專利名稱：可用于生產(chǎn)人重組白細(xì)胞介素－15的原核表達(dá)工程菌及純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩種用于人重組白細(xì)胞介素-15(recombinant humaninterleukin-15，rhIL-15)的原核表達(dá)工程菌及其重組蛋白純化技術(shù)。更具體地，本發(fā)明的工程菌中含有一種全新的重組表達(dá)載體，其中有一全新合成的DNA片斷。本發(fā)明還涉及所述重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)和純化技術(shù)。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素(IL)-15是Grabstein等人于1994年發(fā)現(xiàn)的一種約為12-14kD的細(xì)胞因子，隨著對(duì)其研究的不斷深入，人們對(duì)IL-15的結(jié)構(gòu)、功能等有了更新的認(rèn)識(shí)。與大多數(shù)細(xì)胞因子相似，IL-15可在機(jī)體正常的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，如促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞的發(fā)育等。IL-15還可對(duì)免疫系統(tǒng)外的多種組織和細(xì)胞發(fā)揮廣泛而多效的作用。由于IL-15作用的多樣性，可在天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)中產(chǎn)生交叉的調(diào)節(jié)作用，因而可將其看作天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)間的橋梁。
在IL-15的功能研究中，其抗腫瘤效應(yīng)受到重視。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低劑量的外源性IL-15能在不產(chǎn)生明顯毒性作用的前提下，誘導(dǎo)NK細(xì)胞、NK-T細(xì)胞及CD8+記憶T細(xì)胞的發(fā)育、增殖及活化。比較IL-15與IL-2對(duì)肺腺癌轉(zhuǎn)移模型的療效時(shí)，發(fā)現(xiàn)雖然IL-15體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性殺傷效應(yīng)只有IL-2的1/3，但是它誘導(dǎo)的NK殺傷活性比IL-2誘導(dǎo)的高3-4倍。此外，6倍劑量的IL-15才能引起肺血管滲漏等毒副作用的出現(xiàn)。在大鼠的結(jié)腸癌模型中也發(fā)現(xiàn)，IL-15能顯著降低化療引起的胃腸道毒性，增強(qiáng)藥物的最大耐受劑量，因而推測IL-15可能是治療實(shí)體瘤，尤其是抑制對(duì)IL-2有抗性的廣譜實(shí)體瘤生長的有效候選因子。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供經(jīng)本發(fā)明得到的新的工程菌。具體而言，本發(fā)明所述的工程菌為兩株大腸桿菌。所述的大腸桿菌已于2003年11月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)(CGMCC)為1049或者保藏號(hào)(CGMCC)為1050。
本發(fā)明還提供純化重組人白細(xì)胞介素-15的方法。
為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明涉及一種編碼人白細(xì)胞介素-15的DNA序列，其序列號(hào)為2或者序列號(hào)為4。
本發(fā)明還涉及一種含有所述序列號(hào)為2或者序列號(hào)為4的DNA序列的重組載體，優(yōu)選的是，該載體為質(zhì)粒。
本發(fā)明還涉及含有序列號(hào)為2或者序列號(hào)為4的DNA序列載體的大腸桿菌。
另外，本發(fā)明涉及一種反相層析分離純化重組人白細(xì)胞介素-15的方法，包括如下步驟(A)在反相柱中，使用緩沖液A平衡層析柱至少2個(gè)柱體積，其中所述的緩沖液A是含有0.005％～0.01％三氟乙酸∶0.5～2％乙腈的水溶液；(B)重組人白細(xì)胞介素-15粗品進(jìn)樣；(C)用緩沖液A和緩沖液B以線性流速2.5cm/min梯度洗脫，按目的蛋白吸收峰收集得一目的蛋白收集物，其中緩沖液B是含有三氟乙酸0.005％～0.01％∶乙腈85～95％的水溶液；(D)將目的蛋白收集物凍干得一凍干物；(E)凍干物于4-10℃溶于生理鹽水，離心分離，得純化重組人白細(xì)胞介素-15溶液。
本發(fā)明還涉及另一種層析分離、復(fù)性重組人白細(xì)胞介素-15的方法，包括如下步驟(I)用緩沖液A平衡凝膠過濾層析柱至少2個(gè)柱體積；其中所述的緩沖液A含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，50～100mMβ-巰基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.64～6mM，0～1M尿素，pH8.0；(J)用緩沖液B逐漸增加尿素濃度，在層析柱上端0.6個(gè)柱體內(nèi)形成8M至0～1M尿素的向下遞減梯度，線性流速為0.5-1cm/min，此時(shí)，層析柱下端0.4倍柱床為0～1M的尿素緩沖液，上端0.6倍柱床為8M-0～1M的尿素緩沖液，其中所述的緩沖液B含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，30～80mMβ-巰基