含有富含亮氨酸重復(fù)序列的融合蛋白及其制法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種含有富含亮氨酸重復(fù)序列的融合蛋白及其制法和應(yīng)用。具體的，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有以下結(jié)構(gòu)：A—X—E—Y1—Y2式Ia；A—Y2—Y1—E—X式Ib；其中，A為任選的分泌信號(hào)肽；X為Slit2蛋白(神經(jīng)導(dǎo)向因子2)富含亮氨酸的重復(fù)序列2(LRRs2)元件；E為酶切位點(diǎn)；Y1為第一標(biāo)簽多肽元件；Y2為第二標(biāo)簽短肽元件，所述第二標(biāo)簽短肽元件為His標(biāo)簽元件；“—”表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。本發(fā)明融合蛋白有助于LRR正確折疊，形成有活性的功能多肽，而且可以簡(jiǎn)便地通過(guò)一次酶切就將兩種標(biāo)簽元件清除，從而制得高純度、高活性的LRR序列。
【專利說(shuō)明】含有富含亮氨酸重復(fù)序列的融合蛋白及其制法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物分子領(lǐng)域，尤其涉及含有富含亮氨酸重復(fù)序列的融合蛋白及其制 法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)導(dǎo)向因子Slit是一種在進(jìn)化上高度保守的分泌型細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，其 基因在1988年發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成中發(fā)揮作用。Slit是一組相對(duì)分子質(zhì)量為 170-190kDa的細(xì)胞外分泌蛋白，對(duì)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移起導(dǎo)向作用的軸突定向分子族成 員之一。
[0003] Slit蛋白是作為Roundabout (Robo)的配體發(fā)揮多功能的導(dǎo)向分子，它不僅具有 調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)方向、引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞遷移、影響神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)分化的功能。近年來(lái)的研究 發(fā)現(xiàn)，Slit在血管生成、心臟形態(tài)發(fā)生、腫瘤細(xì)胞遷移等多種生理過(guò)程中也發(fā)揮作用。
[0004] 在脊椎動(dòng)物中存在3種Slit基因，即Slitl、Slit2、Slit3,并在各種生物組織中 廣泛表達(dá)。
[0005] S1 i t蛋白的主要結(jié)構(gòu)包括N端的胞外分泌信號(hào)肽，4個(gè)連續(xù)的富含亮氨酸 的重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRRs),也被命名為D1-D4結(jié)構(gòu)域，串聯(lián)的6-9個(gè) EGF (epidermal growth factor)樣功能區(qū)，一個(gè)laminin G樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)富含半光氨酸 的C末端結(jié)構(gòu)域。
[0006] Slit2能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤、纖維肉瘤、乳腺癌、口腔鱗癌細(xì)胞的遷移，Slit3能 夠抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的遷移，也有報(bào)道稱Slit2能夠促進(jìn)乳腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移。目前，Slit2對(duì)血管生成的作用仍存在爭(zhēng)議，關(guān)于Slit2促進(jìn)血管生成和抑制血管生成 的兩方面作用都有文獻(xiàn)報(bào)道。Dunaway等發(fā)現(xiàn)，在Slit2單獨(dú)存在時(shí)，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都證 明其能促進(jìn)血管生成；然而在Ephrin-Al存在時(shí)，Slit2則能抑制血管生成，說(shuō)明體外相對(duì) 簡(jiǎn)單的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)環(huán)境得到的結(jié)果并不能完全反映體內(nèi)的真實(shí)作用。
[0007] Anil Prasad等人的研究表明，過(guò)度表達(dá)Slit2可以抑制乳腺癌細(xì)胞以及小鼠體 內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)；Tseng等人的研究表明Slit2可以減緩肺癌的發(fā)展過(guò)程；Yuasa-Kawada等 人報(bào)道了 Slit蛋白能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移；Werbowetski-Ogilvie等人報(bào)道了 Slit2 能抑制成神經(jīng)管細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲；Yiin等人報(bào)道了 Slit2能抑制大腦中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤 細(xì)胞的侵襲。綜合考慮Slit2和/或Robol基因在腫瘤中存在廣泛的啟動(dòng)子甲基化而導(dǎo)致 功能的缺失，以及Slit2對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑制作用。
[0008] 為了研究和應(yīng)用，有必要對(duì)Slit蛋白或其片段進(jìn)行表達(dá)和分離純化。然而，由于 天然蛋白的含量有限，分離困難，因此需要開(kāi)發(fā)高效的重組生產(chǎn)工藝。
[0009] 在重組生產(chǎn)工藝中，高效地生產(chǎn)出構(gòu)象正確且便于分離和純化的目的蛋白，常常 是較為困難的。常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然可以較高效地表達(dá)目的蛋白，但卻常常需要 復(fù)雜的復(fù)性工藝，且復(fù)性后的目標(biāo)蛋白的活性往往難以令人滿意。
[0010] 當(dāng)采用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，雖然避免了復(fù)性工藝，但目標(biāo)蛋白的正確折疊、 如何實(shí)現(xiàn)高表達(dá)水平以及如何有效分離目標(biāo)蛋白仍然是難點(diǎn)，尤其是對(duì)于某些短肽或含重 復(fù)序列的多肽而言。
[0011] 獲得了含目標(biāo)蛋白的培養(yǎng)液（或發(fā)酵產(chǎn)物）后，可采用各種不同的純化手段進(jìn)行 分離純化。目前，一種常用的分離純化重組蛋白的方法為親和層析技術(shù)。
[0012] 以采用的His標(biāo)簽為例，6XHis是專門設(shè)計(jì)用于重組蛋白質(zhì)純化工作的標(biāo)簽蛋 白，是目前最常見(jiàn)的表達(dá)方式，其表達(dá)純化技術(shù)都很成熟，而且相對(duì)比便宜，它的優(yōu)點(diǎn)是表 達(dá)方便而且基本不影響蛋白的活性。通常帶組氨酸蛋白都可以在天然情況下被鎳瓊脂糖凝 膠或鎳NTA瓊脂糖凝膠吸附，但是因?yàn)镠is標(biāo)簽非常小，如果在融合蛋白折疊過(guò)程中被折疊 到蛋白內(nèi)部而導(dǎo)致His標(biāo)簽不容易暴露的話，則很難開(kāi)展蛋白純化工作；同時(shí)His標(biāo)簽確實(shí) 還存在特異性不夠的問(wèn)題。
[0013] 通常，使用His標(biāo)簽技術(shù)分離所得的蛋白質(zhì)純度約為90%左右，而現(xiàn)有技術(shù)中，使 蛋白進(jìn)一步純化的工藝和步驟都相對(duì)較為繁瑣，且添加的蛋白或肽段常會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白的活 性造成干擾，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的表達(dá)不準(zhǔn)確或雜質(zhì)過(guò)多。
[0014] 綜上所述，為了簡(jiǎn)便高效地制備高純度、高活性的重組蛋白，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā) 高效簡(jiǎn)便的生產(chǎn)工藝。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的就是提供一種高效簡(jiǎn)便的生產(chǎn)外源蛋白的方法，從而簡(jiǎn)便高效地制 備高純度、高活性的重組蛋白。
[0016] 本發(fā)明提供了一種融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有式la或lb所述 的結(jié)構(gòu)：
[0017] A-X-E-Y1-Y2 式 la ;
[0018] A-Y2-Yl-E-X 式 lb ;
[0019] 其中，
[0020] A為任選的分泌信號(hào)肽；
[0021] X為Slit2蛋白的富含亮氨酸的重復(fù)序列2(leucine_rich repeat2，LRRs2)元 件；
[0022] E為酶切位點(diǎn)；
[0023] Y1為第一標(biāo)簽多肽元件；
[0024] Y2為第二標(biāo)簽短肽元件，所述第二標(biāo)簽短肽元件為His標(biāo)簽元件；
[0025] "一，，表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白具有位于N端的分泌信號(hào)肽。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的分泌信號(hào)肽是來(lái)自于Slit2的分泌信號(hào)肽、或來(lái)自于其 他蛋白的分泌信號(hào)肽。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的分泌信號(hào)肽在其N端具有或不具有起始氨基酸Met。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一標(biāo)簽多肽元件的46aa。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，在X和E之間的"一"為肽鍵。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，在Y1和Y2之間無(wú)蛋白酶切位點(diǎn)。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，在Y1和Y2之間的"一"為肽鍵。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的酶切位點(diǎn)是TEV蛋白酶的酶切位點(diǎn)。
[0034] (LeuGluValLeuPheGlnGlyPro, SEQ ID NO. :3)
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的肽接頭長(zhǎng)度為3-15個(gè)氨基酸；較佳地5-10個(gè)氨基酸。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的Slit2蛋白來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的Slit2蛋白來(lái)源于人、大鼠、小鼠；更佳地，來(lái)源于人。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的Y1包括SEQ ID N0. : 2所示的改良型親和素標(biāo)簽（Strap II標(biāo)簽）、鏈親和素（Strepavidin)標(biāo)簽。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的His標(biāo)簽元件包括8 XHis標(biāo)簽元件和6 XHis標(biāo)簽元件。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的Y1為Strap II標(biāo)簽，而Y2為8XHis標(biāo)簽元件。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的S1U2LRR2的氨基酸序列如SEQ ID N0. :5所示。
[0042] 本發(fā)明第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第一 方面所述的融合蛋白。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID N0. :6所示。
[0044] 本發(fā)明第三方面，提供了一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有本發(fā)明第二方面所 述的多核苷酸。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體包括真核表達(dá)載體、原核表達(dá)載體。
[0046] 本發(fā)明第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第三方面所 述的表達(dá)載體或轉(zhuǎn)染了本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞；較佳地包括CH0細(xì)胞、293 細(xì)胞。
[0048] 本發(fā)明第五方面，提供了一種制備S1U2LRR2蛋白的方法，所述的方法包括步驟：
[0049] (i)在合適的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)本發(fā) 明第一方面所述的融合蛋白；
[0050] (ii)從培養(yǎng)體系中分離純化出本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白；
[0051] (iii)對(duì)所述的融合蛋白，用針對(duì)元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而制得S1U2LRR2。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（ii)中，先用針對(duì)Y1元件的親和層析進(jìn)行第一次分離； 然后用針對(duì)Y2元件的親和層析進(jìn)行第二次分離。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（iii)中，還包括將S1U2LRR2與多肽E-Y1-Y2或Y2- Y1-E分開(kāi)，從而制得純化的S1U2LRR2。
[0054] 本發(fā)明第六方面，提供了一種制備S1U2LRR2蛋白的方法，所述的方法包括步驟：
[0055] 對(duì)本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白，用針對(duì)元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而制得 Slit2LRR2。
[0056] 本發(fā)明第七方面，提供了一種純化的S1U2LRR2蛋白，是通過(guò)本發(fā)明第五或第六 方面所述的方法生產(chǎn)制備的。
