(fā)明的測定法可用于測定逆轉(zhuǎn)錄病毒對抗病毒藥的易感性。在一個實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV。優(yōu)選地，病毒是HIV-1.
本發(fā)明的抗病毒劑可以是抗病毒的任何有效治療。本發(fā)明的實施可用于，例如，理解可在本發(fā)明的藥物易感性實驗中進行檢測的病毒的結(jié)構(gòu)、生命周期和遺傳成分。這些將被本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉并提供，例如關(guān)鍵酶和抗病毒劑可靶向的其它分子。本發(fā)明的抗病毒劑的實例包括，但不限于，核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿巴卡韋(abacavir)，核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如替諾福韋(tenofovir)，非-核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑例如奈韋拉平、依非韋侖、地拉韋定，融合抑制劑例如T-20和T-1249和蛋白酶抑制劑例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。
在本發(fā)明的某些實施方案中，將抗病毒劑施用于逆轉(zhuǎn)錄病毒。在某些實施方案中，抗病毒劑是蛋白酶抑制劑例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個優(yōu)選實施方案中，抗病毒劑是安潑那韋。
某些與抗病毒劑治療易感性降低相關(guān)的突變是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，如對于蛋白酶抑制劑安潑那韋是N88S。Ziermann et al.，2000，JVirol 744414-4419。例如，表1提供了與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)的突變列表。
5.10 使用算法預(yù)測抗病毒療法對個體的有效性另一方面，本發(fā)明還提供了一種使用本發(fā)明的算法基于病毒對抗病毒療法的基因型從而預(yù)測抗病毒療法對感染了病毒的個體的有效性的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒的衍生物中，檢測是否存在一個或多個RAMs，將該算法規(guī)則用于檢測到的RAMs，其中滿足所述算法規(guī)則的病毒具有對抗病毒療法的基因型抗性，而不滿足所述算法規(guī)則的病毒具有對抗病毒療法的基因型敏感性。在另一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒的衍生物中，檢測是否存在一個或多個RAMs，將該算法規(guī)則用于檢測到的RAMs，其中得分等于或大于基因型臨界值提示該病毒具有對抗病毒療法的基因型抗性，而得分低于基因型臨界值則提示該病毒具有對抗病毒療法的基因型敏感性。
如上面5.4.1節(jié)中所述，本發(fā)明的算法可用于任何抗病毒藥易感性是關(guān)注因素的病毒病，而本發(fā)明的抗病毒劑可以是任何對病毒有效的治療法。在特定的實施方案中本發(fā)明的測定法用于測定逆轉(zhuǎn)錄病毒對抗病毒藥的易感性。在一個優(yōu)選實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV。優(yōu)選地，病毒是HIV-1。在本發(fā)明的某些實施方案中，將所述抗病毒劑導(dǎo)向逆轉(zhuǎn)錄病毒。在特定的實施方案中，抗病毒劑是蛋白酶抑制劑例如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在一個優(yōu)選實施方案中，抗病毒劑是安潑那韋。
如上面5.9節(jié)中所述，與抗病毒劑治療易感性的降低相關(guān)的突變可獲自現(xiàn)有技術(shù)或采用如上面5.4-5.8節(jié)中所述方法測定。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種在感染了病毒并在之前正在進行或已經(jīng)進行了相同或不同抗病毒療法治療的患者中監(jiān)測抗病毒療法有效性的方法，包括在所述個體的樣品中檢測，是否存在與對抗病毒療法治療的易感性降低相關(guān)的氨基酸殘基，其中所述殘基的存在與所述抗病毒療法治療的易感性降低相關(guān)。