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.64～6mM，8M尿素，pH8.0；(K)重組人白細(xì)胞介素-15粗品上樣，體積不超過柱床的5％，濃度不超過10mg/ml；(L)緩沖液B液洗脫0.5個(gè)柱體積，然后換成緩沖液A液洗脫，線性流速均為0.05～0.1cm/min，收集目的蛋白；(M)在DEAE陰離子交換柱中，用緩沖液C平衡層析柱至少2個(gè)柱體積；其中所述的緩沖液C含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mMβ-巰基乙醇，pH6～8.0；(N)上樣步驟D得到的目的蛋白后，用緩沖液C洗滌層析柱至少2個(gè)柱體積；(O)緩沖液D梯度洗脫，按吸收峰收集得重組人白細(xì)胞介素-15收集物，其中所述的緩沖液D含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mMβ-巰基乙醇，1～2M NaCl，pH6.0～8.0，；(P)將步驟G的收集物經(jīng)脫鹽柱脫鹽，得純化的重組人白細(xì)胞介素-15。
由此可見，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了兩種新的工程菌，該工程菌含有編碼人白細(xì)胞介素-15的DNA序列(序列15)或其衍生物(序列28)，也含有與該重組DNA分子有效連接的并能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定高效表達(dá)的重組載體。
本發(fā)明的另一個(gè)方面也提供了兩種誘導(dǎo)該工程菌表達(dá)人白細(xì)胞介素-15的工藝方法，以及兩種純化人白細(xì)胞介素-15的工藝方法。
附序列說明序列1-14表示PCR法拼接全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因DNA序列I時(shí)用到的4對(duì)引物，同時(shí)還列出了3對(duì)在拼接中可能用到的短小引物。引物L(fēng)1s、L2s、L3s、L4s的3’端分別與引物L(fēng)1a、L2a、L3a、L4a的3’端互補(bǔ)配對(duì)，引物L(fēng)2s、L3s、L4s的5’端分別與引物L(fēng)1a、L2a、L3a的5’端互補(bǔ)配對(duì)。小引物用于第二輪和第三輪PCR擴(kuò)增，起輔助引物作用。在第一輪PCR反應(yīng)中，L1s與L1a配對(duì)、L2s與L2a配對(duì)、L3s與L3a配對(duì)、L4s與L4a配對(duì)。第二輪PCR反應(yīng)中，第一輪的PCR產(chǎn)物L(fēng)1與L2配對(duì)、L3與L4配對(duì)。第三輪PCR反應(yīng)中，第二輪的PCR產(chǎn)物L(fēng)1-2與L3-4配對(duì)，即合成全長的人白細(xì)胞介素-15的成熟基因序列。
序列15表示序列1-14的引物通過PCR法拼接得到的全合成的人白細(xì)胞介素-15DNA序列I。
序列16-27表示序列1-14的引物的衍生物(部分堿基不同于圖2)，此引物通過搭橋PCR可以得到序列28所示的人白細(xì)胞介素-15成熟基因DNA序列II。
序列28表示序列16-27的引物通過PCR法拼接得到的全合成的人白細(xì)胞介素-15DNA序列II。
序列29表示由全合成的人白細(xì)胞介素-15DNA序列I或DNA序列II得到的人白細(xì)胞介素-15的氨基酸順序。
序列30表示重組表達(dá)載體pBV220-hIL-15插入目的基因部分的DNA序列測定結(jié)果，表明全合成人白細(xì)胞介素-15成熟基因序列正確、插入載體位置正確。方框內(nèi)即為全合成的人白細(xì)胞介素-15DNA序列I，其兩端為酶切位點(diǎn)和載體pBV220序列。


圖1表示PCR法全合成人白細(xì)胞介素-15成熟基因的原理。這4對(duì)引物可兩兩部分互補(bǔ)配對(duì)，彼此以對(duì)方為模板，在Taq酶作用下合成DNA片斷。同樣，合成的DNA片斷間也可以彼此部分互補(bǔ)配對(duì)合成更長一點(diǎn)的DNA片斷。因此，通過逐步搭橋拼接可以合成出短片斷、次全長和全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因DNA。根據(jù)hIL-15氨基酸序列和大腸桿菌對(duì)密碼子的偏好，設(shè)計(jì)合成4對(duì)寡核苷酸片斷，相鄰兩個(gè)片斷之間重疊約18bp。
圖2表示原核表達(dá)人白細(xì)胞介素-15的表達(dá)載體pBV220-hIL-15的構(gòu)建過程。
圖3表示原核表達(dá)人白細(xì)胞介素-15的表達(dá)載體pET42-hIL-15的構(gòu)建過程。
圖4表示PCR法拼接全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因的新DNA序列1-14或新DNA序列15的不同階段得到的DNA片斷2％瓊脂糖電泳結(jié)果，1和2是第一輪PCR拼接結(jié)果，3和4是第二輪PCR拼接結(jié)果，5和6是第三輪PCR拼接結(jié)果，M為大連寶生物公司的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。
圖5表示構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pBV220-hIL-15雙酶切鑒定陽性，表示人白細(xì)胞介素-15成熟基因插入正確。1為pBV220-hIL-15載體，3和4是沒有插入目的基因的pBV220空載體，M為大連寶生物公司的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。
圖6表示重組表達(dá)載體pBV220-hIL-15插入目的基因部分的測序圖譜。
