專利名稱：白細(xì)胞介素－11的衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物。
白細(xì)胞介素11(Interleukin11，簡(jiǎn)稱IL-11)是人體內(nèi)分泌的一類重要細(xì)胞因子，它作用于骨髓細(xì)胞中原始的造血干細(xì)胞，促進(jìn)巨核細(xì)胞成熟，增加血小板數(shù)目，促進(jìn)血小板再生。重組白細(xì)胞介素11于1997年11月由美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，成為治療癌癥病人經(jīng)放、化療后血小板數(shù)降低的唯一藥物。
目前，用基因工程方法生產(chǎn)IL-11是唯一有效的途徑。但重組野生型IL-11在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)遇到很大的困難，即游離的完整的IL-11不能直接在大腸桿菌中表達(dá)。這是因?yàn)橥暾腎L-11cDNA5’端GC含量特別豐富，尤其是前8個(gè)氨基酸中有6個(gè)脯氨酸，嚴(yán)重地阻礙了完整的IL-11直接表達(dá)。為了表達(dá)IL-11，只能用隔合蛋白的表達(dá)方法。這樣一來(lái)又造成了融合蛋白需要酶切的困難，產(chǎn)生了諸如切割用專一蛋白酶價(jià)格昂貴及異源蛋白污染等問(wèn)題。
本發(fā)明的目的是用基因工程中最常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)直接表達(dá)游離的IL-11。在保證IL-11的生物學(xué)活性不變的前提下，發(fā)明出具有表達(dá)量高、純化工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉的新型重組白細(xì)胞介素11及其制備方法。
本發(fā)明的原理我們?cè)囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)，在野生型IL-11cDNA5’端缺失一部分氨基酸，從而降低GC含量和脯氨酸數(shù)目，可以提高IL-11的表達(dá)。當(dāng)IL-11N端缺的氨基酸數(shù)目從1個(gè)增加至8個(gè)時(shí)，游離IL-11的表達(dá)量從無(wú)到有并且逐步增加，而表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性與野生型IL-11相比則基本不變。同樣，若以蘇氨酸和蛋氨酸取代IL-11前8個(gè)氨基酸中的脯氨酸或甘氨酸，表達(dá)效果與缺失氨基酸相同。這樣，便可通過(guò)缺失N端幾個(gè)氨基酸或用蘇氨酸取代脯氨酸和甘氨酸來(lái)達(dá)到在大腸桿菌中直接表達(dá)游離的IL-11。
經(jīng)上述改造轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)用菌種，在發(fā)酵表達(dá)結(jié)束后，經(jīng)收菌--菌體破碎--固液分離--分子篩層析--離子交換層析等純化步驟，即可制得純度大于95％，比活性達(dá)到8×106IU/mg的具有相同于野生型IL-11生物活性的新型重組白細(xì)胞介素11。
最佳實(shí)施例在構(gòu)建新型重組IL-11的克隆過(guò)程中，其N端比野生型的IL-11缺失前5個(gè)氨基酸(Pro-Gly-Pro-Pro-Pro)，且第6-8個(gè)氨基酸換成Met-Thr-Thr，其余的氨基酸序列與野生型的IL-11相同。上述改造的IL-11cDNA放在表達(dá)載體PBV220中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，用溫控誘導(dǎo)的方式可以直接表達(dá)產(chǎn)生游離的IL-11，表達(dá)水平達(dá)20％。游離表達(dá)的IL-11是以可溶狀態(tài)存在于大腸桿菌的細(xì)胞漿中，且具天然活性，這一優(yōu)勢(shì)可以免去包涵體形式的蛋白所需的變性、復(fù)性及異構(gòu)體分離等問(wèn)題，從而大大簡(jiǎn)化了純化工藝及降低了IL-11的生產(chǎn)成本。
