專利名稱：一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記、試劑盒及其檢測方法，具體地涉及GADD45A基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其與卵巢癌的相關性，及檢測這些SNP的方法和試劑盒，屬于分子生物學和醫(yī)學領域。
背景技術：
卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，2008年全球新發(fā)病例225500人，死亡140200人。由于起病隱匿，癥狀不明顯，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屆晚期，晚期卵巢癌患者5年生 存率僅為30 45%左右，預后差，而早期卵巢癌患者5年生存率高達90%，這提示我們提高卵巢癌患者預后和生存的關鍵是早診、早治，因此探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展的生物學機制，尋找鑒定卵巢癌易感人群的分子標記，卵巢癌患者分子分型和預后預測的分子標記，對于高危人群或易感個體及卵巢癌患者實施有效的早診、早治和個體化防治具有重要意義?，F(xiàn)有技術中，雖然已經(jīng)有超過200個候選基因和20個遺傳區(qū)域的1100個遺傳變異與卵巢癌易感性相關，但是與卵巢癌相關性很強的遺傳變異卻很少。并且沒有GADD45A基因與卵巢癌相關性的報道，更沒有GADD45A基因SNP與卵巢癌相關性的報道。因此，本領域急需進一步尋找卵巢癌易感基因，開發(fā)檢測卵巢癌高危人群和易感個體的方法、試劑盒，以及相關的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術，本申請的發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析，首次發(fā)現(xiàn)GADD45A和卵巢癌易感性密切相關，可作為卵巢癌易感性檢測或者早期診斷的分子標記，因此，本發(fā)明提供了一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒及其方法，以及體外檢測樣品是否存在GADD45A基因的單核苷酸多態(tài)性的方法。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，其與正常的GADD45A基因相比，區(qū)別在于第1506位存在一個單核苷酸多態(tài)性T>C，即第1506位的堿基包括堿基T和堿基C兩種情形，當為堿基T時，為正常的GADD45A基因，當為堿基C時，為突變的GADD45A基因cagtggctgg taggcagtgg ctgggaggca gcggcccaat tagtgtcgtg cggcccgtgg 60cgaggcgagg tccggggagc gagcgagcaa gcaaggcggg aggggtggcc ggagctgcgg 120cggctggcac aggaggagga gcccgggcgg gcgaggggcg gccggagagc gccagggcct 180gagctgccgg agcggcgcct gtgagtgagt gcagaaagca ggcgcccgcg cgctagccgt 240ggcaggagca gcccgcacgc cgcgctctct ccctgggcga cctgcagttt gcaatatgac 300tttggaggaa ttctcggctg gagagcagaa gaccgaaagg tgagtcggcc tgcggactct 360tccggcccga acttctctta cctaccccgc gctccccggt gcagccgggc tgtggaaggc 420ttgcagggga ggaagctaaa aagtttgcac agggcaactc ccgcccttgc tccctcggga 480
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具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例I GADD45A基因突變的檢測及與卵巢癌的關聯(lián)分析I. I研究對象選取卵巢癌患者139例，2008年9月 2011年4月于山東大學齊魯醫(yī)院確診治療，臨床資料從病歷獲得。年齡匹配的對照病人189例，為齊魯醫(yī)院健康體檢中心健康查體婦女。大部分受試者均為山東省內(nèi)漢族居民。取受試人員外周血I. 5ml，于-80°C冷藏保存。所有受試人員均按照山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會要求征得同意。1.2DNA 提取用常規(guī)酚氯仿法提取受試者外周血DNA，具體如下(I)取400ul血加于I. 5ml離心管中。(2)加入 800ul PBS,混勻，3500g，15min，棄上清；重復一遍。(3)加入 400ul 裂解液，37°C，lh。(4)加入蛋白酶 K 4ul，濃度 200ug/ml。(5) 55°C水浴消化過夜(4_12h)。(6)加入400ul的Tris飽和酹，混合搖動lOmin。(7) 5000g，15min，取水相。(8)加入 IOOul NaAc，800ul 無水乙醇，-20°C，20min。(9) 12000g，5min，棄上清。(10) 600ul 70% 冰乙醇，12000g，5min，棄上清，重復一次。(11) 12000rpm離心，10分鐘。棄上清，晾干。溶于100 μ I TE。(12)測定濃度和純度，分裝，凍存于_80°C。I. 3引物、PCR擴增和測序從GenBank下載 GADD45A 基因組序列(GenBank 序列；AY135686. I ；GI: 22122007),用primer premier5. O設計引物。具體引物詳細信息見表I。表I引物序列表
