一種高效制備重組人白細胞介素-33蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于高效制備重組人白細胞介素-33(rhIL33-Fc)蛋白的重組載體、方法、重組畢赤酵母工程菌以及生產的重組蛋白。所述方法包括下述步驟：(1)構建人白細胞介素-33蛋白表達載體，所述表達載體包含表達調控元件，分泌信號肽，人白細胞介素-33和IgG1-Fc融合蛋白的編碼序列；(2)構建和篩選人白細胞介素-33蛋白的畢赤酵母高效表達菌株；(3)優(yōu)化工程菌株的發(fā)酵pH，溫度和碳源；(4)人白細胞介素-33蛋白的分離純化和理化鑒定。通過本發(fā)明的方法可以高效地獲得具有產業(yè)化價值的重組人白細胞介素-33蛋白。
【專利說明】一種高效制備重組人白細胞介素-33蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及用畢赤酵母生產重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)的方法，高效表達rhIL33_Fc的畢赤酵母工程菌及所表達的重組蛋白。
【背景技術】
[0002]白細胞介素-33 (IL-33)是IL-1家族的成員，它與IL-1 β和IL-18類似，在機體的免疫反應中發(fā)揮著重要的作用。IL-33是一個30kDa的蛋白，進化上比較保守，人源的序列與小鼠來源的序列有54%的同源性。正常的IL-33主要表達于內皮細胞和表皮細胞內，它的釋放經常伴隨著機體的損傷或細胞的壞死，因而它也被認為是一種警示蛋白(Alarmin)。IL-33通過與細胞表面的受體ST2結合而招募MyD88，IRAK1/4和TRAF6，進而導致NF- κ B的激活和Th-2促炎癥因子的釋放，如IL-4， IL-5和IL-13等因子。釋放到血液中的IL-33有利于促進機體防御寄生蟲，細菌感染和病毒感染，甚至它還被認為具有保護心肌的功能。
[0003]本發(fā)明前，市場上出售的重組人白細胞介素-33(rhIL_33)主要是用大腸桿菌表達和制備的。眾所周知，在大腸桿菌中重組表達的蛋白容易形成包涵體，進而涉及復雜的變復性過程，且整個系統(tǒng)會產生大量的內毒素等諸多不利因素。因而，用傳統(tǒng)的方法來制備白細胞介素-33(rhIL-33)大大增加了生產成本，且生產技術復雜，生產工藝不穩(wěn)定。同時，當前用大腸桿菌制備的重組人白細胞介素-33(rhIL-33)的分子量約為18kDa，當其被用于動物體內或人體內時極易被腎小球過濾除去，嚴重影響了其潛在的生理功能和作為一個候選藥物的應用前景。特別的，目前還沒有成功地表達制備重組人白細胞介素-33 (rhIL-33)與Fe的融合蛋白(rhIL33-Fc)的報道，也為沒有成功地運用畢赤酵母來表達制備重組人白細胞介素-33(rhIL-33)的報道。
[0004]綜上，當前急需要一種簡便，活性高，產量高和有產業(yè)化應用前景的重組人白細胞介素-33蛋白的制備方法。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供了一種利用畢赤酵母表達和制備重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)的方法，其包括了重組表達質粒的構建、高效表達菌株的篩選、工程菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化和重組人白細胞介素-33蛋白的分離純化。通過以下步驟實現(xiàn)本發(fā)明:(I)構建表達載體，其包含啟動子、終止子、抗生素抗性基因、分泌信號肽和重組人白細胞介素-33 (rhIL33-Fc)的編碼序列；(2)電轉畢赤酵母，利用抗生素濃度梯度來篩選高效表達克?。?3)優(yōu)化工程菌株的發(fā)酵條件；(4)分離純化重組人白細胞介素-33(rhIL33-Fc)蛋白。
[0006]具體的，本發(fā)明涉及以下各項:
[0007]1.一種表達盒，所述表達盒從5’至3’依次包括以下元件:
[0008](I)畢赤酵母啟動子；
[0009](2)信號肽序列；[0010](3)重組人白細胞介素-33與IgGl-Fc融合蛋白(rhIL33_Fc)的序列；
[0011](4)轉錄終止子。
[0012]2.根據(jù)I所述的表達盒，其中所述畢赤酵母啟動子為pGAPZ a -A質粒的GAP啟動子或PPIC9K質粒的AOXl啟動子；所述的信號肽為a-factor序列，其核苷酸序列如SEQID No:1所示；所述rhIL33-Fc的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；所述的轉錄終止子為PPIC9K質粒的AOXl轉錄終止子元件。
