專利名稱：體外肽表達(dá)文庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣泛涉及重組DNA技術(shù)，特別是涉及體外構(gòu)建和篩選DNA文庫的方法以獲得編碼生物活性分子的DNA序列。
背景技術(shù)：
從重組DNA(脫氧核糖核酸)文庫中分離編碼所需肽的未知基因是一項(xiàng)困難的任務(wù)。使用雜交探針可以使所述過程變得容易些，但是該方法通常必須知道編碼該蛋白的基因的至少部分序列。當(dāng)序列為未知時(shí)，可將DNA文庫在表達(dá)載體中表達(dá)，然后使用抗體對(duì)噬斑或菌落進(jìn)行篩選，從而得到所需的蛋白質(zhì)抗原。所述方法在對(duì)小型文庫進(jìn)行篩選時(shí)是有用的，但是在105個(gè)克隆中出現(xiàn)幾率小于約1次的罕見序列很容易被遺漏，使篩選大于106個(gè)克隆的文庫成為一項(xiàng)勞動(dòng)量大而且困難的工作，所述罕見序列如罕見的cDNA(互補(bǔ)DNA)分子或合成的肽。篩選更大的文庫需要開發(fā)出設(shè)計(jì)用于進(jìn)行罕見序列分離的方法，該方法基于對(duì)分子和編碼這些分子的DNA的共選擇。已經(jīng)開發(fā)了一些用于篩選大型文庫的體內(nèi)方法，例如噬菌體展示和使用lacI(半乳糖苷酶I)融合肽的“質(zhì)粒上的肽”。
噬菌體展示基于以下原理將DNA文庫與絲狀噬菌體外殼蛋白的N末端融合，并且它們在細(xì)菌宿主中的表達(dá)導(dǎo)致外源肽展示在噬菌體顆粒的表面，而且將編碼融合蛋白的DNA包裝入噬菌體顆粒中(Smith G.P.，1985，《科學(xué)(Science)》2281315-1317)。然后可對(duì)整合入噬菌體的融合蛋白文庫進(jìn)行選擇以獲得結(jié)合在所需靶點(diǎn)(配體)上的噬菌體。然后可使結(jié)合的噬菌體再次感染大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)，之后擴(kuò)增細(xì)菌并重復(fù)所述選擇過程，從而使結(jié)合噬菌體富集(Parmley，S.F.，和Smith，G.P.1988，《基因(Gene)》73305～318；Barrett R.W.等，1992，《分析生物化學(xué)(Analytical Biochemistry)》204357～364；Williamson等，《美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，904141～4145；Marks等，1991，《分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)》，222581～597)。
lacI融合質(zhì)粒展示基于DNA與lac阻遏物的結(jié)合能力。隨機(jī)肽文庫與lacI阻遏蛋白的C末端融合。通過質(zhì)粒上的lacO序列，lacI-肽融合物與其編碼DNA連接起來，形成了穩(wěn)定的肽-LacI-肽復(fù)合物。通過細(xì)胞溶解，將所述復(fù)合物從宿主細(xì)菌中釋放出來，然后在固定的受體靶點(diǎn)上通過親和純化分離得到感興趣的肽。然后可采用電穿孔法將如此分離的質(zhì)粒再次引入大腸桿菌以增加所選種群的數(shù)量，以用于更多次的篩選(Cull，M.G.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，891865-1869)。
所述細(xì)菌方法受到下列因素限制通過當(dāng)前的將DNA引入宿主細(xì)菌的方法可以制備的文庫的大小，所引入的表達(dá)肽的潛在細(xì)胞毒性，和無法引入翻譯后的修飾，或無法向表達(dá)肽中引入新的氨基酸整。
專利申請WO 91/05058中描述了一種完全體外核糖體系統(tǒng)，該系統(tǒng)以通過核糖體的肽與編碼這些肽的RNA的連接為基礎(chǔ)。核糖體展示還被用于對(duì)單鏈Fv抗體片段(scFv)進(jìn)行選擇(Matheakis，L.C.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919022～9026；Hanes，J.和Pluckthun A.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944937～4942)。該方法存在以下問題RNA遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性低；和在可能存在有RNAse(核糖核酸酶)的某些選擇條件下降解可能會(huì)增加。
通過在表達(dá)肽之前將DNA區(qū)室化，而后所述肽在該區(qū)室內(nèi)對(duì)DNA進(jìn)行修飾，Griffiths和Tawfik所描述的體外方法(WO 99/02671和WO00/40712)解決了部分上述問題。在后續(xù)步驟中選擇因感興趣的酶促活性而具有修飾能力的肽。然而，如果不修飾編碼所述肽的DNA并從區(qū)室中釋放出修飾后的DNA，則均不可能對(duì)肽和DNA的肽結(jié)合活性進(jìn)行直接選擇。
專利申請WO 9837186描述了另一種現(xiàn)有技術(shù)方法，即共價(jià)展示技術(shù)(CDT)。所述方法依賴于通過交聯(lián)蛋白質(zhì)的順式(cis)作用的蛋白質(zhì)和DNA的共價(jià)連接以保持基因型和表型的關(guān)聯(lián)。這一方法教導(dǎo)說這一技術(shù)的成功應(yīng)用需要兩個(gè)條件。第一，需要蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在體外能夠與編碼它們的DNA序列相互作用(順式作用)；第二，所述蛋白質(zhì)必需與它們自己的DNA模板建立共價(jià)連接。該方法的問題在于DNA經(jīng)化學(xué)修飾，這會(huì)妨礙對(duì)感興趣的結(jié)合肽的回收和鑒定。
除了上述方法以外，還需要更通用的體外構(gòu)建肽文庫方法，該方法能夠直接選擇結(jié)合活性和酶促活性，能夠高效生成復(fù)合肽結(jié)構(gòu)，也能夠回收編碼感興趣肽的完整遺傳物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種制備體外肽表達(dá)文庫的方法，所述肽表達(dá)文庫包含大量肽，其中每個(gè)肽與編碼該肽的DNA構(gòu)建體相連，所述方法包括以下步驟(a)提供DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含(i)DNA靶序列；(ii)編碼文庫成員肽的DNA；和(iii)對(duì)能夠直接或間接地與如(i)所述的DNA靶序列非共價(jià)結(jié)合的肽進(jìn)行編碼的DNA；其中，所述DNA構(gòu)建體和編碼生成的蛋白質(zhì)經(jīng)選擇具有順式活性；(b)表達(dá)如(a)所述的大量DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體編碼大量文庫成員肽，從而每個(gè)表達(dá)生成的肽與生成該肽的DNA非共價(jià)相連。
本發(fā)明還提供了一種制備體外肽表達(dá)文庫的方法，該文庫包含大量肽，其中每個(gè)肽與編碼該肽的DNA構(gòu)建體相連，所述方法包括以下步驟(a)提供DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含(i)編碼文庫成員肽的DNA；和(ii)編碼肽的DNA，所述肽能夠與雙功能試劑非共價(jià)結(jié)合；其中，所述DNA構(gòu)建體和經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)選擇為具有順式活性；(b)結(jié)合雙功能試劑或DNA標(biāo)簽，該標(biāo)簽?zāi)軌驅(qū)㈦p功能試劑與如(a)所述的DNA構(gòu)建體結(jié)合，其中所述雙功能試劑能夠與由如(ii)所述的DNA所編碼的肽結(jié)合；和(c)表達(dá)(b)所述的大量DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體編碼大量文庫成員肽，從而每個(gè)表達(dá)生成的肽通過所述雙功能試劑與生成該肽的DNA相連。
本發(fā)明的范圍擴(kuò)展至由所述方法制備的肽文庫和所述方法中使用的DNA構(gòu)建體。
本發(fā)明還提供了篩選本發(fā)明的體外肽表達(dá)文庫的方法。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在體外肽表達(dá)文庫中對(duì)顯示出所需特性的肽進(jìn)行鑒定和/或純化的方法，所述體外肽表達(dá)文庫根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法制備，所述對(duì)顯示出所需特性的肽進(jìn)行鑒定和/或純化的方法至少包括以下步驟(a)篩選所述文庫與(b)選擇并分離相關(guān)的文庫成員。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種鑒定特定配體結(jié)合肽的方法，所述方法至少包括以下步驟(a)用選擇性結(jié)合于固相支持物的配體分子篩選根據(jù)本發(fā)明的方法制備的體外肽表達(dá)文庫；(b)選擇和分離結(jié)合于所述靶點(diǎn)分子的文庫成員；和(c)分離特異性結(jié)合于所述靶點(diǎn)分子的肽。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種鑒定和/或純化肽的方法，該肽具有與特定DNA靶序列結(jié)合的能力，所述方法至少包括以下步驟(a)提供本發(fā)明所述的體外表達(dá)文庫，其中，(iii)的所述肽或蛋白質(zhì)是具有DNA結(jié)合活性的文庫成員肽，而其中(i)的所述DNA靶序列是感興趣的靶序列；(b)選擇和分離文庫成員，其中，經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合于所述靶序列；(c)分離結(jié)合于所述靶序列的肽。
除了由本發(fā)明文庫分離和/或鑒定特定肽以外，本發(fā)明的篩選方法也可用于從文庫中分離和/或鑒定編碼特定肽的DNA。


圖1給出了一種方法的示意圖，通過所述方法，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可連接于由其編碼的肽。
圖2給出了本發(fā)明的一種方法的示意圖，通過所述方法，DNA結(jié)合蛋白可被轉(zhuǎn)化為順式作用的DNA結(jié)合蛋白。
圖3給出了如何將靶序列特異性DNA結(jié)合蛋白從本發(fā)明的文庫中分離出來的示意圖。
圖4給出了如何通過順式作用并使用雙特異性結(jié)合分子將文庫蛋白質(zhì)與其編碼DNA相連的示意圖。
圖5是對(duì)順式活性進(jìn)行說明根據(jù)各自抗體選擇的兩種不同大小的加入DNA(input DNA)(CK-RepA或V5-RepA)的1∶1混合物，。1標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA；2用抗人CK抗體選擇后的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增結(jié)果；3用抗V5肽抗體選擇后的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
圖6顯示結(jié)合有抗V5抗體的克隆的特異性。對(duì)特異性結(jié)合于抗V5抗體的7個(gè)克隆(1-7)在450nm處進(jìn)行ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))篩選。四個(gè)一組的條形圖代表所篩選克隆的ELISA信號(hào)，從左至右為抗人κ區(qū)抗體；抗V5抗體；BSA(牛血清白蛋白)；和空白。圖中也顯示了既不表達(dá)CK也不表達(dá)V5的陰性對(duì)照(8)。
圖7顯示了培養(yǎng)物上清在450nm處進(jìn)行ELISA檢測OD(光密度)的肽信號(hào)，所述肽是通過實(shí)施例4中針對(duì)枯草芽孢桿菌(B.globigii)孢子進(jìn)行5輪選擇后回收得到的。A克隆1e；B克隆1f；C克隆1g；D克隆8a；E克隆10c；F克隆10e；G陰性對(duì)照。
圖8顯示了肽在450nm處的OD信號(hào)，所述肽為通過實(shí)施例5中針對(duì)抗V5抗體的4輪選擇后分離得到的。AP1C12；BP2H1；CP1B5；DP2B8。針對(duì)抗V5抗體和抗ACTH肽抗體對(duì)肽-噬菌體進(jìn)行檢驗(yàn)。
圖9顯示了合成肽在450nm處的OD信號(hào)，所述肽為通過針對(duì)卵清蛋白的4輪選擇后分離得到的。AC1；BC4；CC6；DC8；E陰性對(duì)照。針對(duì)卵清蛋白、抗V5抗體和封閉后的平板(塑料)對(duì)肽進(jìn)行檢驗(yàn)。
圖10顯示了用BSA或BSA-2甲4氯丙酸(mecoprop)選擇后scFvDNA的PCR回收結(jié)果。A用BSA和2.5mM(毫摩爾每升)氧化型谷胱甘肽選擇的抗2甲4氯丙酸scFv。B用2甲4氯丙酸-BSA和2.5mM氧化型谷胱甘肽選擇的抗2甲4氯丙酸scFv。C用BSA而不用氧化型谷胱甘肽選擇的抗2甲4氯丙酸scFv。D用2甲4氯丙酸-BSA而不用氧化型谷胱甘肽選擇的抗2甲4氯丙酸scFv。
序列的簡單描述SEQ ID No 1至11，19至23，26至35和45至47為實(shí)施例中所用的引物。
SEQ ID No12為TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI構(gòu)建體的序列；SEQID NO13為TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI構(gòu)建體的序列；SEQ ID NO24為TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408構(gòu)建體的序列；和SEQ ID NO25為TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408構(gòu)建體的序列。
SEQ ID No14為雌激素受體上的靶識(shí)別序列。
SEQ ID No 15和16為來自于incFII不相容群R1質(zhì)粒的repA基因的DNA和氨基酸序列。SEQ ID No 17和18為來自相同系統(tǒng)的CIS DNA元件序列和ori(復(fù)制起始)序列。
SEQ ID No 36至39為實(shí)施例5中經(jīng)過選擇后分離得到的肽的序列。SEQ ID Nos 39至43為實(shí)施例6中分離得到的克隆的序列。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及構(gòu)建和篩選文庫以獲得在體外編碼感興趣肽的核苷酸序列。對(duì)編碼感興趣肽的構(gòu)建體進(jìn)行設(shè)計(jì)以使被表達(dá)的肽對(duì)該構(gòu)建體顯示順式活性。順式活性的定義是肽與生成該肽的DNA的相結(jié)合的能力，其中，生成該肽的DNA指轉(zhuǎn)錄和翻譯生成該肽的DNA。構(gòu)建體的體外表達(dá)導(dǎo)致肽與編碼該肽分子的DNA通過非共價(jià)相互作用結(jié)合。這一點(diǎn)與專利申請WO 98/37186中所述的教導(dǎo)不同，該專利不允許蛋白質(zhì)與編碼該蛋白質(zhì)的DNA之間的體外非共價(jià)相互作用，實(shí)際上，其特地排除了所述相互作用在文庫篩選中的任何實(shí)際應(yīng)用。
非共價(jià)結(jié)合指可被本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法所破壞的一種結(jié)合，所述方法為例如加入適當(dāng)溶劑或改變離子環(huán)境，例如加入低pH的甘氨酸或高pH的三乙胺。在本發(fā)明中，非共價(jià)結(jié)合的典型例子是DNA結(jié)合蛋白和DNA分子之間的非共價(jià)相互作用。相反地，當(dāng)DNA和經(jīng)編碼的多肽形成共價(jià)連接時(shí)，展示的肽或蛋白質(zhì)不會(huì)由于離子環(huán)境和溶劑而從DNA解離，而所述離子環(huán)境和溶劑會(huì)破壞DNA結(jié)合蛋白DNA之間的非共價(jià)相互作用。例如，細(xì)菌復(fù)制蛋白repA非共價(jià)結(jié)合于其靶DNA序列oriR，并且在鹽濃度大于0.2M(摩爾每升)KCl(氯化鉀)時(shí)，其可從所述靶DNA解離下來(Giraldo R.和Diaz R.1992，J.Mol.Biol.228787-802)。該鹽濃度不會(huì)影響共價(jià)連接，更為惡劣的條件才會(huì)使共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)解離下來，而且會(huì)增加使回收的DNA受破壞的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明描述了順式活性和非共價(jià)結(jié)合，該順式活性和非共價(jià)結(jié)合使經(jīng)編碼的肽或蛋白質(zhì)持續(xù)結(jié)合于DNA構(gòu)建體上，其半壽期的時(shí)間足以使單個(gè)肽和與其結(jié)合的編碼該肽的DNA從所形成的蛋白質(zhì)DNA復(fù)合體的混合物中分離出來，所述肽具有感興趣的活性。例如，編碼生成的蛋白質(zhì)及其DNA之間的結(jié)合可以具有最大為30分鐘、45分鐘、1個(gè)小時(shí)、2個(gè)小時(shí)、6個(gè)小時(shí)或12個(gè)小時(shí)的半壽期。因此，本發(fā)明的篩選方法可在文庫構(gòu)建完成后立即實(shí)施或晚些時(shí)候?qū)嵤?，例如最晚?小時(shí)、2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)或24小時(shí)或24小時(shí)后。
令人驚奇的是，本發(fā)明由此證明了可在體外表達(dá)所述經(jīng)編碼生成的肽或蛋白質(zhì)，并在其他DNA序列存在的情況下與編碼該肽的DNA結(jié)合。本發(fā)明還證明了蛋白質(zhì)和DNA之間的共價(jià)連接無需維持該順式活性，DNA和結(jié)合蛋白之間的非共價(jià)相互作用足以使肽的選擇可以在體外表達(dá)和選擇系統(tǒng)中進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，DNA文庫的單個(gè)成員均置于合適的DNA構(gòu)建體中，每個(gè)文庫成員均可編碼肽表達(dá)文庫中待表達(dá)的肽(文庫成員肽)。包含有DNA文庫成員的DNA構(gòu)建體包括從該構(gòu)建體表達(dá)文庫成員肽所需的全部序列，也包括使該構(gòu)建體編碼的肽與其DNA構(gòu)建體結(jié)合所需的全部序列。文庫中的每個(gè)肽通常包括融合蛋白，該融合蛋白包含文庫成員肽，該文庫成員肽與參與所述融合蛋白與相關(guān)DNA構(gòu)建體的結(jié)合的肽融合。所述融合蛋白可包含更多的序列，而且所述文庫肽可通過連接序列與所述結(jié)合肽連接。
編碼大量不同的文庫成員肽的大量所述構(gòu)建體構(gòu)成了本發(fā)明的DNA文庫。在存在編碼其他文庫成員的許多其他DNA分子的情況下，表達(dá)所述DNA分子文庫可導(dǎo)致單個(gè)的編碼生成的蛋白質(zhì)與編碼該蛋白質(zhì)的DNA的非共價(jià)結(jié)合，所述蛋白質(zhì)由所述DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此，對(duì)存在于特定的經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)中的肽文庫成員進(jìn)行編碼的序列也存在于與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA中。由此，所述過程將生物學(xué)活性形式(通常具有結(jié)合活性)的文庫成員肽與編碼該肽的特定文庫成員DNA序列連接，從而能夠例如由于特定的結(jié)合活性對(duì)感興趣的肽進(jìn)行選擇，并隨后對(duì)編碼所述文庫成員肽的DNA進(jìn)行分離和鑒定。
因此，根據(jù)本發(fā)明的目的，DNA文庫是DNA構(gòu)建體的集合。每個(gè)構(gòu)建體包含對(duì)作為文庫成員肽的待表達(dá)的肽進(jìn)行編碼的DNA序列，每個(gè)構(gòu)建體還包含合適的啟動(dòng)子、翻譯起始和終止信號(hào)。本發(fā)明的DNA文庫包含大量所述DNA分子。本發(fā)明提供了大量DNA構(gòu)建體，每個(gè)構(gòu)建體編碼一個(gè)文庫成員肽，以提供大量不同的文庫成員。DNA文庫優(yōu)選含有至少104個(gè)離散的DNA分子。例如，DNA文庫可含有超過106個(gè)、超過108個(gè)、超過1010個(gè)、超過1012個(gè)或超過1014個(gè)離散的DNA分子。
肽表達(dá)文庫的定義為由DNA分子文庫表達(dá)得到的肽序列的集合。因此，本發(fā)明的肽表達(dá)文庫包括與編碼肽的DNA非共價(jià)結(jié)合的肽的文庫。例如，本發(fā)明的肽表達(dá)文庫可為至少具有104個(gè)離散的蛋白質(zhì)的文庫，每個(gè)蛋白質(zhì)包括從DNA分子文庫表達(dá)得到的文庫肽序列。本發(fā)明的肽表達(dá)文庫可以是本發(fā)明的DNA文庫表達(dá)形成的任何文庫。
肽文庫成員可定義為具有可變組成的氨基酸鏈，其至少具有2個(gè)氨基酸的長度，或者部分或全部是天然存在的諸如酶等蛋白質(zhì)，或?yàn)槭荏w或抗體或其片段等結(jié)合分子。合適的肽文庫成員可以是具有隨機(jī)氨基酸組成的肽。具有可變或隨機(jī)組成的肽可以在N和/或C末端旁側(cè)具有已知的氨基酸序列以限制其結(jié)構(gòu)。所述已知結(jié)構(gòu)的長度可變?？蓪⒕哂锌勺兓螂S機(jī)組成的肽插入到已知蛋白質(zhì)支架的不同位點(diǎn)上，例如受體或抗體或其他蛋白質(zhì)或它們的片段。所述肽可一次或不止一次地插入到相同的蛋白質(zhì)支架中，例如兩次或更多次地插入到相同的蛋白質(zhì)支架中。
本發(fā)明所述的DNA構(gòu)建體可包含編碼文庫成員肽的DNA和用于使編碼生成的肽與編碼DNA構(gòu)建體結(jié)合的手段。除了編碼文庫成員肽的DNA之外，本發(fā)明的合適的DNA構(gòu)建體還包含至少一個(gè)DNA靶序列和編碼肽的DNA，所述肽能夠直接或間接與DNA靶序列結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，DNA構(gòu)建體和編碼生成的蛋白質(zhì)被選擇為具有順式活性。也就是說，編碼生成的蛋白質(zhì)具有與編碼該蛋白質(zhì)的DNA分子特異性結(jié)合的能力。例如，順式活性的功能可以使編碼生成的DNA結(jié)合肽與編碼該肽的DNA構(gòu)建體的靶序列特異性(直接或間接)結(jié)合，而不與其他DNA構(gòu)建體的靶序列結(jié)合。
在某些情況下，由能夠指導(dǎo)順式活性的DNA元件提供順式活性，即所述DNA元件允許或促使由DNA構(gòu)建體編碼生成的蛋白質(zhì)具有順式活性，并由此與其編碼序列結(jié)合。在其他情況下，如果編碼DNA的特性本來就使其編碼生成的肽具有順式活性，則單獨(dú)的DNA元件本身是不需要的。
指導(dǎo)順式活性的DNA元件可在DNA構(gòu)建體中與編碼肽的DNA一起提供，所述肽與所述順式元件相互作用。例如，在來自于將在下文討論的repA系統(tǒng)的順式元件的情況下，編碼repA序列片段的DNA可與順式DNA元件一起提供，所述repA序列片段包含repA的C末端的至少20個(gè)氨基酸。通過把所述DNA元件和其發(fā)揮作用所必需的任何其他序列引入DNA構(gòu)建體，將順式活性賦予平常不具有順式作用的DNA結(jié)合肽是可能的。例如，將編碼肽的DNA引入DNA構(gòu)建體中，所述肽與所使用的順式元件相互作用。