表達(dá)和制備方法如下在菌種平板上挑取一單菌落，接種于2mlLBA培養(yǎng)基中(LBA每升含10g蛋白胨，5g酵母膏，5gNaCl，60mg氨芐青霉素，PH7.0)30℃培養(yǎng)過(guò)夜作為種子，按1％的接種量接種于50mlLBA中，30℃生長(zhǎng)至0D600=0.5時(shí)，迅速升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，離心收獲菌體。將菌體懸浮在50mMPB(Na2HPO4+NaH2PO4，PH8.0)緩沖液中，超聲破碎菌體，20000g×20分鐘離心，取上清。上清過(guò)分子篩SephacrylS-200凝膠層析純化，上樣量為柱體積的1-5％，20mMPB、PH8.0緩沖液洗脫，收集IL-11富集峰。再用陽(yáng)離子交換柱CM-Sepharose進(jìn)一步純化，用0-1MNaCl、20mMPB、PH8.0線性梯度洗脫，在0.25MNaCl左右濃度處洗下IL-11活性峰。SDS-PAGE電泳分析表明，得到的IL-11純度大于95％，比活性達(dá)8×106IU/mg。通過(guò)上述方法，可以得到高純度、高比活性的新型重組IL-11。
本發(fā)明提供了一種新的表達(dá)和制備IL-11的方法，與世界上唯一生產(chǎn)IL-11的美國(guó)Genetics Institute生產(chǎn)工藝相比具有如下特點(diǎn)①表達(dá)水平高，本發(fā)明的游離IL-11表達(dá)水平達(dá)20％，而G·I·公司的IL-11表達(dá)水平只相當(dāng)于5％；②不需要切割用專一蛋白酶，而G·I·公司的工藝需用價(jià)格昂貴的enterokinase來(lái)切割融合蛋白；③極少的異源蛋白污染，而G·I·公司的工藝中存在著融合蛋白前導(dǎo)肽和加入eterokinase的異源蛋白污染問(wèn)題；④生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單且成本低廉。上述優(yōu)勢(shì)使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性和工藝先進(jìn)性，使之更適合于工業(yè)化生產(chǎn)且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
權(quán)利要求
1．白細(xì)胞介素-11的衍生物，其特征在于該IL-11的cDNA在野生型的IL-11 cDNA的N端缺失1-8個(gè)氨基酸或N端1-8個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代。
2．白細(xì)胞介素-11的衍生物的制備工藝，其特征在于經(jīng)大腸桿菌發(fā)酵--溫度誘導(dǎo)表達(dá)--收菌--菌體破碎--固液分離--分子篩層析--離子交換層析等步驟完成。
3．如權(quán)利要求2所述的固液分離，其特征在于用離心方法分離，工藝參數(shù)為15000g～25000g，離心時(shí)間是10～30分鐘。
4．如權(quán)利要求2所述的分子篩層析，其特征在于采用S-100或S-200、S-300 Sephacryl凝膠柱層析，上樣量為柱體積的1-5％，洗脫緩沖液是10～30mMPB(PBNa2HPO4+NaH2PO4、PH6～9)。
5．如權(quán)利要求2所述的離子交換層析，其特征在于采用CM-Sepharose陽(yáng)離子交換柱，洗脫條件是0-1MNaCl，PH7～10，線性梯度洗脫，最佳洗脫濃度是NaCl200～300mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組白細(xì)胞介素11及其制備方法,該IL－11的cDNA是在野生型IL－11的cDNA的N端缺失1—8個(gè)氨基酸或N端1—8個(gè)氨基酸被其它氨基酸取代。改造后的cDNA放在表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后能直接表達(dá)產(chǎn)生游離的IL－11,與野生型IL－11具有相同的生物學(xué)活性。經(jīng)收菌—菌體破碎—固液分離—分子篩層析—離子交換層析等步驟,可制得高純度、高比活的新型重組IL－11用于治療血小板數(shù)低的病人。本發(fā)明的特點(diǎn)是:①直接表達(dá)游離IL－11,表達(dá)水平達(dá)20%以上;②純化工藝簡(jiǎn)單;③極少的異源蛋白污染;④生產(chǎn)成本低廉。
文檔編號(hào)C07K14/55GK1280983SQ9911232
公開日2001年1月24日 申請(qǐng)日期1999年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月16日
發(fā)明者王革, 鄒明富 申請(qǐng)人:王革, 鄒明富