[0013]3.一種表達載體,其包含1-2任一項所述的表達盒。
[0014]4.一種畢赤酵母工程菌，其包含3所述的表達載體。
[0015]5.一種重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)，其氨基酸序列如SEQID No:3所
/Jn ο
[0016]6.一種高效制備重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33_Fc)的方法，其包括表達4所述的畢赤酵母工程菌的步驟。
[0017]7.一種提高重組蛋白工程菌株的蛋白表達量的方法，其特征在于以山梨醇和其它碳源的混合碳源作為碳源。
[0018]8.根據(jù)7所述的方法，其中所述其它碳源優(yōu)選葡萄糖和/或甘油。
[0019]9.根據(jù)6所述的方法，其包含7或8所述的提高重組蛋白工程菌株的蛋白表達量的方法步驟，其中山梨醇和其它碳源的混合比例可以適當調節(jié)，優(yōu)選1:1，1:2或I ;3。
[0020]10.6或9所述的方法表達的rhIL33_Fc。
[0021]本發(fā)明人員發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明方法表達和制備的重組人白細胞介素-33(rhIL33-Fc)是一個由共價二硫鍵形成的同源二聚體，二聚體的分子量約為120kDa(10% SDS-PAGE所顯示分子量，非理論分子量)。用糖苷酶F處理純化的重組人白細胞介素-33蛋白，發(fā)現(xiàn)分子量有明顯的減小(見圖_2)，表明本發(fā)明所制備的重組人白細胞介素-33(rhIL33-Fc)具有N-糖基修飾，且質譜結果顯示的糖基化位點如圖3所示。
[0022]另外，本發(fā)明人員發(fā)現(xiàn)，使用葡萄糖溶液和山梨醇溶液的混合液作為工程菌株生長的碳源，能夠非常顯著的提高重組人白細胞介素-33的產量(見圖6)。用葡萄糖和山梨醇的混合碳源來顯著提高以GAP為啟動子的重組蛋白工程菌株的蛋白表達量尚屬首次。
[0023]本發(fā)明方法表達產量高，發(fā)酵液的后期處理和純化方便，具有很好的產業(yè)化前景。
[0024]發(fā)明詳述
[0025]以下對本發(fā)明的技術方案做進一步詳細闡述。應當指出，本發(fā)明的各實施方案可以根據(jù)需要以任何方式組合。
[0026]本發(fā)明的第一個方面提供一種表達盒，其包括畢赤酵母啟動子、信號肽序列、rhIL33-Fc的編碼序列以及轉錄終止子。其中所述啟動子為在畢赤酵母中高效調控目的基因表達的控制序列；所述信號肽為分泌信號肽，即將表達的目的蛋白分泌到細胞外培養(yǎng)基中的信號分子。
[0027]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述啟動子可以是pGAPZ a -A質粒的GAP啟動子或PPIC9K質粒的AOXl啟動子，優(yōu)選為GAP啟動子。 [0028]在另一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用本領域技術人員熟知的各種合適的分泌信號肽，其包括但不限于a-factor、α _淀粉酶、葡糖淀粉酶、血清白蛋白分泌信號肽，優(yōu)選所述分泌信號肽為a-factor序列。[0029]在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述終止子為AOXl轉錄終止子。
[0030]在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述rhIL33_Fc為人白細胞介素33(IL33)與人IgGlFc的重組蛋白的編碼序列，在進一步優(yōu)選的實施方案中，IL33為Serll2-Thr270部分，IgGl-Fc 序列如 SEQ ID No:4 所示。
[0031]在更優(yōu)選的實施方案中，所用的重組人白細胞介素-33(rhIL33_Fc)蛋白的編碼序列是未經密碼子優(yōu)化的序列。
[0032]在最優(yōu)選的實施方案中，所用的重組人白細胞介素-33(rhIL33_Fc)蛋白的編碼序列是經密碼子優(yōu)化的序列。對編碼序列進行優(yōu)化以利于在宿主細胞中表達的方法是本領域技術人員熟知的。
[0033]本發(fā)明的第二個方面提供一種表達載體，所述表達載體包含本發(fā)明第一個方面的表達盒，所述表達載體中還包括用于篩選的抗性基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗性基因為Zeocin抗性基因。