替代性地，與順式元件相互作用的肽也可以是DNA結(jié)合肽的一部分。例如，DNA結(jié)合肽可以是repA，其包含與repA順式元件相互作用的序列。替代性地，DNA結(jié)合肽可順式結(jié)合于其編碼DNA，而無需單獨(dú)的順式元件。
合適的DNA元件可以是允許或指導(dǎo)順式活性的任何元件。例如，所述DNA元件可通過與參與DNA構(gòu)建體的翻譯和轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)相互作用而起效，以延緩編碼的肽的生成和釋放。
能夠允許編碼生成的肽與編碼該肽的DNA分子特異性結(jié)合的任何DNA元件，均可用作本發(fā)明所述的DNA元件。合適的DNA元件的一個(gè)例子是將在下文詳細(xì)描述的repA順式系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，在轉(zhuǎn)錄的ρ依賴性終止之前，RNA聚合酶被5’順式序列的環(huán)終止。由此，DNA元件使編碼生產(chǎn)的結(jié)合肽與構(gòu)建體中生成了所述結(jié)合肽的DNA靶序列結(jié)合。
優(yōu)選順式DNA元件位于DNA構(gòu)建體中文庫成員肽和能夠與所述DNA靶序列結(jié)合的肽或蛋白質(zhì)的3’端。這意味著所述序列在RNA聚合酶到達(dá)順式作用序列之前就可被轉(zhuǎn)錄和翻譯。
根據(jù)本發(fā)明，結(jié)合肽可直接或間接地與DNA構(gòu)建體連接。在直接結(jié)合的情況下，結(jié)合肽以非共價(jià)方式直接與DNA靶序列結(jié)合。在間接結(jié)合的情況下，由另一個(gè)分子提供結(jié)合肽與DNA構(gòu)建體之間的連接。所述分子同時(shí)與肽和DNA靶序列連接，所述分子例如將在下文中描述的雙功能試劑。
合適的DNA構(gòu)建體可包含其他序列，例如合適的啟動(dòng)子序列，以表達(dá)所編碼的肽。
存在順式活性的系統(tǒng)的一個(gè)例子是具有順式作用的不相容群質(zhì)粒的復(fù)制蛋白系統(tǒng)，所述復(fù)制蛋白稱為repA。如下文所述，該系統(tǒng)的某些方面可用于本發(fā)明中。
許多質(zhì)粒含有編碼repA和順式DNA元件的序列。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中存在的repA序列和順式DNA元件可以來自于相同的質(zhì)粒株，也可以來自不同的質(zhì)粒株。
據(jù)信repA順式系統(tǒng)的作用如圖1所示。簡而言之，在轉(zhuǎn)錄的ρ依賴性終止之前，RNA聚合酶被5’順式序列中的環(huán)所終止。這使repA肽的C末端暫時(shí)與CIS(順式序列)相互作用，并可能導(dǎo)致DNA彎曲。然后repA肽結(jié)合于ori，而ori與repA編碼序列的終止氨基酸具有確定的距離(Prazkier等，2000，《細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriology)》1823972～3980；Praszkier和Pittard，1999，J.Bacteriol.1812765～2772；Masai和Arai，1988，《核酸研究(Nucleic.Acids.Res.)》166493～6514)。
通過監(jiān)測repA與經(jīng)選定的順式序列之間的相互作用，可以很容易地確定來自一個(gè)質(zhì)粒的repA序列與來自另一質(zhì)粒的順式序列的相容性。
合適的repA蛋白和序列以及順式DNA元件包括以下質(zhì)粒的repA蛋白和序列以及順式DNA元件，所述質(zhì)粒為IncI復(fù)合物質(zhì)粒，或者IncF、IncB、IncK、IncZ和IncL/M質(zhì)粒，這些質(zhì)粒在DNA水平上的相關(guān)性很遠(yuǎn)，但是均通過具有順式作用的repA蛋白的作用來控制質(zhì)粒的復(fù)制(Nikoletti等，1986，J.Bacteriol.1701311～1318；Prazkier J.等，1991，J.Bacteriol.1732393～2397)。可用于提供所述序列的具體質(zhì)粒包括IncII不相容群的R1質(zhì)粒和IncB質(zhì)粒pMU720(在Praskier J.和Pittard J.，1999，《順式序列在IncB質(zhì)粒的復(fù)制中的作用(Role of CIS in replication of anIncB plasmid)》，J.Bacteriol.1812765～2772一文中有所描述)。來自于IncII群R1質(zhì)粒的repA的DNA和氨基酸序列在SEQ ID No15和16中給出。來自于IncII群R1質(zhì)粒的順式DNA元件的DNA序列在SEQ IDNo17中給出。通常，順式元件的長度為150～200個(gè)核苷酸。只要更長或更短的序列能夠維持與repA相互作用的能力并展現(xiàn)順式活性，則也可以使用這樣的序列。也可以考慮諸如順式序列中的替換或缺失等較小的變異，例如野生型順式序列中1、5、10直至20個(gè)核苷酸的改變。
對(duì)于repA蛋白的順式活性，需要所述的順式元件(Praszkier和Pittard，1999，J.Bacteriol.1812765～2772)。因此，所述順式DNA元件也應(yīng)位于DNA構(gòu)建體中編碼repA序列的DNA的3’端。在到達(dá)順式序列后RNA多聚酶將被終止，從而使所編碼的蛋白質(zhì)與DNA靶序列結(jié)合。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，DNA結(jié)合蛋白自身包含具有DNA結(jié)合能力的repA或其片段或變異體，所述repA或其片段或變異體包含能與順式DNA元件結(jié)合的repA的至少20個(gè)C末端氨基酸。在該實(shí)施方案中，DNA靶序列包含ori序列，例如oriR序列。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，DNA結(jié)合蛋白由另一個(gè)蛋白質(zhì)提供，并在該序列中整合入被該結(jié)合蛋白識(shí)別的相關(guān)DNA靶序列。在所述各個(gè)實(shí)施方案中，DNA-蛋白質(zhì)的結(jié)合為直接結(jié)合，其中由DNA構(gòu)建體編碼的肽直接與該編碼DNA構(gòu)建體結(jié)合。在本發(fā)明的其他方面中，也可通過使用肽標(biāo)簽-DNA標(biāo)簽、雙功能試劑和/或合適的接頭來實(shí)現(xiàn)DNA-蛋白質(zhì)的間接結(jié)合，該間接結(jié)合將在下文詳述。
因此，在一個(gè)方面，同一個(gè)序列可以同時(shí)提供能夠結(jié)合DNA靶序列的肽和repA的C末端氨基酸。所述序列可以是或可以包含完整的repA序列，或者repA序列的片段或變異體，所述片段或變異體保留了與所使用的DNA靶序列相結(jié)合的能力。在repA作為DNA結(jié)合蛋白的情況下，對(duì)于順式活性(cis)和DNA結(jié)合(ori)，同時(shí)需要cis和ori序列(Praszkier和Pittard，1999，J.Bacteriol.1812765～2772)。因此在此方面，DNA靶序列是ori序列，能與所述靶序列結(jié)合的肽或蛋白質(zhì)是repA蛋白。ori在本發(fā)明DNA構(gòu)建體中的位置可以變化。如上所述，合適的repA、cis和ori序列可由一個(gè)或一個(gè)以上的質(zhì)粒提供。例如，合適的序列可來自于IncI復(fù)合物質(zhì)粒，或IncF、IncB、IncK、IncZ和IncL/M質(zhì)粒。來自于IncII群R1質(zhì)粒的ori的DNA序列在SEQ ID NO18中給出。該序列或其片段可包含于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體之中。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可包含完整的ori序列或其片段，該片段能被所用的repA蛋白結(jié)合。
只要RepA的變異體或片段保留了與所選定的ori序列結(jié)合的能力，則本發(fā)明所使用的repA蛋白也可包括repA的變異體或片段。所述repA的變異體或片段可以包括替換，例如替換repA序列中的1、2、3直至20個(gè)氨基酸，而只要所述變異體保留了與ori序列結(jié)合的能力即可。合適的repA片段是repA的ori結(jié)合序列。ori序列包括那些存在于如前所述的野生型質(zhì)粒中的序列。通常，這樣的ori序列的長度為170～220個(gè)核苷酸。只要野生型ori序列的片段或變異體保留了被repA識(shí)別的能力，則也可使用這樣的ori序列。可以使用repA蛋白家族的其他順式作用成員。例如，在范圍廣泛的宿主的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了repA蛋白質(zhì)家族，即一種repA質(zhì)粒可以在不同種類的細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)。從例如嗜熱的、嗜硫的、嗜鹽的或嗜酸的細(xì)菌中分離repA家族質(zhì)?？梢蕴峁﹔epA-cis-ori DNA，所述DNA可在升高的溫度或極端的鹽、pH或硫濃度條件下在本發(fā)明中使用。repA家族的所述成員對(duì)在該極端條件下能夠與靶分子結(jié)合的文庫成員進(jìn)行分離時(shí)是有優(yōu)勢的。通過監(jiān)測repA與ori序列之間的相互作用，可以容易地確定與選定repA蛋白聯(lián)合使用的適當(dāng)?shù)膐ri序列。
因此，通過參考如圖1所示的repA/cis/ori系統(tǒng)可以描述本發(fā)明的基本原理。圖中顯示了本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的一個(gè)例子。從5’端到3’端，所述構(gòu)建體包含啟動(dòng)子序列、編碼文庫成員肽的序列、編碼repA蛋白的序列、順式(cis)DNA元件和ori序列。簡單地說，DNA序列從啟動(dòng)子開始被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄成RNA。所述cis DNA元件中存在的p依賴性終止功能使RNA聚合酶在序列的這一部分停止。這使repA蛋白和文庫肽得以被翻譯。然后repA蛋白能夠與ori序列結(jié)合，從而將編碼生成的蛋白質(zhì)與其編碼DNA構(gòu)建體連接。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，文庫成員DNA序列與IncFII質(zhì)粒R1的repA、cis和ori DNA融合(Masai H.等，1983，Proc Natl Acad Sci USA806814～6818)。在該實(shí)施方案中，感興趣的文庫成員DNA序列可以通過編碼柔性的氨基酸接頭的DNA區(qū)域，在用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的合適啟動(dòng)子和翻譯序列的控制下與repA DNA的5’末端連接。許多合適的啟動(dòng)子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，例如araB、tac啟動(dòng)子，或T7、T3或SP6啟動(dòng)子等。所述啟動(dòng)子應(yīng)位于待表達(dá)的多肽序列的上游。
此處示例性地所用了repA蛋白家族，而非限制于僅可使用該類蛋白。其他無關(guān)的非共價(jià)結(jié)合的順式作用DNA結(jié)合蛋白也可用于本發(fā)明。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，非順式作用的DNA結(jié)合蛋白可被轉(zhuǎn)化為具有順式活性的蛋白質(zhì)(見圖2)。這一目的可通過將這些蛋白質(zhì)與賦予它們順式活性的序列聯(lián)合使用來實(shí)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)能直接或間接結(jié)合DNA靶序列。通過在DNA構(gòu)建體中包含指導(dǎo)順式活性的DNA元件，順式活性可被賦予正常情況下并無順式作用的結(jié)合蛋白，所述DNA元件例如repA系統(tǒng)的順式元件。包含所述元件是為了確保通過DNA結(jié)合蛋白的DNA的結(jié)合是順式的，即編碼生成的DNA結(jié)合蛋白會(huì)與轉(zhuǎn)錄和翻譯該蛋白的DNA構(gòu)建體結(jié)合。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，合適的DNA構(gòu)建體可包含指導(dǎo)順式活性的DNA元件(順式DNA元件)，該DNA元件來自于repA系統(tǒng)。所述元件可進(jìn)一步包含編碼repA的一部分C末端的DNA，優(yōu)選為repA的C末端部分的至少20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為30個(gè)氨基酸，直至40、50、60或70個(gè)氨基酸，其中，repA的所述片段具有與所述構(gòu)建體中的DNA元件相互作用的能力。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，可將Tn5和IS903等轉(zhuǎn)順式作用轉(zhuǎn)座酶用于本發(fā)明中(McFall E.J Bacteriol.1986年8月，167429～432；Derbyshire KM和Grindley ND.《分子微生物學(xué)(Mol Microbiol.)》1996年9月，11261-72)。編碼本發(fā)明序列的DNA可包含編碼所需repA片段的野生型序列、編碼野生型repA片段的簡并序列，或者編碼所述repA片段變異體的序列，所述變異體保留了與整合入DNA構(gòu)建體的順式元件相互作用的能力。所述變異體可包括在所述repA的C末端的20個(gè)氨基酸中替換1、2、3或4個(gè)氨基酸的變異體。
此處所用的repA蛋白家族用作示例，而非限制于僅可使用該類蛋白。能夠?qū)㈨樖交钚再x予無順式作用的蛋白質(zhì)的任何DNA元件均可用于本發(fā)明。
用所述方式可以轉(zhuǎn)化任何無順式作用的蛋白質(zhì)。例如雌激素受體的DNA結(jié)合域(DBD)可被轉(zhuǎn)化為順式作用DNA結(jié)合蛋白，該例僅作為示例，并不排除其他可能的例子。雌激素受體的DNA結(jié)合域片段(氨基酸176～282)已在大腸桿菌中表達(dá)，并顯示與特定雙鏈DNA雌激素受體上的靶HRE(激素效應(yīng)元件)核苷酸序列結(jié)合，所述結(jié)合具有與母體分子相似的親和力(0.5 nM(納摩爾))(Murdoch等，1990，《生物化學(xué)(Biochemistry)》298377～8385；Mader等，1993，《DNA研究(DNAsResearch)》211125～1132)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼所述序列的DNA與以下DNA融合編碼repA的至少最后20個(gè)氨基酸的DNA，順式DNA元件，以及直至ori序列的DNA，所述ori序列的下游是雌激素受體上的靶識(shí)別序列(5’-TCAGG TCAGA GTGAC CTGAG CTAAA ATAACACATT CAG-3’，SEQ ID NO14)，該識(shí)別序列代替了repA的ori識(shí)別序列，上述融合均優(yōu)選在編碼所述序列DNA的3’末端融合。然后可通過編碼柔性氨基酸接頭的DNA區(qū)域，在用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的適當(dāng)啟動(dòng)子和翻譯序列的控制下，將感興趣的DNA序列與雌激素受體DNA片段的5’端連接。表達(dá)所述多肽使雌激素受體的DBD結(jié)合于編碼該多肽的DNA上的DBD靶序列上，所述靶序列代替了正常ori序列。然后通過用目標(biāo)蛋白捕獲的方式來分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體。未結(jié)合的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體被洗去，使編碼感興趣的肽或蛋白質(zhì)的DNA得到富集，進(jìn)而這些DNA可以通過PCR進(jìn)行回收，并且可以使用前述方法進(jìn)行另幾輪體外表達(dá)和蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體捕獲操作，以進(jìn)一步富集感興趣的DNA。
顯然，可以簡單地通過使用以下物質(zhì)將上述方法用于其他DNA結(jié)合蛋白順式DNA元件和編碼repA的至少C末端20個(gè)氨基酸的序列，或來自于DNA構(gòu)建體中不同順式作用系統(tǒng)的對(duì)等元件。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將隨機(jī)DNA結(jié)合蛋白文庫用于篩選與感興趣的靶序列的特異性結(jié)合(見圖3)，所述隨機(jī)DNA結(jié)合蛋白例如鋅指蛋白、螺旋-環(huán)-螺旋蛋白或螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白。在所述實(shí)施方案中，repA的ori識(shí)別序列可被感興趣的靶序列所替代，大部分repA編碼序列可被隨機(jī)鋅指蛋白文庫所替代。因此在這一方面，所述DNA結(jié)合蛋白既作為文庫成員肽，也作為能夠結(jié)合DNA靶序列的蛋白質(zhì)。編碼每個(gè)鋅指蛋白的DNA可另外在5’末端與肽標(biāo)簽序列連接，所述標(biāo)簽序列可被抗體等另一個(gè)捕獲蛋白質(zhì)所識(shí)別，也可在3’末端與以下DNA連接編碼repA的至少最后20個(gè)氨基酸的DNA，順式DNA元件，和直至ori序列的DNA，所述ori序列的下游是感興趣的靶序列。表達(dá)所述多肽使鋅指蛋白與編碼所述多肽的DNA上的感興趣的靶序列結(jié)合，所述感興趣的靶序列替換了正常ori序列。只有在隨機(jī)鋅指結(jié)構(gòu)域能夠與感興趣的序列結(jié)合的前提下，與靶序列的結(jié)合才會(huì)發(fā)生。然后，用通過結(jié)合蛋白捕獲的方式將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體分離出來，所述結(jié)合蛋白識(shí)別融合蛋白多肽的N端的肽標(biāo)簽。未結(jié)合的DNA可被洗去，使編碼鋅指蛋白的DNA得到富集，所述鋅指蛋白能夠結(jié)合靶序列，這些編碼鋅指蛋白的DNA進(jìn)而可以通過PCR回收，并且可以進(jìn)行另幾輪體外表達(dá)和蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體捕獲操作，以進(jìn)一步得以富集。
如上文所述，在諸如DNA結(jié)合蛋白-靶序列配對(duì)的情況，結(jié)合肽可直接與DNA靶序列結(jié)合；或者諸如通過雙功能試劑和選擇性的DNA標(biāo)簽，結(jié)合肽可間接與DNA靶序列結(jié)合(見圖4)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的適當(dāng)啟動(dòng)子和翻譯序列的控制下，編碼肽標(biāo)簽的DNA連接于感興趣的文庫成員DNA的5’末端，或選擇性地通過編碼柔性氨基酸接頭的DNA區(qū)域來連接，所述肽標(biāo)簽無法直接與DNA靶序列結(jié)合。由于編碼生成的肽間接連接于DNA靶序列，所以上述情況形成了編碼結(jié)合肽的DNA。選擇性地位于文庫成員DNA序列3’末端的序列是編碼repA的至少最后20個(gè)氨基酸的DNA，和順式DNA元件，而不是repA的ori靶序列。所述DNA靶序列可以是或可以包含DNA標(biāo)簽。所述DNA標(biāo)簽可以是修飾后的單個(gè)堿基。例如，當(dāng)制備含有所述元件的文庫DNA構(gòu)建體時(shí)，可以用例如熒光素或生物素的分子在對(duì)所述DNA的3’末端進(jìn)行標(biāo)記，該分子僅為舉例，而不是用于限制該分子的范圍。
在體外表達(dá)前，文庫DNA片段可與雙功能試劑混合，且DNA片段與雙功能分子的混合比例是1∶1，所述試劑的一個(gè)功能是識(shí)別靶序列并與靶序列結(jié)合，所述靶序列位于DNA的5’末端。該雙功能試劑的另一種功能元件是結(jié)合試劑，該結(jié)合試劑可以識(shí)別肽標(biāo)簽并與肽標(biāo)簽結(jié)合，所述肽標(biāo)簽在DNA片段的5’末端編碼。所述雙功能試劑可以包含識(shí)別DNA上的熒光素或生物素標(biāo)簽的一個(gè)Fab片段(抗原結(jié)合片段)和另一個(gè)識(shí)別在DNA中編碼的肽標(biāo)簽的Fab片段，所述僅為舉例，并不排除其他可能。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道，所述雙功能試劑可由許多不同的方法來制備，所述方法例如將兩種元件化學(xué)交聯(lián)、或?qū)煞N元件表達(dá)為融合蛋白、或雙特異性抗體。所述制備雙功能試劑的方法僅為舉例，并不排除其他可能。
所述雙功能試劑可在表達(dá)編碼生成的肽之前結(jié)合于DNA構(gòu)建體，或者表達(dá)期間提供。
然后，由DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄和翻譯融合蛋白，同時(shí)結(jié)合于雙功能試劑。首先翻譯肽標(biāo)簽，且在信使RNA或RNA聚合酶從DNA解離之前，所述肽標(biāo)簽可由雙功能試劑的第二元件結(jié)合。該過程產(chǎn)生了功能性的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體，其中表達(dá)生成的多肽和編碼該多肽的DNA均通過雙功能試劑連接。因此，肽標(biāo)簽分子間接而特異地連接于DNA靶點(diǎn)(標(biāo)簽)上。通過所述方式將蛋白質(zhì)和DNA構(gòu)建體連接起來，有可能篩選出具有特定特性的蛋白質(zhì)，進(jìn)而鑒定與所述蛋白質(zhì)連接的編碼DNA，所述篩選蛋白質(zhì)的過程將于下文描述。通過利用雙功能試劑而不是蛋白質(zhì)和DNA之間的共價(jià)結(jié)合，可以更容易地從蛋白質(zhì)中分離出DNA構(gòu)建體，而沒有破壞DNA的風(fēng)險(xiǎn)。
隨后通過目標(biāo)蛋白質(zhì)的捕獲來分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體。未結(jié)合的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體可被洗去，使編碼感興趣的肽或蛋白質(zhì)的DNA得到富集，進(jìn)而這些DNA可以通過PCR回收，并且可以使用前述方法進(jìn)行另幾輪體外表達(dá)和蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體捕獲操作，以進(jìn)一步富集感興趣的DNA。
此外，在這個(gè)實(shí)施方案中，DNA可與聚合物等雙功能試劑直接結(jié)合，所述直接結(jié)合例如共價(jià)結(jié)合。所述聚合物可含有不止一個(gè)識(shí)別肽標(biāo)簽的結(jié)合元件，從而可以在一個(gè)單位中多價(jià)展示肽表達(dá)文庫分子，所述單位含有編碼所展示肽的DNA。所述聚合物可以包括聚乙烯和其他能夠與DNA融合的多聚化合物，所述僅為舉例，并非限制該多聚體的范圍。因此本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可與所述雙功能試劑或如上所述的DNA標(biāo)簽結(jié)合，該標(biāo)簽?zāi)軌虮凰鲭p功能試劑結(jié)合。
