一種可提高分泌效率的信號(hào)肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可提高分泌效率的信號(hào)肽，核苷酸序列如1）或2所示1）核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；2）對(duì)SEQ?ID?NO.1序列做出改造，但仍就行使信號(hào)肽功能且分泌效率未發(fā)生根本改變的核苷酸序列。本發(fā)明提供了一種可提高分泌效率的信號(hào)肽，使用后可顯著提高菌株的分泌能力，本發(fā)明中可將天冬酰胺酶酶活提高了1.5倍。改造后的菌株產(chǎn)酶能力顯著提高，更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
【專利說明】一種可提高分泌效率的信號(hào)肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分泌能力提高的信號(hào)肽，特別是一種提高天冬酰胺酶活力的信號(hào)肽。
技術(shù)背景
[0002]L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一種有抗癌活性的蛋白酶，能專一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和nh3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現(xiàn)為對(duì)某些腫瘤的抑制作用，尤其對(duì)急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物，對(duì)骨髓細(xì)胞沒有抑制作用。
[0003]L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過程中通過美拉德反應(yīng)生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，從源頭上減少丙烯酰胺的生成。
[0004]一些微生物、哺乳動(dòng)物及植物被證實(shí)含有L-天冬酰胺酶。因?yàn)閯?dòng)物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工藝復(fù)雜，微生物具有易培養(yǎng)，成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為學(xué)者研究的重點(diǎn)，目前研究的產(chǎn)L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia col1、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi等,但野生菌株L-天冬酰胺酶產(chǎn)量低,近年來利用基因工程技術(shù)將L-天冬酰胺酶基因克隆到大腸桿菌中，獲得L-天冬酰胺酶的高效表達(dá)，利用工程菌產(chǎn)L-天冬酰胺酶已成為一個(gè)重要來源。
[0005]L-天冬酰胺酶有兩種類型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II, Escherichiacol1、Erwinia chrysanthem1、B.subtilis等均包含這兩種L-天冬酰胺酶,研究證實(shí)僅L-天冬酸胺酶II具有抗癌作用，來自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被開發(fā)為治療急性淋巴細(xì)胞白血病的有效藥物，目前研究的大部分是具有抗腫瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
[0006]本發(fā)明基于枯草芽孢桿菌來源天冬酰胺酶基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的平臺(tái)，通過改造信號(hào)肽，實(shí)現(xiàn)的天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)，以期得到天冬酰胺酶分泌能力提聞的菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為提供一種可提高分泌效率的信號(hào)肽，核苷酸序列I)或2所示:
[0008]I)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0009]SEQ ID N0.1 序列如下:
[0010]ATGAAAAAAAGAAAGAGGCGAAACTTTAAAAGGTTCATTGCAGCATTTTTAGTGTTGGCTTTAATGATTTCATTAGTGCCAGCCGATGTACTAGCAAAATCTACA
[0011]2)對(duì)SEQ ID N0.1序列做出改造，但仍就行使信號(hào)肽功能且分泌效率未發(fā)生根本改變的核苷酸序列。[0012]本研究通過融合信號(hào)肽，使天冬酰胺酶的分泌途徑發(fā)生改變，轉(zhuǎn)向SEC分泌方式，使天冬酰胺酶分泌量增加，酶活得到進(jìn)一步的提高。
[0013]本發(fā)明還提供一株天冬酰胺酶分泌能力增強(qiáng)的枯草芽孢桿菌。
[0014]先前的工作中，本研究團(tuán)隊(duì)已將枯草芽孢桿菌168來源的天冬酰胺酶基因在枯草芽孢桿菌WB600中得到表達(dá)?；诳莶菅挎邨U菌以構(gòu)建好的平臺(tái)，通過融合信號(hào)肽，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的新菌株；所述信號(hào)肽融合到需要表達(dá)基因的N端。
[0015]本發(fā)明所用到的培養(yǎng)基:
[0016]LB 培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，ρΗ7.0 ；
[0017]枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆蛋白胨10g/L,玉米衆(zhòng)15g/L,尿素3g/L,葡萄糖40g/L,磷酸氫二鉀2.3g/L，磷酸二氫鉀1.7g/L，硫酸鎂0.75g/L，氯化鈉5g/L ;調(diào)節(jié)pH6.8-7.00
[0018]本發(fā)明中天冬酰胺酶酶活力的測(cè)定:
[0019]采用分光光度法測(cè)定天冬酰胺酶酶活。I個(gè)單位天冬酰胺酶酶活定義為:酶活定義:在37°C反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)能催化L-天冬酰胺釋放lymol NH3所需要的酶量為一個(gè)酶活單位(U/ml)。酶活測(cè)定條件:37°C條件下，ImllOmM K2HPO4-KH2PO4CPH7.5),0.lmll89mM天冬酰胺，0.3ml發(fā)酵上清液，保溫30分鐘，0.1mll.5M TCA終止反應(yīng)。利用ShimadzuUV-1240在436nm處測(cè)定吸光值，通過硫酸銨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。[0020]本發(fā)明提供了一種可提高分泌效率的信號(hào)肽，使用后可顯著提高菌株的分泌能力，本發(fā)明中可將天冬酰胺酶酶活提高了 1.5倍。改造后的菌株產(chǎn)酶能力顯著提高，更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1 pMA0911-wapA-SP_ansZ 質(zhì)粒圖譜