[0034]在一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用本領域人員熟知的各種畢赤酵母質粒，包括但不限于 pPIC9K，pPICZa -A/B/C, pGAPZ-A/B/C 和 pGAPZ a -A/B/C 等。
[0035]本發(fā)明的第三個方面提供一種重組的畢赤酵母工程菌，所述工程菌包含本發(fā)明第一和第二方面的表達盒或表達載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用本領域人員熟知的各種畢赤酵母菌株，其包括但不限于X_33、GS115和KM71等。
[0036]本發(fā)明的第四個方面提供用本發(fā)明第三個方面的畢赤酵母工程菌表達rhIL33_Fc的方法。
[0037]在一個具體的實施方案中，還包括在優(yōu)化培養(yǎng)條件下表達的步驟，所述優(yōu)化培養(yǎng)條件包括對pH，溫度及培養(yǎng)基的優(yōu)化。
[0038]在一個優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)化培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)基pH為7.5,培養(yǎng)溫度為30度，培養(yǎng)基的碳源為山梨醇和其它碳源的混合液。
[0039]在一個更優(yōu)選的實施方案中，其它碳源為葡萄糖或甘油，且混合液的比例可以調
難
iF.0
[0040]在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基的碳源用于提高以GAP為啟動子的重組蛋白工程菌株的蛋白表達量。
[0041]在另一個具體的實施方案中，還包括純化rhIL33_Fc的步驟,包括以下步驟:
[0042](I)離心分離菌體和發(fā)酵液上清，收集離心后的發(fā)酵上清，并進一步過濾發(fā)酵液上清；
[0043](2)用Fe親和的protein A柱(如MabSelect等)從發(fā)酵液上清中分離純化出重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)。
[0044](3)用陰離子交換層析柱(如Q-Sepharose HP, Capto DEAE等)去除殘留的DNA,雜蛋白等，
[0045](4)用分子篩(如S200HR等)去除多聚體蛋白和降解蛋白片段，得到純化的重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)。
[0046]本發(fā)明的第五個方面提供本發(fā)明第四個方面的方法表達的rhIL33_Fc，其不僅限于表達的氨基酸序列，在優(yōu)選的實施方案中，還包括對氨基酸序列的修飾，如糖基化修飾。
[0047] 在本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如【具體實施方式】)具體描述的各技術特征可以互相結合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1 a -factor-rhIL33-Fc/pGAPZ-A 質粒的構建流程圖；
[0049]圖2考馬斯亮藍染色方法檢測糖苷酶F處理的rhIL33_Fc蛋白；
[0050]圖3LC-MS方法檢測到的N-糖基修飾位點；
[0051]圖4高效工程菌株克隆篩選；
[0052]圖5優(yōu)化工程菌株的培養(yǎng)pH條件；
[0053]圖6優(yōu)化工程菌株的培養(yǎng)溫度條件；
[0054]圖7優(yōu)化工程菌株生長的碳源。
【具體實施方式】
[0055]實驗材料
[0056]菌株與質粒
[0057]巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)菌株X-33 和 pGAPZ-A 質粒購自 Invitrogen公司。
[0058]試劑
[0059]Yeast Nitrogen Base (YNB)購自 BD 公司；Yeast Extract 和 Tryptone 購自 OXOID公司；D-Sorbitol (山梨醇)、Biotin (生物素)、DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、蛋白marker和PAGE配置相關試劑購自上海生工；質粒抽提試劑盒、PCR產物回收試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司；Zeocin購自Invitrogen公司；糖苷酶F購自NewEngland Biolabs公司；羊抗人IgG-Fc HRP抗體購自Thermo公司；IL_33ELISA試劑盒購自R&D公司；其他化學試劑購自國藥集團。
[0060]引物