在本發(fā)明的全部實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體包含用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的適當(dāng)啟動(dòng)子和翻譯序列。任何合適的啟動(dòng)子均可使用，例如ara B、tac啟動(dòng)子、T7、T3或SP6啟動(dòng)子，或其他啟動(dòng)子。將啟動(dòng)子如此放置，使其可操作地連接于本發(fā)明DNA序列，使所述序列得以表達(dá)。
編碼文庫成員肽的DNA可由任何來源(sourcible)的方法制備。特別地，所述DNA可包括分離自cDNA的DNA，從DNA改組獲得的DNA，和合成DNA。
DNA構(gòu)建體也可編碼經(jīng)表達(dá)生成的融合蛋白中的氨基酸接頭。特別地，可包含柔性氨基酸接頭以將DNA結(jié)合肽/repA連接于文庫成員肽上。
根據(jù)本發(fā)明，并參考這一優(yōu)選的實(shí)施方案，可以制備肽或者蛋白質(zhì)表達(dá)文庫，該肽或蛋白質(zhì)表達(dá)文庫與編碼它們的DNA連接，且通過以下步驟選擇具有所需活性的肽構(gòu)建融合蛋白文庫通過編碼柔性氨基酸接頭的DNA區(qū)域，在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的控制下，使用翻譯或核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始和終止密碼子，以適于體外表達(dá)肽文庫成員和結(jié)合蛋白質(zhì)的方式，將肽或蛋白質(zhì)的DNA文庫與編碼肽的DNA融合，所述肽能夠結(jié)合于DNA靶序列，例如順式作用DNA結(jié)合蛋白的DNA。以repA蛋白為例，所述DNA(例如是DNA)文庫成員與repA的DNA結(jié)合蛋白的DNA或其片段融合。cis序列和ori序列可包含于構(gòu)建體中其他元件的下游。在DNA文庫的情況下，將所述DNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)為適于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。
DNA文庫融合蛋白的表達(dá)和順式結(jié)合為了允許產(chǎn)生順式活性，可使用細(xì)菌的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯環(huán)境，例如S30提取物系統(tǒng)(Zubay，0G.，1973，《遺傳學(xué)年度綜述(Ann.Rev.Genet.)》7267)。在同時(shí)存在cis序列和ori序列的條件下，在所述環(huán)境中表達(dá)DNA文庫成員肽-repA融合蛋白等肽，將會(huì)使融合蛋白結(jié)合在編碼該融合蛋白的DNA上。當(dāng)肽-repA融合蛋白文庫以該方式表達(dá)時(shí)，該過程產(chǎn)生了蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體文庫，其中結(jié)合于DNA的蛋白質(zhì)由表達(dá)該蛋白質(zhì)的DNA的片段編碼，由此可以進(jìn)行后續(xù)的對(duì)感興趣的肽或蛋白質(zhì)的選擇和進(jìn)行對(duì)編碼所述肽的DNA的選擇。該方法的體外特性增加了這些文庫的復(fù)雜度，如果不是更大的文庫，至少1010～1014個(gè)DNA片段的文庫是容易制備的。
在轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)和順式結(jié)合過程中，可加入抑制核酸酶活性或減少非特異性DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的化合物。合適的所述化合物的例子包括去污劑和封閉蛋白，后者例如牛血清白蛋白(BSA)。
選擇感興趣的肽由本發(fā)明方法制備的體外肽表達(dá)文庫可用于篩選文庫的特定成員。例如，文庫可用于篩選具有特定活性或特定結(jié)合親和力的肽。通過例如親和力或活性富集技術(shù)，可從文庫中篩選出感興趣的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體。該目的可由感興趣蛋白質(zhì)的特異性配體實(shí)現(xiàn)，例如，如果感興趣的蛋白質(zhì)是抗體，則所述配體就是抗原。配體可存在于固相表面上，例如ELISA平板孔的表面，也可例如與生物素化的配體一起存在于溶液中，然后在蛋白質(zhì)文庫-DNA復(fù)合體與配體溫育以產(chǎn)生配體-配體相互作用之后，生物素化的配體被鏈霉親和素包被的表面或磁珠所捕獲。在固相上或液體中進(jìn)行溫育之后，未結(jié)合的復(fù)合體被洗去，而結(jié)合的復(fù)合體通過以下方法分離得到改變孔中的pH以破壞配體-配體相互作用；或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如蛋白酶消化；或者通過加熱或苯酚-氯仿抽提使repA-ori DNA的結(jié)合變性而使DNA直接從復(fù)合物中解離下來。DNA也可通過上述一種方法解離下來，直接放入PCR緩沖液中進(jìn)行擴(kuò)增?；蛘撸梢栽贒NA沒有從復(fù)合物中解離下來時(shí)直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選擇性地，例如，可以通過組蛋白等非特異性DNA結(jié)合蛋白，保護(hù)未被例如repA蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA以防止降解。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉還有許多其他非特異性DNA結(jié)合蛋白可用于所述目的。進(jìn)一步地，在選擇過程中也可存在抑制核酸酶活性或者降低非特異性DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的化合物。合適的所述化合物的例子包括去污劑、例如在奶粉或牛血清白蛋白(BSA)中發(fā)現(xiàn)的封閉蛋白質(zhì)、肝素或金精三羧酸。
回收結(jié)合的復(fù)合體、再次擴(kuò)增結(jié)合的DNA并重復(fù)所述選擇過程可以使編碼所需序列的克隆得到富集，而后可分離這些克隆用于測序、進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)。例如，編碼感興趣的肽的DNA可由例如PCR的方法進(jìn)行分離和擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用連續(xù)巢式PCR引物來使重復(fù)數(shù)輪的選擇過程和DNA回收更為便利。DNA末端通常在多次PCR步驟后會(huì)受到破壞。為了從該被破壞的分子中回收DNA，需要引物退火于DNA構(gòu)建體末端以外的位置上，從而隨著進(jìn)行每輪選擇連續(xù)縮短所述構(gòu)建體。
在一個(gè)方面，可將DNA構(gòu)建體和/或所編碼的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)為包含標(biāo)簽。這樣的肽或DNA標(biāo)簽(例如上文所描述的)可用于隔離和分離感興趣的文庫成員。該標(biāo)簽也可用于在例如本發(fā)明所述的篩選方法所使用的固相支持物上固定文庫成員。
因此，可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的篩選方法可包括進(jìn)一步的選擇和分離相關(guān)文庫成員肽的步驟，從而對(duì)顯示所需特征的肽以及編碼該肽的DNA進(jìn)行鑒定和純化。
因此，本發(fā)明包括由本發(fā)明的方法鑒定的肽和DNA。所述肽和DNA可被分離和/或純化?？蓪?duì)本發(fā)明的方法分離的肽或DNA加以改造，例如缺失、增加或替換氨基酸或核苷酸。合適的經(jīng)改造的肽或DNA在氨基酸或核苷酸序列上，可與由本發(fā)明方法分離的肽或DNA存在至少50％、至少75％、至少90％、至少90％或更多的同一性。出于運(yùn)輸和/或穩(wěn)定的目的，可以對(duì)本發(fā)明方法鑒定的肽進(jìn)行改造。例如，所述肽可被聚乙二醇化(與聚乙二醇結(jié)合)，以延長血清半壽期或防止蛋白酶的攻擊。本發(fā)明方法鑒定的肽可在例如噬菌體展示等其他展示系統(tǒng)中加以改造，或通過合成和篩選肽變異體的方式加以改造。所述改造序列的集合可形成一個(gè)新的文庫，該文庫可被整合入本發(fā)明的構(gòu)建體中，并進(jìn)一步進(jìn)行篩選以發(fā)現(xiàn)例如顯示出與特定配體具有更優(yōu)結(jié)合能力的變異序列。由此在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中使用的肽文庫可以是結(jié)構(gòu)相關(guān)肽的文庫。
或者，可以使用基本上隨機(jī)的肽序列文庫。在本實(shí)施方案中，可以篩選多種類型的與順式作用DNA結(jié)合蛋白融合的肽文庫，該肽文庫包括(i)由合成的、長度可變的DNA編碼的隨機(jī)肽序列。
(ii)抗體或抗體片段，例如單鏈Fv抗體片段。所述單鏈Fv抗體片段由柔性接頭肽將抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域連接起來而組成，以產(chǎn)生單鏈抗原結(jié)合分子。
(iii)天然存在蛋白質(zhì)的隨機(jī)cDNA片段，所述蛋白質(zhì)從含有感興趣活性的細(xì)胞群中分離得到。
(iv)插入或替換已知蛋白質(zhì)區(qū)域的隨機(jī)肽序列，由此以所述已知蛋白質(zhì)序列作為約束隨機(jī)肽序列的骨架。許多所述蛋白支架已經(jīng)被描述，例如CTLA-4(見專利WO 00/60070)已用作肽文庫的支架，所述僅為舉例，并非排除其他可能。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及DNA文庫的篩選方法，為了發(fā)揮活性，所述DNA文庫成員需要超過一條鏈，例如，與配體結(jié)合需要多條抗體Fab片段。在該實(shí)施方案中，重鏈或輕鏈抗體DNA連接于編碼DNA結(jié)合域的核苷酸序列上，所述DNA結(jié)合域例如repA的DNA結(jié)合域。未知抗體DNA文庫的重鏈(VH和CH1)或輕鏈(VL和CL)基因序列通常插入到repA DNA的5’區(qū)域，該區(qū)域位于適當(dāng)啟動(dòng)子和翻譯序列的后方。由此，產(chǎn)生與DNA文庫成員編碼的蛋白質(zhì)相融合的repA，并結(jié)合在編碼該蛋白質(zhì)的DNA上。編碼輕鏈或重鏈蛋白的第二個(gè)已知鏈，可由以下兩種情況分別進(jìn)行表達(dá)(a)由相同的DNA片段表達(dá)，所述DNA片段含有repA和第一多肽融合蛋白文庫，或(b)由不同的DNA片段表達(dá)，所述DNA片段存在于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中。
已知鏈與未知融合蛋白文庫有關(guān)，該文庫與repA蛋白融合，由此能夠與用于未知鏈的DNA結(jié)合。而后通過抗體特異性的配體，能夠?qū)δ苄訤ab文庫進(jìn)行選擇。
使用本發(fā)明篩選方法鑒定的DNA可被克隆入載體中，所述DNA例如編碼選定文庫成員肽的DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明方法鑒定的DNA可操作地與控制序列連接，該控制序列可以由宿主細(xì)胞提供用于表達(dá)編碼序列，即該載體是表達(dá)載體。術(shù)語“可操作地連接”指所描述的組分按某種關(guān)系并置，所述關(guān)系允許這些組分以其預(yù)定的方式發(fā)揮功能。將與編碼序列“可操作地連接”的調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子以以下方式定位，以在與調(diào)節(jié)序列相容的條件下完成編碼序列的表達(dá)。
所述表達(dá)載體按照分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)構(gòu)建，例如可包括使用質(zhì)粒DNA和合適的起始子、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他元件，所述其他元件例如多聚腺苷酸信號(hào)，該信號(hào)可能是必需的，且以正確的取向安置上，以允許蛋白質(zhì)表達(dá)。其他合適的載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。其他這方面的例子可以參考Sambrook等在1989年編寫的書籍。
所述載體例如可為質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體，均具有復(fù)制起點(diǎn)，選擇性地具有用于表達(dá)所述DNA的啟動(dòng)子和選擇性地具有該啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)子。所述載體可含有一個(gè)或一個(gè)以上的可選擇的標(biāo)記基因，例如，用于細(xì)菌質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因，或用于真菌載體的抗性基因。載體可以用于體外操作，例如用于制備DNA或RNA，或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。也可對(duì)所述載體進(jìn)行改造以用于體內(nèi)操作，例如基因治療方法。
可以選擇與宿主細(xì)胞相容的啟動(dòng)子和其他表達(dá)調(diào)節(jié)信號(hào)，表達(dá)是為所述宿主細(xì)胞而設(shè)計(jì)。例如，酵母啟動(dòng)子包括釀酒酵母(S.cerevisiae)GAL4和ADH啟動(dòng)子，裂殖酵母(S.pombe)的nmtl和adh啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括金屬硫蛋白啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可被鎘等重金屬所誘導(dǎo)。也可使用SV40大T抗原啟動(dòng)子或腺病毒啟動(dòng)子等病毒啟動(dòng)子。所有上述啟動(dòng)子在本領(lǐng)域均易于獲得。
也可使用β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。特別優(yōu)選組織特異性啟動(dòng)子。也可使用病毒啟動(dòng)子，例如莫洛尼鼠白血病病毒的長末端重復(fù)(MMLV LTR)、rous肉瘤病毒(RSV)LTR啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動(dòng)子、腺病毒、HSV(人單純皰疹病毒)啟動(dòng)子(例如HSV IE啟動(dòng)子(立即早期啟動(dòng)子))或HPV(人乳頭瘤病毒)啟動(dòng)子，尤其是HPV的上游調(diào)節(jié)區(qū)域(URR)。病毒啟動(dòng)子在本領(lǐng)域均易于獲得。
所述載體可進(jìn)一步包括側(cè)接有感興趣的多核苷酸的序列，從而產(chǎn)生包含以下序列的多核苷酸，所述序列為與真核基因組序列同源的序列，優(yōu)選為與哺乳動(dòng)物基因組序列或病毒基因組序列同源的序列。所述情況可使通過同源重組將本發(fā)明的多核苷酸引入真核細(xì)胞或病毒的基因組中。特別地，質(zhì)粒載體可用于制備適于將本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒載體，該質(zhì)粒載體所包含的表達(dá)盒位于病毒序列的旁側(cè)。適當(dāng)病毒載體的其他例子包括單純皰疹病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包括慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和HPV病毒。使用所述病毒的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)為本領(lǐng)域中技術(shù)人員所知曉。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于穩(wěn)定地整合多核苷酸，從而使該多核苷酸整合入宿主基因組。與此相反，復(fù)制缺陷型腺病毒載體仍然是游離的，因而允許短暫表達(dá)。
通過標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合檢測可將所述表達(dá)載體用于鑒定感興趣的配體，該配體即結(jié)合于肽文庫成員的分子，所述檢測例如為ELISA或酶檢測分析，其中適當(dāng)?shù)孜锬軌蚶绨l(fā)生顏色改變、發(fā)光或產(chǎn)生熒光現(xiàn)象?？梢允褂闷渌捎玫墓δ軝z測。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將本發(fā)明方法鑒定的DNA克隆入非表達(dá)載體。所述載體可用于例如通過測序進(jìn)一步表征該DNA。
或者可以不進(jìn)行克隆而鑒定感興趣的配體。合適方法的例子包括單個(gè)DNA序列的體外表達(dá)，該DNA序列由本發(fā)明的篩選方法回收得到；也包括對(duì)單個(gè)DNA進(jìn)行測序，該DNA由所述篩選方法回收得到。所述單個(gè)DNA序列可選擇性地加以擴(kuò)增。
本發(fā)明還包括經(jīng)改造以表達(dá)由本發(fā)明方法鑒定的肽的細(xì)胞，例如，通過將如上所述的表達(dá)載體引入細(xì)胞。所述細(xì)胞包括瞬時(shí)或優(yōu)選穩(wěn)定的高等真核細(xì)胞系，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，所述高等真核細(xì)胞系使用例如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；低等真核細(xì)胞，例如酵母或諸如細(xì)菌細(xì)胞等原核細(xì)胞。所述細(xì)胞的具體例子可包括哺乳動(dòng)物HEK293T、CHO、HeLa和COS細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞通過插入對(duì)由本發(fā)明方法鑒定的肽進(jìn)行編碼的載體而進(jìn)行了改造。優(yōu)選所選定的細(xì)胞系不僅是穩(wěn)定的，而且能夠?qū)﹄倪M(jìn)行成熟所需的糖基化和細(xì)胞表面表達(dá)。表達(dá)可以在轉(zhuǎn)化的卵母細(xì)胞中進(jìn)行。本發(fā)明的方法鑒定的肽可在轉(zhuǎn)基因的非人類動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，所述動(dòng)物優(yōu)選為小鼠。本發(fā)明的方法鑒定的肽也可在光滑爪蟾(Xenopuslaevis)卵母細(xì)胞或黑素細(xì)胞中表達(dá)。
為了更徹底地理解本發(fā)明，現(xiàn)將參考附圖更詳盡地描述實(shí)施方案，但是所述實(shí)施方案僅為舉例，不能用作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
本發(fā)明一些實(shí)施方案的實(shí)施例如下。
材料與方法Sambrook，J.等，1989年出版的書(見上)中描述了當(dāng)前申請人所使用的下列方法在瓊脂糖凝膠上分析限制性內(nèi)切酶的消化產(chǎn)物、使用苯苯酚/氯仿存儲(chǔ)液純化DNA、制備磷酸鹽緩沖液。
常規(guī)試劑均購自SIGMA-Aldrich Ltd(Poole，多塞特，英國)。寡核苷酸購自SIGMA-Genosys Ltd(劍橋郡，英國)。氨基酸和S30提取物購自Promega Ltd(南安普敦，漢普郡，英國)。Deep Vent和Taq DNA多聚酶購自New England Biolabs(劍橋郡，英國)。Taqplus DNA多聚酶購自Stratagene Inc.(阿姆斯特丹，荷蘭)。GeneClean DNA凝膠純化試劑盒購自BIO101(La Jolla，加利福尼亞，美國)，抗人Igκ抗體購自Immunologicals Direct Ltd(牛津郡，英國)，抗c-myc多克隆抗體購自VectorLabs Inc(劍橋郡，英國)，抗V5抗體購自Abcam Ltd(劍橋郡，英國)。Superblock封閉試劑購自Perbio Science(柴郡，英國)。
實(shí)施例1.特異性順式作用蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體的分離通過PCR擴(kuò)增依次把TAC啟動(dòng)子、c-myc表位、及人κ恒定區(qū)或V5表位中的一種插入到repA-CIS-ORI區(qū)域，制備體外表達(dá)構(gòu)建體。所述構(gòu)建體可由為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來制備，例如，通過擴(kuò)增不同的DNA片段，然后拼接PCR產(chǎn)物來制備。在本實(shí)施例中，初始擴(kuò)增模板是R1質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有repA-CIS-ORI區(qū)域(Masai，H.和Arai，K.(1988)，DNAs Res.16，6493～6514)。