[0057] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0058] 圖1為原始的pcDNA3. 1 (-)質(zhì)粒的圖譜；
[0059] 圖2顯示了實(shí)施例1中的真核表達(dá)Slit2蛋白的LRR2結(jié)構(gòu)域部分序列的表達(dá)質(zhì) 粒的構(gòu)建方法的流程圖；
[0060] 圖3為SI it2蛋白的LRR2結(jié)構(gòu)域部分序列的RT-PCR擴(kuò)增電泳圖；
[0061] 圖4為Strap II蛋白標(biāo)簽、His蛋白標(biāo)簽以及TEV酶切位點(diǎn)序列的PCR擴(kuò)增電泳 圖；
[0062] 圖5為構(gòu)建好的pcDNA3. 1 (_)/Slit2LRR2質(zhì)粒的圖譜；
[0063] 圖6為Western Blot方法檢測(cè)構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達(dá)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0064] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，在LRR序列的一端（尤其是C 端）添加第一標(biāo)簽多肽元件和第二標(biāo)簽短肽元件，不僅有助于LRR正確折疊，形成有活性的 功能多肽，而且可以極其簡(jiǎn)便地通過(guò)一次酶切就將兩種標(biāo)簽元件清除，從而制得高純度、高 活性的LRR序列。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0065] 術(shù)語(yǔ)
[0066] 如本文所用，"本發(fā)明蛋白"、"本發(fā)明融合蛋白"、"具有式la或lb的融合蛋白"可 互換使用，均指具有式la或lb的融合蛋白，其N端至C端分別含有任選的分泌信號(hào)肽、目 標(biāo)基因、酶切位點(diǎn)、第一標(biāo)簽多肽元件以及第二標(biāo)簽短肽元件；或任選的分泌信號(hào)肽、第二 標(biāo)簽短肽元件、第一標(biāo)簽多肽元件、酶切位點(diǎn)以及目標(biāo)基因。本發(fā)明融合蛋白的一個(gè)顯著特 點(diǎn)是在C端或N端具有可通過(guò)酶切去除的連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽元件。此外，應(yīng)理解，所述術(shù)語(yǔ)還包 括重組融合蛋白的活性片段和衍生物。
[0067] 如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)（如果是天然的物質(zhì)， 原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化 的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。 [0068] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"標(biāo)簽蛋白"、"標(biāo)簽"、"標(biāo)簽蛋白元件"、"標(biāo)簽元件"可互換使用， 均指可用于分離純化具有本發(fā)明式la或lb的融合蛋白的標(biāo)簽多肽。
[0069] Slit2 蛋白及其 LRR
[0070] Slit2蛋白的全長(zhǎng)序列如SEQ ID N0. :15所示，編碼其蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0. :14所示。本發(fā)明S1U2LRR2蛋白的序列如SEQ ID N0. :5所示，編碼其蛋白的核苷 酸序列如SEQ ID N0. :4所示。
[0071] 本發(fā)明Slit2蛋白來(lái)源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地，來(lái)源于人、大鼠、小鼠。
[0072] 如本文所用，"S1U2LRR2蛋白"是指Slit2蛋白的LRR2結(jié)構(gòu)域。
[0073] 如本文所用，"純化的S1U2LRR2蛋白"是指S1U2LRR2蛋白基本上不含天然與其 相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純 化S1U2LRR2蛋白?；旧霞兊牡鞍自诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
[0074] 肽鍵或肽接頭
[0075] 本發(fā)明的具有式la或lb的融合蛋白各元件之間可以直接以肽鍵相連接，或者通 過(guò)肽接頭連接。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方式，所述的具有式la或lb的融合蛋白各元件 之間通過(guò)肽鍵之間連接，從而形成融合蛋白。
[0076] 通常，過(guò)短的肽接頭可在融合蛋白內(nèi)部造成空間位阻，影響蛋白的正確折疊，過(guò)長(zhǎng) 的肽接頭可能增加融合蛋白的免疫原性，還可能影響融合蛋白的活性和功能。因此，可用于 本發(fā)明的肽接頭一般包括3-15個(gè)氨基酸；較佳地為5-10個(gè)氨基酸。
[0077] 具有連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽元件的融合蛋白
[0078] 本發(fā)明融合蛋白的氨基端（或羧基端）連續(xù)地含有兩個(gè)標(biāo)簽元件（如式la或lb 所示）。
[0079] A-X-E-Y1-Y2 式 la
[0080] A-Y2-Yl-E-X 式 lb
[0081] 其中，A、X、E、Y1、Y2的定義如上所述。
[0082] 對(duì)于第一標(biāo)簽多肽元件Y1而言，優(yōu)選的Y1選自下組：改良型親和素標(biāo)簽（Strap II標(biāo)簽）（長(zhǎng)度為46aa)、鏈親和素（Str印II標(biāo)簽）（長(zhǎng)度為9aa)。
[0083] 改良型親和素標(biāo)簽（Strap II標(biāo)簽）是在鏈親和素（Str印II標(biāo)簽）的基礎(chǔ)上改 良過(guò)的一種標(biāo)簽蛋白，其多肽序列如SEQ ID N0. :2所示，編碼其多肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. :1 所示。
[0084] 本發(fā)明Strap II標(biāo)簽與Str印II標(biāo)簽的純化方式可以是相同或基本相同，即通 過(guò)與生物素的親和力進(jìn)行層析。與Str印II標(biāo)簽相比，Strap II標(biāo)簽（SEQ ID NO. :2)增 加了標(biāo)簽的親和性，其優(yōu)點(diǎn)在于純化過(guò)程在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，使用的脫硫生物素溫和程度 的洗脫保護(hù)了靶蛋白的活性。而且，避免了常規(guī)Strep II標(biāo)簽的純化技術(shù)需要進(jìn)行封閉處 理步驟。
[0085] Y2為第二標(biāo)簽短肽元件，且為His標(biāo)簽元件?？捎糜诒景l(fā)明的His標(biāo)簽元件包括 6XHis或8XHis短肽，優(yōu)選的，為8XHis標(biāo)簽元件。
[0086] 此外，Y1和Y2之間無(wú)蛋白酶切位點(diǎn)，并以肽鍵直接連接。
[0087] 連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽的蛋白表達(dá)方案，一方面是結(jié)合兩種載體的優(yōu)點(diǎn)，避免存在的問(wèn)題， 另一方面可以優(yōu)化蛋白純化步驟，提高純化后蛋白的純度，盡量減少來(lái)自動(dòng)物源性的污染 和純化過(guò)程中的離子性污染。
[0088] 在本發(fā)明融合蛋白中，在元件Y1和X之間為蛋白酶酶切位點(diǎn)，可以包括本領(lǐng)域常 用的用于分離純化蛋白的酶切位點(diǎn)，如TEV蛋白酶、Hrv3C蛋白酶。附加條件是，在本發(fā)明 融合蛋白的其他元件序列中，不含有該酶切位點(diǎn)。
[0089] TEV蛋白酶是來(lái)源于煙草蝕紋病毒（TEV)的Nla蛋白酶經(jīng)改進(jìn)后的50kDa的蛋白 酶，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)后與天然TEV蛋白酶相比其穩(wěn)定性更好。此蛋白酶被用來(lái)切除純化后融合蛋 白的親和標(biāo)簽；并且該酶是經(jīng)由6 XHis標(biāo)簽純化而得（含組氨酸標(biāo)簽），純度達(dá)99%，剪切 反應(yīng)完畢后可通過(guò)Ni親和層析去除。在PH7. 0, 30°C時(shí)可達(dá)到最佳活性，但在PH5. 5-8. 5和 4-30°C的廣泛范圍內(nèi)TEV蛋白酶皆有活性，使得反應(yīng)條件的選擇可根據(jù)目的蛋白的情況而 修改。
[0090] -種可用于本發(fā)明的蛋白酶酶切位點(diǎn)為TEV蛋白酶，如SEQ ID N0. : 3所示。
[0091] 此外，在本發(fā)明的融合蛋白的N端，可具有或不具有分泌信號(hào)肽。當(dāng)具有分泌信號(hào) 肽時(shí)，有助于實(shí)現(xiàn)融合蛋白的分泌表達(dá)，以便提高純化效率。在本發(fā)明中，適用的分泌信號(hào) 肽包括來(lái)自于Slit2的分泌信號(hào)肽、或來(lái)外源導(dǎo)入的自于其他蛋白的分泌信號(hào)肽。其中，來(lái) 源于Slit2的分泌信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQ ID N0. :16所不，其編碼的信號(hào)肽序列如SEQ ID NO. :17 所示。
[0092] 編碼序列和重組生產(chǎn)
[0093] 對(duì)于本發(fā)明的融合蛋白而言，本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA 形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是 編碼鏈或非編碼鏈。
[0094] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然 發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域 所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失 或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0095] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"引物"指的是在與模板配對(duì)，在DNA聚合酶的作用下能以其為 起點(diǎn)進(jìn)行合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA，也可 以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物"大 致上"（或"基本上"）與模板上一條鏈上的一個(gè)特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板上的一 條鏈充分互補(bǔ)才能開(kāi)始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補(bǔ)。比如，在一個(gè)3' 端與模板互補(bǔ)的引物的5'端加上一段與模板不互補(bǔ)的序列，這樣的引物仍大致上與模板 互補(bǔ)。只要有足夠長(zhǎng)的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成引 物-模板復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。
[0096] 本發(fā)明融合蛋白的各元件的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重 組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi) 放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制 備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0097] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。 [0098] 此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通 過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0099] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引 物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方 法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0100] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或融合蛋白編 碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及制備本發(fā)明所述融合蛋白的方法。
[0101] 通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組 蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟：
[0102] (1).用本發(fā)明的編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0103] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0104] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0105] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明蛋白的編碼DNA序列和合適 的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi) 重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。 表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0106] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0107] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞 如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、C0S、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
[0108] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl 2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0109] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0110] 在上面的方法中的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化蛋白。這些方法是 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀 劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過(guò)濾）、吸附層析、 離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0111] 表達(dá)載體