圖7表示工程菌BL21StarTM(DE3)PlysS/pBV220-hIL-15誘導(dǎo)表達(dá)前后菌體蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果。M為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，1和3為工程菌誘導(dǎo)后的菌體總蛋白，2為工程菌誘導(dǎo)前的菌體總蛋白。箭頭所指為表達(dá)的目的蛋白。
圖8表示目的蛋白占菌體總蛋白的百分含量。16為目的蛋白吸收峰，箭頭所指數(shù)值為目的蛋白表達(dá)量，即15.2％。
圖9表示用人白細(xì)胞介素-15單克隆抗體的Western Blot法檢測目的蛋白質(zhì)在菌體中的存在形式。1和3為包涵體沉淀，2為上清。箭頭所指為表達(dá)的目的蛋白。
圖10表示初步純化的重組蛋白質(zhì)的氨基酸序列測定，初步純化的蛋白質(zhì)N末端6個(gè)氨基酸依次為M-N-W-V-N-V，結(jié)果表明為人白細(xì)胞介素-15。
圖11表示包涵體經(jīng)不同洗滌過程后雜質(zhì)去除情況，1，2為包涵體經(jīng)洗滌液A洗滌后上清；3為2％ TritonX-100洗滌后上清；4，5為2M尿素洗滌后上清；6，7為洗滌后包涵體沉淀；M為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；8為誘導(dǎo)后的菌體蛋白；9為誘導(dǎo)前的菌體蛋白。
圖12表示重組人白細(xì)胞介素-15粗品反相層析分離的洗脫梯度和吸收曲線，箭頭所指的吸收峰即是重組人白細(xì)胞介素-15的吸收峰。
圖13表示重組人白細(xì)胞介素-15粗品反相層析分離各收集峰的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果，5、6、7分別是目的蛋白質(zhì)吸收峰的前、中、后部分，1、2、3和4是目的蛋白質(zhì)吸收峰以外的其他吸收峰，M是低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，8和9為重組人白細(xì)胞介素-15粗品。箭頭所指即為重組人白細(xì)胞介素-15。
圖14表示重組人白細(xì)胞介素-15粗品反相層析分離后收集的目的蛋白質(zhì)凍干后溶解得到的純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果。1為凍干物溶于水后上清，2為凍干物溶于生理鹽水后的上清，4為凍干物溶于水后沉淀，5為凍干物，9和11為重組人白細(xì)胞介素-15粗品，10為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。
圖15表示用光密度法測定純化的重組人白細(xì)胞介素-15的純度，1為雜質(zhì)吸收峰，2為重組人白細(xì)胞介素-15吸收峰，其他為噪音。其中吸收峰#峰面積峰高百分?jǐn)?shù)％1 36.38 4.82 7.92 421.927 78.98892.1圖16表示重組人白細(xì)胞介素-15粗品經(jīng)Amersham Sephacryl S100凝膠過慮層析分離、復(fù)性后收集的各部分的SDS-PAGE結(jié)果。M為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，1至10分別是目的蛋白質(zhì)吸收峰的前、中、后各部分。箭頭所指位置是重組人白細(xì)胞介素-15。
圖17表示經(jīng)Amersham Sephacryl S100凝膠過慮層析分離、復(fù)性后收集的目的蛋白質(zhì)用HiTrap DEAE FF陰離子交換層析純化的人白細(xì)胞介素-15的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果。1為粗品，3和5是HiTrapDEAE FF陰離子交換層析純化蛋白，M為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施方案本發(fā)明的工程菌、誘導(dǎo)表達(dá)方法和純化工藝可以用于生產(chǎn)重組人白細(xì)胞介素-15。
本發(fā)明中，所使用的術(shù)語定義如下術(shù)語“原核表達(dá)”是指轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)載體pBV220-hIL-15質(zhì)粒的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)plysS在高溫誘導(dǎo)下或者轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)載體pET42-hIL-15質(zhì)粒的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)plysS在1.0mmol/l的IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)人白細(xì)胞介素-15的過程。
術(shù)語“工程菌”指轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)載體pBV220-hIL-15質(zhì)粒的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)plysS和轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)載體pET42-hIL-15質(zhì)粒的大腸桿菌BL21StarTM(DE3)plysS。