5.11 將對一種抗病毒療法的易感性與對另一種抗病毒療法的易感性相關(guān)聯(lián)另一方面，本發(fā)明提供了一種采用本發(fā)明的算法，基于病毒對不同抗病毒療法的基因型易感性，預(yù)測抗病毒療法對病毒的有效性。在一個實施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中檢測，其中滿足所述算法規(guī)則的病毒具有針對抗病毒治療的基因型抗性，而不滿足所述算法規(guī)則的病毒具有對抗病毒療法的基因型易感性。在另一個實施方案中，所述方法包括在所述病毒或所述病毒衍生物中檢測，是否存在一個或多個與對抗病毒療法抗性相關(guān)的突變并將所述算法規(guī)則用于檢測到的突變，其中得分等于或高于基因型臨界值則表明該病毒具有對不同抗病毒療法的基因型抗性，而當(dāng)?shù)梅值陀诨蛐团R界值時則表明該病毒具有對不同抗病毒療法的基因型敏感性。在另一個實施方案中，所述兩種抗病毒療法影響相同的病毒蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，所述兩種抗病毒療法均為蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑的實例包括，但不限于，沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋、安潑那韋和洛匹那韋。在另一實施方案中，兩種抗病毒蛋白之一是安潑那韋。而在另一實施方案中，與對一種蛋白酶抑制劑的抗性相關(guān)的突變還與對另一蛋白酶抑制劑的抗性相關(guān)。
6.實施例下述實施例用于舉例說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明主題的限制。
6.1 實施例1分析患者樣品以鑒定易感性降低相關(guān)突變本實施例證明了分析患者樣品從而鑒定與對蛋白酶抑制劑，如安潑那韋的易感性增加或降低相關(guān)的突變的方法。
為了確定HIV-1株的蛋白酶序列與其對安潑那韋治療的易感性，采用了10,513個樣品的數(shù)據(jù)組。從該數(shù)據(jù)組去除了所有“野生型”樣品，即對于所有蛋白酶抑制劑都表現(xiàn)為FC＜2并且沒有藥物選擇的突變的樣品。圖2示出了流程圖，描述了得到仔細分析的最終一組樣品所采用的步驟。用作去除樣品的標(biāo)準(zhǔn)的藥物選擇的PI突變是存在于HIV蛋白酶氨基酸位置23、24、30、32、33F、46、48、50、53、54、82(除82I)、84、88或90的那些(圖2)。接下來，從數(shù)據(jù)組去除具有相同基因型的樣品。這得到了用于進行基因型和表型分析的4414個患者血漿樣品的數(shù)據(jù)組。
用PHENOSENSETM(Virologic，South San Francisco，CA)HIV測定進行表型測定(Petropoulos et al.，2000，Antimicrob.AgentsChemother.44920-928；美國專利5,837,464和6,242,187)。從來自患者樣品的HIV-1獲得安潑那韋的IC50值。將其與安潑那韋抗NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的IC50進行比較。將表型數(shù)據(jù)表示為安潑那韋的50％抑制濃度(IC50)的“倍數(shù)改變”(或log倍數(shù)改變)。通過用安潑那韋抗來自患者血漿樣品的HIV-1的IC50除以安潑那韋抗NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的IC50計算倍數(shù)IC50值。用于確定對APV的表型抗性的臨界值是2.5倍。該臨界值不是來源于臨床結(jié)局研究，但2.5倍的域值是有意義的，因為在包括接受安潑那韋的患者的隊列中采用該臨界值和臨床反應(yīng)數(shù)據(jù)的表型結(jié)果之間存在強相關(guān)性(Haubrich et al，2001，Antivir Ther 6(suppl 1)63；Katzenstein et al.，2002，9th CROI，Seattle，WA)；在經(jīng)歷病毒負荷反彈而采用安潑那韋作為他們的第一種PI的患者中觀察到的對安潑那韋的易感性降低是中度的(低至2-3倍)(Maguireet al.，2002，Antimicrob Agents Chemother 46731-738)；采用PhenoSenseTM測定的基因型為野生型的病毒中安潑那韋FC分布的第99個百分位是2.1倍。對于安潑那韋FC＞2.5的那些突變體，根據(jù)下式計算％R和％S值％R＝(具有PT-R突變的樣品數(shù))/(PT-R樣品的總數(shù))％S＝(具有PT-S突變的樣品數(shù))/(PT-S樣品的總數(shù))為了確定與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)的基因型改變，分析了每個患者樣品中HIV蛋白酶的完整氨基酸序列。將突變與NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的蛋白酶序列進行比較。仔細分析了在4414個樣品的至少1％(即，至少44個樣品)中突變的所有位置。將混合物計數(shù)為突變體。在某些情況下，將相同位置的不同氨基酸分組在一起(如第67位)，而對其它位置(如第82位)的不同突變(如V82A，F(xiàn)，S或T)分開計數(shù)。