(a)首輪擴(kuò)增。從含有質(zhì)粒R1的ECO K12菌株的單個(gè)菌落利用PCR擴(kuò)增RepA-CIS-ORI區(qū)域，該反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mMdNTP(脫氧核苷三磷酸)，2.5單位Taqplus Precision DNA多聚酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷蘭)，使用的引物REPAFOR(SEQ ID 01)和ORIREV(SEQ ID 02)均為12.5pmol(皮摩爾)。所述REPAFOR引物退火于repA編碼區(qū)的5’末端。所述ORIREV引物退火于非編碼ORI區(qū)的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，4分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(b)第二輪擴(kuò)增。將1μl(500pg(皮克))稀釋100倍的經(jīng)凝膠純化的首輪反應(yīng)產(chǎn)物再次擴(kuò)增，該反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mMdNTP，2.5單位Taqplus Precision DNA多聚酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷蘭)，使用的引物CKREPFOR(SEQ ID 03)和ORIREV(SEQ ID 02)均為12.5pmol。所述CKREPFOR引物退火于首輪反應(yīng)產(chǎn)物的5’末端，并附加有κ恒定區(qū)DNA的3’部分。所述ORIREV引物退火于首輪反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，2分鐘，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(c)第三輪擴(kuò)增。將1μl(500pg)稀釋100倍的經(jīng)凝膠純化的首輪反應(yīng)產(chǎn)物再次擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位Taqplus Precision DNA多聚酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷蘭)，使用的引物V5REPFOR(SEQ ID 04)和ORIREV(SEQID 02)均為12.5pmol。所述V5REPFOR引物退火于首輪反應(yīng)產(chǎn)物的5’末端，并附加有V5表位DNA的3’部分。所述ORIREV引物退火于首輪反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，2分鐘，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(d)第四輪擴(kuò)增。將1μl(500pg)稀釋100倍的pCKV5質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqplusPrecision DNA多聚酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷蘭)，使用的引物MYCCKFOR(SEQ ID 05)和CKREV(SEQ ID 06)均為12.5pmol。所述pCKV5質(zhì)粒含有人κ恒定區(qū)cDNA(McGregor DP，MolloyPE，Cunningham C，和Harris WJ.1994《分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)》31219-26)和V5表位DNA(Southern JA，Young DF，Heaney F，BaumgartnerWK，Randall RE.1991《基因病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)》721551-7)。所述MYCCKFOR引物退火于κ恒定區(qū)DNA的5’末端，并附加有MYC表位DNA的3’部分。所述CKREV引物退火于κ恒定區(qū)DNA的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，2分鐘，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(e)第五輪擴(kuò)增。將1μl(500pg)稀釋100倍的pCKV5質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqplusPrecision DNA多聚酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷蘭)，使用的引物MYCV5FOR(SEQ ID 07)和V5REV(SEQ ID 08)均為12.5pmol。所述MYCV5FOR引物退火于V5表位DNA的5’末端，并附加有MYC表位DNA的3’部分。所述V5REV引物退火于V5表位DNA的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，30秒，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(f)第六輪擴(kuò)增。將1μl(500pg)稀釋100倍的pTACP2A質(zhì)粒(ref)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqplusPrecision DNA多聚酶，1×PCR反應(yīng)緩沖液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷蘭)，所用的引物TAC3(SEQ ID 09)和MYCTACREV(SEQ ID 10)均為12.5pmol。所述TAC3引物退火于TAC啟動(dòng)子DNA的5’末端。所述MYCTACREV引物退火于TAC啟動(dòng)子DNA的3’末端，并附加有MYC表位DNA的5’部分。
在EppendorfMaster循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，30秒，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(g)第一輪拼接PCR產(chǎn)物。對(duì)(f)和(d)的反應(yīng)產(chǎn)物各1μl(50ng)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(New EnglandBiolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，使用的引物TAC5(SEQ ID 11)和CKREV(SEQ ID 06)均為50pmol。所述TAC5引物退火于(f)反應(yīng)產(chǎn)物的5’末端，并加入了20個(gè)核苷酸。所述CKREV引物退火于(d)反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。
在EppendorfMaster循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(h)第二輪拼接PCR產(chǎn)物。對(duì)(f)和(e)的反應(yīng)產(chǎn)物各1μl(50ng)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為50μl反應(yīng)體系，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(NewEngland Biolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，使用的引物TAC5(SEQ ID11)和V5REV(SEQ ID 08)均為50pmol。所述TAC5引物退火于(f)反應(yīng)產(chǎn)物的5’末端，并加入了20個(gè)核苷酸。所述V5REV引物退火于(e)反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(i)第三輪拼接PCR產(chǎn)物。對(duì)(b)和(g)的反應(yīng)產(chǎn)物各1μl(50ng)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(New EnglandBiolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，使用的引物TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)均為50pmol。所述TAC3引物退火于(g)反應(yīng)產(chǎn)物5’末端下游的20個(gè)核苷酸。所述ORIREV引物退火于(b)反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。(i)的反應(yīng)產(chǎn)物稱為TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI(SEQ ID 12)。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，1分鐘，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(j)第四輪PCR產(chǎn)物拼接。對(duì)(b)和(h)的反應(yīng)產(chǎn)物各1μl(50ng)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(New EnglandBiolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，所用的引物TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)均為50pmol。所述TAC3引物退火于(g)反應(yīng)產(chǎn)物5’末端下游的20個(gè)核苷酸。所述ORIREV引物退火于(b)反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。(j)的反應(yīng)產(chǎn)物稱為TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI(SEQ ID13)。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，2分15秒，之后30個(gè)循環(huán)的條件為94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，1分鐘，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)的準(zhǔn)備。將反應(yīng)體系置于冰上，采用Promega的細(xì)菌線性模板S30偶聯(lián)體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系如下20μl TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI模板(0.5μg最終構(gòu)建體DNA，即上述SEQ ID 012)；20μl TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI模板(0.5μg最終構(gòu)建體DNA，即上述SEQ ID 013)；20μl完全氨基酸混合物(Promega)；80μl S30預(yù)混合液；60μl S30混合液；將反應(yīng)體系在25℃反應(yīng)30分鐘后置于冰上，用封閉緩沖液(Superblock(Perbio Ltd)，0.1％Tween 20(吐溫20)，200μg/ml鯡精DNA)稀釋10倍。
DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的捕獲。用每管內(nèi)500μl PBS(磷酸緩沖鹽溶液)中的10μg/ml的抗c-myc抗體、抗V5抗體或抗人κ鏈抗體包被NUNC star免疫管(immunotube)，4℃過夜。另一只空管作為陰性對(duì)照。將所述免疫管用PBS洗兩次，用Superblock/PBS/0.1mg/ml鯡精DNA/0.1％Tween20在室溫封閉1小時(shí)，再用PBS洗兩次。將500μl稀釋的轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)體系加入各個(gè)管中，室溫溫育1小時(shí)。然后用PBS/0.1％Tween 20洗管5次，用2ml Superblock/PBS/0.1mg/ml鯡精DNA/0.1％Tween 20洗30分鐘，再用PBS洗5次。用300μl T.E.緩沖液和300μl苯酚/氯仿振搖5分鐘，以回收DNA。所述反應(yīng)混合物以13,200g離心5分鐘，用0.5倍體積的7.5M(摩爾每升)醋酸銨、20μg糖原和三倍體積的純乙醇沉淀DNA。離心后，用70％乙醇洗滌沉淀，真空干燥，并重懸于20μl水中。使用引物TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)，將10μl回收的DNA在50μl反應(yīng)體系中再次擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠上進(jìn)行電泳(圖5)。
實(shí)施例2.repA-DNA復(fù)合體的分離將已在實(shí)施例1中描述的兩個(gè)體外表達(dá)構(gòu)建體(SEQ ID 12和SEQ ID13)用于針對(duì)如實(shí)施例1描述的抗人κ恒定區(qū)抗體的選擇實(shí)驗(yàn)，不同之處是使用以下任意一種方法從repA回收和解離的DNA；甘氨酸、三乙胺、苯酚/氯仿、蛋白酶K和EDTA(乙二胺四乙酸)。所述方法描述如下。
甘氨酸將管用500μl的200mM甘氨酸和150mM NaCl(pH2.0)溫育10分鐘。然后將甘氨酸洗脫物轉(zhuǎn)至新的eppendorf管中，并加入50μl的2M的Tris(pH8.5)。
三乙胺用500μl的0.1M三乙胺溫育免疫管10分鐘，然后將三乙胺洗脫物轉(zhuǎn)至新的eppendorf管中，并加入250μl的1M Tris(pH7.4)。
苯酚/氯仿如實(shí)施例1所述。
蛋白酶K將管用500μl的100mM Tris(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)和0.5％SDS(二十烷基磺酸鈉)在37℃溫育30分鐘。將蛋白酶K洗脫物轉(zhuǎn)至新的eppendorf管中。
EDTA將管用250μl的10mM Tris(pH8.0)、1mM EDTA、500mMNaCl和250μl苯酚/氯仿溫育5分鐘。然后將EDTA洗脫物轉(zhuǎn)至新的eppendorf管中。
將回收后的DNA用苯酚/氯仿抽提，如果合適，隨后再進(jìn)行如實(shí)施例1所述的乙醇沉淀。將10μl重懸的DNA在50μl反應(yīng)體系中再次擴(kuò)增，使用TAC3(SEQ ID 09)和CISREV(SEQ ID 019)引物。CISREV引物退火于ORIREV(SEQ ID 02)結(jié)合位點(diǎn)上游的196個(gè)堿基處。反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠上電泳(數(shù)據(jù)未給出)。只有含有CK-DNA的構(gòu)建體(SEQ ID 12)以大致的相當(dāng)?shù)牧勘粩U(kuò)增。
所述結(jié)果不僅證明上述用于從repA回收和解離DNA的方法均可使用，而且提示repA以非共價(jià)方式與其相應(yīng)DNA相互作用。
實(shí)施例3.使用CIS展示技術(shù)在V5摻入(V5-spiking)實(shí)驗(yàn)中檢測特異性抗V5結(jié)合物體外表達(dá)構(gòu)建體通過在repA-CIS-ORI區(qū)域加入TAC啟動(dòng)子和V5表位或12聚體的NNB文庫兩者中的一種，由PCR擴(kuò)增方法制備。所述構(gòu)建體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法來制備，例如擴(kuò)增DNA的不同片段后進(jìn)行PCR產(chǎn)物拼接。在本實(shí)施例中，初始擴(kuò)增模板是R1質(zhì)粒，其含有repA-CIS-ORI區(qū)域(Masai，H.和Arai，K.(1988).Nucleic Acids Res.16，6493～6514)。
(a)首輪擴(kuò)增。從含有質(zhì)粒R1的ECO K12菌株的單個(gè)菌落中擴(kuò)增RepA-CIS-ORI區(qū)域，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(NewEngland Biolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，所用的引物REPAFOR(SEQID 01)和ORIREV408(SEQ ID 20)均為12.5pmol。所述REPAFOR引物退火于repA編碼區(qū)域的5’末端。所述ORIREV408引物退火于非編碼ORI區(qū)域3’末端的下游。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，4分30秒，之后25個(gè)循環(huán)的條件為94℃，30秒；60℃，45秒；72℃，1分鐘，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(b)第二輪擴(kuò)增。將1μl(500pg)100倍稀釋的經(jīng)凝膠純化的首輪反應(yīng)產(chǎn)物再次擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(NewEngland Biolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，所用的引物V5(NNB)REPFOR(SEQ ID 21)和ORIREV408(SEQ ID 20)均為12.5pmol。所述V5(NNB)REPFOR引物退火于首輪反應(yīng)產(chǎn)物的5’末端，并附加有V5表位DNA。所述ORIREV408引物退火于首輪反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，4分30秒，之后25個(gè)循環(huán)的條件為94℃，30秒；60℃，45秒；72℃，1分鐘，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(c)第三輪擴(kuò)增。將1μl(500pg)100倍稀釋的經(jīng)凝膠純化的首輪反應(yīng)產(chǎn)物再次擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(NewEngland Biolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，所用的引物NNBREPFOR(SEQ ID 22)和ORIREV408(SEQ ID 20)均為12.5pmol。所述NNBREPFOR引物退火于首輪反應(yīng)產(chǎn)物的5’末端，并附加有一個(gè)隨機(jī)12聚體NNB文庫DNA。所述ORIREV408引物退火于首輪反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，4分30秒，之后25個(gè)循環(huán)的條件為94℃，30秒；60℃，45秒；72℃，1分鐘，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(d)第四輪擴(kuò)增。將1μl(500pg)100倍稀釋的pTACP2A質(zhì)粒(ref)擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVentDNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(New England Biolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，所用的引物TACFARUP(SEQ ID 23)和TACREV(SEQ ID 27)均為12.5pmol。所述TACFARUP引物退火于TAC啟動(dòng)子DNA的5’末端。所述TACREV引物退火于TAC啟動(dòng)子DNA的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，1分45秒，之后25個(gè)循環(huán)的條件為94℃，15秒；60℃，30秒；72℃，30秒，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(e)第一輪PCR產(chǎn)物拼接。對(duì)(b)和(d)的反應(yīng)產(chǎn)物各1μl(50ng)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(New EnglandBiolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，所用的引物TACFARUP(SEQ ID 23)和ORIREV408(SEQ ID 20)均為50pmol。所述TACFARUP引物退火于(d)反應(yīng)產(chǎn)物的5’末端。所述ORIREV480引物退火于(b)反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。(e)的反應(yīng)產(chǎn)物稱為TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408(SEQ ID 24)。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，1分45秒，之后25個(gè)循環(huán)的條件為94℃，15秒；60℃，30秒；72℃，1分30秒，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。
(f)第二輪PCR產(chǎn)物拼接。對(duì)(c)和(d)的反應(yīng)產(chǎn)物各1μl(50ng)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5單位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反應(yīng)緩沖液(New EnglandBiolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)，所用的引物TACFARUP(SEQ ID 23)和ORIREV408(SEQ ID 20)均為50pmol。所述TACFARUP引物退火于(d)反應(yīng)產(chǎn)物的5’末端。所述ORIREV480引物退火于(c)反應(yīng)產(chǎn)物的3’末端。
在Eppendorf Master循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，第一個(gè)循環(huán)的條件為94℃，1分45秒，之后25個(gè)循環(huán)的條件為94℃，15秒；60℃，30秒；72℃，1分30秒，隨后進(jìn)行72℃、10分鐘的單循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需產(chǎn)物，根據(jù)廠商說明書使用Geneclean II試劑盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亞州，美國)將其從凝膠上純化至40μl無菌水中。(f)的反應(yīng)產(chǎn)物稱為TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408(SEQ ID 25)。
體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)的準(zhǔn)備。將反應(yīng)體系置于冰上，使用Promega的細(xì)菌線性模板S30偶聯(lián)體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)體系如下20μl 5000倍稀釋的TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408模板(0.1ng的最終構(gòu)建體DNA，如上所述SEQ ID 24)20μl 5 TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408模板(0.5μg最終構(gòu)建體DNA，如上所述SEQ ID 25)20μl完全氨基酸混合物(Promega)80μlS30預(yù)混合液
60μl S30混合液將所述反應(yīng)體系在25℃繼續(xù)進(jìn)行30分鐘后置于冰上，用2％Marvel/PBS稀釋10倍。
DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體的捕獲。用溶于500μl PBS的10μg/ml的抗V5抗體包被NUNC star免疫管，4℃過夜。另一只空管留作陰性對(duì)照。所述免疫管用PBS洗兩次，用封閉緩沖液(2％Marvel，0.1％Tween 20，0.1mg/ml鯡精DNA)室溫封閉1小時(shí)，再用PBS洗兩次。將1ml稀釋的轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)體系加入各個(gè)管中，室溫溫育1小時(shí)。然后用PBS/0.1％Tween20洗管5次，再用PBS洗5次。用500μl TE緩沖液和500μl苯酚/氯仿回收DNA。所述反應(yīng)混合物以13,200g離心5分鐘，用0.1倍體積的3M(摩爾每升)醋酸鈉、50μg/ml糖原和2倍體積的純乙醇沉淀DNA。離心后，用70％乙醇洗滌沉淀，真空干燥，并重懸于40μl水中。使用生物素化的bTAC6(SEQ ID 26)和bCISREV(SEQ ID 19)引物，將20μl回收的DNA在50μl反應(yīng)體系中再次擴(kuò)增。將反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠上進(jìn)行電泳。
