專利名稱:人白細胞介素11的改造和制備的制作方法
已經證明和發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)中起調節(jié)作用的蛋白質有數(shù)十種,它們統(tǒng)稱為細胞因子,如集落刺激因子、白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子等。這些細胞因子具有廣泛的生物功能和廣泛的靶細胞,包括骨髓細胞、外周血細胞、胎肝細胞、淋巴細胞等。由于細胞因子的自然來源十分有限,應用基因工程手段進行基因克隆、重組表達和高效的純化,是目前眾多細胞因子在基礎研究和臨床應用上重要手段。
人白細胞介素11(interleukin 11,IL-11)是具有多種生物功能的蛋白。主要證實的作用有刺激巨核細胞增生,促進B細胞的發(fā)育和功能,保護粘膜細胞受損,增加血小板數(shù)量。天然成熟人白介素11由178個氨基酸組成,分子量為20kD,是強堿性蛋白(pI11.7),疏水性較強。人IL-11基因全長1100對堿基,其中5’端有72個堿基非編碼區(qū),3’端有431個堿基非編碼區(qū)。閱讀框架為597個堿基,翻譯表達為199個氨基酸組成的人白介素11蛋白,其中N末端1-21個氨基酸是信號肽序列,故天然活性的人白介素11N末端為Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Ala Ser ProAsp等。猿和鼠的白介素11基因已被克隆和重組表達成功。人和猿的白介素11在氨基酸和堿基序列方面有極高的同序性,其中氨基酸序列同源性93.7%,堿基序列同源性99.5%。
重組人白細胞介素11已經在原核細胞(大腸桿菌)和真核細胞(COS細胞)表達成功。由于IL-11的特殊性,在大腸桿菌中表達十分困難。美國Genetics Institute公司采用融合蛋白表達系統(tǒng)pTRXFUS來表達人IL-11獲得成功,其融合蛋白為還原型硫氧蛋白(Thioredoxin)。此系統(tǒng)有幾個特點十分有利于人IL-11的表達(1)Thioredoxin的pI為4.5,中間接頭區(qū)有四個天冬氨酸,可以中和IL-11的強堿性;(2)Thioredoxin是一種伴侶蛋白,可以幫助IL-11的復性;(3)酶切下的重組IL-11與天然成熟的IL-11僅在N-末端缺失一個脯氨酸;(4)缺失脯氨酸的人白介素11在體內外證明與天然IL-11有相同的生物功能。用本方法的最大缺點是蛋白酶切位點是腸激酶(enterokinase),此酶的成本高,酶切效率不如凝血酶。本專利為了引進凝血酶作為融合表達蛋白的蛋白酶切點,構建了新型的人白介素11。凝血酶特異蛋白識別位點是Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser,切點在Arg和Gly之間。分析人和猿的IL-11的N末端35個氨基酸序列中僅有三個差異(
圖1),其中6-10位氨基酸序列的差異猿為Gly Ser Pro ArgAla,人為Gly Pro Pro Arg Val。
猿的白介素11在N末端第6和7位氨基酸序列正好是Gly Ser,這樣就可以用具有含凝血酶酶切位點的融合表達系統(tǒng)來制備。主要的設計方案是首先缺失人白介素11的N末端5個氨基酸即Pro Gly Pro Pro Pro,然后將人的第7位和第10位氨基酸替換成猿的氨基酸即分別為Ser和Ala,其它的序列與人的IL-11氨基酸序列完全一致。這種改進的新型人白細胞介素11可用含凝血酶切點的融合表達系統(tǒng)來制備。本專利所述方法制備的新型重組人白介素11與設計的完全一致,不會出現(xiàn)多余的氨基酸。應用本專利制備的新型人白介素11與天然人白介素11相比在體內外的活性一致。由于N末端缺失脯氨酸的重組人白介素11已正式應用于臨床治療腫瘤病人因化療引起的血小板減少癥,本專利發(fā)明的新型改進型白介素11可望具有臨床應用價值。
實例說明一、新型人白介素11融合表達系統(tǒng)的構建選用含谷胱甘肽轉硫酶(GST)的融合表達質粒pGEX-4T-1(Pharmacia)作為構建的載體,此載體含有凝血酶切位點。根據(jù)人和猿的白介素11的cDNA序列,以及新型改進型人白介素11即N末端缺失5個氨基酸,N末端第7位和10位氨基酸改為猿的Ser和Ala的要求,設計兩對PCR擴增引物,即正鏈5’-CT GGA TCC CCT CGA GCT TCCCCA GAC CCT CGG-3’,反鏈5’-TTA TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAGCAG TAG CCC-3’。以人的白細胞介素11全基因cDNA為模板,擴增出的改進型人白介素11基因片段與酶切后的pGEX-4T-1大片段相連,轉化大腸桿菌JM105,篩選出含插入片段的重組子命名為pGEX-FK-11(圖2)。經序列分析后可進行融合表達研究。二、新型人白介素11的基因測序從pGEX-FK-11中用BamHI和Sal I雙酶切下新型改進型人白介素11基因片段,與pUC-19經BamHI和Sal I雙酶切后的大片段相連,用藍白斑法篩選出重組子,命名為pUC-FK-11。