[0112] 在獲得了編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn) 入合適的宿主細(xì)胞。最后通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過(guò)分離純化得到本發(fā)明的融合蛋 白。
[0113] 因此，本發(fā)明還提供了包含編碼所述融合蛋白的核酸分子的載體。所述的載體還 可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達(dá)。
[0114] 如本文所用，"操作性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列 的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體 表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽（分泌前導(dǎo)序列）DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如 果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置 于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般"可操作地連于"意味著相 鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
[0115] 在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體，如Pouwels等，克隆載體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（Elsevier最新版） 中所描述的?？蛇x用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將 編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成蛋白表達(dá)載體。
[0116] 可用于本發(fā)明的一種優(yōu)選的真核表達(dá)載體可以為pcDNA3. 1 (_)(購(gòu)自Invitrogen 公司）。
[0117] 表達(dá)載體包括連接有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的融合蛋白DNA序列，如來(lái)源于 哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲(chóng)的基因。調(diào)控序列可包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)或控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的合適序列。在融合蛋白序列需要調(diào)節(jié)序列功能 的時(shí)候，則連接合適的調(diào)控序列。這樣，啟動(dòng)子序列被連接在編碼融合蛋白DNA序列前端。 在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制的能力通常由復(fù)制起始點(diǎn)控制。用于轉(zhuǎn)化株識(shí)別的篩選基因也可加入 表達(dá)載體。
[0118] 另外，非天然的Slit2蛋白的信號(hào)肽的編碼序列可以引入表達(dá)載體。例如：信號(hào)肽 (分泌引導(dǎo)物）序列可以和與融合蛋白編碼序列融合，從而使翻譯的融合蛋白可分泌到細(xì) 胞外。信號(hào)肽可增強(qiáng)宿主細(xì)胞向胞外分泌嵌合多肽。信號(hào)肽在多肽從細(xì)胞內(nèi)分泌出來(lái)的過(guò) 程中可被切去。
[0119] 生產(chǎn)S1U2LRR2蛋白的方法
[0120] 本發(fā)明還包括生產(chǎn)融合蛋白以及純化的Slit2LRR2蛋白的方法，所述方法包括培 養(yǎng)含有融合蛋白編碼核酸的宿主細(xì)胞，從而培養(yǎng)本發(fā)明融合蛋白，從培養(yǎng)體系中分離純化 出權(quán)利要求1所述的融合蛋白；以及對(duì)所述的融合蛋白，用針對(duì)元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解， 從而制得純化的S1U2LRR2蛋白。
[0121] 在分離本發(fā)明融合蛋白的標(biāo)簽元件時(shí)，可以使用分別針對(duì)不同標(biāo)簽元件的親和 層析進(jìn)行兩次分離后，再使用針對(duì)酶切位點(diǎn)的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而分離出純度更高的 Slit2LRR2 蛋白。
[0122] 所述的融合蛋白包括S1U2LRR2或其活性片段。所述方法可包括讓細(xì)胞表達(dá)編碼 的融合蛋白，以及使表達(dá)的融合蛋白的復(fù)性。此外所述方法還可包括復(fù)性的融合蛋白的分 離和/或純化。
[0123] 可將上述制備獲得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上 呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達(dá)時(shí)，可以采用商品化的超濾膜來(lái)分離所述蛋白， 例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方 法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析（DEAE等）或 陽(yáng)離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或 SP-基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏 水相互作用層析和反相高效液相色譜（RP-HPLC)等方法對(duì)上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。
[0124] 可利用含有Slit2LRR2結(jié)構(gòu)域的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對(duì)表達(dá)的 融合性多肽進(jìn)行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改 變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽。
[0125] 重組蛋白以及編碼該重組蛋白的核酸可利用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?，例如，化學(xué)合成、重 組表達(dá)，或其合并應(yīng)用。參見(jiàn)John Wiley&Sons，Inc2000年出版的《Current Protocols in Molecular Biology》，以及 Cold Spring Harbor Laboratory Pressl989 年出版的 ((Molecular Coning:A Laboratory Manual〉〉。
[0126] 本發(fā)明的有益效果
[0127] 1.本發(fā)明融合蛋白獨(dú)特的連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽元件設(shè)計(jì)，尤其是經(jīng)改良的Strap II標(biāo) 簽，其長(zhǎng)度合適，使表達(dá)的蛋白在宿主細(xì)胞中能夠得到各種修飾，能在不影響蛋白質(zhì)折疊的 情況下，最大程度的還原其天然構(gòu)象，使S1U2LRR2蛋白能于宿主細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)量 高，且表達(dá)完整、準(zhǔn)確。
[0128] 2.本發(fā)明融合蛋白的連續(xù)串聯(lián)標(biāo)簽元件設(shè)計(jì)使目標(biāo)蛋白更易純化，且標(biāo)簽元件能 通過(guò)一次酶切完整切除，制備工藝簡(jiǎn)單，制得的S1U2LRR2蛋白純度高，活性強(qiáng)。
[0129] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0130] 實(shí)施例 1 構(gòu)建 pcDNA3. 1 (_) /Slit2LRR2 載體
[0131] 方法：采用外切酶法構(gòu)建質(zhì)粒。構(gòu)建質(zhì)粒的過(guò)程，共PCR擴(kuò)增3段片段（信號(hào)肽序 列、目標(biāo)序列、酶切位點(diǎn)+標(biāo)簽蛋白序列），進(jìn)行3次片段連接插入。所使用的引物分別是 Primerl、Primer2 和 Primer3〇
[0132] 外切酶法具體步驟：
[0133] 1、配制反應(yīng)體系：載體片段（BamHI酶切后膠回收并測(cè)定濃度）和PCR片段（PCR 后膠回收并測(cè)定濃度）各50ng，lullOx外切酶buffer,補(bǔ)充ddH20至10ul ;
[0134] 2、冰上放置5min，加入lul稀釋至20U/ul的外切酶III(Takara公司），混勻后冰 上放置60min ;
[0135] 3、加入lulO. 5M EDTA(pH8. 0)溶液終止反應(yīng)，之后65°C水浴5min ;
[0136] 4、水浴后冰上放置5min ;
[0137] 5、轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物。
[0138] 引物：
[0139] Primerl-F ：CCACACTGGACTAGTATGCGCGGCGTTGGCTGG SEQ ID NO. :8
[0140] Primerl-R ：ACCGAGCTCGGATCCCGCCGGGCACGCCTGCGG SEQ ID NO. :9
[0141] Primer2-F ：CAGGCGTGCCCGGCGTTGCACTGCCCTGCCGCC SEQ ID NO. : 10
[0142] Primer2-R ：ACCGAGCTCGGATCCTTATGAACAACGGAATTTCTTG SEQ ID NO. :11
[0143] Primer3-F ：AAATTCCGTTGTTCACTGGAAGTGCTGTTCCAG SEQ ID NO. : 12
[0144] Primer3-R ：ACCGAGCTCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTG SEQ ID NO. : 13
[0145] 結(jié)果：目標(biāo)序列、酶切位點(diǎn)+標(biāo)簽蛋白序列的擴(kuò)增結(jié)果圖3和4所示，圖中可見(jiàn)，目 標(biāo)序列、酶切位點(diǎn)+標(biāo)簽蛋白序列擴(kuò)增成功。
[0146] 實(shí)施例 2pcDNA3. 1 (_) /Slit2LRR2 的成功表達(dá)
[0147] 方法：為了檢測(cè)構(gòu)建的質(zhì)粒是否成功表達(dá)，通過(guò)把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到AD293細(xì)胞中，之后 經(jīng)標(biāo)簽蛋白8XHis來(lái)做Western Blot,檢測(cè)融合蛋白是否成功表達(dá)。
[0148] 材料：High glucose DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自HyClone公司；轉(zhuǎn)染試劑 Magetran購(gòu)自O(shè)rigene公司；AD293細(xì)胞用含10%胎牛血清的High glucose DMEM培養(yǎng)液 培養(yǎng)。倒置顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，突光倒置顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。
[0149] 步驟：
[0150] 2. 1.將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)行鋪 板檢測(cè)。Magetran試劑轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。
[0151] 2. 2.接種AD293細(xì)胞至6孔板，用含10%胎牛血清的High glucose DMEM培養(yǎng)基培 養(yǎng)至密度約為70%-80%時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。將Magetran試劑及質(zhì)粒pcDNA3. 1 (_)/Slit2LRR2溶 液平衡至室溫，在離心管內(nèi)準(zhǔn)備下列混合液：200μ 1 opti_DMEM、2y g質(zhì)粒、6μ 1 Magetran 轉(zhuǎn)染試劑，震蕩混勻后靜置室溫孵育lOmin。給細(xì)胞更換新的培養(yǎng)基后將混合液加入培養(yǎng)盤 中，搖勻。置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時(shí)候移除培養(yǎng)基，更換為新鮮的含10% 胎牛血清的High glucose DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h后，收蛋白用于Western Blot 檢測(cè)質(zhì)粒的蛋白表達(dá)情況。
[0152] 2. 3去除培養(yǎng)基后加入4°C PBS將細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下來(lái)放入1. 5ml離心管中，2000 轉(zhuǎn)5min離心，去除上清。接著開(kāi)始裂解細(xì)胞，將RIPA強(qiáng)裂解液與蛋白酶抑制劑，100:1的比 例混合后加到細(xì)胞沉淀中，4°C搖晃裂解lh后，4°C，14000g離心30min，取上清即樣品。最 后測(cè)樣品蛋白濃度，并加入Loading buffer煮沸8min，再調(diào)平上樣量用SDS-聚丙烯凝膠電 泳跑膠。電泳3小時(shí)，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，之后抗體孵育，一抗2小時(shí)，顯色曝光。
[0153] 結(jié)果：Western Blot檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組蛋白表達(dá)正常，而轉(zhuǎn)染空 載組沒(méi)有檢測(cè)到蛋白表達(dá)，說(shuō)明所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒能正常的在真核細(xì)胞中表達(dá)，質(zhì)粒 構(gòu)建成功。
[0154] 實(shí)施例3表達(dá)量的測(cè)試
[0155] 將一個(gè)純化得到的已知濃度（20 μ g/ml)的HisGFP蛋白作為對(duì)照，用Western Blot的方法進(jìn)行蛋白表達(dá)量的測(cè)定。
[0156] 具體方法同實(shí)施例2,先轉(zhuǎn)染細(xì)胞，之后做Western Blot檢測(cè)。區(qū)別在于，跑 SDS-PAGE電泳時(shí)，加入一定已知量的HisGFP蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0157] 曝光得到結(jié)果后，通過(guò)對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算得到蛋白的表達(dá)量。
[0158] 實(shí)施例4S1U2LRR2蛋白的純化