將回收的DNA克隆入表達(dá)載體pDMG-K(SEQ ID 27)中。根據(jù)廠商說明書使用QIAquick Gelextracation試劑盒(QIAGEN Ltd，West Sussex，英國)對(duì)所述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并用50μl無菌水洗脫。將純化的反應(yīng)產(chǎn)物和質(zhì)粒pDMG-K均用20單位的NcoI和NotI(New England Biolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)消化。根據(jù)廠商說明書(QIAGEN Ltd，WestSussex，英國)使用QIAquick Gelextracation試劑盒對(duì)所述酶切質(zhì)粒進(jìn)行凝膠純化，然后用0.01單位的牛小腸堿性磷酸酶(Promega，南安普敦，英國)處理，再進(jìn)行如上所述的苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。將沉淀DNA溶解于20μl水中。在1×TBS(Tris緩沖鹽溶液)、0.3mg/ml BSA、0.1％Tween20的溶液中把經(jīng)酶切的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)至鏈霉親和素包被的小條上(RocheDiagnostics Ltd，East Sussex，英國)，并且室溫振蕩溫育30分鐘。所述操作去除了PCR產(chǎn)物NcoI和NotI位點(diǎn)上下游的生物素化的旁側(cè)DNA，從而能夠回收含有所選肽序列的小DNA片段。采用如上所述的苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法處理上清。將沉淀DNA溶解于10μl水中。根據(jù)廠商說明書使用Quick連接試劑盒(New England Biolabs，Beverly，馬薩諸塞州，美國)將酶切質(zhì)粒和含有所選肽序列的分離后的小DNA片段相連，所述兩者均具有NcoI和NotI突出端，然后進(jìn)行如上所述的苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。將沉淀DNA溶解于10μl水中后，按照廠商說明書(Stratagene，美國)將所述DNA電激轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)TG1細(xì)胞中，并在2×TY、100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖的平板上進(jìn)行選擇。
所選克隆的抗V5抗體ELISA篩選。挑選88個(gè)克隆放入400μl的2×TY、2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)液中，于37℃、300rpm(轉(zhuǎn)每分鐘)振蕩培養(yǎng)過夜。將50μl過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1ml的2×TY、2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)液中，于37℃、300rpm振蕩培養(yǎng)至OD為0.5。然后以1000g將所述細(xì)胞離心10分鐘。棄上清，將沉淀重懸于600μl的2×TY、0.4M蔗糖、100μg/ml氨芐青霉素和1mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的培養(yǎng)液中，以37℃、300rpm培養(yǎng)4小時(shí)。誘導(dǎo)后，將所述細(xì)胞以1000g離心10分鐘。將150μl上清用于ELISA試驗(yàn)。用1×PBS配制的100μl的1μg/ml抗人κ區(qū)抗體或抗V5抗體溶液或50μg/ml的BSA，室溫包被NUNC Maxisorp板7小時(shí)。另一塊板留作空白，僅包被PBS。將孔用PBS沖洗2次，然后用1×PBS配制的300μl的4％Marvel、0.1％Tween室溫封閉1小時(shí)。將孔用PBS沖洗2次，再在孔中加入150μl上清和用1×PBS配制的150μl的4％Marvel、0.1％Tween 20，室溫溫育1小時(shí)。然后將孔用PBS、0.1％Tween 20清洗2次，再用PBS清洗2次。偶聯(lián)有辣根過氧化物酶(HRP)的抗人κ區(qū)抗體(終濃度為1.6μg/ml)在1×PBS中配制的4％Marvel、0.1％Tween 20中稀釋500倍，然后加入孔中，室溫溫育1小時(shí)。將孔用PBS、0.1％Tween 20清洗4次，再用PBS清洗2次。加入200μl的TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)底物以檢測HRP信號(hào)。用100μl的0.5M硫酸終止反應(yīng)。在450nm處讀取吸收值。根據(jù)抗人κ區(qū)抗體篩選的克隆的HRP信號(hào)進(jìn)行評(píng)價(jià)，88個(gè)克隆中的35個(gè)表達(dá)良好。所述35個(gè)克隆中的7個(gè)顯示其能夠特異性結(jié)合于抗V5抗體，因此V5肽從5000個(gè)中有1個(gè)富集到5個(gè)中有1個(gè)，即富集因子為1000(圖6)。
實(shí)施例4.針對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus globigii)的CIS展示文庫的構(gòu)建、選擇和篩選文庫構(gòu)建為了創(chuàng)建文庫DNA，首先必需構(gòu)建啟動(dòng)子文庫DNA片段和repA-CIS-ori片段，然后通過消化-連接作用將其連接起來。本實(shí)施例中使用來自P2A-HA載體的tac啟動(dòng)子，但是也可以使用許多可獲得的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。初始repA-CIS-ori和TAC片段的PCR產(chǎn)物，分別附加有Bsp120I位點(diǎn)和隨機(jī)文庫/NotI位點(diǎn)。制備2種主要混合物使用10μl 1∶50稀釋的P2A-HA質(zhì)粒DNA(25ng/反應(yīng))進(jìn)行20次PCR擴(kuò)增，每次反應(yīng)體系的體積為50μl，含有200μM dNTP，1×NEB多聚酶擴(kuò)增緩沖液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)，均為10pmol的TACFARUP(SEQ ID 23)和NTERM18MER(SEQ ID 28)引物，2單位的Taq DNA多聚酶∶DeepVent DNA多聚酶為20∶1的混合物(NEB)，反應(yīng)條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，60秒的25個(gè)循環(huán)，然后在72℃延伸5分鐘。將20μl反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠中電泳并照相，剩余產(chǎn)物用Qiagen柱純化至200μl水中。
使用10μl Bsp120I校正的Rep-CIS-ori DNA(50ng/反應(yīng))進(jìn)行10次PCR擴(kuò)增，每次反應(yīng)體系的體積為50μl，含有200μM dNTP，1×NEB多聚酶擴(kuò)增緩沖液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)，均為10pmol的BSPREPAFOR(SEQ ID 29)和ORIREV(SEQ ID 02)引物，2單位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶為20∶1的混合物(NEB)，反應(yīng)條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5分鐘。將20μl反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠中電泳并照相，剩余產(chǎn)物用Qiagen柱純化至120μl水中。
然后用10μl NotI(NEB)(100u(單位))消化文庫-TAC產(chǎn)物，消化條件為300μl反應(yīng)體積、37℃溫育1小時(shí)，再用Qiagen柱純化至120μl的水中。所述兩種產(chǎn)物由以下條件的限制性酶切-連接作用而連接起來

使所述反應(yīng)在37℃進(jìn)行2小時(shí)。從反應(yīng)產(chǎn)物中取20μl利用凝膠電泳進(jìn)行評(píng)估，取30μl直接進(jìn)行10次50μl反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增，剩余產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后切下文庫條帶，用Qiagen柱純化，再以TACFAR4(SEQID 30)和ORIREV(SEQ ID 02)為引物進(jìn)行20次50μl反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增，條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的30個(gè)循環(huán)，而后在72℃延伸5分鐘。在4個(gè)Qiagen柱中凝膠純化DNA，匯集200μl洗脫物以進(jìn)行ITT(體外轉(zhuǎn)錄/翻譯)反應(yīng)/選擇。
第一輪選擇準(zhǔn)備2個(gè)200μl的ITT反應(yīng)體系，室溫溫育1小時(shí)，所述反應(yīng)體系如下

將1ml封閉緩沖液加入到各個(gè)反應(yīng)體系中(封閉緩沖液為用TBS配制的4％Marvel，100μg/ml經(jīng)剪切的鮭精DNA，0.1％Tween 20，2.5mg/ml肝素)，10,000g離心2分鐘，轉(zhuǎn)入新的管中后置于冰上。
將100μl枯草芽孢桿菌(Bg)的孢子懸液用1ml TBS/0.1％Tween 20洗滌2次，然后重懸于100μl封閉緩沖液中。將其再加入封閉緩沖液中，在攪拌下在室溫結(jié)合1小時(shí)。
將上述混合物以16,100g離心1分鐘，在離心前通過用移液管混合并用渦旋的方式，將孢子沉淀用1ml的TBS/0.1％Tween 20洗滌6次。最后用1ml TBS洗滌所述沉淀，并棄上清。
在攪拌器上通過在120μl 0.5M醋酸鈉(pH5.5)中對(duì)所述孢子溫育10分鐘，以洗提DNA。將所述孢子在16,100g離心1分鐘，上清用120μl Tris(pH8.0)中和，然后以16,100g離心5分鐘進(jìn)行苯酚/氯仿抽提。用20μg載體糖原和2.5倍體積乙醇沉淀DNA。以16,100g離心20分鐘來使DNA沉淀，再用0.75ml 70％乙醇將沉淀洗滌3次，每次洗滌之間以16,100g離心3分鐘，然后在空氣中干燥，并重懸于20μl水中。
將10μl回收的DNA在10個(gè)50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為CISREV(SEQ ID 19)和TACFAR5(SEQ ID 31)，使用2單位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶為20∶1的混合物(NEB)，反應(yīng)條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的30個(gè)循環(huán)，而后在72℃延伸5分鐘。對(duì)DNA進(jìn)行純化、乙醇沉淀，并重懸于10μl水中。5μl產(chǎn)物以上述條件進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但是使用的引物改為NOTRECREV2(SEQ ID 32)和TACFAR5(SEQ ID 31)，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)。該產(chǎn)物用QiagenPCR純化試劑盒純化，并洗脫入50μl 5mM Tris(pH8.0)中。
限制性酶切-連接該反應(yīng)在30μl的體系中在37℃進(jìn)行1小時(shí)，以再次將repA-CIS-oriDNA與所回收的肽結(jié)合，以進(jìn)行另一輪選擇。

將20μl所述反應(yīng)產(chǎn)物在10個(gè)50μl反應(yīng)體系中直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以TACFAR5.1(SEQ ID 33)和ORIREV(SEQ ID 02)為引物，反應(yīng)條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的20個(gè)循環(huán)，而后在72℃延伸5分鐘。在1個(gè)Qiagen柱中凝膠純化DNA，將洗脫物用于第二輪ITT反應(yīng)/選擇(第二輪中使用58μl)。
第二輪用如第一輪所述方法進(jìn)行第二輪選擇，其中更改如下所使用的加入DNA約為3μg。封閉緩沖液為用TBS配制的2％牛血清白蛋白、1％明膠、100μg/ml經(jīng)剪切的鮭精DNA、2.5mg/ml肝素。每次選擇時(shí)使用10μl經(jīng)洗滌的孢子。使用TACFAR5.2(SEQ ID 34)和NOTRECREV2(SEQID 32)引物回收PCR產(chǎn)物。最后，使用TACFAR5.2(SEQ ID 34)和ORIREV(SEQ ID 02)引物拼接(pull through)PCR產(chǎn)物，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)。
第三輪用如第二輪所述方法進(jìn)行第三輪選擇，其中更改如下所使用的加入DNA約為2.5μg。使用TACFAR6(SEQ ID 35)和NOTRECREV2(SEQID 32)引物回收PCR產(chǎn)物。最后，使用TACFAR6(SEQ ID 35)和ORIREV(SEQ ID 02)引物拼接PCR產(chǎn)物，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)。
第四輪用如第三輪所述方法進(jìn)行第四輪選擇，不同之處是選擇過程中所使用的加入DNA約為2μg。使用TAC3(SEQ ID 09)和NOTRECREV2(SEQ ID 32)引物回收PCR產(chǎn)物。最后，使用TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)引物拼接PCR，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)。
第五輪用如第四輪所述方法進(jìn)行第五輪選擇。
為了克隆出NcoI-NotI片段，使用生物素化的TAC6(SEQ ID 26)引物和NOTRECREV2(SEQ ID 32)引物對(duì)儲(chǔ)存的從第五輪選擇回收的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用NotI消化后用Qiagen PCR純化試劑盒純化，用NcoI消化后在包被有鏈霉親和素的平板上溫育。在苯酚/氯仿純化和乙醇沉淀后，將消化后的DNA連接入用相似方法消化的pVIII噬菌粒載體中，并轉(zhuǎn)化入ER2738大腸桿菌中，然后涂于含2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨芐青霉素的平板上，在37℃溫育過夜(o/n)。
挑選單個(gè)菌落放入96孔板中的200μl的含2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)液里，以37℃/200rpm振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。然后，將其中100μl轉(zhuǎn)移至深孔板，每孔含有100μl的2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨芐青霉素和10μl M13K07輔助噬菌體，在37℃不加振蕩溫育1小時(shí)。每孔加入500μl含有2×TY、100μg/ml氨芐青霉素/25μg/ml卡那霉素/20μM IPTG的培養(yǎng)液，在37℃/200rpm振蕩溫育過夜。
ELISA篩選將圓底96孔板用以TBS配制的4％Marvel和以PBS配制的0.1％Tween 20室溫封閉1小時(shí)。取出噬菌體培養(yǎng)物，以3000g離心5分鐘，用ELISA檢測噬菌體上清。在每個(gè)孔中，將50μl噬菌體上清與5μl Bg孢子混合于50μl的用TBS配制的4％牛血清白蛋白、1％明膠中，室溫振蕩溫育1小時(shí)。用200μl TBS/0.1％Tween20洗滌所述孔5次，每次洗滌之間以3000g離心5分鐘，然后與偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗M13抗體溫育，所述抗體以0.2μg/ml的濃度溶于用TBS配制的4％牛血清白蛋白、1％明膠溶液中。于室溫振蕩溫育所述孢子1小時(shí)。將孔用TBS/0.1％Tween20清洗5次后，將孢子轉(zhuǎn)入新平板中。在用TMB底物顯色之前，用上述TBS將所述孢子洗滌1次。用0.5M的H2SO4使顯色反應(yīng)終止，然后將所述溶液轉(zhuǎn)入新的平底平板中，用于在450nm處讀數(shù)。選擇得到的肽的結(jié)合數(shù)據(jù)見圖7。
實(shí)施例5.針對(duì)抗V5抗體的CIS展示文庫的構(gòu)建、選擇和篩選采用如實(shí)施例4所述的方法進(jìn)行文庫構(gòu)建。
第一輪選擇配制1個(gè)200μl的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯(ITT)反應(yīng)體系，如實(shí)施例4所述在室溫溫育1小時(shí)。將1ml封閉緩沖液(封閉緩沖液是TBS配制的5％脫脂奶粉，100μg/ml經(jīng)剪切的鮭精DNA，2.5mg/ml肝素)加入各個(gè)反應(yīng)體系中，然后置于冰上。
在第一輪文庫篩選中，用1ml PBS配制的10μg/ml多克隆抗V5肽抗體(Harlan-Seralab)于37℃包被70×11mm的NUNC Maxisorp免疫管(LifeTechnologies，Paisley，英國蘇格蘭)1小時(shí)。用PBS洗管3次(注滿再傾空)后，用3ml封閉緩沖液于37℃封閉1小時(shí)，再以如前方法洗管。加入含有文庫蛋白-DNA復(fù)合體的緩沖液，室溫靜置溫育1小時(shí)。用PBS/0.1％Tween 20洗管5次，再僅用PBS進(jìn)一步洗管5次。
在血液混合器上將DNA洗脫入500μl 1M的醋酸鈉(pH5.2)中，洗脫時(shí)間為10分鐘，再用100μl 1M的Tris-HCl(pH8.0)中和，然后用苯酚/氯仿在16,100g下抽提5分鐘。以20μg載體糖原、0.5倍體積7.5M醋酸銨和3倍體積乙醇沉淀DNA。以16,100g離心20分鐘來使DNA沉淀，用0.5ml的70％乙醇在16,100g將沉淀洗滌5分鐘，然后真空干燥，并重懸于20μl水中。
在1個(gè)50μl反應(yīng)體系中對(duì)10μl回收的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為NOT1RECREV2(SEQ ID 32)和TACFAR4(SEQ ID 30)，使用2單位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶為20∶1的混合物(NEB)，反應(yīng)條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的30個(gè)循環(huán)，之后在72℃延伸5分鐘。將50μl反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠上電泳并照相，然后用GeneClean純化至10μl水中。將所述DNA再連接于RepA DNA，并采用如實(shí)施例4第二輪所述的方法再次擴(kuò)增，所使用的引物為TACFAR5(SEQ ID 31)和ORIREV(SEQ ID 02)。
采用第一輪的方法進(jìn)行第二輪選擇，使用與實(shí)施例4所述相同的引物對(duì)，變更如下將抗V5抗體的包被濃度減至5μg/ml。加入DNA約為4μg。采用第二輪的方法進(jìn)行第三輪選擇，變更如下所使用的加入DNA約為4μg。使用TACFAR5.1(SEQ ID 33)和NOTRECREV2(SEQ ID 32)引物回收PCR產(chǎn)物。最后，使用TACFAR6(SEQ ID 35)和ORIREV(SEQID 02)引物拼接PCR，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)。采用第三輪的方法進(jìn)行第四輪選擇。
為了克隆出NcoI-NotI片段，用生物素化的TAC6(SEQ ID 26)和NOTIREPRECREV2(SEQ ID 32)引物對(duì)所儲(chǔ)存的從第四輪選擇回收的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆入pVIII噬菌粒載體，然后電激轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)TG-1大腸桿菌，所述過程如實(shí)施例4所述。
挑選單個(gè)菌落放入96孔板上的200μl的含2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)液中，以37℃/200rpm振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。將其中100μl轉(zhuǎn)至深孔平板，每孔含有2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨芐青霉素和109kru M13K07輔助噬菌體的培養(yǎng)液100μl，于37℃不加振蕩地溫育1小時(shí)。每孔加入400μl含有2×TY、100μg/ml氨芐青霉素/25μg/ml卡那霉素/20μM IPTG的培養(yǎng)液，將噬菌體在37℃以200rpm振蕩持續(xù)擴(kuò)增16小時(shí)。然后，將細(xì)菌培養(yǎng)物在微量滴定板載體中以4℃、2000g的條件在臺(tái)式離心機(jī)中離心10分鐘，以分離沉淀的細(xì)菌和用于ELISA檢測的培養(yǎng)物上清。
于37℃用100μl/孔PBS中的100ng/孔的抗V5肽抗體包被NUNCMaxisorp ELISA板1小時(shí)。每孔用200μl的PBS洗2次，然后在37℃每孔用200μl的2％BSA/PBS封閉1小時(shí)，再用200μl/每孔的PBS洗2次。每孔加入50μl噬菌體培養(yǎng)物上清，室溫結(jié)合1小時(shí)，所述每孔中含有50μl的4％BSA/PBS。每孔用200μl的PBS/0.1％Tween 20洗2次，再用200μl的PBS洗2次。向每孔加入100μl的2％BSA/PBS，其中含有1∶5000稀釋的結(jié)合有HRP的抗M13抗體(Amersham-Pharmacia)，室溫溫育1小時(shí)，以檢測結(jié)合的噬菌體，再用上述方法洗板4次。每孔加入100μl的TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)底物緩沖液，室溫顯色5分鐘。然后加入100μl/孔的0.5N(當(dāng)量)H2SO4以終止反應(yīng)，并在450nm處讀數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)pUC正向測序引物和反向測序引物，對(duì)ELISA陽性克隆的噬菌粒DNA進(jìn)行測序。所述分離得到克隆的氨基酸序列在下文中給出。取4個(gè)ELISA陽性克隆使其在10ml培養(yǎng)液中生長，然后用PEG-NaCl沉淀噬菌體顆粒，并重懸于1ml的PBS中，取其中50μl用上述方法再次進(jìn)行ELISA檢測。圖8顯示了針對(duì)抗V5抗體和作為對(duì)照的抗ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)肽抗體在450nm處的OD信號(hào)。
