專利名稱：膽石病易感性檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及利用線粒體12s核糖體核糖核酸(線粒體12s rRNA)基因及其編碼產(chǎn)物診斷和治療膽石病的方法，以及含有線粒體12s rRNA基因和/或編碼產(chǎn)物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
膽石病是一種常見的疾病，它是由于膽囊或膽總管的結(jié)石造成的。一般膽石病按膽石的成分分為三類膽固醇結(jié)石，膽色素結(jié)石和混合結(jié)石。其中以膽固醇結(jié)石最為常見?；加心懯〉牟∪艘话銜霈F(xiàn)上腹部有悶脹不適，惡心，常伴有消化不良的癥狀，用手深壓上腹部時，有疼痛的感覺。中國人群中膽石病的發(fā)病率約為7％-10％，其中女性發(fā)病率比男性高2倍以上，以50歲以上老年人發(fā)病較普遍。
線粒體疾病是比較特殊的一類遺傳疾病，它是由線粒體上基因發(fā)生突變而造成的遺傳疾病。其特征是母系遺傳，即只能由母親遺傳給孩子。由于線粒體基因全部是能量代謝相關(guān)的基因，在氧化磷酸化和糖，脂類的代謝中起著至關(guān)重要的作用，所以線粒體遺傳病大多為與代謝相關(guān)的疾病，典型的如非胰島素依賴型線粒體糖尿病，神經(jīng)性肌無力等。某些退行性疾病也與線粒體DNA(mtDNA)的突變有關(guān)，如Alzeimer綜合癥、Parkinson綜合癥、Huntington舞蹈癥，衰老等。線粒體疾病可以是由于線粒體基因的突變引起，也可以是由于線粒體所編碼的tRNA或相對風(fēng)險(xiǎn)NA發(fā)生突變引起的。
迄今為止，本領(lǐng)域還缺乏診斷膽石病的有效方法以及非手術(shù)治療膽石病的有效手段。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的診斷和治療膽石病的有效方法，以及相關(guān)的治療藥物，診斷技術(shù)和試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的就是提供一種新的診斷(尤其是早期診斷)膽石病的方法及檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療膽石病的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療膽石病的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的膽石病易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟(a)檢測該個體的線粒體12s rRNA基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并與正常的線粒體12srRNA基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相比較，其中，存在差異就表明該個體患膽石病的可能性高于正常人群；或者該方法包括步驟(b)檢測該個體的線粒體DNA的SEQ ID NO1所示序列中以下位點(diǎn)的核苷酸827、4820、13590、15534；其中，827位點(diǎn)的核苷酸為G，4820位點(diǎn)的核苷酸為A，13590位點(diǎn)的核苷酸為A，或15534位點(diǎn)的核苷酸為T，就表明該個體患膽石病的可能性高于正常人群。
在另一優(yōu)選例中，檢測的是線粒體12s rRNA的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常線粒體12s rRNA核苷酸序列比較差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異選自下組SEQ ID NO1中827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，和15534 C→T。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測膽石癥易感性的核酸引物對，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人線粒體12s rRNA的SEQ ID NO1所示序列中第827、4820、13590或15534位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種寡核苷酸探針，其長度為15-500bp，且特異性地雜交并檢測含人線粒體12s rRNA的SEQ ID NO1所示序列中第827、4820、13590或15534位的單核苷酸多態(tài)性。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測膽石病的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增線粒體12s rRNA基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，且所述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含有選自下組的突變位點(diǎn)SEQ ID NO1中第827、4820、13590或15534位。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有與突變位點(diǎn)結(jié)合的探針。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒檢測的突變選自SEQ ID NO1中827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，15534 C→T。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒檢測的突變是同時發(fā)生SEQ ID NO1中827A→G，4820 G→A，13590 G→A，15534 C→T的突變。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種治療膽石病的方法，它包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常線粒體12s rRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或編碼產(chǎn)物。還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的線粒體12s rRNA或其編碼產(chǎn)物以及藥學(xué)上可接受的載體。


圖1顯示了B4b的系統(tǒng)演化關(guān)系。其中，P1-P15是病人，C1-C17是對照。各個SNP的位置編號指SEQ ID NO1中相對應(yīng)的堿基變化，如827G代表在SEQ IDNO1中第827號堿基突變?yōu)镚。
具體實(shí)施例方式
線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是氧化磷酸化，能量生成的場所。能源物質(zhì)的氧化磷酸化為類固醇的合成的提供了前體物質(zhì)NADPH和乙酰輔酶A，而類固醇的代謝產(chǎn)物也要通過氧化磷酸化途徑完成徹底的代謝。線粒體基因通過控制氧化磷酸化過程直接或間接的控制著類固醇的代謝。因此，線粒體基因的異常可能會導(dǎo)致包括膽石病在內(nèi)的許多與類固醇代謝類疾病。本發(fā)明人經(jīng)過多年深入和廣泛的研究，首次發(fā)現(xiàn)和證明了線粒體12s核糖體核糖核酸(線粒體12s rRNA)與膽石病密切相關(guān)，線粒體12s核糖體核糖核酸的改變將直接導(dǎo)致膽石病。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