引物名稱序列SEQ ID NO ~
上游引物 5，AGTTTGCACAGGGCAACTCC3，2
下游引物 5，CCTGCTAAAGGAATTAGTCACG3，3PCR 擴增條件94 °C 3 分鐘，(94 V 30 秒，60 V 30 秒，72 V 40 秒)X 35，72 °C 7 分鐘，10°C保溫。PCR擴增產(chǎn)物為1255bp。
PCR擴增產(chǎn)物送交上海博尚生物技術公司測序，測序結(jié)果應用軟件Meglign 7.0和ChiOmas 2. 33進行檢驗和分析，本實施采用了反向測序，經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)存在以下SNP 1506T>C。I. 4SNP分型和關聯(lián)分析應用卡方(X2)檢驗對受試人員位點的分布進行統(tǒng)計分析；當一個單元格的期望個數(shù)少于5個時應用Fisher精確檢驗進行分析。所有P值均為雙側(cè)概率，當P〈0. 05時認為有顯著統(tǒng)計學意義。應用無條件邏輯回歸分析對基因型頻率、等位基因頻率和卵巢癌患病之間的相關性進行評估，計算其比值比(Odds ratio, OR)和95%可信區(qū)間(confidenceinterval, Cl)，并應用 SPSS17. O 軟件(SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO :1中的1506T>C位點與卵巢癌發(fā)病顯著相關，其中加性遺傳模型(T/T vs. T/C vs. C/C)的P值為0.003。顯性遺傳模型(T/T+T/C vs C/C)的P值為 0.002 (OR=L 301，95%CI [I. 093 I. 55)。隱性遺傳模型(T/Tvs T/C+C/C)的 P 值為0. 014 (OR=L 817，95%CI [1112 2. 968] )，C 等位基因為易感基因(P=0. 0004，OR=L 762，95%CI [1285^2. 418] )0 詳細結(jié)果見表 2。表2 1506T>C位點基因型及等位基因在卵巢癌組和健康對照組中的分布
權利要求
1.一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NOI所示，第1506位存在一個單核苷酸多態(tài)性T>C，即第1506位的堿基包括堿基T和堿基C兩種情形cagtggctgg taggcagtgg ctgggaggca gcggcccaat tagtgtcgtg cggcccgtgg60cgaggcgagg tccggggagc gagcgagcaa gcaaggcggg aggggtggcc ggagctgcgg120cggctggcac aggaggagga gcccgggcgg gcgaggggcg gccggagagc gccagggcct180gagctgccgg agcggcgcct gtgagtgagt gcagaaagca ggcgcccgcg cgctagccgt240ggcaggagca gcccgcacgc cgcgctctct ccctgggcga cctgcagttt gcaatatgac300tttggaggaa ttctcggctg gagagcagaa gaccgaaagg tgagtcggcc tgcggactct360tccggcccga acttctctta cctaccccgc gctccccggt gcagccgggc tgtggaaggc420ttgcagggga ggaagctaaa aagtttgcac agggcaactc ccgcccttgc tccctcggga480ctctccgtgg agctcccacg gactgaaaga gcgtgccccc caacccgaac gagccccgcc540ggggcctttg caaagggcag cagtggccgt cgctgcccgt gcggctcccg tggctggcag600cctgtggcag gggcactctc gggacttctc acgggacgcc cggtccttgg gcgtgcaggg660gtcatggggg gtgacggggc cgcgggagcg ccgggttttc gtagagccca ggtgcgcggt720ggtgcttgca ttcgagaggg aggggcgtgg taccggacga ggggggcggc gatggccccg780agggcaccgg ggctgacggg acccctcgcc cttgcccgcg tgtaggatgg ataaggtggg840ggatgccctg gaggaagtgc tcagcaaagc cctgagtcag cgcacgatca ctgtcggggt900gtacgaagcg gccaagctgc tcaacgtgta agtggggccc ttgcgcgtcc cccatggcac960cccttcccgc cccagcccgg gaggtcgcct tggctgggcg cccctcgccc ggccgcgcca1020cttcctgtcg cttttctgcc tgtctcggaa gggagggggc gagcgggccg ggcggcgacc1080cccagggacc cgggcagggg ttgagggcgc ccgcgcttct gcgctcactg gccccgcccg1140ctgcccccag cgaccccgat aacgtggtgt tgtgcctgct ggcggcggac gaggacgacg1200acagagatgt ggctctgcag atccacttca ccctgatcca ggcgttttgc tgcgagaacg1260acatcaacat cctgcgcgtc agcaacccgg gccggctggc ggagctcctg