選擇后分離得到的肽序列如下P1C12(SEQ ID 36)C G C P T M A A R V R P V L N S K HP2H1(SEQ ID 37) M T T V P V L M I S VP1B5(SEQ ID 38) T L S T R H H N V I D R F N L R N FP2B8(SEQ ID 39) S I R T L T G S T P A Q F D A T A D實(shí)施例6.從CIS展示文庫中選擇卵清蛋白結(jié)合肽對(duì)于任何選擇技術(shù)而言，重要的是在選擇和篩選過程中，使被選擇的實(shí)體能夠與選擇所針對(duì)的靶點(diǎn)結(jié)合，且不依賴于與其有關(guān)的載體分子。在本實(shí)施例中，選擇和合成一些選定肽，以確保與靶點(diǎn)的結(jié)合。如實(shí)施例3所述，構(gòu)建由12個(gè)氨基酸組成的肽的隨機(jī)文庫。使用100μg/ml卵清蛋白(SIGMA，Dorset，英國)包被的免疫管，進(jìn)行如實(shí)施例4所述的四輪選擇。
為了克隆出NcoI-NotI片段，采用生物素化的TAC6(SEQ ID 26)和NOTIREPRECREV2(SEQ ID 32)引物，對(duì)第四輪選擇中回收的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將此PCR產(chǎn)物克隆入pVIII噬菌粒載體，電激轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)TG-1大腸桿菌中，上述過程如實(shí)施例4所述。
挑出單個(gè)菌落放入96孔板上的200μl含2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)液中，以37℃/200rpm振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。將其中100μl轉(zhuǎn)到深孔平板，每孔含有2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨芐青霉素和109kru M13K07輔助噬菌體的培養(yǎng)液100μl，于37℃不加振蕩地培養(yǎng)1小時(shí)。每孔加入400μl含有2×TY、100μg/ml氨芐青霉素/25μg/ml卡那霉素/20μM IPTG的培養(yǎng)液，將噬菌體在37℃以200rpm振蕩持續(xù)擴(kuò)增16小時(shí)。然后，將細(xì)菌培養(yǎng)物在微量滴定板載體中以4℃、2000g的條件在臺(tái)式離心機(jī)中離心10分鐘，以分離沉淀的細(xì)菌和用于ELISA檢測的培養(yǎng)物上清。
用100μl/孔PBS中100μg/孔的卵清蛋白包被NUNC MaxisorpELISA板，4℃過夜。每孔用200μl PBS洗2次，然后在37℃用200μl的2％BSA/PBS封閉1小時(shí)，再用200μl/孔PBS洗2次。每孔加入50μl噬菌體培養(yǎng)物上清，室溫結(jié)合1小時(shí)，所述每孔中含有50μl 4％BSA/PBS。每孔用200μl PBS/0.1％Tween 20洗2次，再用200μl PBS洗2次。每孔加入100μl的2％BSA/PBS，其中含有1∶5000稀釋的偶聯(lián)有HRP的抗M13抗體(Amersham-Phamacia)，室溫溫育1小時(shí)，以檢測結(jié)合的噬菌體，再用上述方法洗板4次。每孔加入100μl TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)底物緩沖液，室溫顯色5分鐘。然后每孔加入100μl 0.5N(當(dāng)量)H2SO4以終止反應(yīng)，并在450nm處讀數(shù)。使用M13REV引物，對(duì)ELISA陽性克隆的噬菌粒DNA測序。從這些克隆分離得到的肽序列如下C1(SEQ ID 40)A N L W R I V L H G W WC4(SEQ ID 41)V S F M L L G P H R H RC6(SEQ ID 42)L V L H W L S L G S RC8(SEQ ID 43)S N Q V V L I L H L R P對(duì)照(SEQ ID 44) A E S W L H Q S W I H L合成了4個(gè)具有代表性來自的ELISA陽性克隆的肽序列(SIGMA-Genosys Ltd)，并在其C末端加入生物素，以有助于ELISA檢測。與先前針對(duì)枯草芽孢桿菌的孢子由噬菌體展示選擇方法分離得到的、作為對(duì)照的肽一起，針對(duì)卵清蛋白對(duì)所述肽進(jìn)行了ELISA檢測。用以下物質(zhì)包被NUNC Maxisorp ELISA平板，4℃過夜，所述物質(zhì)為每孔100μlPBS中的100μg卵清蛋白或PBS中的200ng抗V5多克隆抗體。用200μlPBS沖洗每孔2次，每孔以200μl PBS配制的2％脫脂奶粉于37℃封閉1小時(shí)，再用200μl PBS沖洗2次。在含有100μl 2％BSA/PBS的孔中加入1μg稀釋的肽，室溫結(jié)合1小時(shí)。用200μl PBS/0.1％Tween20將各孔沖洗2次，再用200μl PBS沖洗2次。在每孔中加入100μl的2％BSA/PBS，其中含有1∶2000稀釋的偶聯(lián)有HRP的鏈霉親和素(Pierce)，室溫溫育1小時(shí)，以檢測結(jié)合的肽，用上述方法沖洗平板4次。每孔加入100μl TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)底物緩沖液，室溫顯色5分鐘。然后加入100μl 0.5N的H2SO4以終止反應(yīng)，并在450nm處讀數(shù)(圖9)。
實(shí)施例7.在CIS展示系統(tǒng)中展示單鏈Fv抗體(scFv)片段基本上如實(shí)施例1所述，由PCR重疊延伸方法構(gòu)建tac-scFv-repA-CIS-ori構(gòu)建體。在50μl反應(yīng)體系中擴(kuò)增抗2甲4氯丙酸scFvDNA(Haptogen Ltd，阿伯丁，英國)，該反應(yīng)體系中含有200μM dNTP、1×NEB多聚酶擴(kuò)增緩沖液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mMTris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)、濃度均為10pmol的TACMECOFOR(SEQ ID 45)和REPAMECOBAK(SEQ ID 46)引物和2單位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶為20∶1的混合物(NEB)，反應(yīng)條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，80秒的30個(gè)循環(huán)，之后在72℃延伸5分鐘。將所述PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠上電泳，用Geneclean II試劑盒純化至20μl水中。將該產(chǎn)物在50μl的反應(yīng)體系中與RepA-CIS-ori DNA和Tac啟動(dòng)子DNA組裝，所述RepA-CIS-ori DNA由ORIREV408(SEQ ID 20)和MECOREPAFOR(SEQ ID 47)制備而成，所述Tac啟動(dòng)子DNA由TACFARUP(SEQ ID 23)和MECOTACBAK(SEQ ID48)制備而成，所述反應(yīng)體系含有200μM dNTP、1×NEB多聚酶擴(kuò)增緩沖液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100(曲通X-100))、濃度均為10pmol的TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)引物和2單位的Taq DNA多聚酶∶Deep VentDNA多聚酶為20∶1的混合物(NEB)，反應(yīng)條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，80秒的30個(gè)循環(huán)，之后在72℃延伸5分鐘。所述PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠上電泳，用Geneclean II試劑盒純化至20μl水中。
所述DNA再次以50μl體系擴(kuò)增10次，反應(yīng)體系中含有200μMdNTP、1×NEB多聚酶擴(kuò)增緩沖液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mMTris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％ TritonX-100)、濃度均為10pmol的TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)引物和2單位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶為20∶1的混合物(NEB)，反應(yīng)條件為94C，40秒；60℃，40秒；72℃，80秒的30個(gè)循環(huán)，之后在72℃延伸5分鐘。所述PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠上電泳，用Geneclean II試劑盒純化至100μl水中。
然后，將scFv DNA在下述兩個(gè)反應(yīng)條件中進(jìn)行翻譯

將上述體系在30℃溫育30分鐘，然后在反應(yīng)2中加入1μl的0.25M氧化型谷胱甘肽，繼續(xù)在30℃再溫育30分鐘。在每個(gè)反應(yīng)體系中加入1ml封閉緩沖液(封閉緩沖液為用TBS配制的1％明膠，100μg/ml經(jīng)剪切的鮭精DNA，2.5mg/ml肝素)，用10,000g離心2分鐘，然后置于冰上。
使用0.5ml用PBS配制的10μg/ml的BSA-2甲4氯丙酸偶聯(lián)物或10μg/ml BSA在37℃包被NUNC star免疫管1小時(shí)。用PBS洗管2次，在血液混合器上用3ml封閉緩沖液于室溫封閉1小時(shí)，再用PBS洗管2次。
將稀釋的ITT各0.5ml加入到已封閉的BSA包被的或BSA-2甲4氯丙酸包被的管中，于室溫溫育1小時(shí)。然后所述管用TBS/0.1％Tween 20洗5次，用TBS洗5次。
將結(jié)合的DNA用0.5ml的0.5M NaCl/10mM Tris(pH8)、1mMEDTA(乙二胺四乙酸)于室溫洗脫10分鐘，然后用0.5ml苯酚/氯仿抽提，用20μg載體糖原、0.5倍體積7.5M醋酸銨和3倍體積乙醇沉淀。以14,000g離心20分鐘來使DNA沉淀，用0.5ml 70％乙醇以14,000g漂洗沉淀5分鐘，然后真空干燥、并重懸于20μl水中。
將10μl回收的DNA以50μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述反應(yīng)體系含有200μM dNTP、1×NEB多聚酶擴(kuò)增緩沖液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)、濃度均為10pmol的TACMECOFOR(SEQ ID 45)和REPAMECOBAK(SEQID 46)引物和2單位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶為20∶1的混合物(NEB)，反應(yīng)條件為94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，80秒的30個(gè)循環(huán)，之后在72℃延伸5分鐘。所述反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖/TAE凝膠上電泳并照相。觀察到由抗體靶點(diǎn)選擇回收得到的DNA量比由BSA包被的管回收的DNA多，該現(xiàn)象提示選擇得到了功能性scFv-repA-DNA復(fù)合體(圖10)。
序列表<110>伊索杰尼卡有限公司<120>體外肽表達(dá)文庫<130>FCI05GB0365<150>GB 0220759.5<151>2002-09-06<150>GB 0304521.8<151>2003-02-27<150>GB 0304657.0<151>2003-02-28<160>48<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1actgatcttc accaaacgta tta 23<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tgcatatctg tctgtccaca gg 22<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>3gagcttcaac aggggagggg gaggaggatc aactgatctt caccaaac 48<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ctaggactgg attcaacggg gggaggagga tcaactgatc ttcaccaaac 50<210>5<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cagaagagga tctgaatggg ggaggagggt ccactgtggc tgcaccatc 49<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tcccctgttg aagctctttg tg 22<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>7cagaagagga tctgaatggg ggaggagggt ccggaaaacc40<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gctacgttga atccagtcct aggagag 27<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9catattgtcg ttagaacgcg gc 22<210>10<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10attcagatcc tcttctgaga tgagtttttg ttcctcgagc atggtagatc ctgtttcc58<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11cgatacctag cgttcggatc catattgtcg ttagaacgcg gc 42<210>12<211>1788<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA構(gòu)建體<400>12catattgtcg ttagaacgcg gctacaatta atacataacc ttatgtatca tacacatacg 60atttaggtga cactatagaa tacaagctta ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat 120ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acaggatcta 180ccatgctcga ggaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggga ggagggtcca 240ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa 300ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga 360aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca 420aggacagcac ctacagcctc agcaacaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac 480acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct 540tcaacagggg agggggagga ggatcaactg atcttcacca aacgtattac cgccaggtaa 600agaacccgaa tccggtgttc actccccgtg aaggtgccgg aacgccgaag ttccgcgaaa 660aaccgatgga aaaggcggtg ggcctcacct cccgttttga tttcgccatt catgtggcgc 720atgcccgttc ccgtggtctg cgtcggcgca tgccaccggt gctgcgtcga cgggctattg 780atgcgctgct gcaggggctg tgtttccact atgacccgct ggccaaccgc gtccagtgtt 840ccatcaccac actggccatt gagtgcggac tggcgacaga gtccggtgca ggaaaactct 900ccatcacccg tgccacccgg gccctgacgt tcctgtcaga gctgggactg attacctacc 960agacggaata tgacccgctt atcgggtgct acattccgac cgacatcacg ttcacactgg1020ctctgtttgc tgcccttgat gtgtctgagg atgcagtggc agctgcgcgc cgcagtcgtg1080ttgaatggga aaacaaacag cgcaaaaagc aggggctgga taccctgggt atggatgagc1140tgatagcgaa agcctggcgt tttgtgcgtg agcgtttccg cagttaccag acagagcttc1200agtcccgtgg aataaaacgt gcccgtgcgc gtcgtgatgc gaacagagaa cgtcaggata1260tcgtcaccct agtgaaacgg cagctgacgc gtgaaatctc ggaaggacgc ttcactgcta1320atggtgaggc ggtaaaacgc gaagtggagc gtcgtgtgaa ggagcgcatg attctgtcac1380gtaaccgcaa ttacagccgg ctggccacag cttctccctg aaagtgatct cctcagaata1440atccggcctg cgccggaggc atccgcacgc ctgaagcccg ccggtgcaca aaaaaacagc1500gtcgcatgca aaaaacaatc tcatcatcca ccttctggag catccgattc cccctgtttt1560taatacaaaa tacgcctcag cgacggggaa ttttgcttat ccacatttaa ctgcaaggga1620cttccccata aggttacaac cgttcatgtc ataaagcgcc agccgccagt cttacagggt1680gcaatgtatc ttttaaacac ctgtttatat ctcctttaaa ctacttaatt acattcattt1740aaaaagaaaa cctattcact gcctgtcctg tggacagaca gatatgca 1788<210>13<211>1518
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA構(gòu)建體<400>13catattgtcg ttagaacgcg gctacaatta atacataacc ttatgtatca tacacatacg 60atttaggtga cactatagaa tacaagctta ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat 120ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acaggatcta 180ccatgctcga ggaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggga ggagggtccg 240gaaaacctat cccaaaccct ctcctaggac tggattcaac ggggggagga ggatcaactg 300atcttcacca aacgtattac cgccaggtaa agaacccgaa tccggtgttc actccccgtg 360aaggtgccgg aacgccgaag ttccgcgaaa aaccgatgga aaaggcggtg ggcctcacct 420cccgttttga tttcgccatt catgtggcgc atgcccgttc ccgtggtctg cgtcggcgca 480tgccaccggt gctgcgtcga cgggctattg atgcgctgct gcaggggctg tgtttccact 540atgacccgct ggccaaccgc gtccagtgtt ccatcaccac actggccatt gagtgcggac 600tggcgacaga gtccggtgca ggaaaactct ccatcacccg tgccacccgg gccctgacgt 660tcctgtcaga gctgggactg attacctacc agacggaata tgacccgctt atcgggtgct 720acattccgac cgacatcacg ttcacactgg ctctgtttgc tgcccttgat gtgtctgagg 780atgcagtggc agctgcgcgc cgcagtcgtg ttgaatggga aaacaaacag cgcaaaaagc 840aggggctgga taccctgggt atggatgagc tgatagcgaa agcctggcgt tttgtgcgtg 900agcgtttccg cagttaccag acagagcttc agtcccgtgg aataaaacgt gcccgtgcgc 960gtcgtgatgc gaacagagaa cgtcaggata tcgtcaccct agtgaaacgg cagctgacgc1020gtgaaatctc ggaaggacgc ttcactgcta atggtgaggc ggtaaaacgc gaagtggagc1080gtcgtgtgaa ggagcgcatg attctgtcac gtaaccgcaa ttacagccgg ctggccacag1140cttctccctg aaagtgatct cctcagaata atccggcctg cgccggaggc atccgcacgc1200ctgaagcccg ccggtgcaca aaaaaacagc gtcgcatgca aaaaacaatc tcatcatcca1260ccttctggag catccgattc cccctgtttt taatacaaaa tacgcctcag cgacggggaa1320ttttgcttat ccacatttaa ctgcaaggga cttccccata aggttacaac cgttcatgtc1380ataaagcgcc agccgccagt cttacagggt gcaatgtatc ttttaaacac ctgtttatat1440ctcctttaaa ctacttaatt acattcattt aaaaagaaaa cctattcact gcctgtcctg1500tggacagaca gatatgca 1518<210>14<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雌激素受體上的靶識(shí)別序列<400>14tcaggtcaga gtgacctgag ctaaaataac acattcag 38<210>15