[0159] 方法及材料：由于采用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物高效表達(dá)系統(tǒng)，選擇的細(xì)胞是 廣泛用于蛋白表達(dá)的經(jīng)過(guò)優(yōu)化的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CH0-S，而表達(dá)載體中有加入胞外分泌 信號(hào)肽，因此采用懸浮培養(yǎng)的方法，使細(xì)胞在高密度情況下分泌盡可能多的蛋白到培養(yǎng)液 中，收集培養(yǎng)液用于后續(xù)蛋白純化。
[0160] 純化方法：
[0161] 4. 1先用針對(duì)第一標(biāo)簽多肽元件的生物素親和柱進(jìn)行層析，再用針對(duì)第二標(biāo)簽短 肽元件的Ni親和柱進(jìn)行層析；或
[0162] 4. 2先用針對(duì)第二標(biāo)簽短肽元件的Ni親和柱進(jìn)行層析，再用針對(duì)第一標(biāo)簽多肽元 件的生物素親和柱進(jìn)行層析。
[0163] 首先，對(duì)純化得到的蛋白片段進(jìn)行定量，按比例的加入TEV蛋白酶進(jìn)行酶切，去除 蛋白標(biāo)簽。
[0164] 酶切緩沖液：50mMTris7. 5,500mM NaCl，5%Glycerol 的反應(yīng)體系，于 4°C過(guò)夜酶 切。
[0165] 酶切過(guò)后體系內(nèi)的標(biāo)簽蛋白片段和TEV蛋白酶均可通過(guò)Ni親和層析去除。
[0166] 實(shí)施例5純化的Slit2LRR2的測(cè)定
[0167] 方法：純化得到S1U2LRR2蛋白之后，將采用細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能檢測(cè)。其 中，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白功能的初步判斷。
[0168] 劃痕實(shí)驗(yàn)借鑒了體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停隗w外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致 傷，然后加入藥物觀察其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力。
[0169] 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為2-10X 105個(gè)/ml，24孔板每孔加 入500ul細(xì)胞懸液，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。用10uL移液槍槍頭（或者無(wú) 菌牙簽）在單層細(xì)胞上呈"一"字劃痕，用PBS清洗3次，然后加入用2%FBS培養(yǎng)基配好的 不同的S1U2LRR2蛋白片段（可設(shè)置濃度梯度）溶液，取3-4個(gè)平行樣本，依據(jù)腫瘤細(xì)胞的 侵襲能力不同，37°C培養(yǎng)12-24h。鏡下拍照測(cè)量細(xì)胞遷移的面積。
[0170] Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)主要采用24孔板小室。用膠原（collagen)包被 Transwell小室（Millipore公司）底部膜。消化細(xì)胞，PBS洗1-2遍，用含0. 2%BSA的無(wú)血 清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1-10X105,取細(xì)胞懸液200 μ 1加入Transwell 小室，24孔板下室加入500μ 1含血清的培養(yǎng)基，其中加入不同的S1U2LRR2蛋白片段。依 據(jù)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力不同，37°C培養(yǎng)12-48h。采用結(jié)晶紫染色細(xì)胞，鏡下拍照計(jì)數(shù)穿過(guò)的 細(xì)胞數(shù)，評(píng)價(jià)S1U2LRR2蛋白片段對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。
[0171] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
[0001] 序々I)表 <_uo>李肀順 <120:> #有富含亮氨酸重復(fù)序列的融1?蛋A及其制法和應(yīng)用 <13?> P2013-0428 <i60> 丄了 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 138 <212> DNA <213>寡核酸 <220> <221> CDS <222> (1)., (138) <400> 1 ctg tcc ace ggt ggc age gat gag aag acc act ggt tgg aga ggt ggc 48 Leu Ser Thr Glv Gly Ser Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly 15 10 L5 ORt gt.t gtg g?ia ggn tt.g get ggt. gan tt.g gaa caa ttg n.gn gcc. cgt 9fi His Val Val Glu Glv Leu Ala Glv Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg 20 25 30 ctg gag cat cac cca caa ggc caa eiga gaa cca ggc age ggc 138 Leu Glu His Ills Pro Gin Gly Gin Arg Glu Pro Gly Ser Glv 35 40 45 <210> 2 <211> 46 <212> PRT <2丄3>人:丨:序列 <400> 2 Leu Ser Thr Gly Gly Ser Asp Glu Lys Thr Thr Glv Trp Arg Glv Gly 1 H 10 15 iiis Val Val Glu G]y Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg 20 25 30 Leu Glu His His Pro Gin Gly Gin Arg Glu Pro Gly Ser Gly 35 40 45 <210> 3 <211> 8 <212> PKT <213〉人丨:序列 <220> <221> MTSC_FEATURE <223>人.1:序列 <400> 3 Leu Glu Val Leu Phe Glii Gly Pro 1 5 <210> 4 <211> 627 <212> DNA <213〉智人（Homo sapiens) <220> <221> CDS <222> (1).. (627)
[0002] <400> 4 ttg cac tgc cct gcc gcc tgt acc tgt age aac aat ate gta gac tgt 48 Leu His Cvs Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn He Val Asp Cys 15 10 15 cgt ggg aaa ggt etc act gag ate ccc aca aat ett cca gag acc ate 96 Arg Glv Lys Glv Lou Thr Glu lie Pro Thr Asn Lou Pro Glu Thr lie 20. 25 30 aca gaa ata cgt ttg gaa cag aac aca ate aaa gtc ate cct cct gga 144 Thr Glu lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr lie Lys Val lie Pro Pro Glv 35 40 45 get t.tc tea cca tat aaa aag ett aga ega att gac ctg age aat aat 192 Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn 50 55 60 cag ate tet gaa ett gca cca gat get ttc caa gga eta ege tet ctg 240 Gin lie Ser Glu Leu Aia Pro Asp Ala P3ie Gin Glv Leu Arg Ser Leu 65 70 75 ' 80 aat tea ett gtc etc tat gga aat aaa ate aca gaa etc ccc aaa agt 288 Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser 85 ^ ' *90 95 tta ttt gaa gga ctg ttt tee tta cag etc eta tta ttg aat gcc aac 336 Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn 100 105 110 aag ata aac tgc ett egg gta gat get ttt cag gat etc cac aac ttg 384 Lys lie Asn Cvs Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu ^ 115 120 125 aac ett etc tee eta tat gac aac aag ett cag acc ate gcc aag ggg 432 Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gin Thr lie Ala Lys Glv 130 ' 135 ' 140 ' acc ttt tea. cct ett egg gcc att caa act atg cat ttg gcc cag aac 480 Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala lie Gin Thr Met His Leu Ala Gin Asn 145 150 155 160 ccc ttt att tgt gac tgc cat etc aag tgg eta geg gat tat etc cat 528 Pro Phe lie Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tvr Leu His 165 170 ^ 175 acc aac ccg all gag acc agt ggl gcc egl tgc acc age ccc ege ege b76 Tin- Asn Pro He Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cvs Thr Ser Pro Arg Arg 180 ?85 190 c tg gca aac atui aga at L gga c.ag ate aaa age aag aaa lie egl tgl 624 Leu Ala Asn Lvs Arg lie Gly Gin He Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys 195 200 205 ' tea 627 Ser <210> 5 <211> 209 <212> P1?T <213> 智人(Homo sapiens) <400> 5 Leu His Cvs Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn lie Val Asp Cys 15 10 15 Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu J_ie Pro Thr Asn Leu Pro GJu Thr He 20 25 30 Thr Glu He Arg Leu Gin Gin Asn Thr lie Lvs Val lie Pro Fro Gly 35 40 45 Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn 50 55 60 Gin lie Ser Clu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Arg Ser Leu 65 70 75 80 Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser 85 90 95 Leu Phe Glu G1y Leu Phe Ser Leu Gin Leu Lett Leu Leu Asn Ala Asn 100 105 110 Lys lie Asn Cvs Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu 115 120 125
[0003] Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lvs Leu Gin Thr lie Ala Lys Gly 130 . 135 140 ' Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala lie Gin Thr Met His Leu Ala Gin Asn 145 150 155 160 Pro Phe lie Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Τ ?/γ Leu His 165 170 175 Thr Asn Pro He Gin Thr Se^r (^1 v Ala Ai'g Cys Tin' Ser Pro Arg Arg 180 185 ' 190 Leu Ala Asn Lys Arg lie Gly Gin lie Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys 195 200 205 Ser <210> 6 <211> 906 <212> DNA <213>人!:序列 <220> <221> CDS <222> (1).. (906) <·!00> 6 cgc ggc gtt ggc igg cag alg ctg icc clg Leg ctg ggg t La gig 48 Met Arg Gly Val GIy Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val 1 δ ^ 10 15 ctg geg ate ctg aac aag gtg gca ccg cag geg tgc ccg geg ttg oac 96 Leu Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala Leu His 20 ' 25 ' 30 i.gc cct gcc gcc tgt acc tgt age aac aat ate gta gac tgt cgt ggg 144 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn lie Val Asp Cys Arg Glv 35 40 45 ggt etc act. gag ate crc aca aat ctt. cce gag acc ate a.ca ga.a 192 Lys Gly Leu Thr Glu 11c Pro Thr Asn Lou Pro Glu Thr Ilo Thr Glu 50 55 60 ata cgt tt.g gaa cag aac aca ate aaa gtc ate cct cct gga get ttc 240 lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr lie Lys Val lie Pro Pro C1y Ala Phe 65 70 75 80 lea cca tai aaa aag ell- aga ega alt gac ctg age aal aat cag ale 288 Ser Pro Tvr Lys Lys Leu Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn Gin lie ' 85 90 95 let gaa ctt gca cca gat get ttc caa gga eta