專利名稱：缺失型人白細胞介素11微小化變異體的制作方法
人體內的各種細胞因子均由特定組織細胞分泌，其中相當數(shù)量的細胞因子通過旁分泌起作用，血液中的含量甚微。作為藥物應用的細胞因子必須達到一定的血藥濃度才能滿足局部生物靶細胞的需求。由于其自然來源十分有限，因此應用基因工程手段進行天然細胞因子的基因改造、重組表達和高效純化，已是目前眾多細胞因子在基礎研究和臨床應用上的重要手段?；蚬こ痰母脑熘饕ɑ虻娜笔А⑼蛔兒腿诤?，從而可以制備出多種形式的細胞因子衍生物。改造的目的除了要進行蛋白的結構與功能研究外，同時提高蛋白質的生物功效及減少體內毒副作用，使其更具有臨床藥物的開發(fā)價值。
人白細胞介素11(human interleukin-11，hIL-11)是具有多種生物功能的蛋白質。主要作用有刺激造血干細胞向巨核系細胞分化，促進巨核細胞增殖和成熟，增加外周血血小板數(shù)量，刺激B細胞的發(fā)育并提高其功能，保護胃腸粘膜細胞受損。天然成熟hIL-11由178個氨基酸組成，分子量為20Kd，是強堿性蛋白質(pI 11.7)，疏水性強。hIL-11 cDNA全長1100對堿基，其中5’端有72個堿基非編碼區(qū)，3’端有431個堿基非編碼區(qū)。閱讀框架為597個堿基，翻譯表達為199個氨基酸組成的hIL-11蛋白，其中N末端1～21個氨基酸是信號肽序列。
通過應用基因工程重組手段，對hIL-11的N末端進行了多種改造的嘗試，分別得到了△1-8 IL-11、△1-9(Ala10)等人白細胞介素11變異體，與天然hIL-11相比其生物活性無改變。說明hIL-11的生物活性區(qū)不位于N末端。對hIL-11C末端缺失5個氨基酸的變異體改造，其生物活性喪失80％以上，證明人IL-11的生物活性區(qū)主要位于C末端。分析hIL-11的DNA全基因序列，其5個外顯子的大小和間隔具有明顯的特點。其中5’端第一個外顯子只有9個核苷酸的編碼區(qū)，編碼3個氨基酸，緊接著由1338個核苷酸組成的第一個內含子。第二、第三、第四、第五個外顯子分別編碼57、29、54、53個氨基酸，其間的內含子分別由198、111、2121個核苷酸組成。除去N末端1～21個氨基酸的信號肽序列，△1-8 IL-11和△1-9(Ala10)變異體基因改造均處于第二個外顯子的前端，提示該區(qū)編碼的氨基酸序列存在與否對生物活性影響不大，即不影響蛋白質活性基團的形成和與受體結合位點的結構。本發(fā)明對hIL-11進一步缺失掉前二個外顯子和第三個外顯子編碼的N末端1～68個氨基酸的改造，因其分子量較hIL-11減小38％，理論上的生物比活性將有增強。這是該專利改造設計的理論根據(jù)之一。另一方面，通過應用Goldkey軟件對輸入的hIL-11氨基酸序列進行二級結構預測分析，提示hIL-11由8個α-螺旋組成，占總氨基酸的40～50％，與文獻值50％基本符合。N末端前三個α-螺旋分別由第12位～第20位、第25位～第33位、第40位～第51位氨基酸序列形成。第52位～第68位氨基酸序列為第三、四α-螺旋之間的β折疊區(qū)。由此可見，△1-8 IL-11和△1-9(Ala10)IL-11變異體所具有完全生物活性，并未影響hIL-11的二級結構α-螺旋。預示hIL-11可以進行缺失N端第一個、第二個和第三個α-螺旋的逐級缺失改造。第三個α-螺旋之后是β折疊和α-螺旋密集區(qū)，形成較復雜的蛋白質二級和三級結構。本發(fā)明中將hIL-11的基因組DNA序列外顯子與hIL-11的二級結構作比較，第二個外顯子正好編碼第一和第二個α-螺旋區(qū)，第三個外顯子正好編碼第三個α-螺旋區(qū)和第一個β折疊區(qū)。第四個外顯子編碼第四、五、六個α螺旋區(qū)和第IIβ折疊區(qū)。第五個外顯區(qū)編碼第七、八個α螺旋區(qū)和第3至6的β折疊區(qū)。這是本專利改造設計的另一理論依據(jù)。