[0061]引物-1:5，CGGAATTCAATTCGAAACG ATGAGATTTCCTTCAATTTT3，(SEQ ID No: 10)
[0062]引物-2:5，AATTCCTGTGATGGATCTTTTCTCGAGAGATACCC3，(SEQ ID No: 11)
[0063]引物-3:5，TCTCTCGAGAAAAGATCCATCACAGGAATTTCACC3，(SEQ ID No: 12)
[0064]引物-4:5，ACAAGATTTGGGCTCAGTTTCAGAGAGCTTAAACA3，(SEQ ID No: 13)
[0065]引物-5:5，AAGCTCTCTGAAACTGAGCCCAAATCTTGTGACAA3，(SEQ ID No: 14)
[0066]引物-6:5，ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGG3，(SEQ ID No: 15)
[0067]下述實施例中其他所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0068]下述實施例中其他所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0069]實施例1
[0070]a -factor-rhIL33-Fc/pGAPZ-A 質粒的構建
[0071 ] 1.擴增 a -factor 序列、IL-33 序列(Ser112_Thr270)和 IgGl-Fc (Glu99_Lys330)的融合片段 α -factor-rhIL33_Fc
[0072] (I)以pPIC9K質粒為模板，用引物-1和引物-2進行PCR，PCR反應條件為:先940C 3分鐘；然后94°C 30秒，55 °C 40秒，72 °C 30秒，共35個循環(huán)；最后72 °C 5分鐘。反應結束后，將得到的PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約300bp的條帶(即a-factor片段)，與預期結果相符。最后，用產物回收試劑盒對PCR片段進行回收。
[0073]以人IL-33的cDNA ORF克隆質粒(購自0RIGENE公司)為模板，用引物_3和引物-4進行PCR，PCR反應條件為:先940C 3分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 30秒，共35個循環(huán)；最后72°C 5分鐘。反應結束后，將得到的PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約500bp的條帶(即rhIL-33片段)，與預期結果相符。最后，用產物回收試劑盒對PCR片段進行回收。
[0074](2)用上述(I)的2條PCR回收產物(即a-factor片段和rhIL_33片段)為模板，用引物-1和引物-4進行PCR(重疊延伸PCR)，PCR反應條件為:先94°C3分鐘；然后94°C30秒，55°C 40秒，72°C I分鐘，共35個循環(huán)；最后72°C 5分鐘。反應結束后，將得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約SOObp的條帶(即a -factor-rhIL33片段)，與預期結果相符。最后，用產物回收試劑盒對PCR片段進行回收，進而獲得了a -factor-rhIL33 片段。
[0075](3)以IGHGl的cDNA克隆質粒(購自0RIGENE公司)為模板，用引物_5和引物-6進行PCR，PCR反應條件為:先940C 3分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C I分鐘，共35個循環(huán)；最后72°C 5分鐘。反應結束后，將得到的PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約700bp的條帶(即IgGl-Fc片段)，與預期結果相符。最后，用產物回收試劑盒對PCR片段進行回收。
[0076](4)用上述(2)和(3)步驟中所得到的a -factor_rhIL33片段和IgGl-Fc片段為模板，用引物-1和引物-6進行PCR(重疊延伸PCR)，PCR反應條件為:先94°C 3分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 2分鐘，共35個循環(huán)；最后72°C 5分鐘。反應結束后，將得到的PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約1500bp的條帶(即a -factor-rhIL33-Fc片段)，與預期結果相符。最后，用產物回收試劑盒對PCR片段進行回收。