術(shù)語“重組人白細(xì)胞介素-15(rhIL-15)”指通過基因工程，產(chǎn)自于大腸桿菌的人白細(xì)胞介素-15，它可能比人體中產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-15多一個(gè)氨基酸(即N端第一個(gè)氨基酸——蛋氨酸)，除此之外，氨基酸順序同人體內(nèi)的白細(xì)胞介素-15。
術(shù)語“全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因的新DNA序列I/II”和“全合成人白細(xì)胞介素-15DNA序列I/II”均指編碼人白細(xì)胞介素-15成熟肽的全長DNA序列的衍生物，其表達(dá)的多肽，除N端第一個(gè)氨基酸為蛋氨酸外，氨基酸序列同人白細(xì)胞介素-15。
術(shù)語“表達(dá)和純化工藝”指誘導(dǎo)工程菌表達(dá)并純化重組人白細(xì)胞介素-15的方法、流程。
通過參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因的全合成根據(jù)圖1所示PCR法全合成人白細(xì)胞介素-15成熟基因的原理。4對(duì)引物兩兩部分互補(bǔ)配對(duì)，彼此以對(duì)方為模板，在Taq酶作用下合成DNA片斷。同樣，合成的DNA片斷間也可以彼此部分互補(bǔ)配對(duì)合成更長一點(diǎn)的DNA片斷。因此，通過逐步搭橋拼接可以合成出短片斷、次全長和全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因DNA序列。引物L(fēng)1s、L2s、L3s、L4s的3’端分別與引物L(fēng)1a、L2a、L3a、L4a的3’端互補(bǔ)配對(duì)，引物L(fēng)2s、L3s、L4s的5’端分別與引物L(fēng)1a、L2a、L3a的5’端互補(bǔ)配對(duì)。小引物用于第二輪和第三輪PCR擴(kuò)增，起輔助引物作用。在第一輪PCR反應(yīng)中，L1s與L1a配對(duì)、L2s與L2a配對(duì)、L3s與L3a配對(duì)、L4s與L4a配對(duì)。第二輪PCR反應(yīng)中，第一輪的PCR產(chǎn)物L(fēng)1與L2配對(duì)、L3與L4配對(duì)。第三輪PCR反應(yīng)中，第二輪的PCR產(chǎn)物L(fēng)1-2與L3-4配對(duì)，即合成全長的人白細(xì)胞介素-15的成熟基因序列。
實(shí)施例2重組表達(dá)載體的構(gòu)建重組表達(dá)載體的構(gòu)建技術(shù)路線如圖7和圖8所示。首先通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)搭橋拼接出全長的人白細(xì)胞介素-15成熟基因，并在其3’和5’端加上酶切位點(diǎn)，引物如圖2和圖4所示。使用pBV220構(gòu)建重組表達(dá)載體的，在rhIL-15的3’和5’端分別加上PstI和EcoRI的酶切位點(diǎn)，即CTGCAG和GAATTC。使用pET42a構(gòu)建重組表達(dá)載體的，在rhIL-15的3’和5’端分別加上XhoI和NdeI的酶切位點(diǎn)，即CTCGAG和CATATG。將此帶有酶切位點(diǎn)的全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因裝入pGEM-T質(zhì)粒后測序，將帶有全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因的pGEM-T質(zhì)粒以PstI和EcoRI雙酶切，或者以XhoI和NdeI雙酶切?；厥蘸L人白細(xì)胞介素-15成熟基因的DNA片段，同時(shí)，將pBV220質(zhì)粒以PstI和EcoRI雙酶切，或者pET42a質(zhì)粒以XhoI和NdeI雙酶切，回收大片段。將酶切后的pBV220載體片段或pET42a載體片段與含全長人白細(xì)胞介素-15成熟基因的DNA片段連接成pBV220-hIL-15質(zhì)粒和pET42-hIL-15質(zhì)粒。然后，進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、小量提取純化質(zhì)粒DNA。
實(shí)施例3工程菌BL21StarTM(DE3)plysS/pBV220-hIL-15和BL21StarTM(DE3)plysS/pET42-hIL-15的獲得、篩選及其鑒定步驟1.篩選穩(wěn)定高效表達(dá)的工程菌(1)將上述實(shí)施例2獲得的pBV220-hIL-15質(zhì)粒和pET42-hIL-15質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21StarTM(DE3)plysS，即本發(fā)明的工程菌；(2)在固體LB瓊脂培養(yǎng)基平板中挑取單克隆菌落BL21StarTM(DE3)plysS/pBV220-hIL-15于4ml LB液體培養(yǎng)基中28℃，250轉(zhuǎn)/分，搖菌過夜；(3)以1∶100的比例接種于4mlLB培養(yǎng)基，28℃，250轉(zhuǎn)/分，搖菌至OD600值為0.4-0.6時(shí)，迅速升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)搖菌4-5小時(shí)，回收菌體。
(4)至于工程菌BL21StarTM(DE3)plysS/pET42-hIL-15也一樣，只是培養(yǎng)條件換成常規(guī)的37℃，誘導(dǎo)條件改為OD600值為0.4-0.6時(shí)往培養(yǎng)基中加入終濃度為1mmol/l的IPTG。
