一株高產(chǎn)熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株高產(chǎn)熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶的地衣芽胞桿菌菌株。該菌株是將原始菌株，經(jīng)紫外-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變得到。所述地衣芽孢桿菌（Βacillus?licheniformis）β-10-25保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC?NO：M2013538。該菌株所產(chǎn)的β-葡聚糖酶酶活力高達(dá)8000-10000u/ml,是原始菌株的2.5倍。比現(xiàn)有的β-葡聚糖酶酶活力高，酶作用最適pH值范圍寬泛，熱穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性均較高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
【專利說(shuō)明】一株高產(chǎn)熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株高產(chǎn)熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002]β_葡聚糖是一種天然多糖，通常存在于特殊種類的細(xì)菌、酵母菌及真菌的細(xì)胞壁，或者高等植物種子的包被中。β-葡聚糖是構(gòu)成禾本植物細(xì)胞壁的一種結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，在大麥、黑麥、高梁、大米及小米的胚乳細(xì)胞壁中含量尤其高。與一般糖類主要以α-1，4_糖苷鍵結(jié)合而成為線形分子不同的是，植物細(xì)胞壁中的β_葡聚糖是以混合的β- (1，3)，(1，4)糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物，因此葡聚糖可以以很大的分子量溶解于水中，從而具有粘度大、親水性高、吸水膨脹力和持水性高的性質(zhì)。當(dāng)以大麥作為啤酒生產(chǎn)原料時(shí)，上述性質(zhì)便會(huì)影響麥芽汁的過(guò)濾速度，降低固形物的浸出率，還會(huì)因凝膠沉淀作用而降低啤酒的品質(zhì)；同時(shí)當(dāng)含有β_葡聚糖的作物用作飼料時(shí)，會(huì)增加非反芻禽畜的腸液粘度，成為飼料的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，降低飼料的利用率。
[0003]β -葡聚糖酶是高效、專一分解β -葡聚糖的主要酶，在啤酒和飼料的生產(chǎn)過(guò)程中添加該酶能有效的解決上述問(wèn)題。在飼料工業(yè)中它能水解β -葡聚糖中的1-3或1-4糖苷鍵，使之降解為低分子糖，降解后的β -葡聚糖失去親水性和粘性，不會(huì)在畜禽腸道中膨脹粘連，使得食糜的消化率以及飼料的能量利用率均得到提高。β -葡聚糖酶應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中，可以轉(zhuǎn)移分解粘度很高的各種大麥葡聚糖，疏松大麥胚乳細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物的外溢，提高原料利用率，降低麥芽汁粘度，從而使啤酒產(chǎn)量增加，品質(zhì)得以提升。
[0004]目前，美國(guó)、日本、丹麥、德國(guó)、澳大利亞、加拿大等國(guó)均已采用葡聚糖酶作為啤酒和飼料工業(yè)的主要酶制劑，而其在醫(yī)藥、紡織、廢水處理和日用化工、生物防治等其他方面的應(yīng)用價(jià)值也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，前景十分廣闊。但是熱穩(wěn)定性差和酶活力低已經(jīng)成為影響其應(yīng)用效果的制約因素。
[0005]中國(guó)專利CN103013873A公開(kāi)了一株產(chǎn)熱穩(wěn)定性β -葡聚糖酶的菌株，該發(fā)明首次提供了一株來(lái)源于溫泉的能夠生產(chǎn)β -1, 3-1，4-葡聚糖酶的高地芽孢桿菌，并克隆得到了該酶的基因，該酶在60°C條件下保存Ih后仍能保持90%的酶活力。
[0006]中國(guó)專利CN102719416A提供了一種提高β _1，3_1，4_葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法，通過(guò)HNO2對(duì)β -1, 3-1，4-葡聚糖酶進(jìn)行化學(xué)修飾，所得的β -1, 3-1，4-葡聚糖酶T5tl值和t(1/2,60D 分別提高了 4.76%和62.1%。
`[0007]之前，市場(chǎng)上高品質(zhì)的β -葡聚糖酶幾乎被國(guó)外的酶制劑生產(chǎn)公司所壟斷，雖然近幾年我國(guó)所報(bào)道的微生物產(chǎn)葡聚糖酶的酶活力已達(dá)到甚至超過(guò)了國(guó)際水平，但是能夠獲得兼具高活性及熱穩(wěn)定性的β_葡聚糖酶及其生產(chǎn)菌株仍然是目前工業(yè)應(yīng)用中亟待解決的一大問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)熱穩(wěn)定性β -葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌。
