一種制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶luxAB的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶luxAB的方法，先獲得目的基因；構(gòu)建重組表達(dá)載體；獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種；誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)及蛋白的純化；檢測純化的增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶的活性。本發(fā)明利用融合型熒光素酶其獨(dú)特的優(yōu)勢，將luxA和luxB基因異二聚體熒光素酶基因融合并經(jīng)過易錯PCR突變和化學(xué)隨機(jī)突變，篩選得到9個熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的突變體，然后經(jīng)過shuffling技術(shù)，得到一個增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶基因luxAB，將其克隆到表達(dá)載體pET28a上，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中表達(dá)，并用溫和破碎法裂解細(xì)胞，純化表達(dá)產(chǎn)物，得到增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶，本發(fā)明的方法過程簡單、生長周期短、成本低廉、易于純化、酶活性損失小，性能穩(wěn)定，具有重要的實際應(yīng)用價值。
【專利說明】—種制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)菌熒光素酶制備領(lǐng)域，尤其涉及一種制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]發(fā)光細(xì)菌由于其獨(dú)特的生理特性，在環(huán)境監(jiān)測中被作為測定環(huán)境中毒物的指標(biāo)，熒光素酶在細(xì)菌發(fā)光的過程中起到至關(guān)重要的作用。
[0003]熒光素酶(英文名稱:Luciferase)是生物體內(nèi)催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱。
[0004]熒光素酶具有靈敏性高、特異性好、反應(yīng)迅速、操作簡便、應(yīng)用廣泛，且對生物體無毒害作用等諸多優(yōu)點，熒光素酶越來越多的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、環(huán)境監(jiān)測等相關(guān)領(lǐng)域。其中有一種為細(xì)菌體內(nèi)的熒光素酶。在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來自于熒光素的氧化，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。沒有熒光素酶的情況下，熒光素與氧氣反應(yīng)的速率非常慢，發(fā)光基因(lux gene)系統(tǒng)中包括結(jié)構(gòu)基因luxC，D，A，B，E和調(diào)芐基因IuxI和IuxR等。從不同發(fā)光細(xì)菌中分離得到的發(fā)光基因其種類和數(shù)量有所差異，在Iux操縱子中，IuxA和IuxB是緊密相連的。
[0005]以明亮發(fā)光桿菌(PhotorhabdusIuminescens)為例，IuxA 基因中含有 1083bp,IuxB基因中含有984bp，IuxA和IuxB基因分別編碼細(xì)菌熒光素酶異二聚體的α (催化亞基，40kD)和β (調(diào)節(jié)亞基，36kD)亞基，只有兩個亞基共存時才有活性，當(dāng)將IuxA和IuxB基因融合表達(dá)后形成的單體蛋白仍然具有與野生型異二聚體蛋白相當(dāng)?shù)陌l(fā)光活性，經(jīng)密碼子優(yōu)化后該融合蛋白在真核生物中也具有很高的活性。IuxC含有1431bp，編碼的蛋白質(zhì)含有477個氨基酸，分子量為55kD ;IuxD編碼的蛋白質(zhì)分子量為33kD ;IuxE編碼的蛋白質(zhì)分子量為42kD。在明亮發(fā)光桿菌中還發(fā)現(xiàn)有IuxF基因，它通常位于IuxB和IuxE之間，其編碼的蛋白質(zhì)分子量為26kD左右，但I(xiàn)uxF基因在弧菌屬和異短桿菌屬中的發(fā)光基因系統(tǒng)中尚未被發(fā)現(xiàn)。在以上所有菌株的操縱子中，這些基因的順序都相同，均為lux CDAB(F)E。
[0006]發(fā)光機(jī)理的研究表明，不同種類的發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)理是相同的，是由特異性的熒光酶(LE)、還原性的黃素(FMNH2)、八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)、氧分子(02)所參與的復(fù)雜反應(yīng)，大致歷程如下:
[0007]

【權(quán)利要求】
1.一種制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 獲得目的基因； 構(gòu)建重組表達(dá)載體； 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種； 誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)及蛋白的純化； 檢測純化的增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶的活性。
2.如權(quán)利要求1所述的制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB的方法，其特征在于，獲得目的基因采用PCR方法； 采用PCR方法獲得目的基因的具體步驟為: 以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物，在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點，PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
3.如權(quán)利要求1所述的制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB的方法，其特征在于，構(gòu)建重組表達(dá)載體的具體步驟為: 步驟一、載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit ； 步驟二、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4 DNA連接酶作用下與載體連接。
4.如權(quán)利要求1所述的制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB的方法，其特征在于，獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種的具體步驟為: 步驟一、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，根據(jù)重組載體的抗Amp、藍(lán)白斑標(biāo)志作篩選，挑取單斑，堿裂解法抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定； 步驟二、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作； 步驟三、以重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)的感受態(tài)菌株中。
5.如權(quán)利要求1所述的制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB的方法，其特征在于，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的方法為: 步驟一、從帶有重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株平板上挑取單菌落，接種于5ml的LB培養(yǎng)基中，加入5ulAmp,過夜搖菌； 步驟二、按照1: 50的比例，從步驟一得到的菌液中，取Iml菌液接種于50ml LB培養(yǎng)基中，加入50ulAmp，擴(kuò)大培養(yǎng)3h ； 步驟三、擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液中加入50ul IPTG(24mg/ml)，過夜低溫26°C誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。
6.如權(quán)利要求1所述的制備增強(qiáng)型單體細(xì)菌熒光素酶IuxAB的方法，特征在于，取過夜誘導(dǎo)的菌液80ul，加入5*SDS-PAGE Loading Buffer20ul，經(jīng)過100°C處理十分鐘后，采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠檢測表達(dá)結(jié)果，凝膠濃度為12%。
【文檔編號】C12N15/70GK104178463SQ201310151132
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月27日
【發(fā)明者】沈錫輝, 崔博宇, 宋云洪, 司美茹, 王瑤 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)