[0077]2.a -factor-rhIL33-Fc 片段與 pGAPZ-A 質粒的連接
[0078]用EcoR I 和 Not I 分別雙酶切 a-factor-rhIL33_Fc 片段和 pGAPZ-A 質粒，分別純化回收a -factor-rhIL33-Fc片段和pGAPZ_A質粒，再用T4DNA連接酶連接，并轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5ci，篩選陽性克隆。陽性重組質粒委托英俊公司測序，結果表明a -factor-rhIL33_Fc片段和pGAPZ-A質粒正確連接,且a -factor-rhIL33_Fc序列與預期一致，進而獲得了 a -factor-rhIL33-Fc/pGAPZ-A表達質粒，整個構建流程見圖-1。
[0079]以上所述質粒中ct -factor-1L33_Fc片段的編碼序列如下所不:
[0080](ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAXTCCATCACAGGAATTTCACCTATTACAGAGTATCTTGCTTCTCTAAGCACATACAATGATCAATCCATTACTTTTGCTTTGGAGGATGAAAGTTATGAGATATATGTTGAAGACTTGAAAAAAGATGAAAAGAAAGATAAGGTGTTACTGAGTTACTATGAGTCTCAACACCCCTCAAATGAATCAGGTGACGGTGTTGATGGTAAGATGTTAATGGTAACCCTGAGTCCTACAAAAGACTTCTGGTTGCATGCCAACAACAAGGAACACTCTGTGGAGCTCCATAAGTGTGAAAAACCACTGCCAGACCAGGCCTTCTTTGTCCTTCATAATATGCACTCCAACTGTGTTTCATTTGAATGCAAAACTGATCCTGGAGTGTTTATAGGTGTAAAGGATAATCATCTTGCTCTGATTAAAGTAGACTCTTCTGAGAATTTGTGTACTGAAAATATCTTGTTTAAGCTCTCTGAAACT>[GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA](SEQ ID No:5)
[0081] 其中，()內為信號肽a -factor核苷酸序列(SEQ ID No:1)；<>內為rhIL-33核苷酸序列(SEQ ID No:6)；[]內為IgGl-Fc核苷酸序列(SEQ ID No:4) ?翻譯后的a -factor氨基酸序列(SEQ ID No:7)為:MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLE⑶FDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR ;IL-33 的氨基酸序列(SEQ ID No:8)為:SITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNES⑶GVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET ；IgGl-Fc 的氨基酸序列(SEQ ID No:9)為:EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKo
[0082]實施例2
[0083]a -factor-rhIL33-Fc/pGAPZ-A重組表達質粒電轉化畢赤酵母
[0084]用Avr II線性化a -factor-rhIL33-Fc/pGAPZ_A重組表達質粒，乙醇沉淀回收。取5-10 μ g線性化后的質粒,用0.2cm電轉化杯進行電轉化畢赤酵母菌株X_33 (參數(shù)設定:電壓1500￥、電容25 4?、電阻200歐姆、放電時間4_5ms)，涂板在含有Zeocin抗性的YI3D板(2% Tryptone, I % Yeast Extract, 2% Glucose, 1.5% Agar, 100 μ g/ml Zeocin),放置于28 °C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。
[0085]當Zeocin抗性的YPD板上的單克隆長到直徑l_2mm時,用無菌牙簽挑取部分的單克隆并劃線到含有更高Zeocin濃度的YPD板，以便獲得更高的IL-33表達盒的拷貝數(shù)，Zeocin 的濃度分別為 250 μ g/ml>500 μ g/ml、lmg/ml 和 2mg/ml。當上述 Zeocin 抗性的 YPD板上的單克隆的直徑為l_2mm時，挑取單克隆進行重組人白細胞介素-33蛋白的表達鑒定(具體方法見以下實施例3部分)。