計算P值以確定表型和基因型相關(guān)的統(tǒng)計學(xué)意義。對于每個突變，在有或沒有所考慮的突變的樣品中比較APV FC＜2.5或APV FC＞2.5的數(shù)據(jù)組中的樣品數(shù)。構(gòu)建2×2表，采用Fisher′s精確檢驗計算P值。P＜0.001并且％R/％S＞3的突變被認為與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)；而P＜0.001并且％R/％S＜0.3的突變被認為與對安潑那韋的易感性增加相關(guān)。根據(jù)此處的教導(dǎo)，在本發(fā)明范圍內(nèi)的P的其它值，如P＜0.05，以及％R/％S比，如％R/％S＞4或5以及％R/％S0.25或0.2，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。表2提供了用于分析的突變的完整列表，表1提供了與對安潑那韋的易感性降低或增加相關(guān)的突變的列表(即P＜0.001并且％R/％S＞3或％R/％S＜0.3的那些突變)。
6.2 實施例2安潑那韋易感性與HIV-1蛋白酶中突變的相關(guān)性本實施例證明了將HIV的蛋白酶基因中的突變與其對安潑那韋的易感性相關(guān)聯(lián)的算法的構(gòu)建。
分析4414名患者血漿樣品的數(shù)據(jù)組并鑒定與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)的突變，如實施例1中所述。將對安潑那韋的表型易感性(洛匹那韋倍數(shù)改變)作為存在于患者的血漿樣品中的HIV蛋白酶中的突變數(shù)的函數(shù)進行分析。通過用安潑那韋抗來自患者血漿樣品的HIV的IC50除以安潑那韋抗NL4-3(GenBank登錄號AF324493)參照病毒株的IC50計算每一樣品的倍數(shù)改變。通過對存在于每一患者的樣品中的HIV蛋白酶進行測序獲得基因型數(shù)據(jù)并確定相對于NL4-3(GenBank登錄號AP324493)HIV序列的序列改變。SEQ.ID.No.1中給出NL4-3蛋白酶的氨基酸序列(圖3A)而SEQ.ID.No.2給出NL4-3蛋白酶基因的核酸序列(圖3B)。
用于預(yù)先一輪分析的突變是主要的安潑那韋突變I54M、I50V、V32I、I54L、184V(由Maguire et al.，2002，Antimicrob AgentsChemother 46731-738鑒定)和I84A。如果存在上述任何突變(V32I、150V、I54L或M、或I84A或V)，將樣品確定為基因型抗性(″GT-R″)。用多變量分析(通過Fisher′s精確檢驗得到P＜0.001，則認為是顯著的)和回歸樹(CART)分析(Statview 5.0 software；SAS，Cary，NC)對數(shù)據(jù)進行分析。
將分析結(jié)果分為4組。在其蛋白酶中不含上述鑒定的突變，并且對安潑那韋是表型和基因型敏感的(PT-S，GT-S)病毒存在于1635個樣品中，或4414個樣品的37％中。含有至少一個上述鑒定的突變，并且對安潑那韋是表型和基因型抗性的(PT-R，GT-R)病毒(APV FC＞2.5；Log安潑那韋倍數(shù)改變＞0.398)存在于1698個樣品中，或樣品的38.5％中。另兩組相應(yīng)于“例外”，其中根據(jù)基因型(突變數(shù))預(yù)測病毒是易感性的，但卻是表型(根據(jù)Log安潑那韋倍數(shù)改變)抗性的(PT-R，GT-S)，或其中根據(jù)基因型預(yù)測病毒是抗性的，但卻是表型(根據(jù)Log安潑那韋倍數(shù)改變)易感性的(PT-S，GT-R)。
幾乎四分之一的起始基因型解釋與觀察到的表型結(jié)果不一致。相應(yīng)于樣品的19.6％的865個樣品缺乏任何上述鑒定的突變，但與預(yù)期相反，發(fā)現(xiàn)這些樣品對安潑那韋是表型抗性的(PT-R，GT-S)。相反，一些具有上述鑒定的一個或多個突變的病毒并沒有表現(xiàn)出與WT病毒株(PT-S，GT-R)相比對安潑那韋更高的抗性(216樣品(4.9％))。
6.3 實施例3分析PT-R，GT-S不一致組本實施例證明了某些突變和某些突變的組合比其它突變對安潑那韋抗性貢獻更大。
實施例2的PT-R，GT-S組中的樣品相應(yīng)于在HIV蛋白酶中沒有與對安潑那韋的抗性降低相關(guān)的已知主要突變的病毒(即，沒有V32I、150V、I54L或M、或I84A或V)。這些病毒是表型抗性的(具有大于2.5的安潑那韋倍數(shù)改變)，但預(yù)測是基因型敏感的(因為它們不含有已知的主要突變)。由于對安潑那韋的主要不一致是PT-R，GT-S型，該算法的開發(fā)集中于與該表型相關(guān)的突變，而不是簡單隨已知突變出現(xiàn)的那些。因此，去除了具有已知突變(GT-R)的樣品。這得到了總共2499個剩余的樣品。這些樣品中的34％具有APV FC＞2.5(圖4)。
CART(分類和回歸樹)分析使得能夠鑒定最重要的用于確定APV易感性降低的變量。圖4示出了由該分析產(chǎn)生的樹。該分析導(dǎo)致鑒定了一系列能夠促成對安潑那韋的抗性降低的突變V11I，L，V32I，L33F，E34Q，K43T，I47V，G48M，I50V，I54M，I54S，I54A，I54L，I54T，A71L，L76V，V82F，I84V和T91。此外，該分析也使得能夠鑒定一些不與對安潑那韋的易感性降低獨立相關(guān)，但很可能組合其它突變而與對安潑那韋的易感性降低相關(guān)的突變。該系列包括L10F，L10I，L24I，E35，M46I，M46L，G48V，F(xiàn)53L，I54V，Q58E，C67，A71V，G73，V82S，V82A，I84A和L90M。按照上文所述檢驗了這些突變的所有可能配對，并且進行了Fisher′s精確檢驗。該結(jié)果概括于表3和圖5中。圖5是與對安潑那韋的抗性相關(guān)的突變對的矩陣。每個空格中的數(shù)字是該突變對的差別比(％R％S)，括號中的數(shù)字表示具有該對的樣品數(shù)。只有那些具有P＜0.001(由Fisher′s精確檢驗確定)的相應(yīng)配對的空格中具有數(shù)字。