ege tet ctg aat tea 336 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser 100 105 ' iiO ctt gtc etc tat gga aat aaa ate aca gaa etc ccc aaa agt tta ttt 384 Leu Val Leu Tvr Gly Asu Lys He Ttir Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 115 120 125 gaa. gga ctg trt tcc tta cag etc eta tta ttg aat gcc a,a,c aag atB 432 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys lie 130 135 140 aac tgc ctt egg gta gat get ttt cag gat etc cac aac ttg aac ctt 480 Asn Cvs Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu Asn Leu 145 150 155 160 etc tcc eta tat gac aac aag ctt cag acc ate gcc aag ggg acc ttt 528 Leu Ser Leu Tvr Asp Asn Lys Leo Gin Thr Tie Ala l.ys Gly Thr Phe ' 165 ' 170 ' 175 tea cct ctt egg gcc att caa act atg cat ttg gcc cag aac ccc ttt 576 Ser Pro Leu Arg Ala lie Gin Thr Met liis Leu Ala Gin Asn Pro Phe 180 185 190 att tgt gac tgc cat etc aag tgg eta geg gat tat etc cat acc aac 624 lie Cvs Asp Cvs His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tvr Leu His Thr Asn "195 200 ' 205 ccg att gag acc agt ggt gcc cgt tgc acc age ccc ege ege ctg gca 672 Pro lie Glu Thi' Sei' G1y Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala 210 215 220 aac aaa aga att gga cag ate aaa age aag aaa ttc cgt tgt tea ctg 720 Asn Lys Arg lie Glv Gin lie Lys Ser Lvs Lys Phe Arg Cys Ser Leu 225 230 ' 235 240
[0004] gaa gtg ctg ttc cag ggc cct ctg t.cc acc ggt ggc. age gat gag aag 768 Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro Leu Ser Thr Glv Gly Ser Asp Glu Lys 245 250 ' 255 acc act ggt tgg aga ggt ggc cat gtt gtg gaa ggc ttg get ggt gaa 816 ?Ητ --τ Gly Trp Arg iiiy ?τ?γ His Val Va.i (ihi fily Len A fa. (tIy Glu 260 * 265 ' 270 ' ttg gaa caa ttg aga gcc cgt ctg gag cat cac cca caa. ggc caa aga 864 Lou Glu Gin Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro Gin Gly Gin Arg 275 280 285 gaa cca ggc age ggc cac cac cac cac cac cac cac cac taa 906 Glu Pro Gly Ser Gly His His His His His His His His 290 ' ' 295 300 <210> 7 <211> 301 <212> PRT <2i3> 人下序列 <400> 7 Met Arg Gly Val Gly Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Leu Val 1 n 10 15 Leu Ala lie Leu x^sn Lvs Val Ala Pro Gin Ala Cvs Pro Ala Leu His 20 25 ' 30 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cvs Ser Asn Asn lie Val Asp Cys Arg Gly 35 40 45 Lys G1y Leu Thr Glu lie Pro Thr Asn Leu Pro Glu Till' lie Thr Glu 50' 55 60 lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr lie Lys Val lie Pro Pro Glv Ala Phc 65 ?0 75 80 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn Gin lie ' 85 90 95 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser 100 105 110 Leu Val Leu Tyr (ily Asn Lys lie I'hr Glu l,eu Pro Lys Ser Leu Fhe 115 ' 120 125 Glu Glv Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lvs lie 130 135 140 Asn Or Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu !h\s Asn Leu Asn Leu 145 150 155 160 Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leo Gin Thr lie Ala Lys Gly Thr Phe 165 170 175 Ser Pro Leu Arg Ala lie Gin Thr Met His Leu Ala Gin Asn Pro Phe 180 185 190 lie Cvs Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asd Tyr Leu His Thr Asn 195 ' 200 ^ ~ 205 Pro lie Gla Thr Ser Gly Ala Arg Cvs Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala 210 215 220 Asn Lys Arg lie Gly Gin lie Lys Ser Lvs Lys Phe Arg Cys Ser Leu 225 230 ^ 235 ' 240 Glu Val Leu Phe Gin Glv Pro Leu Ser Thr Gly Gly Ser Asp Glu Lys 245 250 255 Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly Leu Ala Glv Glu 260 ^ ^ 265 ' 270 ' Leu Glu Gin Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro Gin Gly Gin Arg 275 280 285 Glu Pro Gly Ser Gly His His His Hi? His His His Hia 290 ~ ' 295 300 <210〉 8 <211> 33 <212> DNA <213> S核音酸 <220> <221> misefeature <223〉人T序列
[0005] <400> 8 ccacactgga ctagtatgcg cggcgttggc tgg 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213〉寡核苷酸 <220> ^221 / misc_feal. ure <223〉人工序列 <400> 9 accgagctcg gatcccgccg ggcacgcctg egg 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213>寡核苷酸 <220> <221> misc_feature <223> 人-T:序列 <400> 10 caggcgtgcr cggcgt.t.gca. c.t.gccctgrc gcr 33 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213〉寡核tr酸 <220> <221> misc_feature <223>人工序夕{J <·!00> 11 accgagctcg gatccttatg aacaacggaa tttcttg 37 <210> 12 <211> 33 <212> DM 1137寡核苷酸 <220> '221% misc_feature 人丄序列 <400> 12 aaattccgtt gttcactgga. agtgctgtic cag 33 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> ?核苷酸 <220> <221> raise feature <223> 人T序列 <400> 13 accgagctcg gatccttagt ggtggtggtg gtggt.g 36 <210> 14 <211> 4590 <212> DNA <213> 智人（Homo sapiens)
[0006] <220> <221> CDS <222> (1).. (4590) <400> L4 atg cgc ggc gtt ggc tgg cag atg ctg tcc ctg txg ctg ggg tta gtg 48 Met Arg Glv Val Gly Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu ￥al 1 5 ' 10 15 clg gcg ate clg aac aag gig gca ccg cag geg Igc ccg geg cag Lgc 96 I.eu Ala Tie Leu Aari Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala Gin Cvs 20 25 30 tet tgc tc.g ggc age aca gtg gac tgt cac ggg ctg gcg ctg cgc age 144 Sor Cys Sor Giy Ser Thr Val Asp Cys His Gly Leu Ala Leu Arg Ser 35 ' 40 45 gtg crx ngg a.at ate ccc cgc aac ace. gag aga ctg gat tta aat gga 192 Yal Pro Arg Asn He Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly 50 55 60 aat aac ate aca aga att aeg aag aca gat ttt get ggt- ett aga cat 240 Asn Asn lie Thr Arg lie Thr Lvs Thr Asp Phe Ala Gly Leu Arg His 65 70 75 80 eta aga gtt ett cag ett atg gag aat aag att age acc att gaa aga 288 Leu Arg Val Leu Gin Leu Met Giu Asn _Lvs 丄le Ser Tkr iie Giu Arg 85 90 95 gga gca ttc cag gat ett aaa gaa eta gag aga ctg cgt tta aac aga 336 Gly Ala Phe Gin Asp Len Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg ^ 100 * 105 110 aat cac ett cag ctg ttt cct gag ttg ctg ttt ett ggg act gcg aag 384 Asn His Leu Gin Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Glv Thr Ala Lys 115 120 125 eta tac agg ett gat etc agt gaa aac caa att cag gca ate cca agg 432 Leu Tvr Arg Leu Asp Loo Sei' Glu Asn Gin He Gin Ala He Pro Arg 130 135 140 aaa get ttc cgt ggg gca gtt gac ata aaa aat ttg caa ctg gat tac 480 Lvs Ala Phe Arg Gly Ala Val Asp lie Lvs Asn Leu Gin Leu Asp Tvr 145 150 155 160 aac cag ate age tgt att gaa gat ggg gca ttc agg get etc egg gac 528 Asa Gin lie Ser Cys lie Glu Asp Gly Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp i65 170 175 ctg gaa gtg etc act etc aac aat aac aac att act aga ett tet gtg 576 Leu Glu Val Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn lie Thr Arg Leu Ser Val 180 185 190 gca agi lie aac cal alg eel aaa cli agg act III ega eLg cal Lea 624 Ala Ser Phe Asn His Met Pro Lys Leu Arg Thr Phe Arg Lei] His Ser 195 200 205 aac aac ctg tat tgt gac tgc cac ctg gee tgg etc tec gac tgg ett 672 Asn Asn Leu Tyr Cys Asp Cys His Leu Ala Trp Leu Ser Asp Trp Leu 210 ' 215 220 cgc caa agg cct egg gtt ggt ctg tac act cag tgt atg ggc ccc tec 720 Arg Gin Arg Pro Arg Val Gly Leu Tyr Thr Gin Cys Met Gly Pro Ser 225 230 235 240 cac ctg aga ggc cat aat gta gee gag gtt caa aaa ega gaa ttt gtc 768 His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Yal Gin Lys Arg Glu Phe Val 245 250 255 tgc agt. ggt cac cag tea ttt atg get cct tet tgt agr gtt ttg cac 816 Cts Ser Gly HivS Gin Ser Phe Met Ala Pro Sei' Cys Ser Val Leu His ^ 260 265 ' 270 tgc cct gee gee tgt acc tgt age aac aat ate gta gac tgt cgt ggg 864 Cvs Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn lie Val Asp Cys Arg Gly ' 275 ' ' 280 285 ^ aaa ggt etc act gag ate ccc aca aat ett cca gag acc ate aca gaa 912 I.ys Gly I.eu Thr Glo Tie Pro Thr Asn Leu Pro Gin Thr Tie Thr Glu ^ 290 295 300 ata cgt ttg gaa cag aac aca ate aaa gtc ate cct cct gga get ttc 960 lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr lie Lys Yal lie Pro Pro Gly Ala Phe 305 310 315 320 tea cca t.at a.aa aag ett aga ega. att ga.c ctg a.gc R.at aat cag ate 1003 Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn Gin lie ' ' 325 330 335