線粒體有著一套相對獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)，它有獨(dú)立的基因編碼和蛋白合成系統(tǒng)，同時也收到細(xì)胞染色體DNA的控制。線粒體的有著兩個獨(dú)立編碼的核糖體RNA，分別為16s rRNA和12s rRNA。rRNA基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工產(chǎn)生成熟的rRNA，具有線粒體蛋白合成的功能。本發(fā)明的研究首先證實(shí)，線粒體12s rRNA的突變與膽石病密切相關(guān)。
如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明基因”指線粒體12s核糖體核糖核酸基因，即線粒體12s rRNA基因。
如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明編碼產(chǎn)物”指線粒體12s核糖體核糖核酸基因編碼的RNA產(chǎn)物，即線粒體12s rRNA基因的RNA產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，關(guān)于線粒體12s rRNA序列及其他一些有用信息，可在如下電子數(shù)據(jù)庫信息中找到GenBank Overview，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/GenbankOverview.html[NC_001807(GI13959823)](SEQ ID NO1)基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療或輔助膽石病，和用于篩選促進(jìn)線粒體12srRNA編碼產(chǎn)物功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人線粒體12s rRNA DNA或是其片段編碼的產(chǎn)物具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
利用本發(fā)明編碼產(chǎn)物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
正常的線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物可直接用于疾病治療，例如，用于膽石病方面的治療。在使用本發(fā)明線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物時，還可同時使用其他治療膽石病的藥劑。
本發(fā)明線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可緩解或消除膽石病。通常，可將線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明線粒體12srRNA編碼產(chǎn)物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如藥膏、片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如藥膏、針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的線粒體12s rRNA或其編碼產(chǎn)物施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
檢測線粒體12s rRNA基因的突變也可用于診斷線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病。線粒體12s rRNA編碼產(chǎn)物突變的形式包括與正常野生型線粒體12srRNA DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響編碼產(chǎn)物的表達(dá)，因此用逆轉(zhuǎn)錄PCR，Westen印跡法等方法可間接判斷編碼產(chǎn)物有無突變。
用于本發(fā)明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的線粒體DNA或RNA。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，有大量的分析技術(shù)可用于檢測基因中所述位點(diǎn)是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測序、雜交測序；酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用線粒體12s rRNA基因特異性引物擴(kuò)增樣品的線粒體12s rRNA基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，15534 C→T，其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID N01。
應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了線粒體12s rRNA基因的SNP與膽石癥的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可特異性擴(kuò)增出含該SNP位置的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，或15534 C→T。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5′端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對應(yīng)位置。部分優(yōu)選的引物對具有SEQ ID NO2-9的序列。
雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)含有SEQID NO1中第827、4820、13590、和/或15534位。
由于本發(fā)明的SNP與膽石癥具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此不僅可用于早期較準(zhǔn)確地診斷原發(fā)性膽石癥，而且可以未雨綢繆地使攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預(yù)防措施，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和社會效益。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1線粒體12s rRNA與膽石病的相關(guān)性在本實(shí)施例中，從上海地區(qū)采集了104例膽石病患者血樣，并與473個隨機(jī)抽取的人群樣本進(jìn)行對照，試圖進(jìn)行線粒體DNA與膽石病的相關(guān)分析。對照組的473個隨機(jī)樣本，并不知道他們是否是膽石病病人。
在本實(shí)施例中檢測了線粒體12s核糖體核糖核酸基因(線粒體12s rRNA)。這個基因編碼線粒體核糖體中的12s rRNA，是合成線粒體各種蛋白的重要功能基因。
通過常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增和377測序儀測序，對線粒體12s rRNA基因內(nèi)的一個頻率比較高的單核苷酸多態(tài)(SNP)827 A→G(見SEQ ID NO1)在病人和對照人群中進(jìn)行了頻率的比較。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這個SNP在膽石病患者中的頻率明顯高于對照人群。在膽石病病人中頻率分別為14.4％(15/104)。而在對照人群中頻率為3.6％(17/473)。