[0009]本發(fā)明提供的高產(chǎn)熱穩(wěn)定性β_葡聚糖酶的菌株具體為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) β-10-25。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)，保藏號(hào)為 CCTCC NO:Μ2013538ο
[0010]所述菌株特點(diǎn)如下:
[0011]在固體平板上菌落為白色，邊緣不整齊，表面干燥不透明，鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞形態(tài)呈短桿狀，芽孢中生，橢圓形，不膨大。
[0012]所述菌株生理生化特征:V-P試驗(yàn)( + )，淀粉水解( + )，酪素水解( + )，明膠水解(+)，硝酸鹽還原(+)，吲哚試驗(yàn)(-)，利用檸檬酸鹽(+)，硝酸還原(+)，甘露醇(+)，木糖(+ )。
[0013]所述地衣芽孢桿菌(B acillus licheniformis) β-10-25由一株本公司實(shí)驗(yàn)室分離獲得的產(chǎn)β-葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌經(jīng):原始出發(fā)菌種β-10—試管活化一紫外線(UV)-氯化鋰(LiCl)-硫酸二乙酯(DES)復(fù)合誘變一平板初篩(高產(chǎn))一搖瓶復(fù)篩(高產(chǎn))—熱穩(wěn)定性測(cè)定一傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)等步驟篩選獲得。
[0014]具體篩選步驟如下:
[0015]1.出發(fā)菌株活化
[0016]出發(fā)菌株的活化:取試管斜面上的地衣芽孢桿菌出發(fā)菌株β-10—環(huán)，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37°C培養(yǎng)24h左右，連續(xù)活化三次。
[0017]所述的種子培養(yǎng)基為:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0018]2.紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變選育
[0019]I)菌懸液的制備
[0020]將在平板劃線分離后長(zhǎng)出的菌株單菌落接入LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h后，取ImL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗滌兩次，并重懸于9mL生理鹽水中。
[0021]2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0022]將菌懸液置于無(wú)菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射60s。將經(jīng)過(guò)照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置30°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上篩選出透明圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于30°C靜止處理40min，將處理過(guò)的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板上。
[0023]所述的氯化鋰平板:地衣多糖0.3%，剛果紅0.1%，蛋白胨1%，(NH) 2S040.4 %，K2HPO40.8 %，CaCl20.2 %，氯化鋰 0.9%,瓊脂 2%。
[0024]3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0025]將上述涂布均勻的平板，置30°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的分離平板上初篩出透明圈與菌落直徑比值比較大者挑至斜面保存，純化后獲得十株菌β-10-21，β-10-22，β -10-23, β -10-24, β -10-25, β -10-26, β -10-27, β -10-28, β -10-29, β -10-30。
[0026]4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩 [0027]將獲得的十株菌在裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，種子接種量5% (V/V)，發(fā)酵完成后采用DNS法測(cè)定酶活，結(jié)果表明β-10-23，β-10-25，β-10-26的產(chǎn)酶能力分別較原始菌株提高55%、62%、47%。
[0028]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉5%~15%，豆餅粉4%~10%，(NH) 2S040.4 %,K2HPO40.8%, CaCl20.2%?