如圖6所示，通過CART分析再次檢驗了與對安潑那韋的易感性降低強相關(guān)的上述突變。
因此，很明顯PT-R，GT-S組可以與那些不與對安潑那韋的易感性降低獨立相關(guān)，但組合其它突變而促成對安潑那韋的易感性降低的突變的存在相關(guān)。
6.4 實施例4算法及其準(zhǔn)確性的證明該實施例證明了通過要求某些突變、突變類型和突變組合而減少PT-R，GT-S結(jié)果出現(xiàn)的算法的構(gòu)建。
如實施例3所述，從4414個樣品的起始數(shù)據(jù)組開始，去除了那些具有APV GT-R的樣品，得到了2499個樣品的數(shù)據(jù)組。根據(jù)用兩個數(shù)據(jù)組，即具有4414和2499個樣品(這些數(shù)據(jù)稱作“排列數(shù)據(jù)”(training data))的數(shù)據(jù)組觀察到的結(jié)果制定最終規(guī)則。根據(jù)可以用于僅僅根據(jù)算法確定病毒易感性的準(zhǔn)確性，評估所設(shè)計的規(guī)則或算法的準(zhǔn)確性。當(dāng)在預(yù)測值和觀察到的結(jié)果之間存在不一致時，修改該算法，以便使其保持與觀察到的結(jié)果的一致性。然后在“驗證數(shù)據(jù)組”的患者中檢驗由排列數(shù)據(jù)設(shè)計的規(guī)則。通過由11768個樣品的數(shù)據(jù)組起始而獲得驗證數(shù)據(jù)組。從該組數(shù)據(jù)，根據(jù)實施例1中描述的步驟，去除了對于所有蛋白酶抑制劑均FC＜2，并且無藥物選擇的突變的樣品。其次，去除了具有相同基因型的樣品。最后，排除了排列數(shù)據(jù)組中存在的樣品。這得到了1634個樣品的驗證數(shù)據(jù)組，用于僅僅使用排列數(shù)據(jù)組而檢驗所得算法的準(zhǔn)確性。
表4提供了在算法開發(fā)的每一輪或版本中使用的規(guī)則的概括，以及用具有4414個樣品的排列數(shù)據(jù)組和具有1634個樣品的驗證數(shù)據(jù)組獲得的結(jié)果。第一列提供了用于每一輪檢驗的規(guī)則。該規(guī)則是累積性的，即，將用于每一輪的規(guī)則與用于其前一輪的規(guī)則相加。
接下來的4列按順序提供了PT-S，GT-S、PT-R，GT-R、PT-R，GT-S和PT-S，GT-R組的樣品數(shù)。PT-S，GT-R列的數(shù)目排除了與主要或至少兩個次要位置的混合相關(guān)的PT-S，GT-R樣品。由于將混合計數(shù)為突變體，具有例如少于50％突變體的樣品將被計數(shù)為用于基因型目的的突變體，盡管其表型抗性可能不如真突變體高。這與單獨基于所述規(guī)則所預(yù)期的結(jié)果相比，在PT-S，GT-R組中得到了更多樣品。
表4中接下來的3輪按順序提供了PT-R，GT-S和PT-S，GT-R組中的樣品百分比以及總體不一致(PT-R，GT-S和PT-S，GT-R組百分比的和，或100-(PT-S，GT-S+PT-R，GT-R組的百分比))。
該算法以要求“起始突變”開始，該起始突變是指I50V自身或V32I，I54L或M，I84A或V的任意一個或多個加上兩個次要突變?？梢允褂帽?中列出的任意次要突變。在下一輪中，加上82F和I84C以及54A，54S或54T的任意一個或多個。從該輪開始，需要至少2個次要突變(表4中的″2mut″)。在下一輪中，加上33F和82A的組合。這需要33F和82A都存在于相同的病毒(或樣品)中。在最后一輪中，加上46I或46L與47V，54V，71L，76V或82A的任意一個或多個的組合。
PT-R，GT-S組的總體不一致性和數(shù)據(jù)百分比隨每一輪的算法而減少，表明該算法在正確預(yù)測導(dǎo)致表型抗性的突變和突變組合方面每次都有所改進。對于排列數(shù)據(jù)組，總的不一致性顯著減少，從第一輪的24.5％減少至最后一輪的14.7％，并且PT-R，GT-S組的樣品數(shù)相應(yīng)地從總樣品的19.6％減少至5.9％。
與排列數(shù)據(jù)組相比，驗證數(shù)據(jù)組具有較低的起始總不一致性(15.8％)以及在PT-R，GT-S中具有更少的樣品(12.8％)。沒有理論的限制，認為這是因為驗證數(shù)據(jù)組含有更少的具有復(fù)雜病毒蛋白酶基因型的樣品。通過在驗證數(shù)據(jù)組的表現(xiàn)，證明了采用僅僅形成排列數(shù)據(jù)組的樣品開發(fā)的算法正確預(yù)測任何病毒對安潑那韋的易感性的準(zhǔn)確性。最終算法，即表4中排列數(shù)據(jù)組的最后一行中的規(guī)則(在驗證數(shù)據(jù)組部分稱作“最終算法”)的應(yīng)用顯著減少了總不一致性以及PT-R，GT-S組中的數(shù)據(jù)百分比，分別從15.8％減少至10.3％，以及從12.8％減少至4.4％。