[0007] tct gaa ctt gca cca gat get ttc caa gga eta ege tet ctg aat tea 1056 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Gly Leu Arg Ser Leu Asn Ser 340 345 ' 350 ctt gtc etc tat gga aat aaa ate aca gaa etc ccc aaa agt tta ttt 1104 Leu Val Leu Tyr Glv Asn Lys lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 355 360 365 gaa gga ctg ttt tee tta cag etc eta tta ttg aat gee aac aag ata 1152 Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gin Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn Lys lie 370 375 380 aac tgc ctt egg gta gat get ttt cag gat etc c.ac aac ttg aac ctt 1200 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu Asn Leu 385 390 395 400 etc tee eta tat gac aac aag ctt cag acc ate gee aag ggg acc ttt 124B l.eu Ser I.eu Tyr Asp Asn Lys I.en Gin Thr Tie Ala. Lvs Gly Thr Phe ? 405 410 ' 415 tea cct ctt egg gee att caa act atg cat ttg gee cag aac ccc ttt 1296 Ser Pro Leu Arg Ala lie Gin Thr Met Ois Leu Ala Gin Asn Pro Phe 420 425 430 att tgt gac tgc cat etc aag tgg eta geg gat tat etc cat acc aac 1344 lie Cvs Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tvr Leu His Thr Asn ^ 435 440 ' 445 ccg att gag acc agt. ggt gee cgt tgc acc age ccc ege ege ctg gca 1392 Pro lie Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala 450 455 460 aac aaa aga att gga cag ate aaa age aag aaa ttc cgt tgt tea get 1410 Asn Lys Arg lie Gly Gin lie Lys Sor Lvs Lvs Phe Arg Cys Ser Ala 465 470 475 480 aaa gaa cag tat ttc att cca ggt aca gaa gat tat ega tea aaa tta 1488 I.ys Glu Gin Tyr Phe Tie Pro Gly Thr Glu Asp Tvr Arg Ser I.ys Leu ' 485 490 ^ 495 agl gga gac tgc til geg gaL ctg get Igc cct gaa aag Lgl ege tgi 1536 Ser Gly Asp Cys Phe Ala Asp Leu Ala Cys Pro Glu Lys C-ys Arg Cys t 500 505 t 5?0 gaa gga acc aca gta gat tgc tct aat caa aag etc aac aaa ate ccg 1581 Glu Gly Thr Thr Val Asp Cys Ser Asn Gin Lys Leu Asn Lys 丄ie Pro 515 = 520 ^ 525 gag cac att ccc cag tac act gca geig ttg cgt etc aat aat aat gaa 1632 Glu His lie Pro Gin Tyr Thr Ala Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu 530 535 540 1.1:t: acc gtg tig gaa gee aca gga a t,c ttt aag aaa ctt cct caa tta 1680 Phe Thr Val Leu Glu Ala Thr Gly lie Pho Lys Lvs Leu Pro Gin Leu 545 550 555 560 cgt aaa ata aac ttt age aac aat aag ate aca gat att gag gag gga 1728 Arg l.ys 11 e Asn Phe Ser Asn Asn l.vs I" 1 r Thr Asp T1 e Glu Gin Gly ' 565 " 570 575 · gca ttt gaa gga gca tct ggt gta aat gaa ata ctt ctt aeg agt aat 1776 Ala Phe Glu Gly Ala Ser Gly Val Asn Glu lie Leu Leu Thr Ser Asn 580 ' 585 590 cgt ttg gaa aat gtg cag cat aag atg ttc aag gga ttg gaa age etc 1824 Arg Leu Glu Asn Val Gin His Lys Met Fhe Lys Giv Leu Glu Ser Leu 595 600 ^ 605 aaa act t.tg axg ttg aga age aat ega ata acc tgt gtg ggg aat gac 1872 Lys Thr Leu Met Leu Arg Ser Asn Arg lie Thr Cys Val Gly Asn Asp 610 B15 620 agt. ttc ata gga. etc agt tct gtg cgt ttg ctt tct. ttg t.a.t gat aat 1920 Ser Phe lie Glv Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn 625 630 635 640 caa att act aca gtt gca cca ggg gca ttl: gat act etc cat tct tta 1968 Gin lie Thr Thr Val Ala Pro Glv Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu 645 650 655 tct act eta aac etc ttg gee aat cct ttt aac tgt aac tgc tac ctg 2016 Ser Thr Leu Asn Leu Leu Ala Asn Pro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Leu 660 665 ' 670 get tgg t.tg gga gag tgg ctg aga aag aag aga att gtc aeg gga aat 2064 Ala Trp Leu Gly Glu Trp Leu Arg Lys Lys Arg lie Val Thr Gly Asn 675 ~ 680 685 ' cct aga tgt caa aaa cca tac ttc ctg aaa gaa ata ccc ate cag gat 2112 Pro Arg Cys Glu Lys Pro Tyr Phe Leu Lys GIli He Pro lie Gin Asp
[0008] 690 695 700 gtg gcc att cag gac ttc act tgt gat gac gga aat gat gac aat agt 2160 Val Ala lie Gin Asp Phe Thr Cys Asp Asp Gly Asn Asp Asp Asn Ser 705 710 715 720 tgc tcc cca ctt tct cgc tgt cct act gaa tgt act tgc ttg gat aca 2208 Cvs Ser Pro Leu Ser Arg Cys Pro Thr Glo Cys Thr Cys Leu Asp Thr ' 725 730 ' 735 gtc gtc cga tgt age aac aag ggt ttg aag gtc ttg ccg aaa ggt att 2256 Val Val Arg Cys Ser Asn Lys Gly Leu Lys Val Leu Pro Lys Gly lie 740 t 745 750 cca aga gal: gtc aca gag ttg tat c1:g gal: gga aac caa ttt aca ctg 2304 Pro Arg Asp Val Thr Gin Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gin Phe Thr Leu 755 760 - 765 gtt ccc aag gaa etc tcc aac tac aaa cat tta aca ctt at.a gac tta 2352 Val Pro Lvs Glu Leu Ser Asn Tyr Lys His Leu Thr Leu lie Asp Leu 770 775 780 agt. aac aac aga a.ta age aeg ctt. tct aat cag age ttc age aac atg 2400 Scr Asn Asn Arg lie Scr Thr Leu Scr Asn Gin Ser Phe Scr Asn Mct 785 790 795 800 occ cag etc etc a.cc tta att ctt agt tac as.c cgt ctg aga tgt att 2448 Thr Gin Leu Leu Thr Leu lie Leu Ser Tyr Asn Arg Leu Arg Cys He 805 810 815 cct cct cgc acc ttt gat gga tta aag tct ctt cga tta ctt tct eta 2496 Pro Pro Arg Thr Phe Asp Glv Leu Lys Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu 82Π ' B25 830 cat gga aat gac att tct gtt gtg cct gaa ggt get ttc aat gat ctt 2544 His Gly Asn Asp lie Ser Val Vai Fro Glu Gly Ala Fhe Asn Asp Leu 835 840 ' 845 tct gca tta tea cat eta gca att gga gcc aac cct ctt tac tgt gat 2592 Ser Ala Leu Ser His Leu Ala lie Gly Ala Asn Pro Leu Tvr Cys Asp 850 855 t 860 tgt aac atg cag tgg tta tcc gac tgg gtg aag teg gaa tat aag gag 261(i Cvs Asn Met Gin Trp Leu Ser Asp Trp Val Lys Ser Glu Tyr Lvs Glu 865 870 875 880 cct gga att get cgt tgt get ggt cct gga gaa atg gca gat aaa ctt 2688 Pro Gly lie Ala Arg Cys Ala Gly Pro Glv Glu Met Ala Asp Lys Leu 885 890 895 tta etc aca act ccc tcc aaa aaa ttt acc tgt caa ggx cct gtg gat 2736 Leu Leu Thr Thr Pro Ser Lys Lys Phe Thr Cvs Gin Gly Pro Val Asp 900 905 910 gtc aat att eta get aag tgt aac ccc tgc eta tea aat ccg tgt aaa 2784 Val Asn lie Leu Ala Lys Cys Asn Pro Cvs Leu Ser Asn Pro Cvs Lvs 915 920 ~ 925 ^ ~ aat gat ggc aca tgt aat agt gat cca gtt gac ttt tac cga tgc acc 2832 Asn Asp Gly Thr Cys Asn Ser Asp Pro Val Asp Phe Tyr Arg Cys Thr 930 ' ' 935 940 ^ Igl cca ial ggl tic aag ggg cag gac tgl gat gic cca alt cal gcc 2880 Cvs Pro Tvr Glv Phe \,ys ΓγΙυ Gin Asp Cys Asp Val Pro He His Ala 945 950 " 955 960 tgc ate agt aac cca tgt aaa cat gga gga act tgc cac tta aag gaa 2928 Cys lie Ser Asn Pro Cys Lvs His Gly Gly Thr Cys His Leu Lvs Glu 965 970 975 gga gaa gaa gat gga ttc tgg tgt att tgt get gat gga ttt gaa gga 2976 Gly Glu Glu Asp Gly Phe Trp Cys lie Cys Ala Asp Gly Phe Glu Gly ' 980 985 990 gao, aat tgt gaa gtc aac gtt gat gat tgt gaa gat aat ga,c tgt gaa 3024 Glu Asn Cys Glu Val Asn Val Asp Asp Cys Glu Asp Asn Asp Cys Glu 995 1000 1005 aat aat tct aca tgt gtc gat ggc att aat aac tac aca tgc ctt 3069 Asn Asn Ser Thr Cys Val Asp Gly lie Asn Asn Tyr Thr Cys Leu 1010 ' 1015 ' 1020 ' tgc cca cct. gag tat aca ggt gag ttg tgt- gag gag aag ctg gac 3114 Cvs Pro Pro Glu Tyr Thr Gly GL·] Leu Cys Glu Glu Lvs Leu Asp ^ 1025 ' 1030 ' 1035 ttc tgt gee cag gac ctg aac ccc tgc cag cac gat tea [tag tgc 3159 Phe Cys Ala Gin Asp Leu Asn Pro C?s Gin His Asp Ser Lys Cys 1040 1045 1050 ate eta act cca aag gga ttc aaa tgt gac tgc aca cca ggg tac 3204