根據(jù)以上兩種理論設計，首先改造了hIL-11 N末端缺失20個和39個氨基酸的變異體[△20 IL-11(以下稱FK-20)和△39 IL-11(以下稱FK-39)]，這兩種變異體正好將hIL-11的第一個α-螺旋區(qū)和第二個α-螺旋區(qū)缺失掉，經(jīng)體內外測定FK-20和FK-39具有完全的生物活性。在此基礎上，改造了hIL-11N末端缺失68個氨基酸的變異體[△68 IL-11(以下稱FK-68)]，此變異體正好將第二、三外顯子編碼的hIL-11前三個α-螺旋區(qū)缺失掉。
應用基因工程技術手段改造的缺失hIL-11N末端68個氨基酸變異體(以下稱FK-68)，經(jīng)重組融合表達、分離純化而得。重組FK-68體內外試驗證明除了具有天然hIL-11相同的生物功能外，尚具有升高外周血白細胞數(shù)量的功能。經(jīng)動物實驗證明重組FK-68在胃腸粘膜組織中有明顯的分布，對損傷后的消化道粘膜具有愈合和保護作用。
由于基因工程技術的進步，應用原核表達體系、酵母表達體系、昆蟲表達體系、哺乳動物細胞表達體系、轉基因動物表達體系、轉基因植物表達體系制備重組蛋白的方法越來越多。本發(fā)明中所述的人白細胞介素11缺失微小型變異體均可在這些體系中選擇相應的表達載體和宿主進行重組表達。重組形式的缺失型人白細胞介素11變異體可以應用現(xiàn)有藥物制劑技術制成各種劑型的藥物，如針劑、片劑、膠囊、口服液以及脂質體或控、緩釋劑型。
本專利所述IL-11N末端缺失68個氨基酸的微小化變異體，適應于治療和預防骨髓抑制、胃腸粘膜損傷等相關性疾病，主要包括腫瘤病人放化療后的支持治療、骨髓移植、放射性骨髓和胃腸粘膜損傷、感染性和非感染性腸炎、繼發(fā)性血小板減少癥和繼發(fā)性白細胞減少癥等。
實例1 重組人△1-68 IL-11(FK-68)變異體融合表達系統(tǒng)的構建和測序選用含谷胱甘肽轉硫酶(GST)的融合表達質粒pGEX-4T-1(Pharmacia)作為構建的載體。根據(jù)人白細胞介素11的cDNA序列以及N末端缺失68個氨基酸的FK-68變異體要求，設計兩對PCR引物。
Seq15’-GCGGA TCCGAC GAT GAC GATAAG CTC CCA GGT GTG CTGACA AGG CTG-3’。
Seq25’-GCGAA TTCTTA TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG CAG TAGCCC CCT CAC-3’。
在正鏈引物5’端引入BamH I酶切位點GGA TCC和腸激酶氨基酸識別位點DDDDK的堿基序列GAC GAT GAC GAT AAG，在反鏈引物5’端引入EcoRI酶切位點GAA TTC和兩個終止密碼子TAA TGA。以人的白細胞介素11全基因cDNA為模板，擴增出的FK-68基因片段經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后與相同雙酶切后的pGEX-4T-1大片段經(jīng)T4連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α。篩選出含插入片段的重組子命名為pGEX-FK68，序列分析后可進行融合表達研究。
從pGEX-FK68中用BamH I和EcoR I雙酶切下FK-68基因片段，與pBluescript經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后的大片段相連，用藍白斑法篩選出重組子，命名為pBSK-FK68。經(jīng)全自動基因測序儀測序后得到插入的FK-68基因序列，結果與設計值完全一致。