[0029]所述的搖瓶培養(yǎng)條件:該菌在含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量5%(V/V)，100r/min、37°C發(fā)酵培養(yǎng) 72h。
[0030]3、熱穩(wěn)定性篩選
[0031]將搖瓶發(fā)酵獲得的三株高產(chǎn)葡聚糖酶的菌株β-10-23，β-10-25，β-10-26進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，200r/min。37°C發(fā)酵2天，發(fā)酵液離心，取上清液即為β-葡聚糖酶粗酶液，置于4°C保存，將上述三株菌株所產(chǎn)β-葡聚糖酶在50、60、70、80、90°C條件下保存lOmin、30min、lh后于50°C條件下測(cè)定酶活，結(jié)果表示β_10_25所產(chǎn)的β -葡聚糖酶具有最好的熱穩(wěn)定性，其在60°C保存Ih后仍能保持80%以上的酶活，因此確定β -10-25為實(shí)驗(yàn)菌株。
[0032]所述β -葡聚糖酶的生產(chǎn)方法如下:
[0033](I)種子培養(yǎng)
[0034]將β -10-25斜面菌種經(jīng)三級(jí)搖瓶發(fā)酵及一級(jí)種子罐發(fā)酵；
[0035]所述種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:酵母粉0.5%，蛋白胨1(%，可溶性淀粉1(%，似(:11(%，，ρΗ4.5-7.0,121-123°C滅菌 30_40min。
[0036](2)發(fā)酵罐發(fā)酵`
[0037]將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35-45 °C，攪拌速度200-300r/min，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時(shí)間10_15h ;然后將IL經(jīng)過(guò)121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時(shí)恒溫培養(yǎng)15-20h ;此時(shí)，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)10-15h ;再將IL經(jīng)過(guò)121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時(shí)恒溫培養(yǎng)10-15h ;
[0038]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水1000mL, pH值4.5-7.0,121°C滅菌20min ；
[0039]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0040]稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10_15份；麥冬10_15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為
5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOff功率下超聲萃取0.5~1.5h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；
[0041]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0042]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果膠酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0043]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5。
[0044](3)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、精濾、干燥得β -葡聚糖酶。[0045]經(jīng)上述制備方法得到的β -葡聚糖酶液體酶活力為8000-10000u/ml。
[0046]由菌株β -10-25發(fā)酵獲得的β -葡聚糖酶，酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0047](I)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度為65°C，在50_70°C之間具有較高的酶活。
[0048](2)該酶最適反應(yīng)pH值為5.0，在pH值為4.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定。
[0049](3)酶活性:由本發(fā)明所提供的菌株β-10-25，制備的β-葡聚糖酶酶活力為8000-10000u/ml，相較出發(fā)菌株酶活提高2.5倍。
[0050](4)熱穩(wěn)定性:該酶在60°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C條件下保存IOmin后保持20%以上酶活；該酶在室溫下保存6個(gè)月后酶活損失小于25%，4°C保存12個(gè)月后酶活損失小于20%。
[0051]有益效果:
[0052]1、本發(fā)明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)熱穩(wěn)定性葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌β-10-25，該菌株所產(chǎn)酶具有熱穩(wěn)定性好，儲(chǔ)存活性好，酶活力高的特點(diǎn)。
[0053]2、有該菌株生產(chǎn)所得的葡聚糖酶酶活力高達(dá)8000-10000u/ml，是原始菌株的2.5倍；在50-70°C條件下具有較高酶活，最適反應(yīng)溫度為65°C ;最適反應(yīng)pH值為5.0 ；在室溫下保存6個(gè)月后酶活損失小于25%，4°C保存12個(gè)月后酶活損失小于20%。比現(xiàn)有的β -葡聚糖酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，熱穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性均較高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0055]實(shí)施例1:紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選
[0056](I)菌懸液的制備
[0057]將在平板劃線分離后長(zhǎng)出的β-10單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，37°C培養(yǎng)48h后,取ImL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗漆兩次,并重懸于9mL生理鹽水中。
[0058]所述的種子培養(yǎng)基為:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0059](2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復(fù)合誘變
[0060]將3mL菌懸液置于無(wú)菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射IOOs0將經(jīng)過(guò)照射的菌液經(jīng)KT1-KT5梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對(duì)照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報(bào)紙包好，置37°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)KT1-KT5梯度稀釋后取20mL菌懸液與ImL硫酸二乙酯原液充分混合，并于37°C震蕩處理40min，將處理過(guò)的菌液涂布于氯化鋰平板。
[0061 ] 所述的氯化鋰平板:地 衣多糖0.3%，剛果紅0.1%，蛋白胨1%，(NH) 2S040.4 %，K2HPO40.8 %，CaCl20.2 %，氯化鋰 0.9%,瓊脂 2%。
[0062](3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0063]將上述涂布均勻的平板，置37°C培養(yǎng)48h，在長(zhǎng)出菌落的分離平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值比較大者挑至斜面保存，純化后獲得十株菌β-10-21，β-10-22，β-10-23, β-10-24, β-10-25, β-10-26, β-10-27, β-10-28, β-10-29, β-10-30。
[0064](4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0065]將獲得的十株菌在含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵完成后取發(fā)酵液5000r/min離心IOmin去除菌體，上清液經(jīng)10000MWC0進(jìn)行超濾濃縮，即得粗酶液，采用DNS法分別測(cè)定上述十株菌株的粗酶液的酶活。
[0066]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉5%~15%，豆餅粉4%~10%，(NH) 2S040.4 %,K2HPO40.8%, CaCl20.2%?