(5)離心收集菌體，用緩沖液A(Buffer A50mM Tris，5Mm EDTA，150Mm NaCl，pH8.0)洗滌一次，然后重懸于1×上樣緩沖液，95℃煮5分鐘，即可上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯蘭染色，對(duì)照誘導(dǎo)前、后菌體蛋白質(zhì)的變化，篩選出目的蛋白表達(dá)量最高的菌株保存作種子菌。
步驟2.目的蛋白的Western-Blot鑒定誘導(dǎo)前后的菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用抗人白細(xì)胞介素-15的單克隆抗體Western Blot法鑒定目的蛋白就是重組人白細(xì)胞介素-15。
實(shí)施例4目的蛋白的大量制備和初步純化(1)保存的種子菌BL21StarTM(DE3)plysS/pBV220-hIL-15按1∶1000的比例接種于100ml LB培養(yǎng)基，28℃，250轉(zhuǎn)/分，搖菌8小時(shí)；(2)菌液再按1∶100的比例接種于大瓶LB培養(yǎng)基，28℃，200轉(zhuǎn)/分，搖菌至OD600值為0.4-0.6(需2.5-3小時(shí))，迅速升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)搖菌4-5小時(shí)，回收菌體。
(3)工程菌BL21StarTM(DE3)plysS/pET42-hIL-15誘導(dǎo)方法一樣，只是培養(yǎng)條件換成常規(guī)的37℃，誘導(dǎo)條件改為OD600值為0.4-0.6時(shí)往培養(yǎng)基中加入終濃度為1mmol/l的IPTG。
(4)離心收集菌體；Buffer A(50mM Tris，5mM EDTA，150mM NaCl，pH8.0)洗滌2遍；冰浴下超聲破碎菌體(360瓦，工作10秒，停30秒，80個(gè)循環(huán))；離心分離沉淀；沉淀依次經(jīng)含2％TritonX-100的Buffer B和含2M尿素的Buffer C洗滌。洗滌后，沉淀溶于6M鹽酸胍，即得重組人白細(xì)胞介素-15粗品。
實(shí)施例5反相層析分離純化重組人白細(xì)胞介素-15反相柱RPC Resource15純化重組人白細(xì)胞介素-15。
(1)Buffer A(三氟乙酸∶乙腈∶水＝0.065％∶2％∶97.35％)平衡層析柱5個(gè)柱體積(column volume，CV)；(2)重組人白細(xì)胞介素-15粗品進(jìn)樣；(3)用Buffer A和Buffer B(三氟乙酸∶乙腈∶水＝0.1％∶90％∶9.9％)以線性流速2.5cm/min分段梯度洗脫，洗脫梯度為0％B 2CV40％ B 5CV 40-50％B 8CV 50-65％B 1CV 65％B5CV 100％B 5CV，按目的蛋白吸收峰收集。
(4)收集物凍干；(5)凍干物于4-10℃溶于生理鹽水，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘即得純化重組人白細(xì)胞介素-15溶液。
溶解的目的蛋白經(jīng)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)證明為具有生物活性的重組人白細(xì)胞介素-15。
實(shí)施例6反相層析分離純化重組人白細(xì)胞介素-15反相柱RPC Resource15純化重組人白細(xì)胞介素-15。
(A)用Buffer A(0.005％三氟乙酸∶0.5％乙腈)的水溶液平衡層析柱5個(gè)柱體積(column volume，CV)；(B)重組人白細(xì)胞介素-15粗品進(jìn)樣；(C)用Buffer A和Buffer B(0.005％三氟乙酸∶85％乙腈的水溶液)以線性流速2.5cm/min分段梯度洗脫，洗脫梯度為0％B 2CV40％ B 5CV 40-50％B 8CV 50-65％B 1CV 65％B5CV 100％B 5CV，按目的蛋白吸收峰收集；(D)收集物凍干；(E)凍干物于4-10℃溶于生理鹽水，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘即得純化重組人白細(xì)胞介素-15溶液。
溶解的目的蛋白經(jīng)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)證明為具有生物活性的重組人白細(xì)胞介素-15。
實(shí)施例7重復(fù)實(shí)施例6的方法步驟，不同的是緩沖液A為含有0.01％三氟乙酸∶2％乙腈的水溶液，而緩沖液B為是含有0.01％三氟乙酸∶95％乙腈的水溶液。
實(shí)施例8用Amersham Sephacryl S100(16×100)分子篩凝膠過慮層析分離、復(fù)性重組人白細(xì)胞介素-15(1)復(fù)性緩沖液A(Buffer A50mM Tris，1 mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，50mM Glycine，GSSG-GSH 0.55mM，0.4M尿素，pH8.0)平衡凝膠過濾層析柱2個(gè)柱體積；(2)用B液(50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，50mMGlycine，GSSG-GSH 0.55mM，8M尿素，pH8.0)逐漸增加尿素的濃度，在層析柱上端0.6個(gè)柱體內(nèi)形成8M至0.4M尿素的向下遞減梯度，線性流速為0.5-1cm/min，此時(shí)，層析柱下端0.4倍柱床為0.4M的尿素緩沖液，上端0.6倍柱床為8M-0.4M的尿素緩沖液；(3)上樣(體積不超過柱床的5％，濃度不超過10mg/ml)；(4)B液洗脫0.5個(gè)柱體積，然后換成A液洗脫，得一目的蛋白收集物。
由于尿素梯度較重組蛋白向下移動(dòng)的慢，所以隨著洗脫進(jìn)行，重組蛋白逐漸流經(jīng)尿素梯度遞減的洗脫液而逐漸復(fù)性，此過程中線性流速為0.05～0.1cm/min，不宜過快，否則蛋白易析出。按吸收峰收集重組人白細(xì)胞介素-15，進(jìn)行離子交換層析分離。
