心肌梗塞易感性無創(chuàng)檢測試劑盒（il-6等基因）的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測心肌梗塞易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測APOE基因上ε2ε3ε4(rs429358,rs7412)、ACE基因上I/D(rs4646994)、IL-6基因上C-572G(rs1800796)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明通過檢測與心肌梗塞發(fā)生密切相關(guān)的3個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型從基因?qū)用鎭碓u估心肌梗塞發(fā)病的風(fēng)險級別，指導(dǎo)人群預(yù)防疾病發(fā)生。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無痛無創(chuàng)、避免交叉感染。測序檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，不必購置價格昂貴的進(jìn)口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】心肌梗塞易感性無創(chuàng)檢測試劑盒(IL-6等基因)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本項目屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種心肌梗塞易感基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u估心肌梗塞發(fā)病的風(fēng)險級別，并作為預(yù)防和治療心肌梗塞的方向指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]心肌梗塞是一種急性的且會引起生命危險的心臟狀態(tài)。其病因是由于部分心肌的血液循環(huán)中斷而使相應(yīng)心肌出現(xiàn)嚴(yán)重的持久性急性缺血，從而最終導(dǎo)致心肌缺血性壞死。其臨床癥狀可表現(xiàn)為胸骨后劇烈疼痛、不適、暈眩等，并出現(xiàn)心律失常、休克和心力衰竭等現(xiàn)象，有時甚至?xí)?喪失知覺。在發(fā)展中國家心肌梗塞仍是最大的死亡原因之一，發(fā)生后一年內(nèi)的死亡率約為50%。因此開發(fā)出一種便捷、高效的心肌梗塞易感性檢測技術(shù)將對于預(yù)防和治療心肌梗塞具有積極的意義。目前已經(jīng)有研究表明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和載脂蛋白E(ApoE)等基因的單核苷酸多態(tài)性均與心肌梗塞的易感性有直接關(guān)聯(lián)，在預(yù)防和治療心肌梗塞中具有一定的預(yù)測價值。
[0003]腎素-血管緊張素系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用，而ACE是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要成分，負(fù)責(zé)將血管緊張素I轉(zhuǎn)化為有生物活性的血管緊張素II，能影響心肌和血管平滑肌細(xì)胞的增殖。ACE第16內(nèi)含子中由287個堿基對組成的Alu重復(fù)序列的存在(I)或缺失(D)被稱為插入/缺失(Ι/D)多態(tài)性。ACE的DD基因型可導(dǎo)致較高水平的血管緊張素II并引起心律失常。在中國漢族人群中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者ACE基因的DD基因型和D等位基因頻率均顯著高于正常人，被認(rèn)為是心肌梗塞的一個獨立危險因素。另外在2型糖尿病患者中也發(fā)現(xiàn)心肌梗塞并發(fā)者的DD純合子頻率顯著增高，認(rèn)為該基因型是心肌梗塞的風(fēng)險因子。
[0004]ApoE是由299個氨基酸構(gòu)成的含磷脂糖蛋白，是血漿脂蛋白的重要組成部分并直接參與膽固醇代謝。ApoE主要有ε 2、ε 3和ε 4三種等位基因，分別編碼Ε2、Ε3和Ε4三種不同的異構(gòu)體。許多研究表明在心肌梗塞患者中ApoE ε 4/ ε 3基因型和ε 4等位基因頻率均顯著高于正常人群。因此，ApoE ε 4等位基因被認(rèn)為是心肌梗塞的重要遺傳標(biāo)記。至于ApoE ε 4對心肌梗塞的具體作用機(jī)制尚不清楚，初步認(rèn)為是由于改變了血脂水平所導(dǎo)致的。在心肌梗塞中，ApoE ε 4等位基因與ACE基因D等位基因有協(xié)同關(guān)系。
[0005]綜上所述，鑒于ACE基因和ApoE基因在心肌梗塞疾病中體現(xiàn)出來的疾病顯著相關(guān)性，可以通過檢測這些心肌梗塞發(fā)生相關(guān)基因單核苷酸位點基因型來及時篩查出易患心肌梗塞的高危人群，從而有針對性地預(yù)防和治療，這對于降低心肌梗塞的發(fā)病率有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于APOE 基因上 ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6基因上C-572G (rsl800796)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型可用來評估心肌梗塞發(fā)病風(fēng)險級別，本發(fā)明提供一種心肌梗塞基因無創(chuàng)檢測試劑盒。
[0007]該試劑盒包括:
檢測 APOE 基因上 ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6基因上C-572G (rsl800796)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物。
[0008]PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)。
[0009]PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0010]DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0011]本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應(yīng)體系:10 XPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0012]PCR 產(chǎn)物純化體系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0013]測序反應(yīng)體系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0014]本試 劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0016]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0017]實施例1.檢測試劑盒的使用。
[0018]1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0019]2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對:
(1)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)正向引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’
APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)反向引物:5’ TGCCCATCTCCTCCATCC3’
(2)ACE (I/D)正向引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