6.5 實施例5N88S突變的作用該實施例證明了N88S能夠使含有與對安潑那韋的易感性降低強相關(guān)的突變的病毒再敏感。
N88S是一種蛋白酶抑制劑抗性突變，并且通過atazanavir在體外選擇(Gong et aL，2000，Antimicrob Agents Chemother 442319-26)。在茚地那韋治療后也可以得到它(Condra etal.，1996，J.Virol.708270-8276)。從表1和2中可以看出，HIV蛋白酶突變N88S與病毒的易感性增加相關(guān)，在病毒中將其呈遞于安潑那韋。另一方面，I50V具有相反的作用，并且與易感性降低相關(guān)。對來自于HIV感染患者的樣品進行基因型和表型分析。發(fā)現(xiàn)該樣品在HIV蛋白酶中含有L10I，I13V，E35D，M36I，R41K，I50V，L63P，A71V，N88N/S(即88位N和S的混合物)和L90M突變。在表型上，觀察到了不同蛋白酶抑制劑的以下IC50倍數(shù)改變安潑那韋4.1；茚地那韋1.4；洛匹那韋3.3；奈非那韋5.3；利托那韋11和沙奎那韋3.6。
從群體選擇克隆，以便分離一些具有N88S突變的克隆和一些不具有N88S突變的克隆。將從原始血漿樣品構(gòu)建的抗性測試載體合并物(Petropoulos et al.，2000，Antimicrob Agents Chemother 44920-8)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并且在PhenoSense_測定中篩選各個克隆的質(zhì)粒DNA，以便確定蛋白酶基因型。分離了總共21個克隆，3個僅有I50V，15個具有I50V和L90M，3個具有I50V和N88S，此外還有其它突變存在于合并物中。圖7概括了對不同蛋白酶抑制劑的表型易感性，表示為每組克隆的倍數(shù)改變(FC)。僅僅具有I50的克隆，或I50V+L90M的克隆，表現(xiàn)出對安潑那韋(13-17 FC)、洛匹那韋(7-9 FC)、奈非那韋(7-10 FC)和利托那韋(12-20 FC)的易感性顯著降低。L90M在每種情況下的作用都很小，除沙奎那韋外(具有L90M的FC中增加1.8倍)。但是，當(dāng)N88S與I50V組合存在時，安潑那韋易感性以14.5的因數(shù)增加。從圖7中可見，含有I50V，但不含N88S的病毒中的倍數(shù)改變(APV為柱1)為約17倍。但是，當(dāng)病毒含有N88S和I50V時(APV為柱2)，倍數(shù)改變降低至野生型水平。N88S存在時洛匹那韋和利托那韋的水平也增加(IC50分別減少1.7倍和1.4倍)。相反，N88S存在時對奈非那韋和atazanavir的易感性降低，IC50分別增加2.1倍和2.3倍。
這些結(jié)果證明N88S可以使含有I50突變的HIV-1對安潑那韋完全再敏感。因此，如果保持了N88S，對于具有含I50V的病毒的患者的未來治療選擇可以包括安潑那韋，可能組合利托那韋。如圖7所示，N88S也降低I50V賦予的對洛匹那韋的抗性水平。N88S對安潑那韋和洛匹那韋的作用的方向性一致，與關(guān)于這兩種PI的交叉抗性的觀察結(jié)果吻合。
本說明書所引用的全部參考文件均為全文引入作為參考。
此處提供的實際的和預(yù)測的實施例僅用于具體描述本發(fā)明而不意欲以任何方式限制本發(fā)明。
表1與對安潑那韋的抗性相關(guān)的突變
*與對安潑那韋的易感性(敏感性)增加相關(guān)。
**所有變體進行相同的處理。
樣品數(shù)＝4414。
％R含有突變的樣品占全部PT-R，GT-S樣品的百分比。
％S含有突變的樣品占全部PT-S，GT-S樣品的百分比。
33位的所有突變，除33F加下劃線的位置與平均FC的最大改變相關(guān)表2經(jīng)分析以確定對安潑那韋的抗性或敏感性的突變
最后3列(P＜0.001，比值＞3，比值＜3)包含“1”和“ 0”，如果該列頂部的條件(如P＜0.001)為真，則為“1”；如果該條件為假，則為“0”。
表3成對突變的組合的分析
-N/A-不適用(結(jié)果被0除)最后3列(P＜0.001，比值＞3，比值＜3)包含“1”和“0”，如果該列頂部的條件(如P＜0.001)為真，則為“1”；如果該條件為假，則為“0”。
表4算法構(gòu)建以及用于排列和驗證數(shù)據(jù)組
1排列數(shù)據(jù)組中的4414個樣品；驗證數(shù)據(jù)組中的1634個樣品沒有用于推導(dǎo)算法2沒有計數(shù)混合物(即，一些不一致是由于混合物，而不是因為規(guī)則不準(zhǔn)確)*除所列的要求外，還需要至少2個次要突變。
表5與安潑那韋抗性相關(guān)的主要和次要突變
序列表<110>ViroLogic，Inc<120>確定致病性病毒對蛋白酶抑制劑易感性的組合物和方法<130>11068-065-228<140>
<141>