實(shí)施例9用DEAE陰離子交換柱層析分離分子篩分離得到的重組蛋白
(2)用緩沖液C液(Buffer A50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，pH8.0)平衡層析柱2個(gè)柱體積；(3)采用實(shí)施例8得到的目的蛋白收集物上樣后用A液洗滌層析柱2個(gè)柱體積；(4)緩沖液D液(50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，1MNaCl，pH8.0)梯度洗脫，按吸收峰收集重組人白細(xì)胞介素-15；(5)收集物經(jīng)脫鹽柱脫鹽即得純化的重組人白細(xì)胞介素-15。
實(shí)施例10重復(fù)實(shí)施例8的步驟，不同的是采用的緩沖液A為含有20mMTris，1mM EDTA，50mMβ-巰基乙醇，30mM Glycine，GSSG-GSH 0.44mM，pH8.0。而緩沖液B為其中所述的緩沖液B含有20mM Tris，1mM EDTA，30mMβ-巰基乙醇，30mM Glycine，GSSG-GSH 0.44mM，8M尿素，pH8.0。
實(shí)施例11重復(fù)實(shí)施例8的步驟，不同的是采用的緩沖液A含有100mM Tris，5mM EDTA，100mMβ-巰基乙醇，80mM Glycine，GSSG-GSH 0.66mM，1M尿素，pH8.0；而緩沖液B含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巰基乙醇，80mM Glycine，GSSG-GSH 0.66mM，8M尿素，pH8.0。
實(shí)施例12重復(fù)實(shí)施例9的步驟，不同的是采用的緩沖液C含有20mM Tris，1mM EDTA，20mMβ-巰基乙醇，pH6.0；而緩沖液D含有20mM Tris，1mM EDTA，20mMβ-巰基乙醇，1M NaCl，pH6.0。
實(shí)施例13重復(fù)實(shí)施例9的步驟，不同的是采用的緩沖液C含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巰基乙醇，pH8.0；緩沖液D含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巰基乙醇，2M NaCl，pH8.0。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>可用于生產(chǎn)人重組白細(xì)胞介素-15的原核表達(dá)工程菌及純化方法<130>
<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>66<212>DNA<213>EcoRI<400>1gaattcatga actgggttaa cgtaatctct gacttgaaaa aaatcgaaga cctgatccag 60tctatg66<210>2<211>59<212>DNA<213>EcoRI<400>2cgggtgaacg tcgctttcgg tgtacagagt agcgtcgatg tgcatagact gatcaggtc 59<210>3<211>60<212>DNA<213>EcoRI<400>3gaaagcgacg ttcacccgtc ttgcaaagta accgctatga agtgcttcct cctggagctc 60<210>4<211>59<212>DNA
<213>EcoRI<400>4gtcgtggata gaagcgtcac cggactcaag agagataacc tggagctcca gaggaagca 59<210>5<211>60<212>DNA<213>EcoRI<400>5gacgcttcta tccacgacac cgtagaaaac ctgatcatcc tggctaacaa ctctttgtct 60<210>6<211>59<212>DNA<213>EcoRI<400>6ctcgcattct ttgcaaccag attcggttac gttcccgtta gaagacaaag gttgttagc 59<210>7<211>60<212>DNA<213>EcoRI<400>7ggttgcaaag aatgcgagga actggaggaa aaaaacatca aagagttctt gcagagcttc 60<210>8<211>63<212>DNA<213>EcoRI<400>8ctgcagctat taagaagtgt tgatgaacat ctgaacgatg tgtacgaagc tctgcaagaa 60ctc 63
<210>9<211>24<212>DNA<213>EcoRI<400>9gaattcatga actgggttaa cgta24<210>10<211>18<212>DNA<213>EcoRI<400>10gtcgtggata gaagcgtc 18<210>11<211>18<212>DNA<213>EcoRI<400>11gacgcttcta tccacgac 18<210>12<211>24<212>DNA<213>PstI<400>12ctgcagctat taagaagtgt tgat24<210>13<211>21<212>DNA<213>NdeI<400>13catatgaact gggttaacgt a 21