經(jīng)Fisher’s精確檢驗(yàn)，兩者具有顯著性差異p＜0.000，從而證實(shí)了線粒體12s rRNA與膽石病具有相關(guān)性。
實(shí)施例2B4b單倍群和線粒體12s rRNA基因突變的相關(guān)性從進(jìn)化的角度看，任何一個致病的突變都是在一定的遺傳背景下產(chǎn)生。如果在人類進(jìn)化過程中某一女性的mtDNA發(fā)生了突變，增加了患某些疾病的可能性，在不影響生殖能力的情況下，這一突變將有可能流傳到現(xiàn)代，導(dǎo)致攜帶該類型mtDNA的個體都具有該疾病的高度易感性。mtDNA在傳代過程中不發(fā)生重組，因此相對容易追溯某一特定線粒體疾病患者共同祖先的mtDNA序列組合狀態(tài)。
研究還表明，擁有827 A→G突變的個體，還會同時擁有4820 G→A，13590G→A，15534 C→T等突變，于是在本實(shí)施例中進(jìn)一步檢測了4820 G→A，13590G→A，15534 C→T三個位點(diǎn)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三個SNP都同時出現(xiàn)在擁有827A→G的個體上，而且與膽石癥相關(guān)。這全部的四個SNP組成了一個線粒體的單倍型，即827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，15534 C→T。在線粒體在中國的遺傳進(jìn)化上，擁有這個單倍型的人群被稱為線粒體B4b單倍群。線粒體B4b單倍群與膽石癥存在密切相關(guān)性。
實(shí)施例3B4b mtDNA之間的系統(tǒng)演化關(guān)系為了近一步闡明B4b mtDNA之間的系統(tǒng)演化關(guān)系，在本實(shí)施例中，對所有B4b群的個體的線粒體第一高變區(qū)(HVS1)進(jìn)行了測序，加上實(shí)施例1獲得的測序結(jié)果，利用NETWORK軟件(Fluxus Technology Ltd.)構(gòu)建了Median-joining網(wǎng)絡(luò)圖。
結(jié)果表明，整個B4b單倍群都具有很高的患膽石病的風(fēng)險(xiǎn)(如圖1)。
實(shí)施例4B4b單倍群與正常人群患膽石病的相對風(fēng)險(xiǎn)比較對病人和對照的比較分析表明B4b的相對風(fēng)險(xiǎn)(Relative risk，相對風(fēng)險(xiǎn))為4.518(P＜0.0001)，即具有B4b線粒體類型的人群患膽石病的可能性是不具有該類型線粒體人群的4.518倍。
因此，中國人中攜帶B4b線粒體單倍群的群體患膽石病的危險(xiǎn)度有非常明顯增高，為膽石病高危人群。通過對線粒體12s rRNA基因的檢測，可以對具有B4b單倍型的個體及其相關(guān)家屬提出膽石病的預(yù)警，通過注意飲食調(diào)理或者醫(yī)學(xué)手段，降低其發(fā)病的可能。并且這一發(fā)現(xiàn)為最終查清膽石病發(fā)生的遺傳原因以及發(fā)病機(jī)理提供了線索和可以進(jìn)一步研究的方向。線粒體B4b單倍群(特征為827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，15534 C→T突變)可作為膽石病患病危險(xiǎn)度的一個有效的預(yù)警指標(biāo)。
實(shí)施例5膽石病易感性的檢測試劑盒如實(shí)施例1-4所述，SEQ ID NO1中827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，15534 C→T的突變，與膽石病密切相關(guān)。因此，可基于這些突變設(shè)計(jì)引物在以病人的mtDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行檢測，例如SEQ ID NO2和3，SEQ ID NO4和5，SEQ ID NO6和7，SEQ ID NO8和9。

制備一檢測SEQ ID NO1中827 A→G的突變試劑盒(100人次)，它含有名稱 編號 數(shù)量正向引物SEQ ID NO2100pmol
反向引物SEQ ID NO3100pmolPCR緩沖液 若干制備一檢測SEQ ID NO1中4820 G→A的試劑盒(100人次)，它含有以下組份名稱 編號 數(shù)量正向引物SEQ ID NO4100pmol反向引物SEQ ID NO5100pmolPCR緩沖液 若干制備一檢測SEQ ID NO1中13590 G→A的突變試劑盒(100人次)，它含有名稱編號數(shù)量正向引物SEQ ID NO6100pmol反向引物SEQ ID NO7100pmolPCR緩沖液 若干制備一檢測SEQ ID NO1中15534 C→T的突變試劑盒(100人次)，它含有名稱編號數(shù)量正向引物SEQ ID NO8100pmol反向引物SEQ ID NO9100pmolPCR緩沖液 若干抽取待檢測病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將膽石癥檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
或者，將擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，也可檢測出上述4個位點(diǎn)的SNP。
檢測結(jié)果表明，屬于線粒體B4b單倍群(特征為827 A→G，4820 G→A，13590G→A，15534 C→T突變)的檢測對象的膽石癥易感性明顯高于正常人群。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海人類基因組研究中心復(fù)旦大學(xué)上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院<120>膽石病易感性檢測方法和試劑盒<130>042150<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>16568<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt60cgtctggggg gtatgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc120gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatc ctattattta tcgcacctac gttcaatatt180acaggcgaac atacttacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata240acaattgaat gtctgcacag ccactttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca300aaccccccct cccccgcttc tggccacagc acttaaacac atctctgcca aaccccaaaa360acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac420ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat480ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata540ccccgaacca accaaacccc aaagacaccc cccacagttt atgtagctta cctcctcaaa600gcaatacact gaaaatgttt agacgggctc acatcacccc ataaacaaat