<150>60/393,248<151>2002-07-01<150>60/414,273<151>2002-09-27<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>99<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>1Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly1 5 10 15Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val20 25 30Leu Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly35 40 45Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile50 55 60Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr65 70 75 80Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr85 90 95Leu Asn Phe<210>2<211>297<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒
<400>2cctcagatca ctctttggca gcgacccctc gtcacaataa agataggggg gcaattaaag 60gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag aagaaatgaa tttgccagga120agatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat180cagatactca tagaaatctg cggacataaa gctataggta cagtattagt aggacctaca240cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg actcagattg gctgcacttt aaatttt 29權(quán)利要求
1.一種確定人免疫缺陷病毒(HIV)對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括檢測所述HIV編碼的蛋白酶在所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M或I84V。
2.一種確定HIV感染個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測HIV蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變，其中所述突變的存在表明個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M或I84V。
3.一種確定HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括檢測所述HIV編碼的蛋白酶是否存在選自下組的突變V11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V和C95F，其中所述突變與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)，并且所述突變的存在表明HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性增加。
4.一種長度為約10～約40個核苷酸的編碼HIV蛋白酶的一部分的分離的寡核苷酸，該部分包括位于所述人免疫缺陷病毒中所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95的突變，其中所述突變與對所述蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)，前提是所述突變不是V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L，I54M或I84V。
5.一種長度為約10～約40個核苷酸的編碼HIV蛋白酶的一部分的分離的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括位于密碼子11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91或95的突變，其中所述突變與對所述蛋白酶抑制劑的易感性降低相關(guān)，前提是所述密碼子不編碼32位的V、46位的I或L、47位的V、50位的V、54位的L或M，或84位的V。
6.一種確定HIV對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括檢測所述HIV編碼的蛋白酶是否存在表1中所列的一種或多種HIV蛋白酶突變；并且將表4所提供的一組規(guī)則應(yīng)用于所述突變；其中如果滿足所述一組規(guī)則，則所述HIV對所述蛋白酶抑制劑治療具有抗性的可能性增加。
7.一種確定HIV感染個體對蛋白酶抑制劑治療的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括在來自所述個體的樣品中檢測是否存在表1中所列的一種或多種HIV蛋白酶突變；并且將表4所提供的一組規(guī)則應(yīng)用于所述突變；其中如果滿足所述一組規(guī)則，則所述個體對所述蛋白酶抑制劑治療具有抗性的可能性增加。