<211>828<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>repA序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(828)<223>
<400>15atg gta aag aac ccg aat ccg gtg ttc act ccc cgt gaa ggt gcc gga 48Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly1 5 10 15acg ccg aag ttc cgc gaa aaa ccg atg gaa aag gcg gtg ggc ctc acc 96Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr20 25 30tcc cgt ttt gat ttc gcc att cat gtg gcg cat gcc cgt tcc cgt ggt144Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly35 40 45ctg cgt cgg cgc atg cca ccg gtg ctg cgt cga cgg gct att gat gcg192Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala50 55 60ctg ctg cag ggg ctg tgt ttc cac tat gac ccg ctg gcc aac cgc gtc240Leu Leu Gln Gly Leu Cys Phe His Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Val65 70 75 80cag tgt tcc atc acc aca ctg gcc att gag tgc gga ctg gcg aca gag288Gln Cys Ser Ile Thr Thr Leu Ala Ile Glu Cys Gly Leu Ala Thr Glu85 90 95tcc ggt gca gga aaa ctc tcc atc acc cgt gcc acc cgg gcc ctg acg336Ser Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Thr Arg Ala Thr Arg Ala Leu Thr100 105 110ttc ctg tca gag ctg gga ctg att acc tac cag acg gaa tat gac ccg384Phe Leu Ser Glu Leu Gly Leu Ile Thr Tyr Gln Thr Glu Tyr Asp Pro115 120 125ctt atc ggg tgc tac att ccg acc gac atc acg ttc aca ctg gct ctg432Leu Ile Gly Cys Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Thr Phe Thr Leu Ala Leu130 135 140
ttt gct gcc ctt gat gtg tct gag gat gca gtg gca gct gcg cgc cgc480Phe Ala Ala Leu Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg145 150 155 160agt cgt gtt gaa tgg gaa aac aaa cag cgc aaa aag cag ggg ctg gat528Ser Arg Val Glu Trp Glu Asn Lys Gln Arg Lys Lys Gln Gly Leu Asp165 170 175acc ctg ggt atg gat gag ctg ata gcg aaa gcc tgg cgt ttt gtg cgt576Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Ile Ala Lys Ala Trp Arg Phe Val Arg180 185 190gag cgt ttc cgc agt tac cag aca gag ctt cag tcc cgt gga ata aaa624Glu Arg Phe Arg Ser Tyr Gln Thr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Ile Lys195 200 205cgt gcc cgt gcg cgt cgt gat gcg aac aga gaa cgt cag gat atc gtc672Arg Ala Arg Ala Arg Arg Asp Ala Asn Arg Glu Arg Gln Asp Ile Val210 215 220acc cta gtg aaa cgg cag ctg acg cgt gaa atc tcg gaa gga cgc ttc720Thr Leu Val Lys Arg Gln Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe225 230 235 240act gct aat ggt gag gcg gta aaa cgc gaa gtg gag cgt cgt gtg aag768Thr Ala Asn Gly Glu Ala Val Lys Arg Glu Val Glu Arg Arg Val Lys245 250 255gag cgc atg att ctg tca cgt aac cgc aat tac agc cgg ctg gcc aca816Glu Arg Met Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ala Thr260 265 270gct tct ccc tga828Ala Ser Pro275<210>16<211>275<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>repA序列<400>16Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly1 5 10 15
Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr20 25 30Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly35 40 45Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala50 55 60Leu Leu Gln Gly Leu Cys Phe His Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Val65 70 75 80Gln Cys Ser Ile Thr Thr Leu Ala Ile Glu Cys Gly Leu Ala Thr Glu85 90 95Ser Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Thr Arg Ala Thr Arg Ala Leu Thr100 105 110Phe Leu Ser Glu Leu Gly Leu Ile Thr Tyr Gln Thr Glu Tyr Asp Pro115 120 125Leu Ile Gly Cys Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Thr Phe Thr Leu Ala Leu130 135 140Phe Ala Ala Leu Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg145 150 155 160Ser Arg Val Glu Trp Glu Asn Lys Gln Arg Lys Lys Gln Gly Leu Asp165 170 175Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Ile Ala Lys Ala Trp Arg Phe Val Arg180 185 190Glu Arg Phe Arg Ser Tyr Gln Thr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Ile Lys195 200 205Arg Ala Arg Ala Arg Arg Asp Ala Asn Arg Glu Arg Gln Asp Ile Val210 215 220Thr Leu Val Lys Arg Gln Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe225 230 235 240Thr Ala Asn Gly Glu Ala Val Lys Arg Glu Val Glu Arg Arg Val Lys245 250 255Glu Arg Met Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ala Thr260 265 270
Ala Ser Pro275<210>17<211>172<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CIS DNA元件<400>17aagtgatctc ctcagaataa tccggcctgc gccggaggca tccgcacgcc tgaagcccgc 60cggtgcacaa aaaaacagcg tcgcatgcaa aaaacaatct catcatccac cttctggagc120atccgattcc ccctgttttt aatacaaaat acgcctcagc gacggggaat tt172<210>18<211>195<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ori序列<400>18tgcttatcca catttaactg caagggactt ccccataagg ttacaaccgt tcatgtcata 60aagcgccagc cgccagtctt acagggtgca atgtatcttt taaacacctg tttatatctc 120ctttaaacta cttaattaca ttcatttaaa aagaaaacct attcactgcc tgtcctgtgg 180acagacagat atgca 195<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19aattccccgt cgctgaggcg 20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>20cgtaagccgg tactgattga 20<210>21<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21cacaggaaac aggatctacc atggccggaa aacctatccc aaaccctctc ctaggactgg 60attcaacggg gggaggagga tcagcggccg caactgatct tcaccaaacg 110<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(29)..(30)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(32)..(33)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(35)..(36)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(38)..(39)<223>n＝a，g，c或t
<220>
<221>misc_feature<222>(41)..(42)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(44)..(45)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(47)..(48)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(50)..(51)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(53)..(54)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>mi sc_feature<222>(56)..(57)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(59)..(60)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(62)..(63)<223>n＝a，g，c或t<400>22cacacaggaa acaggatcta ccatggccnn bnnbnnbnnb nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn 60bnnbggggga ggaggatcag cggccgcaac tgatcttcac caaacg 106<210>23<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23cagttgatcg gcgcgagatt 20<210>24<211>2390<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408構(gòu)建體<400>24cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag 60actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg 120gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga 180aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc 240tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg 300gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg gctagcgatg accctgctga 360ttggttcgct gaccatttcc ggggtgcgga acggcgttac cagaaactca gaaggttcgt 420ccaaccaaac cgactctgac ggcagtttac gagagagatg atagggtctg cttcagtaag 480ccagatgcta cacaattagg cttgtacata ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac 540ataaccttat gtatcataca catacgattt aggtgacact atagaataca agcttactcc 600ccatccccct gttgacaatt aatcatggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 660caatttcaca caggaaacag gatctaccat ggccggaaaa cctatcccaa accctctcct 720aggactggat tcaacggggg gaggaggatc agcggccgca actgatcttc accaaacgta 780ttaccgccag gtaaagaacc cgaatccggt gtttacaccc cgtgaaggtg caggaacgct 840gaagttctgc gaaaaactga tggaaaaggc ggtgggcttc acttcccgtt ttgatttcgc 900cattcatgtg gcgcatgccc gttcgcgtgg tctgcgtcga cgcatgccac cagtgctgcg 960tcgacgggct attgatgcgc tcctgcaggg gctgtgtttc cactatgacc cgctggccaa1020ccgcgtccag tgctccatca ccacgctggc cattgagtgc ggactggcga cggagtctgc1080tgccggaaaa ctctccatca cccgtgccac ccgggccctg acgttcctgt cagagctggg1140actgattacc taccagacgg aatatgaccc gcttatcggg tgctacattc cgaccgatat1200cacgttcaca tctgcactgt ttgctgccct cgatgtatca gaggaggcag tggccgccgc1260gcgccgcagc cgtgtggtat gggaaaacaa acaacgcaaa aagcaggggc tggataccct1320gggcatggat gaactgatag cgaaagcctg gcgttttgtt cgtgagcgtt ttcgcagtta1380tcagacagag cttaagtccc ggggaataaa gcgtgcccgt gcgcgtcgtg atgcggacag1440ggaacgtcag gatattgtca ccctggtgaa acggcagctg acgcgcgaaa tcgcggaagg1500gcgcttcact gccaatcgtg aggcggtaaa acgcgaagtt gagcgtcgtg tgaaggagcg1560catgattctg tcacgtaacc gtaattacag ccggctggcc acagcttccc cctgaaagtg1620acctcctctg aataatccgg cctgcgccgg aggcttccgc acgtctgaag cccgacagcg1680cacaaaaaat cagcaccaca tacaaaaaac aacctcatca tccagcttct ggtgcatccg1740gccccccctg ttttcgatac aaaacacgcc tcacagacgg ggaattttgc ttatccacat1800taaactgcaa gggacttccc cataaggtta caaccgttca tgtcataaag cgccatccgc1860
cagcgttaca gggtgcaatg tatcttttaa acacctgttt atatctcctt taaactactt 1920aattacattc atttaaaaag aaaacctatt cactgcctgt cctgtggaca gacagatatg 1980cacctcccac cgcaagcggc gggcccctac cggagccgct ttagttacaa cactcagaca 2040caaccaccag aaaaaccccg gtccagcgca gaactgaaac cacaaagccc ctccctcata 2100actgaaaagc ggccccgccc cggcccgaag ggccggaaca gagtcgcttt taattatgaa 2160tgttgtaact acttcatcat cgctgtcagt cttctcgctg gaagttctca gtacacgctc 2220gtaagcggcc ctgacggccc gctaacgcgg agatacgccc cgacttcggg taaaccctcg 2280tcgggaccac tccgaccgcg cacagaagct ctctcatggc tgaaagcggg tatggtctgg 2340cagggctggg gatgggtaag gtgaaatcta tcaatcagta ccggcttacg 2390<210>25<211>2384<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408構(gòu)建體<220>
<221>misc_feature<222>(695)..(696)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(698)..(699)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(701)..(702)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(704)..(705)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(707)..(708)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(710)..(711)<223>n＝a，g，c或t
<220>
<221>misc_feature<222>(713)..(714)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(716)..(717)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(719)..(720)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(722)..(723)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(725)..(726)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(728)..(729)<223>n＝a，g，c或t<400>25cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag 60actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg 120gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga 180aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc 240tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg 300gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg gctagcgatg accctgctga 360ttggttcgct gaccatttcc ggggtgcgga acggcgttac cagaaactca gaaggttcgt 420ccaaccaaac cgactctgac ggcagtttac gagagagatg atagggtctg cttcagtaag 480ccagatgcta cacaattagg cttgtacata ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac540ataaccttat gtatcataca catacgattt aggtgacact atagaataca agcttactcc 600ccatccccct gttgacaatt aatcatggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 660caatttcaca caggaaacag gatctaccat ggccnnbnnb nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn 720bnnbnnbnnb gggggaggag gatcagcggc cgcaactgat cttcaccaaa cgtattaccg 780ccaggtaaag aacccgaatc cggtgtttac accccgtgaa ggtgcaggaa cgctgaagtt 840ctgcgaaaaa ctgatggaaa aggcggtggg cttcacttcc cgttttgatt tcgccattca 900tgtggcgcat gcccgttcgc gtggtctgcg tcgacgcatg ccaccagtgc tgcgtcgacg 960ggctattgat gcgctcctgc aggggctgtg tttccactat gacccgctgg ccaaccgcgt1020ccagtgctcc atcaccacgc tggccattga gtgcggactg gcgacggagt ctgctgccgg1080