[0067]所述的搖瓶培養(yǎng)條件:該菌在含有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量5%(V/V)，100r/min、37°C發(fā)酵培養(yǎng) 72h。
[0068]實(shí)施例2: β -葡聚酶活性的測(cè)定
[0069](I)酶活單位的定義:lmL粗酶液，于5(TC、pH6.0條件下，Imin從濃度為4mg/ml β -葡聚糖溶液終降解出I μ mo I還原糖，即為I個(gè)酶活單位(lU/ml)
[0070](2)酶活力測(cè)定方法:采用DNS法測(cè)定
[0071]①取5支試管，編號(hào)1、2、3、4、5，分別加入0.5ml葡聚糖溶液；
[0072]②向1、2、3號(hào)試管中加`入0.5ml待測(cè)粗酶液，于50°C水浴中反應(yīng)15min ；
[0073]③向4、5號(hào)試管中加入0.5ml待測(cè)粗酶液；
[0074]④向5支試管中各加入3mlDNS試劑,搖勻后沸水浴5min ；
[0075]⑤水浴冷卻后，以4、5號(hào)試管為對(duì)照,測(cè)定1、2、3號(hào)在540nm下的吸光度；
[0076]⑥對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。
[0077]實(shí)施例3:酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定
[0078](I)溫度對(duì)β -葡聚糖酶酶活性的影響
[0079]于40、50、60、70、80、90°C下分別測(cè)定所得β -葡聚糖酶粗酶液的活力，結(jié)果表明該酶在50-70°C之間均具有較高的酶活性，說(shuō)明該酶的溫度適應(yīng)范圍較寬，其最適作用溫度為65°C。(2) β -葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性
[0080]將所得的粗酶液于40、50、60、70、80、90°C下保存10min、30min、Ih后于50°C條件下測(cè)定酶活，結(jié)果表明該酶在60°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C條件下保存IOmin后保持20%以上酶活。
[0081](3) β-葡聚糖酶的保存穩(wěn)定性
[0082]將所得的粗酶液于4°C和室溫條件下保存I天、15天、I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月后于50°C條件下測(cè)定酶活。結(jié)果表明該酶在室溫下保存6個(gè)月后酶活損失小于25%，4°C保存12個(gè)月后酶活損失小于20%。
[0083](4) pH對(duì)酶活性的影響
[0084]在50°C，pH3-9下分別測(cè)該酶酶活，結(jié)果表明該酶在pH4.5-7.0時(shí)酶活性較高，最適pH為6.5。
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)熱穩(wěn)定性β -葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)β -10-25，保藏編號(hào)為 CCTCC NO:Μ2013538。
2.如權(quán)利要求1所述高產(chǎn)熱穩(wěn)定性葡聚糖酶的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis) β-10-25,其特征在于,所述地衣芽孢桿菌β-10-25生產(chǎn)的β -葡聚糖酶酶活力為8000-10000u/ml，在60°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C條件下保存IOmin后保持20%以上酶活；該酶在室溫下保存6個(gè)月后酶活損失小于25%，4°C保存12個(gè)月后酶活損失小于20%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) β -10-25在生產(chǎn)β-葡聚糖酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK103820356SQ201310716849
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李洪兵, 朱永明, 蔣珂, 毛強(qiáng), 王小玲, 周俊 申請(qǐng)人:湖南鴻鷹生物科技有限公司