8.權(quán)利要求1、2、3、6或7的方法，其中所述人免疫缺陷病毒是1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)。
9.權(quán)利要求1、2、3、6或7的方法，其中所述蛋白酶具有與SEQID NO1的同一性大于90％的序列。
10.權(quán)利要求1、2、3、6或7的方法，其中所述蛋白酶抑制劑是安潑那韋。
11.權(quán)利要求1、2、3、6或7的方法，其中是否存在所述突變是通過序列特異性寡核苷酸探針與編碼所述突變的人免疫缺陷病毒的核酸序列雜交而檢測的，其中雜交的存在表明是否存在所述突變。
12.權(quán)利要求1、2、3、6或7的方法，其中是否存在所述突變是通過確定編碼所述突變的核酸序列而檢測的。
13.權(quán)利要求2或7的方法，其中所述個體正在進行或已經(jīng)進行抗病毒藥物治療。
14.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的11位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
15.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的11位氨基酸是I或L。
16.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的33位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
17.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的33位氨基酸是F。
18.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的34位氨基酸是含有中性、極性或親水性側(cè)鏈的氨基酸。
19.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的34位氨基酸是Q。
20.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的43位氨基酸是含有中性、疏水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
21.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的43位氨基酸是T。
22.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的48位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
23.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的48位氨基酸是M。
24.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
25.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
26.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的54位氨基酸是A。
27.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的54位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
28.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的54位氨基酸是S或T。
29.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的58位氨基酸是含有酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
30.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的58位氨基酸是E。
31.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的71位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
32.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的71位氨基酸是L。
33.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的76位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
34.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的76位氨基酸是V。
35.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的79位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