[0009] Ilo Lou Thr Pro Lvs Glv Phc Lys Cvs Asp Cys Thr Pro Gly Tyr 1055 1060 1065 ' gta ggt gaa cac tgc gac ate gat ttt gac gac tgc caa gac aac 3249 Val Gly Glu His Cys Asp lie Asp Phe Asp Asp CVs Gin Asd Asn 1070 " 1075 1080 ^ aag tgt aaa aac gga gee cac tgc aca gat. gca gtg a.ac ggc ta.t 3294 Lts Cys Lys Asn Ala His Cys Thr Asp Ala Val Asn Gly Tyr 1085 1090 1095 aeg tgc ata tgc ccc gaa ggt tac agt ggc ttg ttc tgt gag r，tt 3339 Thr Cys He Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Glu Phe 1100 1105 1110 tet cca ccc atg gtc. etc. cct cgt ac.c age ccc tgt gat aat ttt 3384 Ser Pro Pro Met Val Leu Pro Arg Thr Ser Pro Cys Asp Asn Fhe 1115 1120 1125 gat tgt cag aat gga get cag tgt ate gtc aga ata aat gag cca 3429 Asp Cys Gin Asn Gly Ma Gin Cvs He Val Arg lie Asn Glu Pro 1130 1135 1140 ata tgt cag tgt ttg cct ggc tat cag gga gaa aag tgt gaa aaa 3474 lie Cys Gin Cys Leu Pro Gly Tyr Gin Gly Glu Lys Cys Glu Lys 1145 - 1150 115B ttg gtt agt gtg aat ttt ata aac aaa gag tet tat ett cag att 3519 Leu Val Ser Val Asn Phe lie Asn Lvs Glu Ser Tyr Leu Gin lie 1160 1165 1170 cct. tea gee aag gtt egg cct cag aeg aac ata aca ett cag att 3564 Pro Ser Ala Lys Val Arg Pro Gin Thr Asn lie Thr Leu Gin lie 117B ( 1180 11BB gee aca gat gaa gac age gga ate etc ctg tat aag ggt. gac aaa 3609 Ala Thr Asp Glu Asp Ser Glv Ilo Leu Lou Tvr Lys Gly Asp Lys 1190 1195 1200 gac cal ale geg gla gaa etc tat. egg ggg cgt git cgi gee agr 3654 Asp His lie Ala Val Glu Leu TVr Arg Gly Arg Val Arg Ala Ser 1205 1210 1215 tat. gac acc ggc tet, cat, cca get tet. gee att tac agT gtg gag 3699 Tvr Asp Thr Gly Ser His Pro Ala Ser Ala lie Tvr Ser Val Glu 1220 1225 1230 aca ate aat gat gga aac ttc cac att gtg gaa eta ett gee ttg 3744 Thr lie Asn Asp G1t Asn Phe His lie Val Glu Leu Leu Ala Leu 1235 ^ 1240 1245 gat cag agt etc tet ttg tee gtg gat ggt ggg aac ccc aaa ate 3789 Asp Gin Ser Leu Ser Leu Ser Val Asp Glv Glv Asn Pro Lvs lie 1250 1255 1260 ate act aac ttg tea aag cag tee act ctg aat ttt gac tet cca 3834 lie Thr Asn Leu Ser Lvs Gin Ser Thr Leu Asn Phe Asp Ser Pro 1265 1270 1275 etc tat gta gga ggc atg cca ggg aag agt aac gtg gca tet ctg 3879 Leu Tyr Val Gly Gly Met Pro Gly Lvs Ser Asn Val Ala Ser Leu 1280 l ' 1285 1290 cgc. cag gee cct ggg cag aac gga acc age ttc cac ggc tgc ate 3924 Arg Gin Ala Pro Gly Gin Asn Gly Thr Ser Phe His Gly Cys lie 1295 1300 1305 ' egg aac ett tac ate aac agt gag ctg cag gac ttc cag aag gtg 3969 Arg Asn Leu Tyr He Asn Ser Glu Leu Gin Asp Phe Gin Lys Val 1310 " 1315 1320 ^ ccg atg caa aca ggc att ttg cct ggc tgt gag cca tgc cac aag 4014 Pro Met Gin Thr Glv lie Leu Pro Gly Cvs Glu Pro Cys His Lys 1325 1330 1335 aag gtg tgl gee cal aca tgc cag ccc age age cag gca ggc 4059 Lys Val Cys Ala His Glv Thr Cys G丄n Pro Ser Ser Gin Ala Gly 1340 '丄345 ' 1350 ^ ttc acc tgc gag tgc cag gaa. gga tgg atg ggg ccc etc tgt. gac 4104 Phe Thr Cvs Glu Cys Gin Glu Gly Trp Met Gly Pro Leu Cys Asp 1355 1360 · 1365 caa c^g acc aal gac eel tgc ell gga aal aaa tgc gta cal ggc 4149 Gin Arg Thr Asn Asp Pro Cys heu G丄y Asn hvs Cvs Vai His Gly 1370 1?375 ' 1380 ' acc tgc ttg ccc ate aat geg ttc tee tar agr tgt aag tgc ttg 4194 Thr Cys I.eu Pro Tie Asn Ala Phe Ser Tvr Ser fys 1 vs Cya Leu 1385 1390 1395 '
[0010] gctg ggc caL gga ggi gtc clc tgi gai gaa gag gag gal clg Lti 4239 Glu Gly His Glv Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Glu Asp Leu Phe 1400 ' ' 1405 1410 aac cca tgc cag gcg ate aag tgc aag cac ggg aag tgc agg ett 428-1 Asn Pro Cys Gin Ala He Lys Cys Lys His Gly Lys Cys Arg Leu 1415 1420 ^ 1425 tea ggt c-tg ggg cag ccc tac tgt gaa tgc age agt gga tac aeg 4329 Ser Gly Leu Glv Gin Pro Tyr Cys Glu Cys Ser Ser Gly Tyr Thr 1430 1435 1440 ggg gac age tgt gat ega gaa ate tet tgt ega ggg gaa agg ata 4374 Glv Asp Ser Cys Asp Arg Glu lie Ser Cys Arg Gly Glu Arg lie 1445 1450 1455 aga gat tat tac caa aag cag cag ggc tat get get tgc caa aca 4419 Arg Asp Tyr Tyr Gin Lys Gin Gin Gly Tyr Ala Ala, Cys Cln Thr 1460 ^ ^ 1465 ' 1470 ?dee aag aag gtg lee ega Ua gag tgc aga ggl ggg Lgl gca gga 4404 Thr Lys Lvs Val Ser Arg Leu Glu Cys Arg Gly Gly Cys Ala Gly 1475 1480 ^ 1485 ^ ggg cag tgc tgt gga ccg ctg agg age aag egg egg aaa tac tet 4509 Gly Gin Cys Cvs Gly Pro Leu Arg Ser Lys Ai'g Arg Lys Tvr Sei' 1490 - · 1495 · 1500 · ttc gaa tgc act gac ggc tee tee ttt gtg gac gag gtt gag aaa 4554 Phe Glu Cys Thr Asp Gly Ser Ser Phe Val Asp Glu Val Glu Lys 1505 1510 1515 gtg gtg aag tgc ggc tgt a.cg agg tgt gtg tee taa 459U Val Val Lys Cvs Glv Cys Thr Arg Cys Yal Ser 1520 1525 <210> 15 <211> 1529 <212> PRT <213> 智人（Homo sapiens) <400> 15 Met Arg Gly Val Glv Trp Gin Met f.eu Ser Leu Ser Leu Glv Leu Yal 1 5 ^ 10 15 Leu Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala Gin Cys 20 . 25 30 Ser Cvs Ser Glv Ser Thr Val Asp Cvs His Gly Leu Ala Leu Arg Ser 35 40 45 Val Pro Arg Asa lie Pro Arg Asn Thr Glu Arg Leu Asp Leu Asn Gly 50 55 60 t Asn Asn lie Thr Arg lie Thr Lvs Thr Asp Phe Ala, Glv Leu Arg His 65 70 75 80 Leu Arg Vai Leu Gin Leu Met G丄u Asn Lys lie Ser --τγ ile Glu Arg 85 90 95 Gly Ala Phe Gin Asp Leu Lys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Leu Asn Arg 100 105 110 Asn i[is Leu Gin Leu Phe Pro Glu Leu Leu Phe Leu Gly Thr Ala Lys 115 120 125 t Leu Tyr Arg Leu Asp Leu Sex- Glu Asn Gin lie Gin Ala He Pro Arg ?30 135 140 Lys Ala Phe Arg Gly Ala Yal Asp lie Lys Asn Leu Gin Leu Asp Tyr 145 150 155 160 Asn Gin Tie Ser Cvs lie Glu Asp Glv Ala Phe Arg Ala Leu Arg Asp 165 170 175 Leu Glu Vp.1 Leu Thr Leu Asn Asn Asn Asn Tie Thr Arg I.eu Ser Val 180 185 190 Ala Ser Phe Asn His Met Pro Lvs Leu Arg Thr Phe Arg Leu His Ser 195 200 205 A>n Asn !,en Tyr Cys Asp Cys His l,en Ala. Trp f.eu Spt Asp Ti'p l.eu 210 ' ' 215 220 Arg Gin Arg Pro Arg Val Gly Leu Tvr Tlir Gin Cys Met Glv Pro Sei' 225 230 ' ' 235 ' 240 His Leu Arg Gly His Asn Val Ala Glu Val Gin Lys Arg Glu Phe Val 245 250 255 Cys Ser Gly His Gin Ser Phe Met Ala Pro Ser Cys Ser Val Leu His
[0011] 260 265 270 Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn lie Vai Asp Cys Arg Gly ' 275 ' ' 280 285 ' Lys Glv Leu Thr Glu lie Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr lie Thr Glu 290 295 300 lie Arg Leu Glu Gin Asn Thr lie Lys Val lie Pro Pro Gly Ala Phe 305 310 ' 315 ' 320 Ser Pro T?r Lys Lys Leu Arg Arg lie Asp Leu Ser Asn Asn Gin lie 325 330 335 Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gin Glv Leu Arg Ser Leu Asn Ser 340 345 ' 350 Leu Val Leu Tyr Gl? Asn Lvs lie Thr Glu Leu Pro Lys Ser Leu Phe 355 360 365 Glu G1 v Leu Phe Sev Leu CHn Leu Leu Leu I,eii Asti Ala A an i.ys T1 e 370 375 380 Asn Cys Leu Arg Val Asp Ala Phe Gin Asp Leu His Asn Leu Asn Leu 385 390 395 400 Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lvs Leu Gin Thr lie Ala Lys Cly Thr Phe 405 410 415 Ser Pro Leu Arg Ala lie Glo Thr Mel His Leu Ala Glu Asn Pro Ptie 420 425 430 lie Cvs Asp Cys His Leu Lvs Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His Thr Asn 435 440 ' 445 Pro lie Glu Thr Ser Gly Ala Aig Cys Thr Ser Pro Arg Arg Leu Ala 450 455 460 Asn Lys Arg lie Gly Gin lie Lys Sor Lvs Lvs Phe Arg Cys Ser Ala 465 470 ' 475 ' 480 Lys Glu Gin Tyr Fhe lie Fro Gly Thr Giu Asp Tyr Arg Ser Lys Leu 48n 490 495 Scr Glv Asp Cvs Pho Ala Asp Lou Ala Cvs Pro Glu Lys Cys Arg Cvs 500 505 510 Glu Gly Thr Thr Val Asp Cys Ser Asn