實例2 重組人△1-68 IL-11(FK-68)變異體的重組表達和制備含F(xiàn)K-68基因的pGEX-FK68轉化大腸桿菌BL21，在含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(稱LA培養(yǎng)基)中搖瓶過夜(37℃，200rpm)。再按1∶10接種LA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3小時后，加入0.2mM IPTG誘導4小時。收集菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，融合蛋白GST-FK68(38.5Kd)以可溶性表達為主，表達量占菌體總蛋白的30％。
經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)表達的發(fā)酵液，離心收集菌體，用50mM磷酸緩沖液(pH7.8)含1％Triton溶液混懸菌體，在室溫下破菌20分鐘，破菌液經(jīng)超聲波處理至無粘稠后離心去沉淀。上清經(jīng)Glutathion-Sepharose(Pharmacia)進行親和層析純化，吸附在柱上的FK-68融合蛋白，用重組腸激酶(1∶500，w/w)室溫下在位酶切4小時。酶切下的重組FK-68再經(jīng)CM-Sepharose CL-4B和Q-Sepharose Fast Flow純化，最終產(chǎn)物的純度超過95％。
實例3 重組人△1-20 IL-11(FK-20)和△1-39 IL-11(FK-39)的重組表達構建和制備按照實例1和2中構建FK-68的重組表達和制備方法成功地構建了表達FK-20、FK-39的重組載體和工程菌，經(jīng)發(fā)酵和親和純化、腸激酶酶切和離子交換層析后純化而得重組的FK-20和FK-39。
實例4 重組人△1-68 IL-11(FK-68)變異體的理化性質本方法制備的重組人△1-68 IL-11變異體分子量為12 Kd，由110個氨基酸組成，其中無半胱氨酸。N末端測序證實是Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg AlaAsp Leu Leu Ser Tyr，與理論設計值完全一致。
用依賴于人白細胞介素11的細胞株B911的MTT方法測定，參照品是重組人白細胞介素11(rhIL-11)。測得本方法制備的重組FK-68比活性為1.5～2.0×108unit/mg，比重組人白細胞介素11的比活性高出1倍。重組FK-20的比活性為0.8-1.1×108Unit/mg，重組FK-39的比活性為0.9-1.2×108Unit/mg。用依賴于人G-CSF的細胞株NSF-60的MTT法測定，參照品為重組人G-CSF。測得重組FK-69的比活性為5.0×107unit/mg，是重組hG-CSF的生物活性的50％，證明重組FK-68具有刺激粒細胞增殖的生物作用。相同方法測定重組FK-20和FK-40則不能刺激NSF-60細胞的增殖。
實例5 重組人白細胞介素11缺失型變異體對正常昆明種小鼠的外周血血小板和白細胞數(shù)量的影響按FK-20、FK-39、FK-68將昆明種小鼠分三個藥物試驗組，一個生理鹽水對照組。每個藥物試驗組分別設50μKD(50ug/kg/day)和100μKD(100ug/kg/day)二個劑量組，皮下注射，1次/日，連續(xù)給藥7天。
表1.FK-20、FK-39和FK-68變異體對昆明種小鼠外周血血小板數(shù)量的影響外周血血小板數(shù)量(109/L)時間(天)對照組50uKD組100uKD組給藥前987.8±122.9 906.6±113.7 983.3±99.8FK-20給藥3天 872.0±100.3 966.6±132.8 999.24±134.7給藥7天 1014±120.8 1171.2±129.0* 1134.8±122.3*停藥3天 933.7±102.9 1312.5±117.9**# 