經AB I全自動基因測序后得到插入的新型人白細胞介素11的基因序列(圖3)以及相對應的氨基酸序列,結果分析與設計的完全一致。三、新型人白介素11的重組表達含新型改進型人白介素11基因的pGEX-FK-11轉化大腸桿菌JM105,在含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜(37℃,200rpm),再按1∶30接種含有100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)3小時后,加入0.5mM IPTG誘導4小時。收集菌體經SDS-PAGE電泳分析,發(fā)現(xiàn)含新型人白介素11的融合蛋白GST-FK-11(44.6kD)以可溶性表達為主,表達量占菌體總蛋白的28%。四、重組新型人白介素11的純化用1000ml發(fā)酵液,離心收集菌體約15克,用50mM磷酸鹽緩沖液(PH7.8)含1%Triton溶液懸液菌體,在室溫下破菌20分鐘,破菌液經超聲波處理至無粘稠后離心去沉淀。上清經Glutathion-Sepharose(Pharmacia)進行親和層析純化,吸附在柱上的含新型人白介素11的融合蛋白,用人血漿凝血酶(每毫克融合蛋白用5NIH單位凝血酶)室溫下在位酶切。酶切下的重組新型人白介素11,再經CM-SepharoseCL-4B純化,最終產物的純度超過98%,熱原含量每mg蛋白低于10EU內毒素。五、重組新型人白介素11的理化性質本方法制備的重組新型人白介素11分子量為18.6KD,等電點大于10.0,紫外最大吸收峰為281nm,溴化氰肽圖分析含有二個甲硫氨酸。氨基酸組成分析與理論設計值一致,其中無半胱氨酸。N末端測序證實是Gly Ser Pro Arg Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Gln Leu Asp SerThr,與設計的新型人白介素11的N末端序列完全一致。六、重組新型人白介素11的體外生物活性用依賴于白介素6的細胞株7TD1和T1165的MTT方法測活,參照品是美國Genetics Institute的缺失脯氨酸的重組人白介素11和天然的人白介素11。測得本方法制備的重組新型改進型人白介素11的比活性分別是2.5×106(7TD1細胞)和8.0×106(T1165細胞),與天然和缺失脯氨酸的人白介素11的比活性完全一致。七、重組新型人白介素11體內增加血小板數(shù)目實驗用5-FU化療的小鼠模型和Carboplatin化療的絨猴模型,血小板數(shù)目均顯著減少,皮下給予本方法制備的重組新型人白介素11,陽性對照藥物是美國Genetics Institute的缺失脯氨酸的重組人白介素11。結果提示,重組新型人白介素11具有顯著增加血小板數(shù)目的功能,其增加效率與陽性對照完全一致(表1和圖4)。
權利要求
1.改進的新型人白細胞介素11是指在N末端比天然成熟的人白細胞介素11少5個氨基酸即Pro Gly Pro Pro Pro,同時將天然人白介素11的N末端第7位和第10位氨基酸替換成猿白介素11相對應位置的氨基酸分別為Ser和Ala。
2.條款1中的第10位氨基酸可以不替換,仍用人的白介素11氨基酸Valine。
3.條款1中的第7位氨基酸可以不替換,仍用人的白介素11氨基酸proline。
4.條款1、2、3中的新型人白細胞介素11可以用基因工程或多肽合成手段獲得?;蚬こ谭椒ㄖ苽浒ㄔ吮磉_系統(tǒng),酵母表達系統(tǒng)以及真核表達系統(tǒng)。
5.條款1和2中新型人白細胞介素11在融合表達系統(tǒng)中最大優(yōu)勢是用凝血酶作為蛋白酶切位點,酶切后制備的重組新型人白介素11在N末端不會含新的氨基酸,與設計的新型人白介素11序列完全一致。
6.條款5中的融合蛋白切開方法可以是化學法或其它方法,如Hydroxylamine和Intein。本條款同樣適合條款3中所述新型人白介素11。
7.條款1和5的重組新型人白介素11用融合表達系統(tǒng)進行表達,親和層析純化融合蛋白,酶解下目的蛋白。
8.條款7中的融合表達系統(tǒng)指任何融合表達系統(tǒng)和相對應的親和層析純化。
9.條款1、2、3、4、6獲得的新型人白介素11具有藥用價值,可以開發(fā)出各種劑型的藥品。
10.條款9中的藥用價值指醫(yī)學和非醫(yī)學的治療和預防作用。
11.條款9中的劑型指粉針、水針、噴霧、含片、膠囊、栓劑等藥物劑型。
全文摘要
人白細胞介素11具有刺激巨核細胞增生、增加血小板數(shù)量、調節(jié)免疫功能和粘膜保護等功能,其重組產品已應用于臨床治療腫瘤病人化療后引起的血小板減少癥。本發(fā)明采用基因工程手段制備出改進的新型改進型重組人白介素11,經證明與天然人白介素11有相同的體內外生物功能,可望成為治療血小板減少癥的藥物。
文檔編號A61K9/00GK1264710SQ9911146
公開日2000年8月30日 申請日期1999年8月16日 優(yōu)先權日1999年8月16日
發(fā)明者范開, 聶李亞, 肖建國, 馬素永, 田峰, 王建, 王立兵, 黃洪濤, 黃秀東 申請人:重慶多泰制藥有限公司