36.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的79位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
37.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的79位氨基酸是含有酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
38.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的79位氨基酸是任何氨基酸，前提是所述氨基酸不是P。
39.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的82位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
40.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的82位氨基酸是A或F。
41.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的83位氨基酸是含有酸性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
42.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的83位氨基酸是D。
43.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的84位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
44.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的84位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
45.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的84位氨基酸是A。
46.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的84位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
47.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的84位氨基酸是C。
48.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的91位氨基酸是含有中性、疏水性、非極性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
49.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的91位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
50.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的91位氨基酸是A或V。
51.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的91位氨基酸是含有中性、親水性或極性側(cè)鏈的氨基酸。
52.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的91位氨基酸是S。
53.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的95位氨基酸是含有中性、疏水性或非極性側(cè)鏈的氨基酸。
54.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶的95位氨基酸是F。
55.權(quán)利要求1、2、3、6或7的方法，其中所述方法包括檢測在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個氨基酸位置是否存在與對所述蛋白酶抑制劑治療的易感性降低相關(guān)的突變的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種確定抗病毒藥有效性的算法的研究方法，所述方法基于表型臨床臨界值指導(dǎo)的配對表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)的綜合分析。一方面，該算法允許使用者為患者提供有效治療。該算法有助于預(yù)測受感染的個體是否對抗病毒化合物治療發(fā)生應(yīng)答，從而允許設(shè)計有效治療方案而不會給患者帶來不需要的副作用。而且由于避免了施用無效藥物，故可以節(jié)省大量的時間和費用。
文檔編號C12Q1/70GK1678755SQ03820745
公開日2005年10月5日 申請日期2003年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月1日
發(fā)明者C·查佩伊, C·J·佩特羅波洛斯, N·T·帕金 申請人:瓦羅洛吉克公司