1362.7±142.2**#FK-39給藥3天 872.0±100.3 982.3±107.8 965.2±125.5給藥7天 1014±120.8 1108.3±112.3* 1243.9±144.3**#停藥3天 933.7±102.9 1325.4±184.2**# 1366.6±198.2**#FK-68給藥3天 872.0±100.3 1010.3±132.1 997.1±132.4給藥7天 1014±120.8 1275.4±139.4*#1287.5±169.3**#停藥3天 933.7±102.9 1415.3±153.4**# 1483.2±213.6**#注與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與給藥前比較，#P＜0.01FK-20、FK-39、FK-68 50μKD和100μKD劑量組在給藥7天到停藥3天之間，昆明種小鼠外周血血小板數(shù)量均有明顯增加，與對照組比較差異顯著(P＜0.05)，其中100μKD劑量組較50μKD劑量組增加更明顯。兩個劑量組均在停藥后3天外周血血小板數(shù)量達到高峰。同時FK-68的50μKD和100μKD劑量組均較FK-20、FK-40對應劑量組增加顯著。
表2.FK-20、FK-39和FK-68變異體對對昆明種小鼠外周血白細胞總數(shù)影響外周血血小板數(shù)量(109/L)時間(天)生理鹽水對照組 50uKD組 100uKD組給藥前 11.2±3.7 10.2±1.510.8±1.3FK-20 給藥3天11.7±2.8 10.9±2.011.0±1.8給藥7天9.7±1.311.1±2.112.0±2.0停藥3天10.7±3.1 11.7±1.912.2±2.2FK-39 給藥3天11.7±2.8 11.7±2.111.3±1.3給藥7天9.7±1.312.1±1.211.8±1.7停藥3天10.7±3.1 11.2±2.411.7±1.3FK-68 給藥3天11.7±2.8 11.4±1.811.1±1.3給藥7天9.7±1.312.3±2.312.9±1.9*停藥3天10.7±3.1 13.4±1.6**# 14.2±3.1**#注與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與給藥前比較，#P＜0.01FK-20和FK-39注射后對正常小鼠的外周血白細胞數(shù)量無明顯改善，而FK-68 50μKD和100μKD劑量組在給藥7天到停藥3天之間，昆明種小鼠外周血白細胞總數(shù)均有明顯增加，與對照組比較差異顯著，其中100μKD劑量組較50μKD劑量組增加更明顯。
實例6 重組人△1-68 IL-11(FK-68)變異體對腸型放射病小鼠胃腸道病理組織變化的影響(表7.)取4-6周Balb/c小鼠24只，隨機分為4組空白對照組，模型對照組，給藥高、低劑量組。給藥組動物造模前1小時皮下注射給藥0.1ml，劑量為100、250μg/kg，溶劑為生理鹽水，對照組動物給予等體積生理鹽水。給藥組和模型對照組動物以Co60r射線全身一次性照射，照射劑率為2.5688Gy/min，劑量為25Gy。于造模后48小時取小腸不同部位(十二指腸、空腸、回腸)病檢。
結果模型顯示對照組小鼠出現(xiàn)體重下降，腸道充血、小腸縮短、腸腔擴張和腸粘膜壞死脫落等病理變化，而FK-68給藥組動物病理變化的程度和范圍較對照組明顯減輕，其中尤以250μg/kg組的保護效果顯著，有關結果見下表3表3.FK-68對給藥后小鼠小腸的長度、寬度、粘膜完好率的變化組別長度(mm)寬度(mm) 粘膜完好率(％)空白對照51-53 4-6 100模型對照35-40 6-7 40-50低劑量組42-46 5-7 65-70高劑量組45-48 4-6 80-90實例7重組人△1-68IL-11(FK-68)變異體對Balb/c小鼠5-FU化療模型外周血血小板和白細胞的影響取4-6周Balb/c小鼠，隨機分成6組空白對照組、模型對照組、重組人G-CSF組、重組人IL-11組、重組FK-68兩個劑量組。每只小鼠腹腔注射5-FU(5氟尿嘧啶)按100mg/kg，于注射的0天到7天給藥。不同給藥時間和停藥后3天取外周血測定。實驗結果見附圖2，其中重組人G-CSF可顯著增加外周血白細胞的數(shù)量，重組人IL-11可明顯增加外周血血小板數(shù)量，重組FK-68可明顯增加外周血血小板和白細胞的數(shù)量。