ctcttggaga1320ccgacgctgg ccccgcggcg agcgagggcg ccgagcagcc cccggacctg cactgcgtgc1380tggtgacggt aagggactgg gggactgcag cctgcagggt agagccccgg aaggacggga1440gtcagggctg ggttgcctga ttgtggatct gtggtaggtg ggggtcagga gggtggctgc1500 ctttgrccga ctagagtgtg gctggacttt cagccgagat gtgctagttt catcaccagg1560 1506attttctgtg gtacagaaca tgtctaagca tgctggggac tgccagcagc ggaagagatc1620cctgtgagtc agcagtcagc ccagctactc cctacctaca tctgcactgc ctcccgtgac1680taattccttt agcagggcag attagataaa gccaaatgaa ttcctggctc acccctcatt1740aaggagtcag cttcattctc tgccagtcag agctaaaaat agaaattgtg taggagacaa1800accttgttaa ttccctagaa atacattaag aggatagagt ggaatttttt ttctctgcaa1860tcttgcattt ttttaatggc tctttttttt tttcctgata aaaacctttg gtaggtaggg1920aagttatgtt ttcaggggta aatgtgctac ttttgtcttc taaattttgc tcttttttga1980ctggtctagt caagtgacag cccgattatt ttgctactcc ttaaaagtac tattctgtct2040cttggagtat ggttgatggc aattccagtt aactgctgtg cagctctcat ctcattgtgc2100acacagcatg gaaatctttc tcaaaactgt ttcactcagg tcagggtaac aagtttggta 2160gagcaaaccg gtgaatgata ctctcatgca aaactgaaca gatatgcaaa catatgtatg 2220tggttcagct tgggttgcat gggttcagac tttgcaatgt gtagtttaat aggtaattac 2280ccttaacgct tttgcaggga acccaactac cttgaagaaa ctttaatttt tttgtgcttc 2340taatttgtct ccatgtcaca tagccaaaat atagaatgtt caagtgtttt ctcctcaaaa 2400gtataattac tagaatatac tggtttttaa aataagttta tttttataaa tttgtttcca 2460g2461o
2.一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，其特征在于包括特異性引物，該引物為一對，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列。
3.根據(jù)權利要求I所述的用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，其特征在于還包括PCR反應液，PCR反應液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer組成。
4.一種體外檢測樣品是否存在GADD45A基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于步驟如下 (1)用GADD45A基因特異性引物擴增樣品的GADD45A基因，得到擴增產(chǎn)物；所述引物為一對，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的序列； (2)對擴增產(chǎn)物進行序列測定，檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性1506T>C ；1506T>C突變位置編號基于SEQ ID NO: I的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測卵巢癌易感性的分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，第1506位存在一個單核苷酸多態(tài)性T>C。一種用于檢測卵巢癌易感性的試劑盒，包括特異性引物，該引物為一對，具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列。一種體外檢測樣品是否存在GADD45A基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，步驟如下(1)用特異性引物擴增樣品的GADD45A基因，得到擴增產(chǎn)物；(2)對擴增產(chǎn)物進行序列測定，檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性1506T>C。本發(fā)明的方法檢測簡單、準確、快速，特異性強，對于高危人群或易感個體及卵巢癌患者實施有效的早診、早治和個體化防治具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102864236SQ20121037659
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者孔北華, 苑存忠, 楊其峰, 閆實, 劉曉燕, 楊寧 申請人:山東大學齊魯醫(yī)院