ACE (I/D)反向引物:5’ ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3’
(3)IL-6 (C-572G)正向引物:5’CAGCAGCCAACCTCCTCTAA3’
IL-6 (C-572G)反向引物:5’CCAAGCCTGGGATTATGAAG3’。
[0020]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:10 X PCR反應(yīng)緩沖液2.5ml ；25mM的dNTP混合液
0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板Iml (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ml、ddH20 19.175ml。[0021]反應(yīng)條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0022]3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0023]在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0024]4、DNA測序反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)測序引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’
(2)ACE (Ι/D)測序引物:5’CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
(3)IL-6 (C-572G)測序引物:5’ CAGCAGCCAACCTCCTCTAA3’。
[0025]反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水2ul。
[0026]在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個循環(huán)的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0027]反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去`上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
[0028]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0029]實施例2.為人群進(jìn)行預(yù)防心肌梗塞基因無創(chuàng)檢測的服務(wù)。
[0030]1.采樣及抽提DNA
由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。
[0031]2.基因型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的APOE基因上ε 2 ε 3 ε 4(rs429358，rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6 基因上 C-572G (rsl800796)的 3個單核苷酸多態(tài)性位點分別進(jìn)行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。
[0032]3.心肌梗塞高危人群風(fēng)險評估分析
通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具心肌梗塞風(fēng)險評估分析報告單。報告中詳細(xì)說明了受檢者 APOE 基因上 ε2ε3ε4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6基因上C-572G (rsl800796)的3個SNP位點基因檢測信息以及遺傳風(fēng)險評估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險級別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀心肌梗塞基因無創(chuàng)檢測報告單。
【權(quán)利要求】
1.一種篩查心肌梗塞高危人群的基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于:檢測APOE基因上 ε 2 ε 3 ε 4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6 基因上 C-572G(rsl800796)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對APOE基因上 ε2ε3ε4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6 基因上 C-572G(rsl800796)的3個單核苷酸多態(tài)性位點，能特異性擴(kuò)增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對APOE基因上 ε2ε3ε4 (rs429358, rs7412)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)、IL-6 基因上 C-572G(rsl800796)的3個單核苷酸多態(tài)性位點而設(shè)計，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下:
(1)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)正向引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’
APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)反向引物:5’ TGCCCATCTCCTCCATCC3’ (2)ACE (Ι/D)正向引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’ ACE (I/D)反向引物:5’ ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3’ (3)IL-6 (C-572G)正向引物:5’CAGCAGCCAACCTCCTCTAA3’
IL-6 (C-572G)反向引物:5’CCAAGCCTGGGATTATGAAG3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下:
(1)APOE ( ε 2 ε 3 ε 4)測序引物:5’ AAATCGGAACTGGAGGAACAA3’ (2)ACE (Ι/D)測序引物:5’CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’ (3)IL-6 (C-572G)測序引物:5’ CAGCAGCCAACCTCCTCTAA3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應(yīng)體系:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產(chǎn)物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測序反應(yīng)體系:25%BigDye mixlul，3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul, 70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627782SQ201210304457
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月24日
【發(fā)明者】石慧林 申請人:解碼（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司