附圖1人白細胞介素11的基因組序列與編碼的蛋白質二級結構比較人IL-11基因含有5個外顯子，分別編碼3個、57、29、54和53個氨基酸。人IL-11蛋白二級結構中含有8個α螺旋和6個折疊區(qū)，其中第一、二個α螺旋是由12-20位和25-33氨基酸組成，由第二個外顯子編碼。第三個α螺旋由40-51位氨基酸組成，第三個和第四個α螺旋區(qū)由52-69位氨基酸組成，由第三個外顯子編碼。圖中 表示外顯子非編碼區(qū)， 表示外顯子編碼區(qū)。
附圖2FK-68對小鼠5-FU化療模型的外周血小板和白細胞計數(shù)的影響A給藥7天和停藥后3天的小鼠外周血血小板數(shù)量的變化。
B給藥7天和停藥后3天的小鼠的外周血白細胞數(shù)量的變化。
其中rhIL-11給藥劑量為100ug/kg。rhG-CSF的給藥劑量為50ug/kg，F(xiàn)K-69的給藥劑量為50ug/kg和100ug/kg，對照組為生理鹽水。
權利要求
1.本發(fā)明所述缺失型人白細胞介素11變異體由天然人白細胞介素11N末端缺失1到68個氨基酸形成。
2.權利要求1中的缺失1到68個氨基酸主要指N末端第20位到第68位氨基酸之間的任何缺失形式。
3.權利要求1和權利要求2中的缺失改造指基因工程重組技術。
4.權利要求2、3中的重組缺失型人白細胞介素11變異體適用于原核和真核表達體系，通過重組表達、發(fā)酵以及純化而得。
5.缺失型人白細胞介素11變異體具有天然人白細胞介素11相應的生物學功效，主要指增加外周血血小板的數(shù)量和胃腸粘膜保護等。
6.本發(fā)明中N末端缺失68個氨基酸的人白細胞介素11微小化變異體具有人白細胞介素11不具有的增加外周血白細胞數(shù)量的功效。
7.權利要求6中缺失型人白細胞介素11微小化變異體適應用大腸桿菌融合表達。
8.權利要求6中缺失型人白細胞介素11微小化變異體可用酵母表達而獲得。
9.權利要求6中重組形式的缺失型人白細胞介素11微小化變異體在加入相應的制劑輔料后可制成注射液、粉針劑、口服劑和脂質體以及控、緩釋劑型等。
10.權利要求9中人白細胞介素11缺失型微小化變異體適應于治療和預防骨髓抑制和胃腸粘膜損傷等相關性疾病。
全文摘要
通過對天然人白細胞介素11(interleukin 11，IL－11)的基因序列和蛋白質二，三級結構分析，以及全基因內含子、外顯子的特點和對應蛋白質N末端α螺旋的組成順序，結合IL－11生物活性決定區(qū)靠近C末端的分析。本發(fā)明設計并改造出N末端缺失第一個、第二個和第三個α螺旋區(qū)即分別缺失20、39、68個氨基酸的人白細胞介素11缺失型變異體(Variants)。經(jīng)體內外試驗證明，大腸桿菌重組表達的N末端缺失68個氨基酸的人IL－11微小化變異體Δ1－68 IL－11，具有顯著提高外周血血小板數(shù)量和胃腸粘膜保護的生物功能，同時具備天然人IL－11不具有的增加外周血白細胞數(shù)量的生物作用。本發(fā)明的缺失型微小化人IL－11變異體，因其獨特的生物作用具有臨床應用價值。
文檔編號A61P1/00GK1517364SQ0310115
公開日2004年8月4日 申請日期2003年1月13日 優(yōu)先權日2003年1月13日
發(fā)明者范開, 張憲, 黃振偉, 范 開 申請人:重慶富進生物醫(yī)藥有限公司