aaaactctcc atcacccgtg ccacccgggc cctgacgttc ctgtcagagc tgggactgat 1140tacctaccag acggaatatg acccgcttat cgggtgctac attccgaccg atatcacgtt 1200cacatctgca ctgtttgctg ccctcgatgt atcagaggag gcagtggccg ccgcgcgccg 1260cagccgtgtg gtatgggaaa acaaacaacg caaaaagcag gggctggata ccctgggcat 1320ggatgaactg atagcgaaag cctggcgttt tgttcgtgag cgttttcgca gttatcagac 1380agagcttaag tcccggggaa taaagcgtgc ccgtgcgcgt cgtgatgcgg acagggaacg 1440tcaggatatt gtcaccctgg tgaaacggca gctgacgcgc gaaatcgcgg aagggcgctt 1500cactgccaat cgtgaggcgg taaaacgcga agttgagcgt cgtgtgaagg agcgcatgat 1560tctgtcacgt aaccgtaatt acagccggct ggccacagct tccccctgaa agtgacctcc 1620tctgaataat ccggcctgcg ccggaggctt ccgcacgtct gaagcccgac agcgcacaaa 1680aaatcagcac cacatacaaa aaacaacctc atcatccagc ttctggtgca tccggccccc 1740cctgttttcg atacaaaaca cgcctcacag acggggaatt ttgcttatcc acattaaact 1800gcaagggact tccccataag gttacaaccg ttcatgtcat aaagcgccat ccgccagcgt 1860tacagggtgc aatgtatctt ttaaacacct gtttatatct cctttaaact acttaattac 1920attcatttaa aaagaaaacc tattcactgc ctgtcctgtg gacagacaga tatgcacctc 1980ccaccgcaag cggcgggccc ctaccggagc cgctttagtt acaacactca gacacaacca 2040ccagaaaaac cccggtccag cgcagaactg aaaccacaaa gcccctccct cataactgaa 2100aagcggcccc gccccggccc gaagggccgg aacagagtcg cttttaatta tgaatgttgt 2160aactacttca tcatcgctgt cagtcttctc gctggaagtt ctcagtacac gctcgtaagc 2220ggccctgacg gcccgctaac gcggagatac gccccgactt cgggtaaacc ctcgtcggga 2280ccactccgac cgcgcacaga agctctctca tggctgaaag cgggtatggt ctggcagggc 2340tggggatggg taaggtgaaa tctatcaatc agtaccggct tacg 2384<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26ccccatcccc ctgttgacaa ttaatc 26<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>27ggtagatcct gtttcctgtg tg 22
<210>28<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(37)..(38)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(40)..(41)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(43)..(44)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(46)..(47)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(49)..(50)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(52)..(53)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(55)..(56)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(58)..(59)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(61)..(62)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(64)..(65)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(67)..(68)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(70)..(71)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(73)..(74)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(76)..(77)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(79)..(80)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(82)..(83)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(85)..(86)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(88)..(89)<223>n＝a，g，c或t
<400>28acataccgtc atgcggccgc tgatcctcct cccccvnnvn nvnnvnnvnn vnnvnnvnnv 60nnvnnvnnvn nvnnvnnvnn vnnvnnvnng gccatggtag atcctgtttc 110<210>29<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>29ctggagatgg catcaagggc cccaactgat cttcaccaaa cgtattacc 49<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>30ggcgctatca tgccataccg 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31accattcggc tagcgatgac 20<210>32<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>32ggtgaagatc agttgcggcc gctgatcctc ctc 33<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33gattggttcg ctgaccattt cc 22<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>34cggcgttacc agaaactcag a 21<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>35aaccgactct gacggcagtt20<210>36<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽
<400>36Cys Gly Cys Pro Thr Met Ala Ala Arg Val Arg Pro Val Leu Asn Ser1 5 10 15Lys His<210>37<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>37Met Thr Thr Val Pro Val Leu Met Ile Ser Val1 5 10<210>38<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>38Thr Leu Ser Thr Arg His Hi s Asn Val Ile Asp Arg Phe Asn Leu Arg1 510 15Asn Phe<210>39<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>39Ser Ile Arg Thr Leu Thr Gly Ser Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Thr1 5 10 15Ala Asp
<210>40<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>40Ala Asn Leu Trp Arg Ile Val Leu His Gly Trp Trp1 5 10<210>41<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>41Val Ser Phe Met Leu Leu Gly Pro His Arg His Arg1 5 10<210>42<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>42Leu Val Leu His Trp Leu Ser Leu Gly Ser Arg1 5 10<210>43<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽
<400>43Ser Asn Gln Val Val Leu Ile Leu His Leu Arg Pro1 5 10<210>44<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>44Ala G1u Ser Trp Leu His Gln Ser Trp Ile His Leu1 5 10<210>45<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>45caggaaacag gatctaccat gctgcaggag tcaggacctg ag42<210>46<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46gtttggtgaa gatcagttga tcctcctccc ccccgctcga ggaagatgga tac53<210>47<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47gtatccatct tcctcgagcg ggggggagga ggatcaactg atcttcacca aac53<210>48<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48ctcaggtcct gactcctgca gcatggtaga tcctgtttcc tg4權(quán)利要求
1.一種制備體外肽表達(dá)文庫的方法，所述肽表達(dá)文庫包含大量肽，其中每個(gè)肽與編碼該肽的DNA構(gòu)建體相連，所述方法包括以下步驟(a)提供DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含(i)DNA靶序列；(ii)編碼文庫成員肽的DNA；和(iii)對(duì)能夠直接或間接地與如(i)所述的DNA靶序列非共價(jià)結(jié)合的肽進(jìn)行編碼的DNA；其中，所述DNA構(gòu)建體和編碼生成的蛋白質(zhì)經(jīng)選擇具有順式活性；(b)表達(dá)如(a)所述的大量DNA構(gòu)建體，其中所述大量DNA構(gòu)建體編碼大量文庫成員肽，從而每個(gè)表達(dá)生成的肽與生成該肽的DNA非共價(jià)相連。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的DNA構(gòu)建體還包含(iv)指導(dǎo)順式活性的DNA元件。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中如(a)所述的DNA構(gòu)建體還包含(v)編碼一段片段的DNA，所述片段至少包含repA蛋白C末端的20個(gè)氨基酸，其中所述片段能夠與如(iv)所述的DNA元件相互作用；其中，如(iv)所述的DNA元件位于如(ii)、(iii)和(v)所述的DNA的3’端。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中由如(iii)所述的DNA編碼的肽能夠識(shí)別如(i)所述的DNA靶序列并與如(i)所述的DNA靶序列直接結(jié)合。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中由如(iii)所述的DNA編碼的肽是repA蛋白，并且其中如(i)所述的DNA靶序列是ori。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，通過限制酶消化和連接，如(ii)所述的DNA與如(i)和(iii)所述的DNA相連。
7.如權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述repA選自IncI復(fù)合物質(zhì)粒的repA；或選自IncF、IncB、IncK、IncZ或IncL/M質(zhì)粒的repA。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述DNA構(gòu)建體包含編碼IncFII質(zhì)粒R1的repA、順式DNA元件和ori DNA的序列。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述repA蛋白具有SEQID NO16所示的序列，并且其中所述順式DNA元件具有SEQ ID NO17所示的序列。
10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中未與由如(iii)所述的DNA編碼的肽結(jié)合的DNA被非特異性DNA結(jié)合蛋白所結(jié)合。
11.如權(quán)利要求4所述的方法，其中由如(iii)所述的DNA編碼的肽是雌激素受體的DNA結(jié)合域，并且其中如(i)所述的DNA靶序列是雌激素受體靶序列。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述DNA結(jié)合域包含雌激素受體的DNA結(jié)合片段的氨基酸176～282，并且其中所述DNA靶序列包含如SEQ ID NO14所示的雌激素受體靶序列。
13.如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中由如(iii)所述的DNA編碼的肽與如(i)所述的DNA靶序列通過雙功能試劑間接結(jié)合，該雙功能試劑的一部分與如(i)所述的DNA靶序列結(jié)合，而第二部分與由如(iii)所述的DNA編碼的肽結(jié)合。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述DNA靶序列包含能夠被所述雙功能試劑結(jié)合的DNA標(biāo)簽，該標(biāo)簽選擇性地選自生物素或熒光素。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述雙功能試劑的結(jié)合活性由兩種抗體或其片段賦予。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述結(jié)合活性中的一種或兩種由Fab片段賦予。
17.如權(quán)利要求13至16任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(b)之前提供所述雙功能試劑。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述雙功能試劑與如(i)所述的DNA靶序列結(jié)合，并能夠與由如(iii)所述的DNA編碼的肽結(jié)合。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述雙功能試劑是聚合物。
20.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述DNA受合適啟動(dòng)子和翻譯序列的控制，以允許進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。
21.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述文庫成員肽是抗體或其片段。
22.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述文庫至少包含104個(gè)分子。
23.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，在抑制核酸酶活性、或者減少非特異性DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的化合物存在的條件下，進(jìn)行所述表達(dá)。
24.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中在細(xì)菌的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯環(huán)境中進(jìn)行所述表達(dá)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的細(xì)菌的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯環(huán)境是S30提取物系統(tǒng)。
26.一種制備體外肽表達(dá)文庫的方法，所述肽表達(dá)文庫包含大量肽，其中每個(gè)肽與編碼該肽的DNA構(gòu)建體相連，所述方法包括以下步驟(a)提供DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含(i)編碼文庫成員肽的DNA；和(ii)編碼能夠與雙功能試劑結(jié)合的肽的DNA；其中，所述DNA構(gòu)建體和編碼生成的蛋白質(zhì)經(jīng)選擇具有順式活性；(b)結(jié)合雙功能試劑或DNA標(biāo)簽，該DNA標(biāo)簽?zāi)軌驅(qū)㈦p功能試劑與如(a)所述的DNA構(gòu)建體結(jié)合，其中所述雙功能試劑能夠與由如(ii)所述的DNA所編碼的肽結(jié)合；和(c)表達(dá)(b)的大量DNA構(gòu)建體，其中所述大量DNA構(gòu)建體編碼大量文庫成員肽，從而每個(gè)表達(dá)生成的肽通過所述雙功能試劑與生成該肽的DNA結(jié)合。
27.一種從體外肽表達(dá)文庫中對(duì)顯示出所需特性的肽進(jìn)行鑒定和/或純化的方法，所述文庫由前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法制備，所述鑒定和/或純化顯示所需特性的肽的方法至少包括以下步驟(a)篩選所述文庫；和(b)選擇和分離相關(guān)的文庫成員。
28.一種鑒定特異性配體結(jié)合肽的方法，所述方法至少包括以下步驟(a)用選擇性地結(jié)合于固相支持物上的配體分子篩選體外肽表達(dá)文庫，該體外肽表達(dá)文庫由權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法制備；(b)選擇和分離與所述配體分子結(jié)合的文庫成員；和(c)分離與所述配體分子特異性結(jié)合的肽。
29.如權(quán)利要求27或28所述的方法，其中所述文庫成員肽是抗體或其片段。
30.一種鑒定和/或純化肽的方法，所述肽具有與特定DNA靶序列結(jié)合的能力，所述方法至少包括以下步驟(a)提供由權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法制備的體外表達(dá)文庫，其中由如(iii)所述的DNA編碼的肽是文庫成員肽，該肽具有DNA結(jié)合活性，并且其中如(i)所述的DNA靶序列是感興趣的靶序列；(b)選擇和分離文庫成員，其中編碼生成的蛋白質(zhì)與所述靶序列結(jié)合；和(c)分離與所述靶序列結(jié)合的肽。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述文庫成員肽是鋅指蛋白、螺旋-環(huán)-螺旋蛋白或螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白。
32.如權(quán)利要求27至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中在抑制核酸酶活性，或者減少非特異性DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的化合物存在的條件下，進(jìn)行所述篩選和/或選擇步驟。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物是肝素。
34.如權(quán)利要求27至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)表達(dá)所述分離得到的肽的DNA進(jìn)行額外分離。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，所述方法還包括將所述DNA克隆入表達(dá)載體中。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，所述方法還包括在體外將所述表達(dá)載體引入細(xì)胞中。
37.如權(quán)利要求35或36所述的方法，所述方法還包括表達(dá)由所述DNA編碼的肽。
38.一種體外肽表達(dá)文庫，該文庫由權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法制備。
39.一種DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體為如權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)中所述的DNA構(gòu)建體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備體外肽表達(dá)文庫的方法，以及用于分離編碼感興趣肽的核苷酸序列，其中，通過蛋白質(zhì)DNA的非共價(jià)結(jié)合，所述肽或蛋白質(zhì)與編碼它們的DNA特異性結(jié)合。所述方法描述了制備所述文庫自身和編碼該文庫的DNA分子的方法，并且描述了該表達(dá)文庫的用途。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1681924SQ03821134
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者鄧肯·麥格雷戈, 理查德·奧迪格雷普, 凱文·菲茨杰拉德, 羅斯瑪麗·黑德雷爾, 比爾·埃爾德里奇, 克里斯·厄爾曼, 菲利普·庫爾曼, 戴維·孔伯 申請人:伊索杰尼卡有限公司