[0086]實施例3
[0087]篩選高效表達重組人白細胞介素-33蛋白的工程菌株
[0088]從含有Zeocin抗性的YH)板上挑取單克隆并接入IOml的YI3D培養(yǎng)基，置于28°C搖床，200rpm搖過夜。次日，當YPD培養(yǎng)物中的菌體0D600達到2_6時，取菌體量相當于0D600=10的培養(yǎng)物，1500g離心并棄上清。將菌體用無菌的雙蒸水重懸，再次1500g離心并棄上清。再用無菌雙蒸水洗一遍菌體，步驟同上。最后，把離心獲得的菌體重懸于IOml的BMGY培養(yǎng)基(2% Tryptone, I % Yeast Extract, 1.34% YNB, 0.1M 憐酸鹽緩沖液，I % Glycerol,pH = 6)，置于28°C的搖床，250rpm,繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
[0089]收取24小時的培養(yǎng)物，其中部分培養(yǎng)物用于0D600檢測，剩下的培養(yǎng)物用于12000g，4°C離心10min，并收集上清用于后續(xù)的ELISA檢測。根據(jù)ELISA測得的重組人白細胞介素-33的濃度與菌體0D600值的比值大小作為判斷高效表達菌株篩選的依據(jù)。如圖4所示，單位菌體產量最高的是4號克隆。因而，用該方法能夠準確的篩選出高效表達克隆。
[0090]實施例4
[0091 ] 優(yōu)化工程菌株的培養(yǎng)條件(pH和溫度)
[0092]pH條件的優(yōu)化步驟如下:從YPD平板上挑取新鮮的單克隆，接種于25ml的YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。次日，取相當于100D600的菌體入IOml的不同pH的BMGY中(pH分別為5，6，7和7.5)，置于30度的搖床中，250rpm，培養(yǎng)12小時。隨后，取部分培養(yǎng)物用于0D600檢測，剩余的培養(yǎng)物12000g，4°C離心10min，并收集上清用于后續(xù)的ELISA檢測。根據(jù)ELISA測得的重組人白細胞介素-33的濃度與菌體0D600值的比值大小作為判斷最佳的pH的依據(jù)。如圖5所示，單位菌體產量最高的發(fā)酵pH條件為pH7.5。
[0093]溫度條件的優(yōu)化步驟如下:從YPD平板上挑取新鮮的單克隆，接種于25ml的YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。次日，取相當于100D600的菌體入IOml的BMGY中(pH7.5)，置于不同溫度的搖床中(溫度分別為20度，25度和30度)，250rpm,培養(yǎng)12小時。隨后，取部分培養(yǎng)物用于0D600檢測，剩余的培養(yǎng)物12000g，4°C離心10min，并收集上清用于后續(xù)的ELISA檢測。根據(jù)ELISA測得的重組人白細胞介素-33的濃度與菌體0D600值的比值大小作為判斷最佳的溫度的依據(jù)。如圖6所示，單位菌體產量最高的發(fā)酵溫度為30度。
[0094]實施例5
[0095]優(yōu)化工程菌株的碳源
[0096]從-80度冰箱中取出一管工程菌株的工作種子，接種于200ml的YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。次日，取相當于2000D600的菌體分別接入200ml的不同碳源的培養(yǎng)基中(共有的培養(yǎng)基成分為2% Tryptone, I % Yeast Extract, 1.34% YNB, 0.1M磷酸鹽緩沖液，但碳源分別為2 %的甘油，2 %的葡萄糖，2 %的山梨醇和I %的葡萄糖+1 %的山梨醇的混合液)，置于250rpm，30 °C的搖床培養(yǎng)24小時后收樣檢測0D600值，并用ELISA檢測蛋白濃度。根據(jù)ELISA測得的重組人白細胞介素-33的蛋白濃度大小作為判斷最佳碳源的依據(jù)。如圖7所示，上清中的人白細胞介素-33蛋白量最高的組是利用葡萄糖和山梨醇的混合碳源。
[0097]實施例6
[0098]重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33_Fc)的搖瓶發(fā)酵和純化
[0099]從-80度冰箱中取出一管工程菌株的工作種子，接種于100mL的YI3D培養(yǎng)基，置于30°C搖床，250rpm培養(yǎng)過夜。次日，將過夜培養(yǎng)物1500g離心棄上清后，用200ml的培養(yǎng)基(I % Yeast Extract, 2% Peptone, 1.34% YNB, 0.1M磷酸鹽緩沖液,2%葡萄糖,2% 山梨醇，pH = 7.5)重懸 菌體，置于30°C搖床，250rpm,繼續(xù)發(fā)酵72小時，其中每隔24小時補充一次葡萄糖和山梨醇的混合碳源(I:1混合)。