aggtttggtc660ctagcctttc tattagctct tagtaagatt acacatgcaa gcatccccgt tccagtgagt720tcaccctcta aatcaccacg atcaaaaggg acaagcatca agcacgcagc aatgcagctc780aaaacgctta gcctagccac acccccacgg gaaacagcag tgattaacct ttagcaataa840acgaaagttt aactaagcta tactaacccc agggttggtc aatttcgtgc cagccaccgc900ggtcacacga ttaacccaag tcaatagaag ccggcgtaaa gagtgtttta gatcaccccc960tccccaataa agctaaaact cacctgagtt gtaaaaaact ccagttgaca caaaatagac1020tacgaaagtg gctttaacat atctgaacac acaatagcta agacccaaac tgggattaga1080taccccacta tgcttagccc taaacctcaa cagttaaatc aacaaaactg ctcgccagaa1140cactacgagc cacagcttaa aactcaaagg acctggcggt gcttcatatc cctctagagg1200agcctgttct gtaatcgata aaccccgatc aacctcacca cctcttgctc agcctatata1260ccgccatctt cagcaaaccc tgatgaaggc tacaaagtaa gcgcaagtac ccacgtaaag1320acgttaggtc aaggtgtagc ccatgaggtg gcaagaaatg ggctacattt tctaccccag1380aaaactacga tagcccttat gaaacttaag ggtcgaaggt ggatttagca gtaaactaag1440agtagagtgc ttagttgaac agggccctga agcgcgtaca caccgcccgt caccctcctc1500aagtatactt caaaggacat ttaactaaaa cccctacgca tttatataga ggagacaagt1560cgtaacatgg taagtgtact ggaaagtgca cttggacgaa ccagagtgta gcttaacaca1620aagcacccaa cttacactta ggagatttca acttaacttg accgctctga gctaaaccta1680gccccaaacc cactccacct tactaccaga caaccttagc caaaccattt acccaaataa1740agtataggcg atagaaattg aaacctggcg caatagatat agtaccgcaa gggaaagatg1800aaaaattata accaagcata atatagcaag gactaacccc tataccttct gcataatgaa1860
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權(quán)利要求
1.一種對個體的膽石病易感性進(jìn)行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟(a)檢測該個體的線粒體12s rRNA基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并與正常的線粒體12srRNA基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相比較，其中，存在差異就表明該個體患膽石病的可能性高于正常人群；或者(b)檢測該個體的線粒體DNA的SEQ ID NO1所示序列中以下位點(diǎn)的核苷酸827、4820、13590、15534；其中，827位點(diǎn)的核苷酸為G，4820位點(diǎn)的核苷酸為A，13590位點(diǎn)的核苷酸為A，或15534位點(diǎn)的核苷酸為T，就表明該個體患膽石病的可能性高于正常人群。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測的是線粒體12s rRNA的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常線粒體12s rRNA核苷酸序列比較差異。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的差異選自下組SEQ ID NO1中827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，和15534 C→T。
4.一種核酸引物對，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人線粒體12s rRNA的SEQ ID NO1所示序列中第827、4820、13590或15534位單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.一種寡核苷酸探針，其特征在于，其長度為15-500bp，且特異性地雜交并檢測含人線粒體12s rRNA的SEQ ID NO1所示序列中第827、4820、13590或15534位的單核苷酸多態(tài)性。
6.一種檢測膽石病的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增線粒體12srRNA基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，且所述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含有選自下組的突變位點(diǎn)SEQ ID NO1中第827、4820、13590或15534位。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，它還含有與突變位點(diǎn)結(jié)合的探針。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變選自SEQ ID NO1中827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，15534 C→T。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是同時發(fā)生SEQ IDNO1中827 A→G，4820 G→A，13590 G→A，15534 C→T的突變。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的線粒體12s rRNA或其編碼產(chǎn)物以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷膽石病的方法，它包括檢測個體的線粒體12s rRNA基因序列、表達(dá)與正常相比是否存在變異，尤其是比較SEQ ID NO1所示序列中以下位點(diǎn)的核苷酸第827、4820、13590、15534位。存在變異就表明該個體患膽石病的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了檢測膽石病的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1690221SQ20041001788
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者黃薇, 金力, 牛振民, 文波, 韓天權(quán) 申請人:上海人類基因組研究中心, 復(fù)旦大學(xué), 上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院