<210>14<211>24<212>DNA<213>XhoI<400>14ctcgagctat taagaagtgt tgat24<210>15<211>351<212>DNA<213>EcoRI<400>15atgaactggg ttaacgtaat ctctgacttg aaaaaaatcg aagacctgat ccagtctatg 60cacatcgacg ctactctgta caccgaaagc gacgttcacc cgtcttgcaa agtaaccgct120atgaagtgct tcctcctgga gctccaggtt atctctcttg agtccggtga cgcttctatc180cacgacaccg tagaaaacct gatcatcctg gctaacaact ctttgtcttc taacgggaac240gtaaccgaat ctggttgcaa agaatgcgag gaactggagg aaaaaaacat caaagagttc300ttgcagagct tcgtacacat cgttcagatg ttcatcaaca cttcttaata g 351<210>16<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>16atgaactggg ttaacgtaat ctctgacctg aaaaaaatcg aagacctgat ccagtctat 59<210>17<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>17
tgaacgtcag attcggtgta cagagtagcg tcgatgtgca tagactggat caggtcttc 59<210>18<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>18caccgaatct gacgttcacc cgtcttgcaa agttactgct atgaaatgtt tcctgctgg 59<210>19<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>19ggatagaagc gtcacctgac tccagagaga taacctggag ttccagcagg aaacatttc 59<210>20<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>20tctatccacg acaccgttga aaacctgatc atcctggcta acaactctct gtcatctaa 59<210>21<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>21tcctcacatt ctttgcaacc tgattcagta acgttaccgt tagatgacag agagttgtt 59<210>22<211>59<212>DNA<213>人工合成
<400>22ggttgcaaag aatgtgagga actggaagaa aaaaacatca aagagttcct ccagtcttt 59<210>23<211>59<212>DNA<213>人工合成<400>23ctattaagag gtgttgatga acatctgaac gatgtgaacg aaagactgga ggaactctt 59<210>24<211>24<212>DNA<213>EcoRI<400>24gaattcatga actgggttaa cgta24<210>25<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>25tgtcgtggat agaagcgtca c 21<210>26<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>26gacgcttcta tccacgacac c 21<210>27<211>26<212>DNA<213>PstI
<400>27ctgcagctat taagaggtgt tgatga 26<210>28<211>351<212>DNA<213>EcoRI<400>28atgaactggg ttaacgtaat ctctgacctg aaaaaaatcg aagacctgat ccagtctatg 60cacatcgacg ctactctgta caccgaatct gacgttcacc cgtcttgcaa agttactgct120atgaaatgtt tcctgctgga actccaggtt atctctctgg agtcaggtga cgcttctatc180cacgacaccg ttgaaaacct gatcatcctg gctaacaact ctctgtcatc taacggtaac240gttactgaat caggttgcaa agaatgtgag gaactggaag aaaaaaacat caaagagttc300ctccagtctt tcgttcacat cgttcagatg ttcatcaaca cctcttaata g 351<210>29<211>115<212>PRT<213>EcoRI<400>29Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu1 5 10 15Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val20 25 30His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu35 40 45Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn65 70 75 80Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn85 90 95Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile100 105 110Asn Thr Ser115<210>30<211>580<212>DNA<213>EcoRI<400>30gtgtgtgatg atacgaaacg aagcattggt