[0100]重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33_Fc)的純化步驟如下:(I)發(fā)酵液用于 4 °C 下 12000g 離心 30min,收集發(fā)酵上清。(2)用 Flex Stand system 和 0.45 μ mmicrofiltrationcartridge 將上步的發(fā)酵上清過濾一遍。(3)用)(K26/20column(購自 GEhealthcare 公司)和 MabSelect 膠(購自 GE healthcare 公司)組裝的 MabSelect 柱來分離純化rhIL33-Fc蛋白。(4)用陰離子層析柱進一步提純MabSelect柱洗脫的rhIL33_Fc蛋白，去除殘留的DNA和雜蛋白。(5)用IOkDa的超濾管(購自Millipore公司)濃縮陰離子層析柱洗脫的rhIL33-Fc蛋白。(6)用S200HR的分子篩(購自GE healthcare公司)進一步地去除重組蛋白多聚體和降解片段。(7)用IOkDa的超濾管濃縮S200HR分子篩純化的rhIL33-Fc蛋白，使rhIL33_Fc蛋白的濃度在lmg/ml以上，內毒素含量低于0.1EU/ μ g蛋白。
[0101]實施例7
[0102]重組人白細胞介素-33糖基修飾鑒定 [0103]最終純化的rhIL33-Fc蛋白用糖苷酶F(購自NEB公司)處理后，再用SDS-PAGE鑒定。如圖2所示，添加了 2-ME(巰基乙醇)的樣品的分子量約為50~60kDa左右，而沒有添加2-ME的樣品的分子量約為120~130kDa，表明此方法所表達和制備的rhIL33-Fc蛋白是由二硫鍵鏈接而成的同源二聚體。另外，用糖苷酶F(PNGase F)處理的還原樣品，其帶型變?yōu)榫坏囊粭l帶，且分子量變?yōu)?5kDa左右，接近理論的沒有糖基修飾的分子量，該結果表明，以上方法所制備的重組人白細胞介素-33具有N-糖基修飾。
[0104]將上述PAGE上的糖苷酶F處理后得到的約45kDa的條帶送LC-MS質譜中心，用Trypsin酶解消化制樣后用于LC-MS質譜檢測(Thermo公司)。如果3所示,檢測結果顯示有2個N-糖基修飾位點，分別是Asn60和Asn241。
【權利要求】
1.一種表達盒，所述表達盒從5’至3’依次包括以下元件: (1)畢赤酵母啟動子； (2)信號肽序列； (3)重組人白細胞介素-33與IgGl-Fc融合蛋白(rhIL33-Fc)的序列； (4)轉錄終止子。
2.根據(jù)權利要求1所述的表達盒，其中所述畢赤酵母啟動子為pGAPZa-A質粒的GAP啟動子或PPIC9K質粒的AOXl啟動子；所述的信號肽為a -factor序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示；所述rhIL33-Fc的核苷酸序列如SEQ ID No: 2所示；所述的轉錄終止子為pPIC9K質粒的AOXl轉錄終止子元件。
3.—種表達載體,其包含權利要求1-2任一項所述的表達盒。
4.一種畢赤酵母工程菌，其包含權利要求3所述的表達載體。
5.一種重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)，其氨基酸序列如SEQID No:3所示。
6.一種高效制備重組人白細胞介素-33蛋白(rhIL33-Fc)的方法，其包括表達權利要求4所述的畢 赤酵母工程菌的步驟。
7.一種提高重組蛋白工程菌株的蛋白表達量的方法，其特征在于以山梨醇和其它碳源的混合碳源作為碳源。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述其它碳源優(yōu)選葡萄糖和/或甘油。
9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其包含權利要求7或8所述的提高重組蛋白工程菌株的蛋白表達量的方法步驟，其中山梨醇和其它碳源的混合比例可以適當調節(jié)，優(yōu)選為1:1，1:2 或 I ;3。
10.權利要求6或9所述的方法表達的rhIL33-Fc。
【文檔編號】C12P21/02GK103966253SQ201410239002
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權日:2014年5月30日
【發(fā)明者】肖衛(wèi)華, 鐘永軍, 鄔婧, 方芳, 馬佳佳, 苗玉輝 申請人:中國科學技術大學