Gin Lvs Leu Asti Lys lie Pro 515 520 ' 525 Glu His He Pro Gin Tvr Thr Ala Glu Leu Arg Leu Asn Asn Asn Glu 530 535 540 Phe Thr Val Len Gin Ala Thr Glv He Phe Lvs Lys Leu Pro Gin Leu 545 550 [ 555 560 Arg Lvs lie Asn Phe Ser Asn Asn Lys lie Thr Asp lie Glu Glu Gly 565 570 575 Ale Phe Glu Gly Ala Ser Gly Val Asn Glu Tie T.eii Ι,βιι Thr Ser Asn 580 ' 585 590 Arg Leu Glu Asn Val Gin His Lvs Mel Phe Lys Gly Leu Glu Sex' Leu 595 600 605 Lys Thr Leu Viet. ].en Arg Ser Asn Arg Tie Thr Cys Val Gly Asn Asp '610 615 620 ' Sor Phe lie Gly Leu Ser Ser Val Arg Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn 625 630 635 ' 640 Gin lie Thr Thr Val Ala Pro Gly Ala Phe Asp Thr Leu His Ser Leu 645 650 655 Ser Thr Leu Asn Leu Leu Ala Asn Fro Phe Asn Cys Asn Cys Tyr Leu 660 665 ' 670 Ala Trp Leu Glv Glu Trp Leu Arg Lys Lys Arg lie Val Thr Gly Asn 675 680 685 Pro Arg Cys Gin Lys Pro Tvr Phe Leu Lys Glu lie Pro lie Gin Asp 890 ' 69n ' 700 Val Ala lie Gin Asp Phe Thr C3 rs Asp Asp Gly Asn Asp Asp Asn Ser 705 710 715 720 Cvs Ser Pro Leu Ser Arg Cys Pro Thr Giu Cys Thr Cys Leu Asp Thr ' 725 730 735 Val Val Arg Cys Ser Asn Lys Gly Leu Lys Val Leu Pro Lvs Giy lie 740 745 750 Pro Arg Asp Val Thr Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gin Phe Thr Leu 755 760 - 765 Val Pro Lvs Glu Leu Ser Asn Tyr Lys His Leu Thr Len lie Asp Leu 770 775 780 Ser Asn Asn Arg Tie Ser Thr Leu Ser Asn Gin Ser Fhe Ser Asn Met 785 790 795 800 Thr Glu Leii Leu Thi' Leu lie Leu Ser Tvr Asn Aig Leu Arg Cys lie
[0012] 805 810 815 Fro Pro Arg Thr Phe Asp Giv Leu Lvs Ser Leu Arg Leu Leu Ser Leu 820 ' 825 830 His Gly Asn Asp lie Sor Val Val Pro Glu Gly Ala Phe Asn Asp Lou B35 840 845 Ser Ala Leu Ser His Leu Ala lie Gly Ala Asn Pro Leu Tyr Cys Asp 850 855 ' 860 Cys Asn Met Gin Trp Leu Ser Asp Trp ￥al Lys Ser Glu Tyr Lys Glu 865 870 875 880 Pro Gly lie Ala Arg Cvs Ala Glv Pro Gly Glu Met Ala Asp Lys Leu ? 885 ' 890 895 Leu Leu Thr Thr Pro Ser Lys Lys Phe Thr Cys Gin Glv Pro ￥al Asp 900 905 910 Va.l Asn Tie Leu Ala. i.vs Cya Asn Pro Cvs Leu Ser Asn Pro Cy vs i,vs 915 920 ' 925 ' ^ Asn Asp Gly Thr Cys Asn Ser Asp Pro Val Asp Phe Tyr Arg Cys Thr 930 935 940 Cvs Pro Tvr Glv Phe Lvs Glv Gin Asp Cys Asp Val Pro lie His Ala 945 950 ' 955 960 Cys lie Ser Asn Pro Cys Lys His Gly Gly Thr Cys His Leu Lys Glti 965 970 975 Glv Glu Glu Asp Glv Phe Trp Cys He Cys Ala Asp Gly Phe Glu Glv 980 985 990 · Glu Asn Cvs Glu Val Asn Val Asp Asp Cys Glu Asp Asn Asd Cys Glu 995 1000 1005 ^ Asn Asn Scr Thr Cvs Val Asp Gly lie Asn Asn Tyr Thr Cvs Leu 1010 1015 1020 Cys Fro Fro Glu Tvr Thr Gly Glu Leu Cys Glu Glu Lys Leu Asp 102B 1030 103ft Phe Cvs Ala Gin Asp Lou Asn Pro Cvs Gin His Asp Scr Lys Cys 1040 1045 1050 lie Leu Thr Pro Lvs Gly Phe Lys Cys Asp Cys Thr Pro Gly Tyr 1055 " 1060 1065 ' Val Gly Glu His Cvs Asp lie Asp Phe Asp Asp Cys Gin Asp Asn 1070 1075 1080 Lys Cys Lys Asn Gly Ala His Cvs Thr Asp Ala Val Asn Gly Tyr ^ 1085 1090 1095 ' Thr Cvs lie Cvs Pro Glu Gly Tvr Ser Glv Leu Phe Cvrs Glu Phe 1100 1105 1110 Ser Pro Prn Met Va"! Len Pro Arg Thr Ser Pro Cys Asp Asn Phe 1115 1120 1125 Asp Cvs Gin Asn Gly Ala Gin Cvs He Val Arg lie Asn Glu Pro 1130 1135 1140 Tie Cys Gin Leu Pro Gly Tvr Gin Glv Glu Lys Cvs Glu Lys 1145 ^ 1150 " 1155 ' Leu Val Ser Val Asn Phe lie Asn Lys Glu Ser Tyr Leu Gin lie 1160 1165 ' 1170 Pro Ser Ala Lys Val Arg Pro Gin Thr Asn lie Thr Leu Gin lie 1175 " 1180 1185 Ala Thr Asp Glu Asp Ser Gly He Leu Leu Tvr Lys Gly Asp Lys 1190 1195 ^ 1200 ' Asp His llo Ala Val Glu Leu Tvr Arg G1y Arg Val Arg Ala Sor 1205 1210 1215 Tyr Asp Thr Gly Ser His Pro Ala Ser Ala lie Tyr Ser Val Glu "1220 1225 1230 Thr lie Asn Asp Glv Asn Phe His lie Val Glu Leu Leu Ala Leu 1235 1240 1245 Asp Gin Ser Leu Ser Leu Ser Val Asp Glv Gly Asn Pro Lys lie 1250 1255 " ' 1260 lie Thr Asn Leu Ser Lys Gin Ser Thr Leu Asn Phe Asp Ser Pro 1265 1270 1275 Leu Tyr Val Glv Gly Met Pro Gly Lys Ser Asn Val Ala Ser Leu 1280 ~ ' 1285 ' ' 1290 Arg Gin Ala Pro Gly Gin Asn Gly Thr Ser Phe His Gly Cys He 1295 1300 1305 Arg Asn Leu Tyr Tie Aan Ser Glu Leu Gin Asp Fhe Gin Lys Val 1310 1315 1320 Pro Met Glu Tin- Gly lie Leu Pro Gly Cys Glu PiO Cys His Lp
[0013] 1325 1330 1335 Lys Val Cys Ala His Gly Thr Cys Gin Pro Ser Ser Gin Ala Gly 1340 1345 1350 Phe Thr Cys Glu Cvs Gin Glu Glv Trp Met Gly Pro Leu Cvs Asp 1355 1360 1365 Gin Arg Thr Asn Asp Pro Cys Leu Gly Asn Lys Cys Val His Gly 1370 1375 1380 Thr Cys Leu Pro lie Asn Ala Phe Ser Tvr Ser Cys Lys Cvs Leu 1385 1390 ' 1395 Glu Gly His Gly Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Glu Asp Leu Phe 1400 ' 1405 1410 Asn Pro Cys Gin Ala lie Lys Cys Lys His Gly Lys Cys Arg Leu 1415 1420 1425 Ser Glv Leu Gly Gin Pro Tyr Cys Glu Cvs Ser Ser Glv Tyr Thr 1430 1435 1440 Gly Asp Ser Cys Asp Arg Glu lie Ser Cvs Arg Gly Glu Arg lie 1445 1450 1455 Arg Asp Tyr Tyr Gin Lys Gin Gin Gly Tvr Ala Ala Cys Gin Thr 1460 · 1465 1470 Thr Lys Lys Val Ser Arg Leu Glu Cvs Arg Gly Gly Cys Ala Gly 1475 1480 1485 Gly Gin Cys Cys Gly Pro Leu Arg Ser Lys Arg Arg Lys Tyr Ser 1490 1495 1500 Phe Glu Cys Tin' Asp Gly Ser Ser Phe Val Asp Glu Val Glu Lys 1505 1510 1515 Val Val Lys Cys Gly Cys Thr Arg Cys Val Ser 1520 ' ' 1525 <210> 16 <211> 90 <212> DMA <213> 智人(Homo sapiens) <220> <221> CDS <222> (1).. (90) <400> 16 atg cgc ggc gtt ggc tgg cag atg ctg tcc ctg teg ctg ggg tta gtg 48 Met Arg Gly Val Glv Trp Gin Met Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 ctg geg ate ctg aac aag gtg gca ccg cag geg tgc ccg geg 90 Lea Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cvs Pro Ala 20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> 智人(Homo sapiens) <400> 17 Met Arg Gly Val Gly Trp Gin Met Leu Ser Leo Ser Leu Gly Leo Val 15 10 15 Leu Ala lie Leu Asn Lys Val Ala Pro Gin Ala Cys Pro Ala 20 25 30
【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白自N端至C端具有式la或lb所述的結(jié) 構(gòu)： A-X-E-Y1-Y2 式 la ; A-Y2-Υ1-Ε-X 式 lb ; 其中， A為任選的分泌信號(hào)肽； X為Slit2蛋白的富含亮氨酸的重復(fù)序列2 (leucine-rich repeat2, LRRs2)元件； E為酶切位點(diǎn)； Υ1為第一標(biāo)簽多肽元件； Υ2為第二標(biāo)簽短肽元件，所述第二標(biāo)簽短肽元件為His標(biāo)簽元件； "一"表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Y1包括SEQ ID NO. : 2所示的改 良型親和素標(biāo)簽（Strap II標(biāo)簽）、鏈親和素（Strepavidin)標(biāo)簽。
3. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Y1為Strap II標(biāo)簽，而Y2為 8XHis標(biāo)簽元件。
4. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的S1U2LRR2的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 5 所示。
5. -種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋 白。
6. -種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求5所述的多核苷酸。
7. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或轉(zhuǎn) 染了權(quán)利要求5所述的多核苷酸。
8. 如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞；較 佳地包括CH0細(xì)胞、293細(xì)胞。
9. 一種制備S1U2LRR2蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟： (i) 在合適的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)權(quán)利要求1所 述的融合蛋白； (ii) 從培養(yǎng)體系中分離純化出權(quán)利要求1所述的融合蛋白； (iii) 對(duì)所述的融合蛋白，用針對(duì)元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而制得S1U2LRR2。
10. -種制備S1U2LRR2蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟： 對(duì)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，用針對(duì)元件E的蛋白酶進(jìn)行酶解，從而制得S1U2LRR2。
11. 一種純化的S1U2LRR2蛋白，其特征在于，是通過(guò)權(quán)利要求9或10所述的方法生產(chǎn) 制備的。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104119447SQ201310151606
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月26日
【發(fā)明者】李華順 申請(qǐng)人:李華順