taaaaattaa ggaggaattc atgaactggg 60ttaacgtaat ctctgacttg aaaaaaatcg aagacctgat ccagtctatg cacatcgacg120ctactctgta caccgaaagc gacgttcacc cgtcttgcaa agtaaccgct atgaagtgct180tcctcctgga gctccaggtt atctctcttg agtccggtga cgcttctatc cacgacaccg240tagaaaacct gatcatcctg gctaacaact ctttgtcttc taacgggaac gtaaccgaat300ctggttgcaa agaatgcgag gaactggagg aaaaaaacat caaagagttc ttgcagagct360tcgtacacat cgttcagatg ttcatcaaca cttcttaata gctgcagcca agcttggctg420ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg480tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc540gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg 580
權(quán)利要求
1.一種編碼人白細(xì)胞介素-15的，其序列號(hào)為2或者序列號(hào)為4的DNA序列。
2.一種含有如權(quán)利要求1所述DNA序列的重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于載體是質(zhì)粒。
4.含有如權(quán)利要求1所述的DNA序列的大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大腸桿菌，其特征在于所述的大腸桿菌已于2003年11月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)(CGMCC)為1049或者保藏號(hào)為1050。
6.一種反相層析分離純化重組人白細(xì)胞介素-15的方法，包括如下步驟a)在反相柱中，使用緩沖液A平衡層析至少2個(gè)柱體積，其中所述的緩沖液A是含有三氟乙酸0.005％～0.01％乙腈0.5～2％的水溶液，b)重組人白細(xì)胞介素-15粗品進(jìn)樣；c)用緩沖液A和緩沖液B以線性流速2.5cm/min梯度洗脫，按目的蛋白吸收峰收集得一目的蛋白收集物，其中緩沖液B是含有三氟乙酸0.005％～0.01％乙腈85～95％的水溶液；d)將目的蛋白收集物凍干得一凍干物；e)將凍干物于4-10℃溶于生理鹽水，離心分離，得純化重組人白細(xì)胞介素-15溶液。
7.一種層析分離、復(fù)性重組人白細(xì)胞介素-15的方法，包括如下步驟(A)用緩沖液A平衡凝膠過濾層析柱至少2個(gè)柱體積；其中所述的緩沖液A含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，50～100mM β-巰基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.6∶4～6mM，0～1M尿素，pH8.0；(B)用緩沖液B逐漸增加尿素的濃度，在層析柱上端0.6個(gè)柱體內(nèi)形成8M至0～1M尿素的向下遞減梯度，線性流速為0.5-1cm/min，此時(shí)，層析柱下端0.4倍柱床為0～1M的尿素緩沖液，上端0.6倍柱床為8M-0～1M的尿素緩沖液，其中所述的緩沖液B含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，30～80mMβ-巰基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.6∶4～6mM，8M尿素，pH8.0；(C)重組人白細(xì)胞介素-15粗品上樣，體積不超過柱床的5％，濃度不超過10mg/ml；(D)緩沖液B液洗脫0.5個(gè)柱體積，然后換成緩沖液A液洗脫，洗脫的線性流速均為0.05～0.1cm/min，收集目的蛋白；(E)在DEAE陰離子交換柱中，用緩沖液C平衡層析柱至少2個(gè)柱體積；其中所述的緩沖液C含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mM β-巰基乙醇，pH6～8.0；(F)上樣步驟D得到的目的蛋白后，用緩沖液C洗滌層析柱至少2個(gè)柱體積；(G)緩沖液D梯度洗脫，按吸收峰收集得重組人白細(xì)胞介素-15收集物，其中所述的緩沖液D含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mM β-巰基乙醇，1～2M NaCl，pH6.0～8.0，；(H)將步驟G的收集物經(jīng)脫鹽柱脫鹽，得純化的重組人白細(xì)胞介素-15。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于大規(guī)模生產(chǎn)人重組白細(xì)胞介素－15(recombinant human interleukin－15，rhIL－15)的原核系統(tǒng)表達(dá)及純化技術(shù)。更具體地，本發(fā)明的技術(shù)包含一種工程菌和一項(xiàng)全新的表達(dá)、純化工藝。該工程菌中含有一種全新的重組表達(dá)載體，其中有一全新合成的DNA片斷。
文檔編號(hào)C07K1/20GK1621524SQ20031011519
公開日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者唐峰, 何維 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所