[0022]圖2天冬酰胺酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)酶鑒定
[0023]I:PMA5-ansZ/WB600
[0024]2:pMA0911-wapA-SP-ansZ/WB600
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1 一種新型信號(hào)肽
[0026]本發(fā)明提供的信號(hào)肽(WapA-SP )核苷酸序列如SEQ ID N0.1:ATGAAAMAAGAAAGAGGCGAAACTTTAAAAGGTTCATTGCAGCATTTTTAGTGTTGGCTTTAATGATTTCATTAGTGCCAGCCGATGTACTAGCAAAATCTACA所示或者是對(duì)SEQ ID N0.1序列做出改造，但仍就行使信號(hào)肽功能且分泌效率未發(fā)生根本改變的核苷酸序列。上述信號(hào)肽序列為化學(xué)全合成或者通過PCR方法獲得。
[0027]將上述目的信號(hào)肽WapA-SP與克隆到載體pMA5，構(gòu)建質(zhì)粒pMA0911-WapA_SP，酶切驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化子由上海生工進(jìn)行測(cè)序。
[0028]本研究通過融合信號(hào)肽，使天冬酰胺酶的分泌途徑發(fā)生改變，轉(zhuǎn)向SEC分泌方式，能使天冬酰胺酶分泌量增加，酶活得到進(jìn)一步的提高。
[0029]實(shí)施例2天冬酰胺酶基因獲取
[0030]根據(jù)NCBI枯草芽孢桿菌全基因組核酸序列中ansZ基因序列，設(shè)計(jì)L-天冬酰胺酶基因的PCR引物G19Sence和G19Antisence。通過PCR的方式，擴(kuò)增缺失信號(hào)肽(N端19個(gè)氨基酸)的ansZ基因。
[0031]G19Sence:CCGGAATTCTGTTCACATTCTCCTGAAACAA (EcoR I)
[0032]G19Antisence:CGCGGATCCTCAATACTCATTGAAATAAGCTTG (BamH I)
[0033]以pET22b_ansZ (上海生工合成)為模版，利用上面提供的引物做PCR擴(kuò)增進(jìn)行，PCR條件:98°C預(yù)變性，3min, 一個(gè)循環(huán)；98°C變性，30s, 50°C退火，30s, 72V延伸，70s，34個(gè)循環(huán)；72°C，10min，一個(gè)循環(huán)；12°C，lOmin，一個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增體系:模板lyL，上下游引物各 I μ L，dNTP Mix4 μ L, 5XprimeSTAR BufferlO μ L，滅菌的雙蒸水 32.5 μ L，primeSTAR DNA聚合酶0.5 μ L。采用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。EcoR I7BamH I酶切膠回收產(chǎn)物(目的基因ansZ)及pMA0911-wapA_SP質(zhì)粒(表達(dá)載體)，柱回收試劑盒對(duì)酶切后的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，膠回收試劑盒對(duì)酶切后質(zhì)粒進(jìn)行純化回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。
[0034]實(shí)施例3高效分泌天冬酰胺酶菌株構(gòu)建
[0035]目的基因ansZ與載體pMA0911-wapA-SP連接，連接體系:目的基因4yL，載體pMA0911-wapA-SPl μ L，solution 15 μ L，16 °C過夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pMA0911-wapA-SP-ansZ轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coil JM109，用氨芐青霉素LB平板，挑取陽性菌落。37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMA0911-WapA-SP-ansZ，酶切驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化子由上海生工進(jìn)行測(cè)序。
[0036]將測(cè)序正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB600，獲得產(chǎn)天冬酰胺酶基因工程菌。
[0037]實(shí)施例4高分泌能力天冬酰胺酶生產(chǎn)菌株的驗(yàn)證
[0038] 將實(shí)施例2中構(gòu)建的重組菌pMA0911-wapA_SP-ansZ/B.subtilisWB600，與出發(fā)菌株WB600PMA5-ansZ分別接種于IOmL含卡那霉素的LB養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日按4%的接種量轉(zhuǎn)接于枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，取發(fā)酵液于4°C，1000Or/min離心lOmin，上清為胞外粗酶液，細(xì)胞破碎上清液為胞內(nèi)粗酶液，用于酶活力的測(cè)定。枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆蛋白胨10g/L，玉米漿15g/L，尿素3g/L，葡萄糖40g/L，磷酸氫二鉀2.3g/L，磷酸二氫鉀1.7g/L，硫酸鎂0.75g/L，氯化鈉5g/L。調(diào)節(jié)ρΗ7.0。
[0039]對(duì)天冬酰胺酶活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與出發(fā)菌株比較，pMA0911-wapA-SP-ansZ/WB600 酶活力提高了 1.5 倍，最高達(dá)到 8.42U/ml。
【權(quán)利要求】
1.一種可提高分泌效率的信號(hào)肽，其特征在于核苷酸序列I)或2所示 1)核苷酸序列如SEQID N0.1所示； 2)對(duì)SEQID N0.1序列做出改造，但仍就行使信號(hào)肽功能且分泌效率未發(fā)生根本改變的核苷酸序列。
2.應(yīng)用權(quán)利要求1所述信號(hào)肽構(gòu)建的表達(dá)效率提高的基因工程菌。
3.權(quán)利要求2所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于將權(quán)利要求1)中所述信號(hào)肽融合到需要表達(dá)基因的N端。
4.權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌分泌天冬酰胺酶能力提高的基因工程菌。
5.權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述工程菌為枯草芽孢桿菌基因工程菌。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103709236SQ201310716775
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 馮岳, 劉松, 堵國成, 王彬晨, 陳璇 申請(qǐng)人:江南大學(xué)